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Cancer Research

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं की गतिशील इमेजिंग [18F] टेट्राफ्लोरोबोरेट पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी /

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

यह प्रोटोकॉल गैर-आक्रामक रूप से ट्रैकिंग टी कोशिकाओं के लिए पद्धति का वर्णन करता है जो नैदानिक रूप से उपलब्ध मंच के साथ विवो में चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर हैं।

Abstract

आनुवंशिक रूप से चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर टी कोशिकाओं ने बी सेल दुर्दमताओं या मल्टीपल मायलोमा (एमएम) वाले रोगियों के लिए निर्णायक नैदानिक परीक्षणों में अभूतपूर्व परिणाम दिखाए हैं। हालांकि, कई बाधाएं प्रभावकारिता को सीमित करती हैं और खराब तस्करी और ट्यूमर साइटों में घुसपैठ के साथ-साथ विवो में दृढ़ता की कमी के कारण सीएआर टी सेल थेरेपी के व्यापक उपयोग को प्रतिबंधित करती हैं। इसके अलावा, जीवन-धमकी देने वाली विषाक्तताएं, जैसे कि साइटोकाइन रिलीज सिंड्रोम या न्यूरोटॉक्सिसिटी, प्रमुख चिंताएं हैं। कुशल और संवेदनशील इमेजिंग और CAR T कोशिकाओं की ट्रैकिंग टी सेल तस्करी, विस्तार, और विवो लक्षण वर्णन में के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है और CAR T सेल थेरेपी की वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए रणनीतियों के विकास की अनुमति देता है। यह पेपर कार टी कोशिकाओं में सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर (एनआईएस) को शामिल करने और प्रीक्लिनिकल मॉडल में [18 एफ] टेट्राफ्लोरोबोरेट-पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी ([18 एफ] टीएफबी-पीईटी) का उपयोग करके सीएआर टी सेल इमेजिंग के लिए पद्धति का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों को इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले लोगों के अलावा अन्य सीएआर निर्माणों और लक्षित जीनों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआर टी) सेल थेरेपी हेमेटोलॉजिकल दुर्दमताओं में एक तेजी से उभरता हुआ और संभावित रूप से उपचारात्मक दृष्टिकोण है1,2,3,4,5,6। CD19-निर्देशित CAR T (CART19) या B सेल परिपक्वता एंटीजन (BCMA) CAR T सेल थेरेपी 2 के बाद असाधारण नैदानिक परिणामों की सूचना दी गई थी। इसने यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) को आक्रामक बी-सेल लिंफोमा (एक्सीकैबटेन सिलोल्यूसेल (एक्सी-सेल)4, टिसाजेनलेक्ल्यूसेल (टीसा-सेल)3, और लिसोकाबैटेजेन मैरालूसेल)7, तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (तीसा-सेल)5,8, मेंटल सेल लिंफोमा (ब्रेक्सुकाबैटेजेन ऑटोल्यूस)9, और कूपिक लिंफोमा (एक्सी-सेल) 10, और कूपिक लिंफोमा (एक्सी-सेल) 10 के लिए CART19 कोशिकाओं के अनुमोदन का नेतृत्व किया। . हाल ही में, एफडीए ने कई मायलोमा (एमएम) (आइडेकाबटेजेन विक्ल्यूसेल) वाले रोगियों में बीसीएमए-निर्देशित सीएआर टी सेल थेरेपी को मंजूरी दी। इसके अलावा, क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) के लिए सीएआर टी सेल थेरेपी देर से चरण के नैदानिक विकास में है और अगले तीन वर्षों के भीतर एफडीए अनुमोदन प्राप्त करने की उम्मीद है।

CAR T सेल थेरेपी के अभूतपूर्व परिणामों के बावजूद, इसका व्यापक उपयोग 1) विवो CAR T सेल विस्तार में अपर्याप्त या ट्यूमर साइटों के लिए खराब तस्करी द्वारा सीमित है, जो टिकाऊ प्रतिक्रिया की कम दर की ओर जाता है12,13 और 2) साइटोकाइन रिलीज सिंड्रोम (CRS) 14,15 सहित जीवन-धमकी वाली प्रतिकूल घटनाओं का विकास . सीआरएस की पहचान में न केवल प्रतिरक्षा सक्रियण शामिल है जिसके परिणामस्वरूप भड़काऊ साइटोकिन्स / केमोकाइन्स का ऊंचा स्तर होता है, बल्कि सीएआर टी सेल इन्फ्यूजन 15,16 के बाद बड़े पैमाने पर टी सेल प्रसार भी शामिल होता है। इस प्रकार, विवो में सीएआर टी कोशिकाओं की छवि के लिए एक मान्य, नैदानिक-ग्रेड रणनीति का विकास 1) विवो में वास्तविक समय में सीएआर टी सेल ट्रैकिंग को ट्यूमर साइटों पर उनकी तस्करी की निगरानी करने और प्रतिरोध के संभावित तंत्र को उजागर करने की अनुमति देगा, और 2) सीएआर टी सेल विस्तार की निगरानी और संभावित रूप से सीआरएस के विकास जैसे उनके विषाक्तताओं की भविष्यवाणी करना।

