Summary
Il protocollo presenta un metodo per la coltivazione e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto isolate dalla papilla del gusto posteriore di topi adulti.
Abstract
Il senso del gusto è mediato dalle papille gustative sulla lingua, che sono composte da cellule recettrici del gusto (TRC) che si rinnovano rapidamente. Questo continuo turnover è alimentato da cellule progenitrici locali e rende la funzione del gusto soggetta a interruzioni da parte di una moltitudine di trattamenti medici, che a loro volta hanno un grave impatto sulla qualità della vita. Pertanto, studiare questo processo nel contesto del trattamento farmacologico è vitale per capire se e come la funzione progenitrice del gusto e la produzione di TRC sono influenzate. Date le preoccupazioni etiche e la limitata disponibilità di tessuto gustatico umano, i modelli murini, che hanno un sistema di gusto simile agli esseri umani, sono comunemente usati. Rispetto ai metodi in vivo, che richiedono molto tempo, sono costosi e non suscettibili di studi ad alto rendimento, gli organoidi linguali murini possono consentire di eseguire rapidamente esperimenti con molte repliche e meno topi. Qui, i protocolli precedentemente pubblicati sono stati adattati e viene presentato un metodo standardizzato per generare organoidi del gusto da cellule progenitrici del gusto isolate dalla papilla circumvallata (CVP) di topi adulti. Le cellule progenitrici del gusto nel CVP esprimono LGR5 e possono essere isolate tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza EGFP (FACS) da topi portatori di un allele Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. Le cellule ordinate vengono placcate su un sistema di coltura 3D a base di gel a matrice e coltivate per 12 giorni. Gli organoidi si espandono per i primi 6 giorni del periodo di coltura attraverso la proliferazione e poi entrano in una fase di differenziazione, durante la quale generano tutti e tre i tipi di cellule del gusto insieme alle cellule epiteliali non gustative. Gli organoidi possono essere raccolti al momento della maturazione al giorno 12 o in qualsiasi momento durante il processo di crescita per l'espressione dell'RNA e l'analisi immunoistochimica. Standardizzare i metodi di coltura per la produzione di organoidi linguali da cellule staminali adulte migliorerà la riproducibilità e farà progredire gli organoidi linguali come un potente strumento di screening farmacologico nella lotta per aiutare i pazienti che soffrono di disfunzione del gusto.
Introduction
Nei roditori, le papille gustative linguali sono alloggiate in papille fungiformi distribuite anteriormente, papille fogliate bilaterali posteriormente, nonché una singola papilla circumvallata (CVP) sulla linea mediana posterodorsale della lingua1. Ogni papille gustatica è composta da 50-100 cellule recettrici del gusto (TRC) di breve durata e in rapido rinnovamento, che includono cellule di supporto gliali di tipo I, cellule di tipo II che rilevano dolci, amare e umami e cellule di tipo III che rilevano acido2,3,4. Nel topo CVP, le cellule staminali LGR5+ lungo la lamina basale producono tutti i tipi di TRC e le cellule epiteliali non gustative5. Quando si rinnova il lignaggio del gusto, le cellule figlie LGR5 vengono prima specificate come cellule precursori del gusto post-mitotico (cellule di tipo IV) che entrano in una papille gustatica e sono in grado di differenziarsi in uno qualsiasi dei tre tipi TRC6. Il rapido turnover dei TRC rende il sistema gustatico suscettibile di perturbazioni da parte di trattamenti medici, tra cui radiazioni e alcune terapie farmacologiche7,8,9,10,11,12,13. Pertanto, studiare il sistema del gusto nel contesto della regolazione delle cellule staminali del gusto e della differenziazione TRC è vitale per capire come mitigare o prevenire la disfunzione del gusto.
I topi sono un modello tradizionale per studi in vivo nella scienza del gusto poiché hanno un sistema del gusto organizzato in modo simile agli esseri umani14,15,16. Tuttavia, i topi non sono ideali per studi ad alto rendimento, in quanto sono costosi da mantenere e richiedono molto tempo per lavorare. Per ovviare a questo, negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di coltura organoide in vitro. Gli organoidi gustazionali possono essere generati dal tessuto CVP nativo, un processo in cui gli organoidi germogliano dall'epitelio CVP di topo isolato coltivato ex vivo17. Questi organoidi mostrano un epitelio multistrato coerente con il sistema di gusto in vivo. Un modo più efficiente per generare organoidi che non richiedono la coltura CVP ex vivo è stato sviluppato da Ren et al. nel 201418. Adattando metodi e mezzi di coltura sviluppati per la prima volta per far crescere organoidi intestinali, hanno isolato singole cellule progenitrici Lgr5-GFP+ da CVP di topo e le hanno placcate in gel di matrice19. Queste singole cellule hanno generato organoidi linguali che proliferano durante i primi 6 giorni di coltura, iniziano a differenziarsi intorno al giorno 8 e alla fine del periodo di coltura contengono cellule epiteliali non gustative e tutti e tre i tipi di TRC18,20. Ad oggi, sono stati pubblicati diversi studi che utilizzano il sistema di modelli organoidi linguali17,18,20,21,22; tuttavia, i metodi e le condizioni di coltura utilizzati per generare questi organoidi variano da una pubblicazione all'altra (Tabella supplementare 1). Pertanto, questi metodi sono stati adattati e ottimizzati qui per presentare un protocollo standardizzato dettagliato per la coltura di organoidi linguali derivati da LGR5+ progenitori di CVP di topo adulto.
