Summary
O protocolo apresenta um método para cultivo e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de sabor isoladas da papila de sabor posterior de camundongos adultos.
Abstract
A sensação de paladar é mediada por papilas gustativas na língua, que são compostas de células receptoras de sabor (TRCs) que renovam rapidamente. Essa rotatividade contínua é alimentada por células progenitoras locais e torna a função de paladar propensa à interrupção por uma infinidade de tratamentos médicos, o que, por sua vez, impacta severamente a qualidade de vida. Assim, estudar esse processo no contexto do tratamento medicamentoso é vital para entender se e como a função progenitora do sabor e a produção de TRC são afetadas. Dadas as preocupações éticas e a limitada disponibilidade do tecido de sabor humano, os modelos de camundongos, que têm um sistema de sabor semelhante aos humanos, são comumente usados. Em comparação com os métodos in vivo, que são demorados, caros e não favoráveis a estudos de alto rendimento, organoides linguais murinos podem permitir que experimentos sejam executados rapidamente com muitas réplicas e menos camundongos. Aqui, protocolos publicados anteriormente foram adaptados e um método padronizado para gerar organoides de paladar a partir de células progenitoras de sabor isoladas da papila circunvallada (CVP) de camundongos adultos é apresentado. Células progenitoras de sabor no LGR5 expresso CVP e podem ser isoladas através da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de camundongos portadores de um alelo Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. As células classificadas são banhadas em um sistema de cultura 3D baseado em gel matricial e cultivadas por 12 dias. Os organoides se expandem durante os primeiros 6 dias do período cultural por meio da proliferação e, em seguida, entram em uma fase de diferenciação, durante a qual geram todos os três tipos de células de paladar, juntamente com células epiteliais sem gosto. Os organoides podem ser colhidos após o amadurecimento no dia 12 ou a qualquer momento durante o processo de crescimento para expressão de RNA e análise imunohistoquímica. Padronizar métodos culturais para a produção de organoides linguais a partir de células-tronco adultas melhorará a reprodutibilidade e avançará organoides linguais como uma poderosa ferramenta de triagem de medicamentos na luta para ajudar pacientes que experimentam disfunção do sabor.
Introduction
Em roedores, as papilas gustativas linguais são alojadas em papilas fungiformes distribuídas anteriormente, papilas foliadas bilaterais posteriormente, bem como uma única papila circunvallada (CVP) na linha média posterodorsal da língua1. Cada paladar é composto por células receptoras de sabor de 50-100 de curta duração, que renovam rapidamente as células receptoras de sabor (TRCs), que incluem células de suporte tipo I, células tipo II que detectam células doces, amargas e umami, e células tipo III que detectam células azedas2,3,4. No mouse CVP, as células-tronco LGR5+ ao longo da lamina basal produzem todos os tipos de TRC, bem como células epiteliais não saborosas5. Ao renovar a linhagem de sabor, as células filhas LGR5 são primeiramente especificadas como células precursoras do sabor pós-mitótico (células tipo IV) que entram em uma papila gustativa e são capazes de se diferenciar em qualquer um dos três tipos TRC6. A rápida rotatividade dos TRCs torna o sistema de paladar suscetível à interrupção por tratamentos médicos, incluindo radiação e certas terapias medicamentosas7,8,9,10,11,12,13. Assim, estudar o sistema de paladar no contexto da regulação de células-tronco do sabor e da diferenciação de TRC é vital para entender como mitigar ou prevenir a disfunção do sabor.
Os camundongos são um modelo tradicional para estudos in vivo em ciência do sabor, uma vez que possuem um sistema de sabor organizado de forma semelhante aos humanos14,15,16. No entanto, os camundongos não são ideais para estudos de alto rendimento, pois são caros de manter e demorados para trabalhar. Para superar isso, métodos in vitro de cultura organoide têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Organoides de paladar podem ser gerados a partir do tecido CVP nativo, um processo no qual organoides brotam do camundongo isolado CVP epitélio cultivado ex vivo17. Estes organoides exibem um epitélio multicamadas consistente com o sistema de sabor in vivo. Uma forma mais eficiente de gerar organoides que não requerem a cultura ex vivo CVP foi desenvolvida pela Ren et al. em 201418. Adaptando métodos e meios de cultura desenvolvidos pela primeira vez para cultivar organoides intestinais, isolaram células lgr5-GFP+ progenitores únicas do mouse CVP e as banhavam em gel de matriz19. Essas células únicas geraram organoides linguais que se proliferam durante os primeiros 6 dias de cultura, começam a se diferenciar por volta do dia 8, e ao final do período cultural contêm células epiteliais sem gosto e todos os três tipos TRC18,20. Até o momento, foram publicados múltiplos estudos utilizando o sistema de modelo organoide lingual17,18,20,21,22; no entanto, os métodos e condições de cultura utilizados para gerar esses organoides variam entre as publicações (Tabela Suplementar 1). Assim, esses métodos foram ajustados e otimizados aqui para apresentar um protocolo padronizado detalhado para a cultura de organoides linguais derivados do LGR5+ progenitores do mouse adulto CVP.