हल्के सीआरएस की नैदानिक विशेषताएं उच्च बुखार, थकान, सिरदर्द, दाने, दस्त, आर्थ्राल्जिया, मायल्जिया और अस्वस्थता हैं। अधिक गंभीर सीआरएस में, रोगियों को टैचीकार्डिया / हाइपोटेंशन, केशिका रिसाव, हृदय रोग, गुर्दे / यकृत विफलता, और प्रसारित इंट्रावैस्कुलर जमावट 17,18 विकसित हो सकते हैं। सामान्य तौर पर, इंटरफेरॉन-गामा, ग्रैनुलोसाइट्स-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक, इंटरल्यूकिन (आईएल) -10, और आईएल -6 सहित साइटोकिन्स की ऊंचाई की डिग्री को नैदानिक लक्षणों की गंभीरता के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है17,19। हालांकि, सीआरएस की भविष्यवाणी करने के लिए "वास्तविक समय" सीरम साइटोकाइन निगरानी का व्यापक अनुप्रयोग उच्च लागत और सीमित उपलब्धता के कारण मुश्किल है। CAR T सेल थेरेपी की लाभकारी विशेषताओं का फायदा उठाने के लिए, दत्तक टी कोशिकाओं की गैर-इनवेसिव इमेजिंग का उपयोग संभावित रूप से CAR T सेल जलसेक के बाद प्रभावकारिता, विषाक्तता और पुनरावृत्ति की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।

कई शोधकर्ताओं ने पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) या एकल-फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT) के साथ रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित इमेजिंग का उपयोग करने के लिए रणनीतियां विकसित की हैं, जो उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 विवो विज़ुअलाइज़ेशन और CAR T सेल तस्करी की निगरानी में. उन रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित इमेजिंग रणनीतियों में, सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर (एनआईएस) को पीईटी स्कैन 31,32 का उपयोग करके छवि कोशिकाओं और वायरस के लिए एक संवेदनशील रूपरेखा के रूप में विकसित किया गया है। [18F] TFB-PET के साथ NIS + CAR T सेल इमेजिंग CAR T सेल विस्तार, तस्करी और विषाक्तता 30 का आकलन और निदान करने के लिए एक संवेदनशील, कुशल और सुविधाजनक तकनीक है। यह प्रोटोकॉल 1) उच्च प्रभावकारिता के साथ दोहरे ट्रांसडक्शन के माध्यम से NIS + CAR T कोशिकाओं का विकास और 2) [18F] TFB-PET स्कैन के साथ NIS + CAR T कोशिकाओं को इमेजिंग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है। MM के लिए BCMA-CAR T कोशिकाओं का उपयोग CAR T सेल इमेजिंग के लिए एक रिपोर्टर के रूप में NIS का वर्णन करने के लिए एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट मॉडल के रूप में किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों को किसी भी अन्य सीएआर टी सेल थेरेपी पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक के संस्थागत समीक्षा बोर्ड, संस्थागत जैव सुरक्षा समिति और मेयो क्लिनिक की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. एनआईएस + BCMA-कार टी सेल उत्पादन

नोट: यह प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (IRB 17-008762) और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (IBC Bios00000006.04) के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