Gli organoidi linguali forniscono un modello unico per lo studio dei processi biologici cellulari che guidano lo sviluppo e il rinnovamento delle cellule del gusto. Man mano che le applicazioni degli organoidi linguali si espandono e sempre più laboratori si spostano verso l'utilizzo di modelli organoidi in vitro, è importante che il campo si sforzi di sviluppare e adottare protocolli standardizzati per migliorare la riproducibilità. Stabilire gli organoidi linguali come strumento standard all'interno della scienza del gusto consentirebbe studi ad alto rendimento che separano il modo in cui le singole cellule staminali generano le cellule differenziate del sistema del gusto adulto. Inoltre, gli organoidi linguali potrebbero essere impiegati per esaminare rapidamente i farmaci per potenziali impatti sull'omeostasi del gusto, che potrebbero quindi essere studiati in modo più approfondito in modelli animali. Questo approccio alla fine migliorerà gli sforzi per ideare terapie che migliorino la qualità della vita per i futuri destinatari di farmaci.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in una struttura accreditata AAALAC in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, la legge sul benessere degli animali e la politica del servizio sanitario pubblico e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università del Colorado Anschutz Medical Campus. I topi Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 utilizzati in questo protocollo provengono da The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
NOTA: i seguenti passaggi devono essere completati prima di iniziare per garantire una progressione regolare e tempestiva del protocollo: impostare il bagno d'acqua a 37 °C, impostare la centrifuga a 4 °C, effettuare soluzioni enzimatiche di iniezione e dissociazione dalle soluzioni madre di dispasi, collagenasi ed elastasi da 10 mg/mL (vedere Tabella dei materiali),rimuovere il gel della matrice dal congelatore a -20 °C (~750 μL necessario per una piastra a 48 pozzetti) e scongelare immergendo il flaconcino nel ghiaccio per a almeno 3-4 ore, tubi microcentrifuga pre-rivestiti in FBS non diluito oscillando delicatamente a temperatura ambiente per almeno 30 minuti (due tubi da 2 ml per la raccolta dei tessuti, due tubi da 1,5 ml per le cellule dissociate e un tubo da 1,5 ml per la raccolta di singole cellule dalla selezionatrice cellulare; rimuovere l'FBS in eccesso prima dell'uso).
1. Isolamento dell'epitelio CVP
NOTA: Per ottenere un numero sufficiente di cellule LGR5+ per una piastra completa a 48 pozzetti, raccogliere tre CVP Lgr5-EGFP nello stesso tubo ed elaborare contemporaneamente. È importante sottolineare che raccogliere ed elaborare il CVP di almeno un cucciolata selvatico in parallelo in un tubo separato e utilizzarlo come controllo di gating per impostare i parametri FACS (vedere Risultati rappresentativi).
- Eutanasia dei topi con asfissia di CO2 secondo le normative IACUC, seguita da un metodo secondario approvato come toracotomia bilaterale, lussazione cervicale, decapitazione o dissanguamento.
- Utilizzare grandi forbici di dissezione sterili per tagliare le guance e rompere la mascella. Sollevare la lingua e tagliare il frenulo linguale per separare la lingua dal pavimento della cavità orale. Ritagliare la lingua e raccoglierla in soluzione salina sterile ghiacciata tamponata con fosfato di Dulbecco (dPBS) con Ca2+ e Mg2+.
- Rimuovere e scartare la lingua anteriore tagliando appena anteriormente l'eminenza intermolare con una lama di rasoio (Figura 1A, linea tratteggiata). Utilizzare una delicata salvietta per rimuovere i peli e il liquido in eccesso dalla lingua posteriore.
- Riempire 1 mL di siringa con 200-300 μL di soluzione enzimatica per iniezione (concentrazione finale: 2 mg/mL di collagenasi di tipo I e 5 mg/mL dispasi II in Ca2+/Mg2+-contenente dPBS, diluita da 10 mg/mL di soluzioni madri) e inserire un ago da 30 G x 1/2 appena sopra l'eminenza intermolare (Figura 1B, freccia nera) fino a quando appena anteriore al CVP ( Figura1B, scatola nera). Iniettare la soluzione enzimatica sotto e ai bordi laterali del CVP tra l'epitelio e i tessuti sottostanti (lamina propria, muscolo). Prelevare la siringa lentamente e continuamente dalla lingua durante l'iniezione.
- Incubare la lingua in dPBS sterile senza Ca2+/ Mg2+a temperatura ambiente per esattamente 33 minuti.
- Fai piccoli tagli nell'epitelio bilateralmente e appena anteriormente al CVP usando forbici di dissezione extra fini e sbuccia delicatamente l'epitelio sollevandolo con una pinza fine. Una volta che l'epitelio della trincea è libero dal tessuto connettivo sottostante, posizionarlo in un tubo microcentrifuga vuoto da 2 ml pre-rivestito con FBS. Eseguire il taglio epiteliale prima o dopo il distacco dell'epitelio CVP (Figura 1C,D).