Organoides linguais fornecem um modelo único para estudar os processos biológicos celulares que impulsionam o desenvolvimento e renovação das células do paladar. À medida que as aplicações dos organoides linguais se expandem e mais laboratórios se movem para utilizar modelos organoides in vitro, é importante que o campo se esforce para desenvolver e adotar protocolos padronizados para melhorar a reprodutibilidade. Estabelecer organoides linguais como uma ferramenta padrão dentro da ciência do sabor permitiria estudos de alto rendimento que provocam como células-tronco únicas geram as células-tronco diferenciadas do sistema de paladar adulto. Além disso, organoides linguais poderiam ser empregados para rastrear rapidamente drogas para potenciais impactos na homeostase do sabor, que poderia então ser investigada mais detalhadamente em modelos animais. Esta abordagem, em última análise, aumentará os esforços para criar terapias que melhorem a qualidade de vida dos futuros receptores de medicamentos.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram realizados em uma unidade credenciada pela AAALAC em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Lei de Bem-Estar Animal e Política de Serviços públicos de Saúde, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz. Os camundongos LGR5EGFP-IRES-CreERT2 usados neste protocolo são do Laboratório Jackson, Stock No. 008875.
NOTA: As seguintes etapas devem ser concluídas antes de começar a garantir a progressão suave e oportuna do protocolo: definir banho de água para 37 °C, definir soluções de enzima centrífuga a 4 °C, fazer soluções de enzima de injeção e dissociação a partir das soluções de espase de 10 mg/mL, Colagenase e Elastase (ver Tabela de Materiais),remover gel de matriz a partir de -20 °C congelador (~750 μL necessário para uma placa de 48 poços) e descongelar submergindo o frasco no gelo para a 00 pelo menos 3-4 h, tubos de microcentrifuuge pré-casaco em FBS não diluídos balançando suavemente à temperatura ambiente por pelo menos 30 min (dois tubos de 2 mL para coleta de tecido, dois tubos de 1,5 mL para células dissociadas e um tubo de 1,5 mL para coleta de células únicas do classificador celular; remover o excesso de FBS antes de usar).
1. Isolamento do epitélio CVP
NOTA: Para obter células LGR5+ suficientes para uma placa completa de 48 poços, colete três CVPs LGR5-EGFP no mesmo tubo e processe simultaneamente. É importante ressaltar que colhe e processa o CVP de pelo menos um tipo selvagem de ninhado em paralelo em um tubo separado e utilize-o como um controle de gating para definir parâmetros FACS (ver Resultados Representativos).
- Eutanize os camundongos com asfixia de CO2 de acordo com as regulamentações da IACUC, seguido de um método secundário aprovado, como toracotomia bilateral, luxação cervical, decapitação ou exsanguinação.
- Use uma grande tesoura de dissecção estéril para cortar as bochechas e quebrar a mandíbula. Levante a língua e corte o frênulo lingual para separar a língua do chão da cavidade oral. Corte a língua e colete-a em salina tamponada de fosfato de Dulbecco (dPBS) com Ca2+ e Mg2+.
- Remova e descarte a língua anterior cortando apenas antes da eminência intermolar com uma lâmina de barbear(Figura 1A, linha tracejada). Use uma limpeza de tarefa delicada para remover qualquer cabelo e excesso de líquido da língua posterior.
- Encha 1 mL de seringa com 200-300 μL de solução de enzima de injeção (concentração final: 2 mg/mL tipo-I Colagemnase e 5 mg/mL Dispase II em Ca2+/Mg2+-contendo dPBS, diluído de 10 mg/mL soluções de estoque) e insira uma agulha de 30 G x 1/2 logo acima da eminência intermolar(Figura 1B, seta preta)até apenas antes do CVP (Figura 1B, caixa preta). Injete a solução enzimante por baixo e nas bordas laterais do CVP entre o epitélio e os tecidos subjacentes (lamina propria, músculo). Retire a seringa lentamente e continuamente da língua à medida que a injeção for realizada.
- Incubar a língua em dPBS ca2+/Mg2+livre a temperatura ambiente por precisamente 33 min.
- Faça pequenos cortes no epitélio bilateralmente e apenas anterior ao CVP usando uma tesoura de dissecção fina extra, e descasque suavemente o epitélio levantando-o com fórceps finos. Uma vez que o epitélio da trincheira esteja livre do tecido conjuntivo subjacente, coloque-o em um tubo vazio de microcentrifuuge de 2 mL pré-revestido com FBS. Faça o aparador epitelial antes ou depois de desacoplar o epitélio CVP (Figura 1C, D).
2. Dissociação do epitélio CVP
NOTA: A dissociação do epitélio CVP e do revestimento são representadas graficamente na Figura 2.
- Adicione o coquetel de enzima dissociação (concentração final: 2 mg/mL tipo I Collagenase, 2 mg/mL Elastase e 5 mg/mL Dispase II em Ca2+/Mg2+-contendo dPBS, diluído a partir de 10 mg/mL soluções de estoque) para tubos contendo epithelia CVP descascada (200 μL por CVP). Incubar em um banho de água de 37 °C por 45 min. Vórtice brevemente a cada 15 minutos.
NOTA: Pré-aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA em banho de água de 37 °C durante os últimos 15 minutos de incubação de coquetéis enzimados. - Após a incubação, o vórtice (três pulsos) em seguida triturar com uma pipeta Pasteur de vidro por 1 min. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernascer contendo a primeira coleção de células dissociadas, em novos tubos de microcentrifuuge revestidos de FBS de 1,5 mL correspondentes ao genótipo. Processe ainda mais as peças de tecido restantes conforme descrito na etapa 2.3. abaixo.