  1. BCMA-CAR, NIS, और लूसिफेरस-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उत्पादन- lentiviruses एन्कोडिंग।
    नोट: एक दूसरी पीढ़ी BCMA-CAR निर्माण को संश्लेषित किया गया था डे नोवो (सामग्री की तालिका देखें) और एक दीर्घीकरण कारक -1 अल्फा (EF-1α) प्रोमोटर के नियंत्रण में एक तीसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल वेक्टर में क्लोन किया गया था। BCMA-CAR निर्माण (C11D5.3-41BBz) में 4-1BB costimulation और एक एकल-श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) शामिल था जो एक मानव-विरोधी BCMA एंटीबॉडी क्लोन C11D5.333,34 से व्युत्पन्न था। एनआईएस EF-1α प्रोमोटर के नियंत्रण में है और स्व-क्लीविंग पेप्टाइड्स (P2A) के माध्यम से प्यूरोमाइसिन प्रतिरोध जीन को बांधता है। ल्यूसिफेरस-जीएफपी एन्कोडिंग लैंटिवरल वेक्टर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जाता है, जो तब जीएफपी और लूसिफेरस को व्यक्त करते हैं।
    1. लेंटिवायरल वेक्टर प्लास्मिड तैयार करें: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg), और pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg)।
      नोट: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro और pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro में puromycin प्रतिरोध जीन होता है। इसलिए, एनआईएस- या लूसिफेरस-जीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को 1 μg / mL या प्यूरोमाइसिन डाइहाइड्रोक्लोराइड के 2 μg / mL के साथ चुना जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णित है14,35।
    2. बीज 20 × एक T175 फ्लास्क में 293T कोशिकाओं के 106 और 5% CO2 के साथ 37 °C पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पुष्टि करें कि 293T कोशिकाओं को माइक्रोस्कोप के नीचे प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा 70-90% संगम पर फ्लास्क पर समान रूप से वितरित किया जाता है।
    3. अभिव्यक्ति वेक्टर के 15 μg का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें (उदाहरण के लिए, CAR, NIS, या लूसिफेरस-GFP रैखिक डीएनए), लिफाफा वेक्टर (VSV-G) के 7 μg, और पैकेजिंग वेक्टर के 18 μg (gag, pol, rev, और tat)। अभिकर्मक माध्यम के 4.5 मिलीलीटर में डीएनए मास्टर मिश्रण को पतला करें, और फिर पूर्व-जटिल अभिकर्मक (मिश्रण ए) के 111 μL जोड़ें।
    4. एक नई ट्यूब तैयार करें, और अभिकर्मक माध्यम (मिश्रण बी) के 4.5 मिलीलीटर में लिपोसोमल अभिकर्मक अभिकर्मक के 129 μL को पतला करें।
    5. मिश्रण ए और बी को संयोजित करें और सामग्री को मिलाने के लिए ट्यूब को फ्लिक करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. इनक्यूबेशन के बाद, बस कोशिकाओं को अलग किए बिना सेल supernatant aspirate और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन-streptomycin-glutamine युक्त एक विकास माध्यम के 16 mL जोड़ें। फिर, 293T कोशिकाओं पर मिश्रण A और B के मिश्रण को ड्रॉपवाइज जोड़ें। अंत में, 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2।
    7. दिन 1 और 2 पोस्ट-ट्रांसफैक्शन पर, 293T के supernatant को काटें, 10 मिनट के लिए 900 × ग्राम पर नीचे स्पिन करें, और 0.45 μm नायलॉन फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। 24 और 48 घंटे पर फिल्टर को 112,700 × ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 2 घंटे के लिए केंद्रित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  2. पूर्व विवो टी सेल अलगाव (चित्रा 1)
    नोट: एसेप्टिक तकनीक और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके एक लैमिनर प्रवाह कैबिनेट में सभी सेल संस्कृति कार्य करें। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) को स्वस्थ स्वयंसेवक दाता रक्त से काटा जाता है जो एफेरेसिस 36 के दौरान एकत्र किया जाता है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली मानव कोशिकाओं पर रोगज़नक़ स्क्रीनिंग की गई थी।
    1. PBMCs को अलग करने के लिए मानक घनत्व ग्रेडिएंट तकनीक का उपयोग करें।
      1. धीरे घनत्व ढाल माध्यम (1.077 ग्राम / एमएल का घनत्व) के 15 मिलीलीटर जोड़ें (अल्फा-डी-ग्लूकोपाइरानोसाइड, बीटा-डी-फ्रुक्टोफ्यूरानोसिल होमोपॉलिमर युक्त, और, 3-(एसिटिलामिनो)-5-(एसिटाइलमाइलैमिनो)-2,4,6-ट्रायडोबेंजोइक एसिड मोनोसोडियम नमक) को 50 एमएल घनत्व ग्रेडिएंट पृथक्करण ट्यूब में हवा के बुलबुले बनाए बिना ( सामग्री की तालिका देखें)।
      2. सेल ट्रैपिंग से बचने के लिए, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस, पोटेशियम क्लोराइड के 0.2 ग्राम / एल, पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक के 0.2 ग्राम / एल, सोडियम क्लोराइड के 8 ग्राम / एल, और सोडियम फॉस्फेट डाइबेसिक के 1.15 ग्राम / एल) के साथ रक्त के नमूने को पतला करें जिसमें 1: 1 वॉल्यूम अनुपात में 2% एफबीएस होता है। धीरे से दोनों के बीच इंटरफ़ेस को तोड़ने के बिना घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर पतला रक्त हस्तांतरण। आरटी में 10 मिनट के लिए 1,200 × जी पर नीचे स्पिन करें।
        नोट: एक 50 mL घनत्व ग्रेडिएंट पृथक्करण ट्यूब का उपयोग रक्त के नमूने के 4-17 mL के अलगाव के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली 50 मिलीलीटर घनत्व ग्रेडिएंट पृथक्करण ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) को सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान "ब्रेक ऑफ" की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, जब मानक 50 एमएल ट्यूबों का उपयोग किया जाता है, तो ब्रेक को बंद करने की आवश्यकता होती है और 30 मिनट सेंट्रीफ्यूजेशन की आवश्यकता होती है।