2. Dissociazione dell'epitelio CVP
NOTA: La dissociazione dell'epitelio CVP e la placcatura sono rappresentate graficamente nella Figura 2.
- Aggiungere il cocktail enzimatico di dissociazione (concentrazione finale: 2 mg/mL di collagenasi di tipo I, 2 mg/mL di elastasi e 5 mg/mL di dispasi II in Ca2+/Mg2+-contenente dPBS, diluito da 10 mg/mL di soluzioni stock) in tubi contenenti epiteli CVP sbucciati (200 μL per CVP). Incubare a bagnomaria a 37 °C per 45 min. Vortice brevemente ogni 15 min.
NOTA: Pre-riscaldamento 0,25% Tripsina-EDTA a 37 °C a bagnomaria durante gli ultimi 15 minuti di incubazione del cocktail enzimatico. - Dopo l'incubazione, vortice (tre impulsi) quindi triturare con una pipetta Pasteur di vetro per 1 min. Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante contenente la prima raccolta di cellule dissociate, in nuovi tubi microcentrifuga da 1,5 mL rivestiti con FBS corrispondenti al genotipo. Elaborare ulteriormente i restanti pezzi di tessuto come descritto al punto 2.3. sotto.
- Ruotare il surnatante per 5 minuti a 370 x g e 4 °C in celle a pellet.
- Rimuovere il surnatante risultante e risospese il pellet cellulare in Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Buffer (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) e 1% FBS in Ca2+/Mg2+-free PBS (50 μL per CVP)). Conservare sul ghiaccio.
- Durante l'esecuzione delle fasi 2.2.1 e 2.2.2, dissociare i restanti pezzi di tessuto dal passaggio 2.2 aggiungendo tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% (200 μL per CVP) ai tubi microcentrifuga originali da 2 mL e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 min. Vortice brevemente ogni 10 min.
- Dopo l'incubazione, vortice il tubo contenente pezzi di tessuto (tre impulsi) quindi triturare con una pipetta Pasteur di vetro per 1 minuto. Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante nei tubi microcentrifuga da 1,5 ml contenenti cellule dal punto 2.2.2. Scartare i tubi contenenti i restanti pezzi di tessuto.
- Ruotare i tubi con celle dissociate per 5 minuti a 370 x g e 4 °C in celle a pellet.
- Rimuovere i pellet di cellule surnatante e riconsossenti in FACS Buffer (100 μL per CVP). Conservare sul ghiaccio.
- Passare le celle attraverso un filtro a rete di nylon da 30 μm e aggiungere DAPI(emissione λ = 450 nm) alle miscele cellulari prima del FACS. Isolare le cellule Lgr5-GFP+ tramite FACS utilizzando il canale proteicofluorescente verde (eccitazione λ = 488 nm;emissione λ = 530 nm). Ordinare le celle utilizzando un ugello da 100 μm in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL rivestito fbS contenente 300 μL di Ca2+/ Mg2+ dPBS libero. Posizionare le cellule sul ghiaccio fino alla placcatura.
3. Placcatura di celle Lgr5-EGFP
- Determinare il volume di sospensione cellulare LGR5+ ricevuto dal citometro a flusso.
- In base al numero di celle ottenute dal sorter, calcolare il numero di celle per μL. Quindi, determinare il volume necessario per ottenere il numero desiderato di celle per la placcatura (usiamo 200 celle per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti) e trasferire quel volume totale di celle sospese in un nuovo tubo microcentrifuga.
- Ruotare il tubo per 5 minuti a 370 x g e 4 °C in celle a pellet (il pellet potrebbe non essere visibile). Rimuovere il surnatante e posizionare il tubo sul ghiaccio.
- Risuscisere delicatamente il pellet cellulare nella quantità appropriata di gel della matrice (15 μL per pozzo per piastre a 48 pozzi); pipettare su e giù delicatamente per distribuire accuratamente le cellule in gel di matrice. Posizionare 15 μL di miscela di gel/cellule della matrice al centro di ciascun pozzo. Mantenere il tubo microcentrifuga sul ghiaccio in un tubo conico da 50 ml durante la placcatura per evitare che il gel della matrice si gelifichi. Continuare a miscelare la miscela di gel / cellule della matrice durante la placcatura tubando su e giù ogni tre pozzi per garantire una distribuzione uniforme delle cellule attraverso i pozzi.
- Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2,~95% di umidità) per 10 minuti per consentire la gelificazione della matrice. Quindi, aggiungere 300 μL di media WENRAS + Y27632 a temperatura ambiente a ciascun pozzo e restituire la piastra all'incubatore.
4. Manutenzione degli organoidi
NOTA: gli organoidi sono coltivati in mezzi organoidi convenzionali (WENR) comprendenti EGF ricombinante e mezzi condizionati al 50% contenenti Wnt3a, Noggin e R-spondin23. I farmaci A8301 e SB202190 vengono aggiunti per i primi 6 giorni del periodo di coltura per ottimizzare la crescita (wenras media) (Figura 5), quindi rimossi per promuovere la differenziazione (wenr media)20. Y27632 viene aggiunto per i primi 2 giorni di cultura per promuovere la sopravvivenza. Le condizioni dei supporti relative alla sequenza temporale della cultura sono presentate nella Figura 4.