- Gire o supernante por 5 min a 370 x g e 4 °C para as células de pelotas.
- Remova o supernascimento resultante e resuspenque a pelota celular no Buffer de Classificação celular Ativado por Fluorescência (FACS) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) e 1% FBS em PBS ca2+/Mg2+-free (50 μL por CVP)). Guarde no gelo.
- Ao realizar as etapas 2.2.1 e 2.2.2, dissociar as peças de tecido restantes da etapa 2.2 adicionando 0,25% de trypsin-EDTA (200 μL por CVP) aos tubos originais de microcentrifuge de 2 mL e incubar em um banho de água de 37 °C por 30 minutos. Vórtice brevemente a cada 10 minutos.
- Após a incubação, o tubo contendo pedaços de tecido (três pulsos) em seguida, triturar com uma pipeta Pasteur de vidro por 1 min. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernacido nos tubos de microcentrifuus de 1,5 mL contendo células da etapa 2.2.2. Descarte os tubos que contenham os pedaços de tecido restantes.
- Gire os tubos com células dissociadas por 5 min a 370 x g e 4 °C para células de pelotas.
- Remova as pelotas de células supernascidas e resuspendas em Buffer FACS (100 μL por CVP). Guarde no gelo.
- Passe as células através de um filtro de malha de nylon de 30 μm e adicione DAPI(emissão λ = 450 nm) às misturas celulares antes do FACS. Isole células Lgr5-GFP+ via FACS usando o canal de proteína fluorescente verde (excitaçãoλ = 488 nm;emissão λ = 530 nm). Classifique as células usando um bico de 100 μm em um novo tubo de microcentrifusagem revestido de FBS de 1,5 mL contendo 300 μL de Ca2+/Mg2+ dPBS grátis. Coloque as células no gelo até chapeamento.
3. Chapeamento de células Lgr5-EGFP
- Determine o volume de suspensão celular LGR5+ recebida do citômetro de fluxo.
- Com base no número de células obtidas do classificador, calcule o número de células por μL. Em seguida, determine o volume necessário para obter o número desejado de células para chapeamento (usamos 200 células por poço de uma placa de 48 poços) e transfira esse volume total de células suspensas para um novo tubo de microcentrifuagem.
- Gire o tubo por 5 min a 370 x g e 4 °C para as células de pelota (pelotas podem não ser visíveis). Remova o supernatante e coloque o tubo no gelo.
- Resuspenque suavemente a pelota celular na quantidade apropriada de gel de matriz (15 μL por poço para placas de 48 poços); pipeta para cima e para baixo suavemente para distribuir completamente as células em gel de matriz. Coloque 15 μL de mistura matriz gel/célula no centro de cada poço. Mantenha o tubo de microcentrifuagem no gelo em um tubo cônico de 50 mL durante o revestimento para evitar que o gel de matriz geleia. Continue a misturar mistura matriz gel/célula ao longo do revestimento, pipetando para cima e para baixo a cada três poços para garantir uma distribuição uniforme das células através dos poços.
- Coloque a placa na incubadora (37 °C, 5% DE CO2, ~95% de umidade) por 10 minutos para permitir gelagem de geleia de geleia matricial. Em seguida, adicione 300 μL de temperatura ambiente WENRAS + Y27632 mídia para cada poço e devolva a placa para a incubadora.
4. Manutenção organoide
NOTA: Os organoides são cultivados em mídia organoide convencional (WENR) que compreendem eGF recombinante e mídia 50% condicionada contendo Wnt3a, Noggin e R-spondin23. Medicamentos A8301 e SB202190 são adicionados nos primeiros 6 dias do período cultural para otimizar o crescimento (mídia WENRAS) (Figura 5), depoisremovidos para promover a diferenciação (mídia WENR)20. Y27632 é adicionado para os dois primeiros dias de cultura para promover a sobrevivência. As condições da mídia relativas ao cronograma da cultura são apresentadas na Figura 4.
- Dois dias após o revestimento, remova as mídias WENRAS + Y27632 de cada poço usando uma pipeta de 1 mL, garantindo nenhuma contaminação cruzada. Adicione 300 μL de mídia WENRAS na lateral do poço para não interromper o gel de matriz. Devolva a placa para a incubadora.
- Alterar a mídia a cada 2 dias, utilizando os meios de comunicação apropriados para a fase cultural(Figura 4). Mantenha os organoides até o dia 12, quando os organoides estiverem prontos para a colheita.
5. Processamento de RNA
- Colhendo organoides para RNA
- Coloque placa de 48 poços no gelo por 30 minutos para despolimerizar o gel de matriz.
- Usando uma pipeta de 1 mL, puxe a mídia organoide; então, à medida que a mídia é devolvida ao poço, use a ponta da pipeta para coçar e quebrar ainda mais o gel de matriz. Transfira o conteúdo para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL, agrupando o conteúdo de três poços em um tubo. Centrifugar os tubos por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
- Remover o máximo de supernanato de mídia possível sem remover quaisquer organoides; em seguida, gire os tubos novamente por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
- Remova a mídia restante e resuspenque os organoides em 350 μL tampão de lise + β-mercaptoetanol (βME) (10 μL βME por tampão de 1 mL de lise). Coloque as amostras no gelo para extração imediata de RNA ou armazene a -80 °C.