      3. Supernatant को एक नई 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, 50 mL तक भरकर PBS + 2% FBS के साथ धोएं, और फिर RT पर 8 मिनट के लिए 300 × g पर नीचे स्पिन करें।
      4. supernatant aspirate, और PBS + 2% FBS के 50 mL में छर्रे कोशिकाओं resuspend. कोशिकाओं की संख्या की गणना करें, और फिर RT पर 8 मिनट के लिए 300 × g पर नीचे स्पिन करें। कुल 2 धोने के लिए पिछले चरण को दोहराएं।
    2. supernatant aspirate, और पीबीएस + 2% FBS के साथ 50 × 106 कोशिकाओं / mL की एकाग्रता के लिए छर्रेदार कोशिकाओं resuspend।
    3. एक नकारात्मक चयन चुंबकीय मनका किट का उपयोग कर PBMCs से टी सेल अलगाव प्रदर्शन.
      नोट: एक आदर्श नकारात्मक चयन किट में टी कोशिकाओं के अलावा अन्य कोशिकाओं पर व्यक्त एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी से जुड़े चुंबकीय मोती शामिल हैं। आमतौर पर उपयोग की जाने वाली किट में CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 और CD16 के खिलाफ चुंबकीय मोतियों के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी होते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
      1. एक 14 mL polystyrene गोल नीचे ट्यूब के लिए PBMCs स्थानांतरण. फिर, PBMCs और नकारात्मक चयन एंटीबॉडी कॉकटेल को पूरी तरह से स्वचालित सेल विभाजक में रखें, और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार टी सेल अलगाव करें।
  3. टी सेल उत्तेजना और टी सेल विस्तार (चित्रा 1)
    1. अलग-थलग टी कोशिकाओं को संस्कृति करने के लिए, सीरम-मुक्त हेमटोपोइएटिक सेल माध्यम के साथ बने टी सेल विस्तार माध्यम (टीसीएम) तैयार करें, जो 10% मानव सीरम एल्ब्यूमिन और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन 14 के साथ पूरक है। टी सेल अलगाव के बाद, टीसीएम के साथ 2 × 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं और संस्कृति की गणना करें।
    2. टी कोशिकाओं के साथ culturing से पहले टीसीएम के साथ तीन बार विरोधी CD3 / CD28 मोतियों धोएं।
      1. मोतियों वाली शीशी को घुमाकर मिलाएं। फिर, मोतियों की आवश्यक मात्रा (3: 1 मोती: सेल) (उदाहरण के लिए, टी कोशिकाओं की 1.0 × 106 कोशिकाओं को उत्तेजित करते समय, एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों के 3.0 × 106 का उपयोग करें) को एक बाँझ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब (1.5 मिलीलीटर) में और टीसीएम के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।
    3. 1 मिनट के लिए एक चुंबक पर मोतियों के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें, और supernatant aspirate। चुंबक से ट्यूब को हटा दें, और टीसीएम के 1 मिलीलीटर में धोए गए मोतियों को फिर से निलंबित करें। कुल 3 वॉश के लिए पिछले दो चरणों को दोहराएं।
    4. टीसीएम के 1 मिलीलीटर में मोतियों को फिर से निलंबित करें और उन्हें टी कोशिकाओं में स्थानांतरित करें। फिर, टी कोशिकाओं को टीसीएम के साथ 1.0 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। टी-सेल / मनका निलंबन को ऊतक-संस्कृति-उपचारित 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में रखें।
  4. लेंटिवायरस का अनुमापन (चित्र 2)
    1. अनुमापन परख के लिए टी कोशिकाओं को तैयार करें। सुनिश्चित करें कि लगभग 1.0 x 106 कोशिकाएं एक प्रकार के वायरस को टाइट करने के लिए उपलब्ध हैं।
    2. टी कोशिकाओं को उत्तेजित करें जैसा कि अनुभाग 1.3.2 में वर्णित है।
    3. प्लेट 1.0 × 96-वेल प्लेट (टिटर प्लेट) में उत्तेजित टी कोशिकाओं की 105 कोशिकाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 (चित्रा 2 ए)। अनुभाग 1.2 में वर्णित टी कोशिकाओं को अलग और उत्तेजित करें।
    4. नामित स्तंभों और अपरिवर्तित नियंत्रण कुओं (चित्रा 2B) के कुओं में TCM के 100 μL जोड़कर एक कमजोर पड़ने वाली प्लेट (96-अच्छी तरह से प्लेट) तैयार करें।
    5. बर्फ पर लेंटिवायरल कणों की एक शीशी को पिघलाएं और धीरे-धीरे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। 96-अच्छी तरह से प्लेट (कमजोर पड़ने 3) (चित्रा 2 बी) के कॉलम 6 के कुओं में वायरस supernatant के 50 μL स्थानांतरण। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे।
    6. सीरियल dilutions (2 गुना सीरियल कमजोर पड़ने) प्रदर्शन: अच्छी तरह से A6 से अच्छी तरह से B6 करने के लिए 50 μL हस्तांतरण और फिर अच्छी तरह से B6 से अच्छी तरह से C6 करने के लिए 50 μL; G6 तक दोहराएँ। फिर, टिटर प्लेट (चित्रा 2 बी) में पतला वायरस का 50 μL जोड़ें।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस पर टिटर प्लेट को इनक्यूबेट करें, 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 , और फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 2 सी) द्वारा कार-, एनआईएस-, या जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करें।
      1. 650 पर टिटर प्लेट को दो बार कताई करके कुओं को धोएं × जी 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए।
      2. चरण 1.5.3 से 1.5.9 में वर्णित के रूप में transduced T कोशिकाओं को दाग।
      3. सूत्र (1) का उपयोग करके CAR-, NIS-, या GFP-धनात्मक कक्षों के प्रतिशत के आधार पर टाइटर्स निर्धारित करें:
        Titers = BCMA-CAR + या NIS + T कोशिकाओं का प्रतिशत × विशिष्ट कमजोर पड़ने / आयतन (1) के ट्रांसडक्शन × ट्रांसडक्शन पर टी सेल गिनती
  5. Lentiviruses और NIS का ट्रांसडक्शन+BCMA-CAR T सेल विस्तार