- Due giorni dopo la placcatura, rimuovere i supporti WENRAS + Y27632 da ciascun pozzo utilizzando una pipetta da 1 mL, assicurando che non vi siano contaminazioni incrociate. Aggiungere 300 μL di media WENRAS lungo il lato del pozzo per non interrompere il gel della matrice. Restituire la piastra all'incubatrice.
- Cambiare i media ogni 2 giorni, utilizzando il supporto appropriato per la fase di coltura (Figura 4). Mantenere gli organoidi fino al giorno 12, quando gli organoidi sono pronti per la raccolta.
5. Elaborazione dell'RNA
- Raccolta di organoidi per RNA
- Posizionare la piastra a 48 pozzi sul ghiaccio per 30 minuti per depolimerizzare il gel della matrice.
- Utilizzando una pipetta da 1 mL, tirare su il mezzo organoide; quindi, quando il supporto viene restituito al pozzo, utilizzare la punta della pipetta per graffiare e rompere ulteriormente il gel della matrice. Trasferire il contenuto in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml, combinando il contenuto di tre pozzetto in un tubo. Centrifugare i tubi per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere il maggior numero possibile di surnatante media senza rimuovere alcun organoide; quindi, girare nuovamente i tubi per 5 minuti a 300 x g a temperatura ambiente.
- Rimuovere il mezzo rimanente e risuscimere gli organoidi in un tampone di lisi da 350 μL + β-mercaptoetanolo (βME) (10 μL βME per tampone di lisi da 1 mL). Posizionare i campioni su ghiaccio per l'estrazione immediata dell'RNA o conservare a -80 °C.
- Analisi quantitativa RT-PCR
- Misurare la quantità di RNA tramite spettrofotometro. Trascrivere inversamente l'RNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA.
- Miscelare cDNA equivalente a 5 ng RNA con primer pre-convalidati in avanti e in retromarcia da 200 nM (Tabella 1) e pcr master mix fluorescente. Eseguire la reazione qRT-PCR per 40 cicli a: 95 °C per 15 s, quindi 60 °C per 60 s.
6. Immunoistochimica
- Raccolta e fissaggio degli organoidi
- Posizionare la piastra a 48 fori sul ghiaccio per 30 minuti per allentare il gel della matrice.
- Rimuovere il mezzo organoide e aggiungere 400 μL di PBS ghiacciato a ciascun pozzo. Quindi, rimuovere PBS e aggiungere 400 μL di soluzione di recupero cellulare ghiacciata a ciascun pozzo. Oscillare dolcemente a 4 °C per 30 min.
- Rivestire una punta di pipetta da 1 mL con l'1% di BSA in PBS e pipettare delicatamente il contenuto del pozzo su e giù per rompere il gel della matrice. Trasferire gli organoidi in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml posto sul ghiaccio.
- Risciacquare ogni bene con 300 μL PBS + 1% BSA e trasferire eventuali organoidi rimanenti nei tubi corrispondenti. Rimuovere Cell Recovery Solution/PBS + BSA da ogni tubo. Aggiungere 400 μL di PBS ghiacciato, quindi ripetere con un altro risciacquo PBS ghiacciato.
- Rimuovere PBS e fissare gli organoidi con 300 μL di PFA al 4% ghiacciato (in 0,1 M PB) per 20 minuti, incubando a temperatura ambiente. Rimuovere il PFA e risciacquare gli organoidi con PBS ghiacciato da 400 μL.
- Rimuovere PBS; quindi, aggiungere 400 μL PBS + 1% BSA. Conservare a 4 °C.
- Colorazione immunofluorescenza
- Risciacquare gli organoidi in 500 μL PBS + 1% BSA. Quindi, incubare gli organoidi in soluzione bloccante (5% normale siero di capra o asino, 1% albumina sierica bovina, 0,3% Triton X 100 in 1x PBS pH 7,3) per 2 ore, oscillando delicatamente a temperatura ambiente.
- Aggiungere la soluzione anticorpale primaria (anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante) e dondolare delicatamente per 3 notti a 4 °C.
- Lavare gli organoidi 4x per 1 ora con 500 μL PBS + 0,2% Tritone, oscillando delicatamente a temperatura ambiente. Aggiungere una soluzione anticorpale secondaria (anticorpi secondari diluiti in soluzione bloccante) e organoidi di roccia durante la notte, al riparo dalla luce, a 4 °C.
- Lavare gli organoidi 3x per 1 ora con 500 μL PBS + 0,2% Tritone, al riparo dalla luce e oscillando delicatamente a temperatura ambiente. Incubare con DAPI diluito 1:10.000 in 0,1 M PB per 20 min, oscillando e coperto a temperatura ambiente.
- Lavare gli organoidi 3x per 20 min con 0,1 M PB, dondolando delicatamente e coperti a temperatura ambiente.
- Montaggio a slitta di organoidi per microscopia confocale invertita.
NOTA: le immagini dettagliate del processo di montaggio delle diapositive sono mostrate nella Figura 7.- Creare un perimetro quadrato di circa 1 mm di spessore 22 x 22 mm di argilla modellante non tossica su un vetrino per microscopio.