- Análise quantitativa de RT-PCR
- Meça a quantidade de RNA via espectotômetro. RNA de transcrição reversa usando um kit de síntese cDNA.
- Misture cDNA equivalente a RNA de 5 ng com primers pré-validados para frente e reverso de 200 nM(Tabela 1) e PCR Master Mix fluorescente. Execute a reação qRT-PCR para 40 ciclos a: 95 °C para 15 s, depois 60 °C para 60 s.
6. Imunohistoquímica
- Colhendo e consertando os organoides
- Coloque placa de 48 poços no gelo por 30 minutos para soltar o gel de matriz.
- Remova a mídia organoide e adicione 400 μL de PBS gelado a cada poço. Em seguida, remova o PBS e adicione 400 μL de solução de recuperação celular gelada a cada poço. Arrase suavemente a 4 °C por 30 min.
- Cubra uma ponta de tubulação de 1 mL com 1% de BSA na PBS, e gentilmente in pipet conteúdo do poço para cima e para baixo para quebrar o gel de matriz. Transfira os organoides para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL colocado no gelo.
- Enxágüe cada poço com 300 μL PBS + 1% BSA e transfira quaisquer organoides restantes para os tubos correspondentes. Remova a solução de recuperação celular/PBS + BSA de cada tubo. Adicione 400 μL de PBS gelado e repita com outra lavagem pbs gelada.
- Remova o PBS e corrija organoides com 300 μL de 4% pfa gelado (em 0,1 M PB) por 20 minutos, incubando à temperatura ambiente. Remova pfa e enxágue organoides com PBS gelado de 400 μL.
- Remover PBS; em seguida, adicione 400 μL PBS + 1% BSA. Armazenar a 4 °C.
- Coloração de imunofluorescência
- Enxágüe organoides em 500 μL PBS + 1% BSA. Em seguida, incubar organoides na solução de bloqueio (5% soro normal de cabra ou burro, 1% de albumina de soro bovino, 0,3% Triton X 100 em 1x PBS pH 7.3) por 2 h, balançando suavemente à temperatura ambiente.
- Adicione a solução de anticorpos primário (anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio) e arrase suavemente por 3 noites a 4 °C.
- Lave organoides 4x por 1h com 500 μL PBS + 0,2% Triton, balançando suavemente à temperatura ambiente. Adicione solução secundária de anticorpos (anticorpos secundários diluídos em solução de bloqueio) e organoides rochosos durante a noite, protegidos da luz, a 4 °C.
- Lave organoides 3x por 1h com 500 μL PBS + 0,2% Triton, protegidos da luz e balançando suavemente à temperatura ambiente. Incubar com DAPI diluído 1:10.000 em 0,1 M PB por 20 min, balançando e coberto à temperatura ambiente.
- Lave os organoides 3x por 20 min com 0,1 M PB, balançando suavemente e cobertos à temperatura ambiente.
- Montagem de organoides para microscopia confocal invertida.
NOTA: As imagens passo a passo do processo de montagem do slide são mostradas na Figura 7.- Crie um perímetro quadrado de 22 x 22 mm de espessura de ~1 mm de argila de modelagem não tóxica em um slide de microscópio.
- Remova 0,1 M PB do tubo de microcentrifuus e resuspende suavemente em 100 μL meio de montagem de escolha; então, transfira para o centro da praça de argila.
- Encha o quadrado de argila até que o meio de montagem esteja quase no topo. Em seguida, coloque as coberturas quadradas de 22 x 22 mm sobre a argila e pressione firmemente para baixo nas laterais da tampa para selar. Deixe curar de acordo com as instruções do fabricante (aqui, temperatura ambiente por 1-2 dias) e armazenar a 4 °C.
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Representative Results
Os camundongos possuem um CVP, localizado posteriormente na língua, a partir do qual as células-tronco LGR5+ podem ser isoladas(Figura 1A, caixa preta). A injeção de uma solução enzimápica dentro e ao redor do CVP (Figura 1B) resulta em um leve inchaço do epitélio e digestão do tecido conjuntivo. A digestão suficiente é alcançada após uma incubação de 33 min, o que permite a fácil separação do epitélio CVP do tecido subjacente. Ao tentar descascar o epitélio CVP, os cortes devem ser feitos a uma distância suficiente do CVP para garantir que as trincheiras não sejam interrompidas ou danificadas(Figura 1C). Isso também permite que se segure o epitélio usando fórceps sem danificar o CVP. Aparar o epitélio ao redor do CVP remove células não-alvo e aumenta a eficiência das etapas seguintes, diminuindo a massa tecidual que está sendo manipulada(Figura 1D). É importante verificar se as duas trincheiras (Figura 1C, setas pretas) estão presentes antes de adicionar epitélio CVP ao tubo de microcentrífuga; o peeling bem sucedido do CVP inclui parte das glândulas e dutos do Von Ebner(Figura 1D,setas pretas). Se o epitélio descascado não contiver essas duas estruturas opacas, o epitélio da trincheira é provavelmente rompido devido à digestão incompleta do tecido conjuntivo.