    1. टी सेल उत्तेजना के बाद चौबीस से 48 घंटे, उत्तेजित टी कोशिकाओं पर लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन करते हैं (टी कोशिकाओं को क्लस्टर बनाना चाहिए)।
      1. जमे हुए lentiviruses एन्कोडिंग कार या एनआईएस 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघला हुआ.
      2. समूहों को तोड़ने के लिए उत्तेजित टी कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिलाएं, और बस 5.0 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर ताजा पिघले हुए वायरस को जोड़ें (जब 1.0 × 106 टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूसिंग करते हैं, तो 5.0 × 106 लेंटिविरोन का उपयोग करें)। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर transduced कोशिकाओं incubate.
      3. दिन 3, 4, और 5 पर, एक hematocytometer37 या एक पूरी तरह से स्वचालित सेल counter38 का उपयोग करके ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं की गणना करें और ताजा, पूर्व-गर्म टीसीएम जोड़कर सेल एकाग्रता को 1.0 × 106 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें। प्यूरोमाइसिन प्रतिरोध जीन ले जाने वाली एनआईएस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के लिए, 3, 4 और 5 दिनों पर प्यूरोमाइसिन डाइहाइड्रोक्लोराइड के 1 μg / mL के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    2. दिन 6 पर, टी सेल क्लस्टर को तोड़ने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण करके और उन्हें 1 मिनट के लिए चुंबक में रखकर ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं (चरण 1.3.4 से) से एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों को हटा दें। फिर, बस एकत्र किए गए ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं को 1.0 × 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर संस्कृति में वापस रखें। टी कोशिकाओं से मोतियों को हटाने के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सीएआर और एनआईएस की अभिव्यक्ति का आकलन करें।
      नोट: चूंकि BCMA-CAR का एकल-श्रृंखला चर टुकड़ा माउस से व्युत्पन्न है, इसलिए इसे एलेक्सा फ्लोर 647 के साथ संयुग्मित बकरी एंटी-माउस IgG (H + L) के साथ दाग दिया जा सकता है। एनआईएस का पता एंटी-ह्यूमन ETNL [सिंथेटिक पेप्टाइड aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQETNL) के अनुरूप] का उपयोग करके लगाया जा सकता है। यह एंटीबॉडी एनआईएस के साइटोसोलिक सी-टर्मिनस को पहचानता है। इसलिए, टी कोशिकाओं को मानव-विरोधी एनआईएस एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन से पहले permeabilized किया जाना चाहिए।
    3. बकरी विरोधी माउस IgG (एच + एल) का उपयोग कर BCMA-कार की सतह धुंधला प्रदर्शन.
      1. संस्कृति का एक एलीकोट लें (उदाहरण के लिए, 50,000 टी कोशिकाएं) और प्रवाह बफर (पीबीएस, 1% एफबीएस, और 1% सोडियम एज़ाइड) के साथ धोएं। इसके बाद, प्रवाह बफर के 50 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और CAR अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी के 1 μL और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए जीवित-मृत एक्वा के 0.3 μL के साथ कोशिकाओं को दाग दें।
      2. आरटी पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, प्रवाह बफर के 150 μL जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 650 × जी पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सतह CAR धुंधला होने के बाद, फिक्स और फिक्सेशन माध्यम के 100 μL (4.21% formaldehyde के साथ PBS) जोड़कर कोशिकाओं को permeabilize और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट। एक बफर के 100 μL के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं जिसमें एक सेल-परमेबिलाइज़िंग एजेंट जैसे सैपोनिन (4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 650 × जी ) होता है।
    5. एक permeabilizing बफर के 50 μL में निश्चित / permeabilized कोशिकाओं resuspend. फिर, प्रवाह बफर के 50 μL में एंटी-ह्यूमन ETNL NIS एंटीबॉडी के 0.3 ng जोड़ें और 4 °C पर 1 h के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. प्रवाह बफर के 150 μL जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 650 × जी पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रवाह बफर के 50 μL में एंटी-खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के 2.5 μL के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, प्रवाह बफर के 150 μL जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 650 × जी पर सेंट्रीफ्यूज।
    7. अंत में, प्रवाह बफर के 200 μL में पुन: निलंबित करें और ट्रांसडक्शन दक्षता (चित्रा 3 ए, बी) को निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का प्रदर्शन करें।
    8. दिन 8 पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 × जी पर टी कोशिकाओं की गणना और स्पिन करें। 10 × 106 / एमएल की एकाग्रता पर ठंड माध्यम (90% एफबीएस + 10% डाइमिथाइलसल्फोक्साइड [डीएमएसओ]) के साथ टी कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, फिर प्रत्येक को लेबल किए गए क्रायोवियल्स में 1 एमएल स्थानांतरित करें।
    9. शीशियों को 48 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। 48 घंटे (और दिन 10 तक) के बाद, टी कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
      नोट:: NIS + CAR T सेल उत्पादन के सिंहावलोकन के लिए चित्र1 देखें। चित्रा 3 डी तीन अलग-अलग दाताओं से पूर्व विवो टी सेल विस्तार के उदाहरणों का प्रतिनिधित्व करता है।