- Rimuovere 0,1 M PB dal tubo di microcentrifuga e risospendare delicatamente gli organoidi in un mezzo di montaggio da 100 μL a scelta; quindi, trasferire al centro del quadrato di argilla.
- Riempire il quadrato di argilla fino a quando il mezzo di montaggio è quasi in cima. Quindi, posizionare 22 x 22 mm di copertura quadrata su argilla e premere saldamente sui lati del coperchio per sigillare. Lasciare polimerizzare secondo le istruzioni del produttore (qui, temperatura ambiente per 1-2 giorni) e conservare a 4 °C.
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Representative Results
I topi hanno un CVP, situato posteriormente sulla lingua, da cui possono essere isolate le cellule staminali LGR5+ (Figura 1A, scatola nera). L'iniezione di una soluzione enzimatica sotto e intorno al CVP (Figura 1B) provoca un leggero gonfiore dell'epitelio e la digestione del tessuto connettivo. Una digestione sufficiente si ottiene dopo un'incubazione di 33 minuti, che consente una facile separazione dell'epitelio CVP dal tessuto sottostante. Quando si tenta di sbucciare l'epitelio CVP, i tagli devono essere effettuati a una distanza sufficiente dal CVP per garantire che le trincee non vengano interrotte o danneggiate (Figura 1C). Ciò consente anche di afferrare l'epitelio usando una pinca senza danneggiare il CVP. Tagliare l'epitelio che circonda il CVP rimuove le cellule non bersaglio e aumenta l'efficienza dei passaggi successivi diminuendo la massa tissutale manipolata (Figura 1D). È importante verificare che le due trincee(Figura 1C,frecce nere)siano presenti prima di aggiungere l'epitelio CVP al tubo del microcentrifuga; il peeling riuscito del CVP include parte delle ghiandole e dei dotti di Von Ebner (Figura 1D, frecce nere). Se l'epitelio sbucciato non contiene queste due strutture opache, l'epitelio della trincea è molto probabilmente rotto a causa della digestione incompleta del tessuto connettivo.
Per stabilire impostazioni FACS adeguate per raccogliere cellule Lgr5-EGFP, le cellule di CVP dissociate sono ottenute separatamente da topi wild type e Lgr5-EGFP. Le cellule CVP di tipo selvatico vengono analizzate prima per stabilire i parametri di gating, un processo in cui le popolazioni di cellule sono classificate all'interno dell'output del grafico a dispersione per caratteristiche di interesse24. Qui, quattro parametri sono stati utilizzati per identificare le celle per la placcatura. Il primo parametro, la dispersione in avanti, filtra particelle e detriti in base alla superficie rilevata. Questo parametro rimuove circa il 70% di tutti gli eventi rilevati durante l'ordinamento (Figura 3). Il parametro width filtra ulteriormente gli eventi in base alle dimensioni per garantire la selezione di singole celle (singoli. Circa il 90% degli eventi sono singoli (Figura 3). Il marcatore nucleare DAPI è assorbito da cellule morte ma non vive e quindi consente alle cellule morte di essere risolte25. Questo protocollo ottimizza la vitalità cellulare, poiché oltre il 90% degli eventi sono cellule vive (Figura 3). Infine, i parametri di gating GFP sono impostati al di sopra del livello di autofluorescenza delle cellule wild type. Le cellule di tipo selvatico non vengono raccolte; sono utilizzati esclusivamente come controllo gating per la fluorescenza GFP. Con i parametri di gating determinati dal campione wild type, le cellule del campione Lgr5-EGFP vengono quindi eseguite attraverso il citometro a flusso per essere ordinate per la raccolta. I gate possono essere regolati all'inizio del tipo Lgr5-EGFP per adattarsi al clustering chiaro di alcune popolazioni cellulari, ma non dovrebbero essere significativamente modificati a metà ordinamento. È stato scoperto che la dissociazione di tre CVP Lgr5-EGFP raggruppati produce ~ 500.000 cellule, tra cui una media di 10.000 cellule GFP+.
Adeguate condizioni di coltura e dei mezzi sono vitali per una crescita e una differenziazione ottimali degli organoidi. Studi precedenti che utilizzavano organoidi linguali modellavano i loro componenti mediali su quelli del campo organoide intestinale, tra cui Wnt3a, EGF, Noggin e R-spondin17,18,19,20,21,22. Tuttavia, quando gli organoidi linguali vengono coltivati con un metodo simile (mezzi WENR), gli organoidi non crescono in modo efficiente (Figura 5A). Negli organoidi intestinali umani, i farmaci A8301 (un inibitore della segnalazione TGFß) e SB202190 (un inibitore della segnalazione della MAPKinase p38) sono usati per promuovere la crescita degli organoidi26. Infatti, l'aggiunta di questi inibitori (mezzi WENRAS) induce una robusta crescita degli organoidi linguali (Figura 5A). È interessante notare che la rimozione di questi inibitori dal mezzo dopo 6 giorni si traduce in una maggiore espressione del marcatore TRC generale Kcnq1, suggerendo che A8301 e SB202190 ostacolano la differenziazione delle cellule del gusto (Figura 5B). Pertanto, la crescita e la differenziazione ottimali si ottengono coltivando organoidi in mezzi WENRAS dai giorni 0-6 e nei mezzi WENR dai giorni 6-12 (Figura 4, Figura 5), rispettivamente.