Para estabelecer as configurações facs adequadas para coletar células LGR5-EGFP, as células de CVPs dissociadas são separadamente obtidas do tipo selvagem e dos camundongos Lgr5-EGFP. As células CVP do tipo selvagem são analisadas primeiro para estabelecer parâmetros de gating, processo em que populações de células são categorizadas dentro da saída de dispersão por características de interesse24. Aqui, quatro parâmetros foram usados para identificar células para chapeamento. O primeiro parâmetro, dispersão para a frente, filtra partículas e detritos com base na área da superfície detectada. Este parâmetro remove ~70% de todos os eventos detectados durante o tipo(Figura 3). O parâmetro de largura filtra ainda mais os eventos com base no tamanho para garantir a seleção de células únicas (singlets). Aproximadamente 90% dos eventos são singlets(Figura 3). O marcador nuclear DAPI é tomado por células mortas, mas não vivas e, portanto, permite que células mortas sejam classificadas25. Este protocolo otimiza a viabilidade celular, já que mais de 90% dos eventos são células vivas(Figura 3). Por fim, os parâmetros de gating GFP são definidos acima do nível de autofluorescência das células do tipo selvagem. As células do tipo selvagem não são coletadas; eles são usados apenas como um controle de gating para fluorescência GFP. Com parâmetros de gating determinados a partir da amostra do tipo selvagem, as células da amostra Lgr5-EGFP são então executadas através do citômetro de fluxo a ser classificado para coleta. Os portões podem ser ajustados no início do tipo Lgr5-EGFP para acomodar um agrupamento claro de certas populações celulares, mas não devem ser significativamente alterados no meio do tipo. Verificou-se que a dissociação de três CVPs Lgr5-EGFP agrupados rende ~500.000 células, incluindo uma média de 10.000 células GFP+ .
As condições adequadas da mídia e da cultura são vitais para o crescimento ideal e diferenciação dos organoides. Estudos anteriores utilizando organoides linguais modelaram seus componentes de mídia após os do campo organoide intestinal, incluindo Wnt3a, EGF, Noggin e R-spondin17,18,19,20,21,22. No entanto, quando organoides linguais são cultivados usando um método semelhante (mídia WENR), os organoides não crescem eficientemente(Figura 5A). Nos organoides intestinais humanos, as drogas A8301 (inibidora de sinalização TGFß) e SB202190 (inibidor de sinalização p38 MAPKinase) são usadas para promover o crescimento organoide26. De fato, a adição desses inibidores (mídia WENRAS) induz o crescimento robusto de organoides linguais(Figura 5A). Curiosamente, remover esses inibidores da mídia após 6 dias resulta em maior expressão do marcador TRC geral Kcnq1,sugerindo que A8301 e SB202190 dificultam a diferenciação de células de paladar(Figura 5B). Assim, o crescimento e a diferenciação ideais são obtidos por organoides em mídia WENRAS dos dias 0-6 e mídia WENR dos dias 6-12(Figura 4, Figura 5), respectivamente.
A composição do tipo de célula organoide pode ser caracterizada por qRT-PCR ou imunohistoquímica. Os organoides maduros contêm ambas as células de sabor, marcadas por Kcnq1 e KRT8, e células epiteliais sem gosto, marcadas por Krt13/KRT13 (Figura 6,8A). Isso sugere que as células LGR5+ isoladas têm uma potência in vitro semelhante à in vivo, uma vez que, na língua adulta, as células Lgr5-GFP+ produzem linhagens de sabor e não-sabor5. Além disso, krt13 é expresso em níveis mais altos do que todos os 3 marcadores TRC(Figura 6),sugerindo que os organoides são predominantemente compostos de células epiteliais não-saborosas. De fato, a quantificação relativa da expressão genética27 indica que Krt13 é expresso 50x maior que o marcador geral TRC Kcnq1 (teste tdo aluno, p = 0,0004). Isso é esperado, pois a língua tem uma proporção semelhante de sabor versus epitélio não-gosto1. Os organoides expressam todos os três tipos de TRC(Figura 6, 8B,C). As células tipo I (marcadas por Entpd2) e as amargas células tipo II (marcadas por Gnat3) são altamente expressas em organoides de sabor, enquanto as células de sensoriamento azedo tipo III (marcadas por Car4) são menos comuns(Figura 6). Os TRCs são distribuídos aleatoriamente em organoides(Figura 8)em vez de em estruturas discretas de paladar observadas in vivo.