2. NIS + BCMA-कार टी सेल इमेजिंग के साथ [18F] TFB-PET स्कैन

नोट: यह प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC A00001767-16), IRB, और IBC (Bios000000006.04) के दिशानिर्देशों का पालन करता है। OPM-2 एक BCMA + MM सेल लाइन है, जिसका उपयोग अक्सर BCMA-CAR T cells39,40 के लिए एक लक्ष्य सेल लाइन के रूप में किया जाता है।

  1. लूसिफेरस + बीसीएमए + ओपीएम -2 कोशिकाओं को स्थापित करें।
    1. बीज 500,000 OPM-2 कोशिकाओं में एक ऊतक संस्कृति-इलाज 24 अच्छी तरह से प्लेट. 4 डिग्री सेल्सियस पर लूसिफेरस-जीएफपी एन्कोडिंग Thaw lentivirus.
    2. OPM-2 कोशिकाओं के लिए 3.0 के एक MOI पर ताजा पिघला हुआ वायरस जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण। प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में रखें।
    3. ट्रांसडक्शन के अड़तालीस घंटे बाद, ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का चयन करने के लिए प्यूरोमाइसिन के 2 μg / mL जोड़ें। ट्रांसडक्शन के चार दिन बाद, फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 3 ई) द्वारा जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं (लूसिफेरस-पॉजिटिव) का आकलन करें।
  2. BCMA + OPM-2 माउस मॉडल (चित्रा 4) स्थापित करें।
    1. लूसिफेरस + ओपीएम -2 कोशिकाओं की गणना करें और सभी सेल संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए उन्हें दो बार नीचे स्पिन करें। PBS के साथ 10 × 106 कोशिकाओं / mL की एकाग्रता पर OPM-2 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    2. दिन -21 पर, 8-से-12-सप्ताह पुराने immunocompromised NOD-scid IL2rπnull (NSG) चूहों (चित्रा 4) चूहों (चित्रा 4) की पूंछ में लूसिफेरस + OPM-2 कोशिकाओं के 100 μL (1.0 × 106 कोशिकाओं) इंजेक्ट करें।
    3. OPM-2 सेल इंजेक्शन (कार टी सेल इंजेक्शन के दिन -1) के बाद 20 वें दिन, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (बीएलआई) (चित्रा 4) के माध्यम से ट्यूमर के बोझ की जांच करें।
      नोट: ओपीएम -2 कोशिकाएं एक धीमी गति से बढ़ने वाला ट्यूमर बनाती हैं, जो आमतौर पर एनग्राफ्ट करने में 2-3 सप्ताह लेती हैं।
    4. इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से ओपीएम -2 चूहों को डी-लूसिफेरिन के 10 μL / g का प्रशासन करें। 10 मिनट के बाद, 2% आइसोफ्लुरेन गैस (चित्रा 5 ए) के तहत चूहों पर बीएलआई करें। ट्यूमर engraftment की पुष्टि करने के बाद, ट्यूमर बोझ के अनुसार चूहों randomize.
    5. कार टी सेल इंजेक्शन के दिन -1 पर, एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं को पिघलाएं, और सेंट्रीफ्यूजेशन (300 × जी, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा ठंड माध्यम को हटा दें। फिर, 2.0 पर टीसीएम के साथ पुन: निलंबित कोशिकाएं 106 कोशिकाओं / एमएल × और रातभर इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) करती हैं।
    6. दिन 0 पर, NIS + BCMA-CAR T कोशिकाओं (300 × g, 8 मिनट, 4 °C) की गणना और सेंट्रीफ्यूज करें। NIS+ BCMA-CAR T कोशिकाओं को PBS के साथ 50 × 106 कोशिकाओं / mL पर फिर से निलंबित करें।
    7. OPM-2 चूहों के लिए पूंछ शिरा इंजेक्शन के माध्यम से NIS + BCMA-CAR T कोशिकाओं के 100 μL (5.0 × 106 कोशिकाओं) का प्रशासन करें। दिन 7 और 15 पर, पीईटी स्कैन का उपयोग करके चूहों की छवि बनाएं।
  3. NIS + BCMA-CAR T सेल विवो इमेजिंग में BCMA + OPM-2 माउस मॉडल का उपयोग कर।
    1. इमेजिंग से पहले चूहों का वजन करें, और धातु से संबंधित कलाकृतियों को खत्म करने के लिए किसी भी धातु कान टैग को हटा दें।
    2. [18F] TFB तैयार करें जैसा कि पहले वर्णित किया गया था41.
      नोट: [18F] TFB को इसके उपयोग के दिन उत्पादित किया जाना चाहिए। रेडियोकेमिकल शुद्धता >99% और दाढ़ गतिविधि >5 GBq / mmol होनी चाहिए।
    3. 9.25 MBq [18F] TFB अंतःशिरा पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से इंजेक्ट करें। रेडियोट्रेसर को शरीर में वितरित करने और रक्त को साफ करने के लिए ~ 40 मिनट की एक अपटेक अवधि की अनुमति दें।
    4. आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन (2%) का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज़ करें।
      नोट: Isoflurane पसंदीदा साँस एनेस्थेटिक है क्योंकि इसमें तेजी से और विश्वसनीय शुरुआत और वसूली है।
    5. माउस को बेहोश करने से पहले, कीटाणुनाशक क्लीनर के साथ संज्ञाहरण मशीन की सभी सतहों को साफ करें।