La composizione del tipo di cellula organoide può essere caratterizzata da qRT-PCR o immunoistochimica. Gli organoidi maturi contengono sia cellule gustative, marcate da Kcnq1 e KRT8, sia cellule epiteliali non gustative, marcate da Krt13/KRT13 (Figura 6, 8A). Ciò suggerisce che le cellule isolate LGR5+ hanno una potenza simile in vitro come fanno in vivo poiché, nella lingua adulta, le cellule Lgr5-GFP+ producono sia lignaggi di gusto che non gustatiche5. Inoltre, Krt13 è espresso a livelli più elevati rispetto a tutti e 3 i marcatori TRC (Figura 6), suggerendo che gli organoidi sono prevalentemente composti da cellule epiteliali non gustative. Infatti, la quantificazione relativa dell'espressionegenica 27 indica che Krt13 è espresso 50 volte superiore al marcatore TRC generale Kcnq1 (Test tdi Student, p = 0,0004). Questo è previsto, poiché la lingua ha una proporzione simile di gusto rispetto all'epitelio nongustalico 1. Gli organoidi esprimono tutti e tre i tipi di TRC (Figura 6, 8B, C). Le cellule di tipo I (contrassegnate da Entpd2) e le cellule amare di tipo II (contrassegnate da Gnat3) sono altamente espresse in organoidi del gusto, mentre le cellule di tipo III con rilevamento acido (contrassegnate da Car4) sono meno comuni (Figura 6). I TRC sono distribuiti casualmente in organoidi (Figura 8) piuttosto che in strutture discrete di papille gustative osservate in vivo.
Figura 1: Lingua sezionata ed epitelio CVP sbucciato. (A) La lingua viene sezionata e la lingua anteriore viene rimossa tagliando appena anteriormente all'eminenza intermolare (linea tratteggiata), lasciando la lingua posteriore, che include la CVP (scatola nera) (B) Un ago viene inserito appena anteriormente all'eminenza intermolare (freccia nera) e la miscela enzimatica viene iniettata sotto e ai bordi laterali della CVP (scatola nera). (C) Epitelio pelato non tagliato che circonda le trincee CVP (frecce nere) e (D) epitelio CVP sbucciato tagliato. Le ghiandole e i dotti di Von Ebner (D, frecce nere) sono visibili dopo il successo della desquamazione delle trincee. Barra della scala: 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Flusso di lavoro della generazione di organoidi linguali. La lingua viene rimossa dai topi Lgr5-EGFP. Gli epiteli della trincea CVP (scatola rossa) vengono staccati dal tessuto connettivo sottostante e dissociati in singole cellule. Le cellule GFP+ sono isolate e placcate in gel di matrice ad una densità di 200 cellule per pozzetti in una piastra a 48 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gating per l'ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza. (A) L'esecuzione di controllo (cellule CVP di tipo selvaggio) determina le porte FACS che eliminano i detriti e le cellule rotte tramite lo scatter in avanti, identifica i singoli tramite la larghezza di dispersione laterale, separa ilneg DAPI vivo dalle cellule morte DAPI+ e stabilisce il livello di autofluorescenza delle cellule wild type. (B) Le porte precedentemente determinate vengono applicate alla corsa sperimentale (cellule Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP) per isolare le cellule Lgr5-EGFP+ prive di detriti, singole, vive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cronologia della coltura di organoidi linguali e supporti richiesti. L'inibitore ROCK Y27632 viene aggiunto ai media per le prime 48 ore di coltura per promuovere la sopravvivenza cellulare. Durante la fase di proliferazione, gli organoidi vengono alimentati con mezzi condizionati contenenti A8301 e SB202190 (WENRAS) per ottimizzare la crescita. Questi farmaci sono trattenuti dai media (WENR) a partire dal giorno 6 per promuovere la differenziazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I farmaci A8301 e SB202190 influenzano la crescita e la differenziazione degli organoidi. (A) Immagini a campo luminoso di organoidi coltivati in media WENR (giorno 0-12), WENRAS (giorno 0-12) o WENRAS (giorno 0-6), quindi WENR (giorno 6-12). Le immagini sono state catturate al giorno 2, al giorno 6 e al giorno 12 della cultura utilizzando un software di imaging dal vivo. Barra di scala: 400 μm (B) L'espressione genica relativa di un marcatore TRC globale Kcnq1 è significativamente ridotta quando i farmaci A8301 e SB202190 sono presenti durante la differenziazione degli organoidi. Ogni punto rappresenta una replica biologica, che includeva tre pozzi raggruppati. La variazione media dell'espressione genica relativa (linea orizzontale) è stata calcolata facendo una media di tre repliche biologiche. Barre di errore: ±SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Gli organoidi linguali esprimono marcatori canonici delle cellule gustative. Variazione del valore della soglia del ciclo (Ct) del marcatore TRC globale Kcnq1, del marcatore epiteliale non gustativo citocheratina 13 (Krt13), del marcatore TRC di tipo I Entpd2, del marcatore TRC amaro di tipo II Gnat3e del marcatore TRC acido di tipo III Car4, rispetto al gene di pulizia Rpl19. Ogni punto rappresenta una replica biologica, che includeva tre pozzi raggruppati da una piastra a 48 pozzi. La variazione media del valore ct (linea orizzontale) per ciascun marcatore è stata calcolata facendo una media di tre repliche biologiche. Unpaired Student's t-test, *p < 0,05. Barre di errore: ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Montaggio di organoidi linguali per microscopia