Figura 1: Língua dissecada e epitélio CVP descascado. (A) A língua é dissecada para fora, e a língua anterior é removida cortando apenas antes da eminência intermolar (linha tracejada), deixando a língua posterior, que inclui o CVP (caixa preta) (B) Uma agulha é inserida apenas anterior à eminência intermolar (seta preta), e a mistura de enzimas é injetada abaixo e nas bordas laterais do CVP (caixa preta). (C) Epitélio descascado não aparado em torno das trincheiras CVP (setas pretas) e (D) epitélio DCP descascado. As glândulas e dutos de Von Ebner(D, flechas pretas) são visíveis após o sucesso da descascação das trincheiras. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho de geração organoide lingual. A língua é removida dos camundongos Lgr5-EGFP. A epitélio da trincheira CVP (caixa vermelha) é descascada do tecido conjuntivo subjacente e dissociada em células únicas. As células GFP+ são isoladas e banhadas em gel de matriz a uma densidade de 200 células por poço em uma placa de 48 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gating para classificação celular ativada por fluorescência. (A) O controle (células CVP do tipo selvagem) executa determina os portões FACS que eliminam detritos e células quebradas através de dispersão para a frente, identifica singlets através da largura de dispersão lateral, separa DAPIneg ao vivo de DAPI+ células mortas e estabelece o nível de autofluorescência de células do tipo selvagem. (B) Os portões previamente determinados são aplicados à execução experimental (células LGr5EGFP-IRES-CreERT2 CVP) para isolar células LGR5-EGFP+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Linha do tempo da cultura organoide lingual e mídia requerida. O inibidor de ROCK Y27632 é adicionado à mídia para as primeiras 48 horas de cultura para promover a sobrevivência celular. Durante a fase de proliferação, os organoides são alimentados com meio condicionado contendo A8301 e SB202190 (WENRAS) para otimizar o crescimento. Essas drogas são retidas da mídia (WENR) a partir do dia 6 para promover a diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Drogas A8301 e SB202190 afetam o crescimento organoide e a diferenciação. (A) Imagens brightfield de organoides cultivados em mídia WENR (dia 0-12), mídia WENRAS (dia 0-12), ou WENRAS (dia 0-6), depois WENR (dia 6-12). As imagens foram capturadas no dia 2, dia 6, e dia 12 de cultura usando software de imagem ao vivo. Barra de escala: 400 μm (B) A expressão genética relativa de um marcador TRC global Kcnq1 é significativamente reduzida quando as drogas A8301 e SB202190 estão presentes durante a diferenciação organoide. Cada ponto representa uma réplica biológica, que incluiu três poços agrupados. A mudança média na expressão genética relativa (linha horizontal) foi calculada pela média de três réplicas biológicas. Barras de erro: ±SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Organoides linguais expressam marcadores celulares de gosto canônico. Mudança no valor do limiar de ciclo (Ct) do marcador TRC global Kcnq1, cytokeratin de marcador epitelial de não gosto 13(Krt13),marcador do tipo I TRC Entpd2,tipo II amargo marcador TRC Gnat3, e tipo III sour TRC marcador Car4, em comparação com o gene de limpeza Rpl19. Cada ponto representa uma réplica biológica, que incluiu três poços agrupados de uma placa de 48 poços. A alteração média do valor da TC (linha horizontal) para cada marcador foi calculada pela média de três réplicas biológicas. Teste t-testdo aluno não remunerado, *p < 0,05. Barras de erro: ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Montagem de organoides linguais para microscopia confocal invertida. (A) Uma sequência de ~1 mm de espessura de argila de modelagem não tóxica é criada. (B) A argila é esculpida como um quadrado de ~20 mm x 20 mm no centro de um deslizamento de microscópio de 24 mm x 75 mm. (C) A 22 mm x 22 mm de cobertura quadrada sela organoides suspensos em meio de montagem. Barra de escala: 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Imunolabelamento de organoides linguais intactos. Imagens confocal de organoides fixos e imunossuados. (A) Seção óptica de um organoide manchado para marcador epitelial não-gosto KRT13 (verde) e marcador TRC geral KRT8 (magenta). (B) Projeção máxima de uma pilha z confocal de um organoide manchado para o marcador celular tipo I NTPDase2 (verde) e KRT8 (magenta). (C) Projeção máxima de uma pilha z confocal de dois organoides parcialmente mostrados (contornos de traço branco) e um organoide completo manchado para o marcador celular de detecção de tamanho III CAR4 (verde), e amargo detectando o marcador celular tipo II GUSTDUCIN (magenta). Barra de escala: 100 μm para A, B e C. Marcador nuclear DAPI (azul, coluna direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome de Gene | Primer para a frente (5'-3') | Primer reverso (5'-3') | Número de avaliação | ||||||
| Carro4 | CTGCTAGGACAAAGGTGAACC | CTCCACTGTGTGTTGATTGTTCTCT | NM_007607.2 | ||||||
| Entpd2 | GACAAGGAAAATGACAGGTATCGTGG | GTTCAAGACATTCAACCAGACTC | NM_009849.2 | ||||||
| Gnat3 | ATCCAGGAATCCAAGCCTGC | TGGTTTTCACCCGGGAATGT | NM_001081143.1 | ||||||
| Kcnq1 | TTTGTTCATCCCCATCTCAG | GTTGCTGGGTAGGAAGAG | NM_008434.2 | ||||||
| Krt13 | TCATCGGTTTGTCACTGGA | TGATCTTCTCGTTGCCAGAGAG | NM_010662.2 | ||||||
| Rpl19 | GGTCTGGTTGGATCCCAATG | CCCGGGAATGGACAGTCA | NM_009078.2 | ||||||
Tabela 1: Sequências de primer utilizadas para RT-PCR quantitativo.
Tabela Suplementar 1: Comparação dos componentes de mídia de cultura organoide publicados. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Relatado aqui é um método eficiente e facilmente repetitivo para a cultura, manutenção e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de gosto de camundongos adultos. Verificou-se que o uso de três CVPs de camundongos Lgr5 de 8 a 20 semanas de idade-EGFP é suficiente para obter ~10.000 células GFP+ para uso experimental, resultando em 50 poços banhados a uma densidade de 200 células por poço em placas de 48 poços. A remoção da epitélio da trincheira CVP é otimizada injetando o epitélio lingual com dispase II recém-feita e solução de colagenase tipo-I, seguida por uma incubação de 33 min. No entanto, um tempo de incubação mais curto, alíquotas de enzimas antigas, lotes diferentes ou o uso de enzimas de diferentes fabricantes podem resultar em remoção incompleta da trincheira. Por outro lado, um tempo de incubação mais longo causa a super digestão do tecido, resultando na perda da integridade do tecido do paladar. Após o peeling, foi feito um enriquecimento adicional para trincheiras cvp, cortando o epitélio em torno do CVP.