    6. माउस को प्रेरण कक्ष के अंदर रखें। वेपोराइज़र डायल को 2% तक घुमाएं और माउस को 1-2 मिनट के भीतर रेकंबेंट और गैर-उत्तरदायी बनने की प्रतीक्षा करें।
    7. अपर्याप्त संज्ञाहरण या श्वसन कार्यों के अत्यधिक अवसाद से बचने के लिए माउस की निगरानी करें। संक्षेप में, अपर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी।
      नोट: सामान्य श्वसन दर 180 / मिनट तक है, और स्वीकार्य ड्रॉप दर 50% है।
    8. कॉर्नियल सुखाने और आघात से बचने के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
    9. एक माइक्रो पीईटी / सीटी इमेजिंग वर्कस्टेशन में एनेस्थेटिक माउस के साथ पीईटी / सीटी छवियों को 45 मिनट के बाद-इंजेक्शन प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। इसके बाद, 15 मिनट के लिए स्थैतिक पीईटी छवियों को प्राप्त करें, जिसके बाद 360 डिग्री रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए सीटी छवि अधिग्रहण और 500 μA, 80 keV और 200 एमएस एक्सपोजर पर 180 अनुमान।
  4. अधिग्रहित इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करना
    1. पीईटी छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (चित्रा 5B और पूरक वीडियो S1) का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण करें।
    2. ब्याज की मात्रा (VOI) को परिभाषित करें।
    3. सूत्र (2) का उपयोग करके मानकीकृत अपटेक मान (SUV) की गणना करें.
      वीओआई में एसयूवी = शरीर के वजन (जी) / प्रशासित खुराक (एमबीक्यू) (एमबीक्यू) × वीओआई (एमबीक्यू ) में गतिविधि की एकाग्रता (2)
  5. प्रवाह cytometry के साथ ट्यूमर साइटों के लिए NIS + BCMA-CAR टी सेल तस्करी की पुष्टि
    1. [18F] TFB-PET इमेजिंग के बाद, माउस को पिंजरे में वापस रखें। संज्ञाहरण की समाप्ति के बाद, जानवरों की निगरानी करें जब तक कि वे उद्देश्यपूर्ण आंदोलन में सक्षम न हों और यह सुनिश्चित करें कि उनके पास भोजन और पानी तक पहुंच है।
    2. इंजेक्ट किए गए [18F] TFB के क्षय तक चूहों की निगरानी करें। एक बार जब रेडियोआइसोटोप का पता लगाने योग्य नहीं होता है, तो सीओ 2 के साथ चूहों को euthanize करें।
    3. euthanize करने के लिए, चूहों को पिंजरे में रखें (प्रति पिंजरे में 5 से अधिक चूहों नहीं)।
    4. लगभग 5-10 मिनट में साँस लेने की पूरी समाप्ति तक चूहों को CO2 में उजागर करें।
      नोट: इस इच्छामृत्यु विधि को जानवरों की इच्छामृत्यु (2020 संस्करण) के लिए AVMA दिशानिर्देशों के अनुरूप होना चाहिए।
    5. चूहों की मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए, सिर के पीछे और जानवर की पूंछ के आधार को पकड़कर ग्रीवा अव्यवस्था करें, फिर हाथों को एक-दूसरे से अलग / दूर खींचें।
    6. यह पुष्टि करने के लिए अस्थि मज्जा की कटाई करें कि एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाएं ट्यूमर साइट पर कुशलतापूर्वक यातायात करती हैं।
    7. काटे गए फीमर और टिबिया को 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें सेल कल्चर माध्यम के 5 मिलीलीटर शामिल हैं। फीमर और टिबिया से मांसपेशियों और टेंडन को हटा दें, और बस फीमर और टिबिया के दोनों सिरों (जोड़ों के ऊपर) को काट दें।
    8. सेल संस्कृति माध्यम के साथ एक इंसुलिन सिरिंज भरें, और 6-अच्छी तरह से प्लेट पर अस्थि मज्जा फ्लश करें। फीमर के लिए, 22 जी सुइयों और 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें क्योंकि फीमर व्यास टिबिया की तुलना में बड़ा है।
    9. अस्थि मज्जा को पीसने के लिए प्लंजर के सपाट छोर का उपयोग करें। एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर एक 70 μm सेल छलनी रखें, और जमीन अस्थि मज्जा को फ़िल्टर करें। फिर, प्रवाह बफर के साथ ट्यूब को भरें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 × जी पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. supernatant aspirate, और प्रवाह बफर के 5 मिलीलीटर के साथ अस्थि मज्जा resuspend. अस्थि मज्जा के 200 μL को 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। Supernatant decant, और प्रवाह बफर के 50 μL के साथ कोशिकाओं resuspend.
    11. माउस CD45 के 0.25 μg, मानव CD45 के 0.03 μg, मानव CD3 के 0.06 μg, मानव BCMA के 0.24 μg, और जीवित / मृत एक्वा के 0.3 μL के खिलाफ प्रवाह एंटीबॉडी के साथ अस्थि मज्जा दाग। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, प्रवाह बफर के 200 μL जोड़ें, और प्रवाह साइटोमीटर (चित्रा 5C) पर चलाएँ।