confocale invertita. (A) Viene creata una stringa di ~ 1 mm di spessore di argilla modellante non tossica. (B) L'argilla è scolpita come un quadrato di ~ 20 mm x 20 mm al centro di un vetrino per microscopio da 24 mm x 75 mm. (C) Un coperchio quadrato di 22 mm x 22 mm sigilla gli organoidi sospesi nel mezzo di montaggio. Barra della scala: 10 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immunolabeling di organoidi linguali intatti. Immagini confocali di organoidi fissi immunostinici. (A) Sezione ottica di un organoide colorato per marcatore epiteliale non gustativo KRT13 (verde) e marcatore TRC generale KRT8 (magenta). (B) Proiezione massima di una pila di z confocale di un organoide colorato per marcatori cellulari gliali di tipo I NTPDase2 (verde) e KRT8 (magenta). (C) Proiezione massima di una pila di z confocale di due organoidi parzialmente mostrati (contorni tratteggiati di bianco) e un organoide completo colorato per il marcatore cellulare di rilevamento acido di tipo III CAR4 (verde) e il marcatore cellulare di tipo II amari GUSTDUCIN (magenta). Barra della scala: 100 μm per A, B e C. Marcatore nucleare DAPI (blu, colonna di destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del gene | Primer in avanti (5'-3') | Primer inverso (5'-3') | Numero di assessione | ||||||
| Auto4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 · | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 · | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 · | TCATCTCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 · | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Tabella 1: Sequenze di primer utilizzate per la RT-PCR quantitativa.
Tabella supplementare 1: Confronto dei componenti dei mezzi di coltura organoidi linguali pubblicati. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Riportato qui è un metodo efficiente e facilmente ripetibile per la coltivazione, il mantenimento e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto di topo adulto. È stato scoperto che l'utilizzo di tre CVP da 8 a 20 settimane di topi Lgr5-EGFP è sufficiente per ottenere ~ 10.000 cellule GFP+ per uso sperimentale, con il risultato di 50 pozzetti placcati ad una densità di 200 cellule per pozzo in piastre a 48 pozzetti. La rimozione degli epiteli della trincea CVP è ottimizzata iniettando l'epitelio linguale con Dispase II appena prodotta e soluzione di collagenasi di tipo I, seguita da un'incubazione di 33 minuti. Tuttavia, un tempo di incubazione più breve, vecchie aliquote enzimatiche, lotti diversi o l'utilizzo di enzimi di diversi produttori possono comportare la rimozione incompleta della trincea. Al contrario, un tempo di incubazione più lungo provoca un'eccessiva digestione del tessuto, con conseguente perdita dell'integrità del tessuto gustatico. Dopo il peeling, un ulteriore arricchimento per le trincee CVP è stato fatto tagliando via l'epitelio che circonda il CVP.
È fondamentale che tutti i tubi di microcentrifuga utilizzati durante il processo di dissociazione e raccolta siano rivestiti con FBS per evitare che tessuti e cellule si attacchino alle pareti di plastica dei tubi, il che riduce significativamente il recupero di cellule isolate (dati non mostrati). L'utilizzo di una leggera mano di FBS e la rimozione del liquido in eccesso dai tubi prima dell'uso riduce al minimo i possibili effetti inibitori sulla tripsina o su altri enzimi.
Gli organoidi linguali sono stati coltivati con successo da tessuto CVP dissociato senza previa selezione delle cellule LGR5+ 17. Sebbene questo metodo si traduca nella formazione di organoidi, abbiamo scoperto che una percentuale minore di questi organoidi contiene cellule del gusto rispetto a quelle cresciute da progenitori isolati (dati non mostrati). La selezione del flusso per le cellule Lgr5-EGFP+ arricchisce i progenitori competenti per il gusto, con conseguente maggiore percentuale di organoidi pieni di gusto. Attualmente, raccogliamo tutte le cellule al di sopra della soglia di autofluorescenza GFP (Figura 3); tuttavia, è possibile che i livelli di luminosità GFP siano associati all'efficienza variabile di formazione degli organoidi o alla competenza del gusto. Questa ipotesi non è stata ancora testata, ma è una strada promettente per il lavoro futuro in quanto potrebbe consentire un ulteriore arricchimento degli organoidi contenenti cellule del gusto.
È noto che la densità di placcatura influisce sull'efficienza della differenziazione organoide e raccomandiamo di determinare la densità di placcatura ottimale prima della sperimentazione28. Le dimensioni e la profondità dei pozzi, così come il volume del gel della matrice, devono essere considerati quando si stabilisce la densità di placcatura. Sulla base del nostro lavoro preliminare (dati non mostrati), troviamo che in una piastra a 48 pozzetti, 15 μL di gel matriciale e una densità di placcatura di 200 cellule per pozzo consentono un'efficiente espansione e differenziazione organoide di tutti e tre i tipi di TRC. Abbiamo scoperto che gli organoidi linguali possono essere coltivati con successo e in modo riproducibile in Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract (RGF BME), un'alternativa sintetica e meno costosa al gel della matrice. Altre matrici alternative possono anche supportare la coltura di organoidi linguali, ma sono necessari ulteriori test per indagare su questa possibilità.