É fundamental que todos os tubos de microcentrifuuagem utilizados durante o processo de dissociação e coleta sejam revestidos com FBS para evitar que tecidos e células grudem nas paredes plásticas dos tubos, o que reduz significativamente a recuperação de células isoladas (dados não mostrados). O uso de uma camada leve de FBS e a remoção do excesso de líquido dos tubos antes do uso minimiza possíveis efeitos inibitórios na Trypsin ou outras enzimas.
Organoides linguais foram cultivados com sucesso a partir de tecido CVP dissociado sem classificação prévia de LGR5+ células17. Embora este método resulte na formação de organoides, descobrimos que uma proporção menor desses organoides contêm células de paladar em comparação com aquelas cultivadas a partir de progenitores isolados (dados não apresentados). A classificação de fluxo para células Lgr5-EGFP+ enriquece para progenitores competentes para o sabor, resultando em uma maior proporção de organoides repletos de sabor. Atualmente, coletamos todas as células acima do limiar da autofluorescência GFP (Figura 3); no entanto, é possível que os níveis de brilho GFP estejam associados à formação organoide variável de eficiência ou competência de sabor. Essa hipótese ainda não foi testada, mas é um caminho promissor para o trabalho futuro, pois poderia permitir um enriquecimento adicional de organoides contendo células de paladar.
É sabido que a densidade de revestimento afeta a eficiência da diferenciação organoide, e recomendamos que a densidade ideal de revestimento seja determinada antes da experimentação28. O tamanho e a profundidade dos poços, bem como o volume do gel de matriz, devem ser considerados ao estabelecer densidade de revestimento. Com base em nosso trabalho preliminar (dados não mostrados), descobrimos que em uma placa de 48 poços, 15 μL de gel de matriz e uma densidade de revestimento de 200 células por poço permite expansão organoide eficiente e diferenciação de todos os três tipos de TRC. Descobrimos que organoides linguais podem ser cultivados com sucesso e reprodutivelmente no Extrato de Membrana de Porão do Fator de Crescimento Reduzido (RGF BME), uma alternativa de gel de matriz sintética e menos cara. Outras matrizes alternativas também podem apoiar a cultura organoide lingual, mas novos testes são necessários para investigar essa possibilidade.
Durante o revestimento, as células coletadas devem ser cuidadosamente, mas suavemente resuspendidas em gel de matriz, frequentemente tubos para cima e para baixo para manter a suspensão da célula homogênea. O tubo contendo a mistura de gel de matriz celular também deve ser mantido no gelo durante todo o processo de revestimento para evitar que o gel de matriz geleia nas laterais do tubo. Essas medidas garantem uma distribuição uniforme das células através de poços, produzindo resultados mais reprodutíveis quando células de revestimento manual. Notavelmente, os recentes desenvolvimentos em tecnologias microfluidic fornecem opções de alto rendimento para a dispensação de células e é uma ferramenta promissora para o trabalho futuro29.
Para avaliar a expressão genética em organoides cultos, verificou-se que era necessário reunir pelo menos três poços para cada réplica biológica para obter RNA suficiente e consistência entre as réplicas(Figura 6). Também foi determinado que a lise imediata dos organoides colhidos de acordo com as instruções específicas do fabricante otimiza a qualidade e a quantidade de RNA extraído. Embora não seja testado aqui, outras opções de armazenamento, como congelamento de flash ou ressuspensão em reagentes de armazenamento, também podem preservar o rendimento e a qualidade do RNA.
A realização de imunohistoquímica em organoides pode ser desafiadora, pois os anticorpos primários e secundários devem penetrar em qualquer gel de matriz residual e em todo o epitélio organoide. Em relatórios anteriores, os organoides foram corrigidos enquanto ainda estavam suspensos em gel matricial, o que posteriormente exigiu concentrações extremamente altas de solução de anticorpos primários para revelar expressão proteica17,18. Semelhante a outros relatórios, a remoção de organoides do gel de matriz usando a Solução de Recuperação Celular antes da fixação foi encontrada para aumentar a eficiência da coloração sem a necessidade de uma alta concentração de anticorpos30,31; no entanto, a detecção de alguns marcadores de células de sabor, por exemplo, CAR4, requer uma maior concentração de anticorpos. Além disso, a incubação de organoides em antisera primária por 3 noites aumenta a probabilidade de ligação de anticorpos. No entanto, este método também pode aumentar a fluorescência de fundo se os organoides forem insuficientemente lavados após a imunossaturação. É importante ressaltar que a solução de anticorpos primários diluídas pode ser salva e reutilizada com sucesso uma ou mais vezes se armazenada por menos de uma semana (dados não mostrados). Para uma imagem ideal, os organoides são montados colocando um deslizamento de cobertura em cima de um perímetro de argila de argila modeladora para preservar sua estrutura 3D. Colocar o vidro da tampa diretamente no slide comprime e quebra organoides, impedindo a análise adequada.