Durante la placcatura, le cellule raccolte devono essere accuratamente ma delicatamente risuscilate in gel di matrice spesso pipettando su e giù per mantenere omogenea la sospensione cellulare. Il tubo contenente la miscela di gel a matrice cellulare deve anche essere tenuto su ghiaccio durante l'intero processo di placcatura per evitare che il gel della matrice si gelifichi sui lati del tubo. Queste misure assicurano una distribuzione uniforme delle cellule attraverso i pozzi, producendo risultati più riproducibili quando si placcano a mano le cellule. In particolare, i recenti sviluppi nelle tecnologie microfluidiche forniscono opzioni ad alta produttività per l'erogazione delle celle ed è uno strumento promettente per il lavoro futuro29.
Per valutare l'espressione genica negli organoidi in coltura, si è scoperto che è necessario mettere in comune almeno tre pozzezze per ogni replicazione biologica per ottenere RNA e consistenza sufficienti tra le repliche (Figura 6). È stato anche determinato che la lisi immediata degli organoidi raccolti secondo le istruzioni specifiche del produttore ottimizza la qualità e la quantità dell'RNA estratto. Sebbene non siano testate qui, altre opzioni di archiviazione come il congelamento flash o la ricaspensione nei reagenti di stoccaggio possono anche preservare la resa e la qualità dell'RNA.
L'esecuzione di immunoistochimica sugli organoidi può essere impegnativa, poiché gli anticorpi primari e secondari devono penetrare in qualsiasi gel della matrice residua e nell'intero epitelio organoide. In precedenti rapporti, gli organoidi sono stati fissati mentre erano ancora sospesi in gel di matrice, che successivamente ha richiesto concentrazioni estremamente elevate di soluzione anticorpale primaria per rivelare l'espressione proteica17,18. Simile ad altri rapporti, la rimozione di organoidi dal gel della matrice utilizzando Cell Recovery Solution prima della fissazione è stata trovata per aumentare l'efficienza della colorazione senza la necessità di un'alta concentrazione di anticorpi30,31; tuttavia, il rilevamento di alcuni marcatori delle cellule del gusto, ad esempio CAR4, richiede una maggiore concentrazione di anticorpi. Inoltre, l'incubazione di organoidi in antisieri primari per 3 notti aumenta la probabilità di legame anticorpale. Tuttavia, questo metodo può anche aumentare la fluorescenza di fondo se gli organoidi non vengono sufficientemente lavati dopo l'immuno colorazione. È importante sottolineare che la soluzione di anticorpi primari diluiti può essere salvata e riutilizzata con successo una o più volte se conservata per meno di una settimana (dati non mostrati). Per un'imaging ottimale, gli organoidi vengono montati posizionando un coperchio sopra un perimetro di argilla di argilla modellante per preservare la loro struttura 3D. Posizionare il vetro di copertura direttamente sul vetrino comprime e rompe gli organoidi, impedendo una corretta analisi.
La coltura di organoidi è una tecnica altamente applicabile ed economica. Alcune applicazioni includono, ma non sono limitate a, la modellazione della malattia e lo screening dei farmaci e lo studio delle cellule staminali e della biologia dello sviluppo32. Pertanto, è fondamentale standardizzare i modelli organoidi per consentire la riproducibilità tra i laboratori. In futuro, sarebbe utile sviluppare un metodo standardizzato per il passaggio di organoidi linguali che garantisca che la potenza delle cellule staminali del gusto possa essere propagata su passaggi seriali, riducendo così la necessità di altri animali per generare più organoidi. È importante sottolineare che, mentre gli organoidi linguali sono composti da cellule epiteliali sia gustative che non gustative, l'organizzazione di queste cellule differisce rispetto al sistema del gusto in vivo. Le discrepanze tra organoidi ed epitelio gustativo in vivo possono essere dovute ai mezzi utilizzati per la coltura di organoidi e/o perché gli organoidi non hanno interazione con il microambiente delle papille gustative, compresi importanti segnali provenienti dai nervi gustativi e dalla lamina propria che sono necessari per la formazione e il mantenimento delle papille gustative22,33,34,35. Il lavoro futuro per incorporare nervi o vascolarizzazione nella coltura organoide linguale, una strategia attualmente in fase di adozione in altri sistemi organoidi, potrebbe consentire una modellazione più accurata dell'epitelio gustativo in vivo 36,37.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Peter Dempsey e Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) per aver fornito media condizionati WNR e preziose discussioni. Ringraziamo anche l'Università del Colorado Cancer Center Cell Technologies and Flow Cytometry Shared Resources, in particolare Dmitry Baturin, per l'esperienza nello smistamento cellulare. Questo lavoro è stato finanziato da: NIH /NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, e NIH/NCI R21 CA236480 a LAB, e R21DC016131 e R21DC016131-02S1 a DG, e F32 DC015958 a EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
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