A cultura organoide é uma técnica altamente aplicável e econômica. Algumas aplicações incluem, mas não se limitam a, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos e o estudo de células-tronco e biologia do desenvolvimento32. Portanto, é fundamental padronizar modelos organoides para permitir a reprodutibilidade entre laboratórios. No futuro, seria útil desenvolver um método padronizado para a passagem de organoides linguais que garanta que a potência das células-tronco do sabor possa ser propagada sobre passagens seriais, reduzindo assim a necessidade de animais adicionais para gerar mais organoides. É importante ressaltar que, embora os organoides linguais sejam compostos tanto de células epiteliais de sabor quanto de não saborosos, a organização dessas células difere em comparação com o sistema de sabor in vivo. As discrepâncias entre organoides e epitélio de sabor in vivo podem ser decorrentes da mídia utilizada para a cultura organoide e/ou porque os organoides não têm interação com o microambiente da papila gustativa, incluindo sinais importantes dos nervos gustativos e da propria lamina que são necessárias para a formação e manutenção do paladar22,33,34,35. Trabalhos futuros para incorporar nervos ou vasculatura na cultura organoide lingual, estratégia atualmente adotada em outros sistemas organoides, poderiam permitir uma modelagem mais precisa do epitélio de sabor in vivo 36,37.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Dempsey e Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) por fornecer mídia condicionada wnr e discussões valiosas. Agradecemos também à University of Colorado Cancer Center Cell Technologies and Flow Cytometry Shared Resources, especialmente Dmitry Baturin, pela experiência em triagem celular. Este trabalho foi financiado por: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 e NIH/NCI R21 CA236480 para LAB, e R21DC016131 e R21DC016131-02S1 para DG, e F32 DC015958 para EJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG | Molecular Probes | A11056, RRID: AB_142628 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A11010, RRID:AB_2534077 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG | Invitrogen | A11075, RRID:AB_2534119 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG | Molecular Probes | A31573, RRID:AB_2536183 | 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG | Molecular Probes | A21247, RRID:AB_141778 | 1:2000 |
| DAPI (for FACS) | Thermo Fischer | 62247 | |
| DAPI (for immunohistochemistry) | Invitrogen | D3571, RRID:AB_2307445 | 1:10000 |
| Goat anti-CAR4 | R&D Systems | AF2414, RRID:AB_2070332 | 1:50 |
| Guinea pig anti-KRT13 | Acris Antibodies | BP5076, RRID:AB_979608 | 1:250 |
| Rabbit anti-GUSTDUCIN | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-395, RRID:AB_673678 | 1:250 |
| Rabbit anti-NTPDASE2 | CHUQ | mN2-36LI6, RRID:AB_2800455 | 1:300 |
| Rat anti-KRT8 | DSHB | TROMA-IS, RRID: AB_531826 | 1:100 |
| Equipment | |||
| 2D rocker | Benchmark Scientific Inc. | BR2000 | |
| 3D Rotator | Lab-Line Instruments | 4630 | |
| Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | S407992 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| CO2 tank | Airgas | CD USP50 | |
| FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4110 | 184 L, Polished Stainless Steel |
| Incucyte | Sartorius | Model: S3 | Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| MoFlo XDP100 | Cytomation Inc | Model: S13211997 | Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | Excella E1 | |
| Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 580BR | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Water bath | Precision | 51220073 | |
| Media | |||
| A83 01 | Sigma | SML0788-5MG | Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Stock concentration 50X, final concentration 1X |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Stock concentration 1000X, final concentration 1X |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Murine EGF | Peprotech | 315-09-1MG | Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100g | Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | Stock concentration 100X, final concentration 1X |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | Stock concentration 500X, final concentration 1X |
| SB202190 | R&D Systems | 1264 | Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM |
| WRN Conditioned media | Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells | ||
| Y27632 dihydochloride 10ug | APExBIO | A3008-10 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Other | |||
| 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| 2-Mercaptoethanol, min. 98% | Sigma | M3148-25ML | β-mercaptoethanol |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1420-2700 | |
| 48-well plates | Thermo Scientific | 150687 | |
| 5 3/4 inch Pasteur Pipets | Fisherbrand | 12-678-8A | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Life Science | A9647-100G | |
| Buffer RLT Lysis buffer | QIAGEN | 1015750 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, type I | Sigma Life Science | C0130-1G | |
| Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3533-005-02 | Matrigel |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Sigma-Aldrich (Roche) | 4942078001 | |
| Disposable Filters | Sysmex | 04-0042-2316 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free) | Gibco | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+ | Sigma Life Sciences | D8662-500ML | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| Elastase Lyophilized | Worthington Biochemical | LS002292 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| HEPES Solution | Sigma Life Science | H3537-100ML | |
| HyClone Tryspin 0.25% + EDTA | Thermo Scientific | 25200-056 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1706691 | |
| Modeling Clay, Gray | Sargent Art | 22-4084 | |
| Needle | BD Syringe | 305106 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerSYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| RNeasy Micro Kit | QIAGEN | 74004 | |
| Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher Chemical | 7558-79-4 | |
| Sodium Phosphate monobasic anhydrous | Fisher Bioreagents | 7558-80-7 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Triton X-100 | Sigma Life Science | T8787-100ML | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366067 | 22x22mm |
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