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Representative Results

चित्र1 NIS+ BCMA-CAR T कोशिकाओं को उत्पन्न करने के चरणों का प्रतिनिधित्व करता है। दिन 0 पर, PBMCs को अलग करें और फिर नकारात्मक चयन द्वारा टी कोशिकाओं को अलग करें। फिर, एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों के साथ टी कोशिकाओं को उत्तेजित करें। दिन 1 पर, एनआईएस और बीसीएमए-कार लेंटिवायरस दोनों के साथ टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें। दिन 3, 4, और 5 पर, टी कोशिकाओं की गिनती करें और एकाग्रता को समायोजित करने के लिए मीडिया के साथ फ़ीड करें 1.0 × 106 / एमएल। एनआईएस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के लिए, एनआईएस + कोशिकाओं का चयन करने के लिए प्यूरोमाइसिन के 1 μg / mL जोड़ें। दिन 6 पर, कोशिकाओं को एक मिनट के लिए चुंबक में रखकर मोतियों को हटा दें। फिर, ट्यूब से डी-बीडेड कोशिकाओं को एक नए फ्लास्क में रखें। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके टी कोशिकाओं की सतह पर एनआईएस और सीएआर की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए कोशिकाओं (जैसे, 50,000 कोशिकाओं) का एक एलीकोट लें और एंटीबॉडी के साथ दाग लें। दिन 8 पर, टी कोशिकाओं की गिनती करें और 10 × 106 / एमएल की एकाग्रता पर ठंड मीडिया के साथ क्रायोप्रिजर्व करें।

चित्र 2 lentiviruses titrating की रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करता है. दिन 0 पर, टीसीएम में 1.0 × 106 / एमएल की एकाग्रता पर टी कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया। फिर, 1: 3 सेल: मोतियों के अनुपात में एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों के साथ टी कोशिकाओं को उत्तेजित करें। रंगीन कुओं में टी कोशिकाओं के 100 μL (100,000 कोशिकाओं) को जोड़ें जैसा कि चित्र 2A में दर्शाया गया है। इस प्लेट को "टिटर प्लेट" कहा जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर टिटर प्लेट को इनक्यूबेट करें, 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2। दिन 1 पर, तनुकरण प्लेट तैयार करें। रंगीन कुओं में TCM के 100 μL जोड़ें जैसा कि चित्र 2B में दर्शाया गया है। फिर, पहली पंक्ति में ताजा पिघले हुए लेंटिवायरस के 50 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, A6, A7, या A8 जैसा कि चित्र 2B में दर्शाया गया है)। A6 से B6 तक 50 μL स्थानांतरित करके सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें, और फिर B6 से C6 तक 50 μL, G6 तक दोहराते हुए। A7 और A8 के लिए सीरियल कमजोर पड़ने के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन करें. फिर पतला वायरस के 50 μL को टिटर प्लेट में स्थानांतरित करें। वायरस को तनुकरण प्लेट से टिटर प्लेट में स्थानांतरित करने के चौबीस घंटे बाद, टीसीएम के 100 μL के साथ कोशिकाओं को खिलाएं। दिन 3 पर, एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को दाग दें और प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से टी कोशिकाओं पर एनआईएस और बीसीएमए की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।

चित्रा 3A, B BCMA-CAR T या NIS+BCMA-CAR T कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंडों को दर्शाता है। टी कोशिकाओं को एफएससी / एसएससी पर गेटेड किया जाता है, इसके बाद सिंगल और लाइव-सेल भेदभाव होता है। 90% से अधिक कोशिकाएं एनआईएस + कोशिकाएं हैं (चित्रा 3 बी)। चित्रा 3C NIS + BCMA-CAR T कोशिकाओं की संरचना के लिए प्रतिनिधि प्रवाह प्लॉट दिखाता है। चित्रा 3ए, बी, टी कोशिकाओं के समान एफएससी / एसएससी पर गेटेड होते हैं, इसके बाद सिंगल और लाइव-सेल भेदभाव होता है। चित्र 3D 0 से 8 दिनों तक T सेल विस्तार वक्र दिखाता है। UTD, BCMA-CAR T, या NIS+BCMA-CAR T कोशिकाओं के बीच कोई गुना विस्तार अंतर नहीं है। चित्रा 3E में लेंटिवायरस के ट्रांसडक्शन के बाद ओपीएम -2 कोशिकाओं पर जीएफपी अभिव्यक्ति को दर्शाया गया है जो जीएफपी और लूसिफेरस को एन्कोड करता है जिसके बाद प्यूरोमाइसिन चयन होता है।

चित्रा 4 [18F] TFB-PET के साथ विवो में इमेजिंग NIS + BCMA-CAR T कोशिकाओं की रूपरेखा है। दिन -21 पर पूंछ शिरा इंजेक्शन के माध्यम से लूसिफेरस + ओपीएम -2 कोशिकाओं की 1.0 × 106 कोशिकाओं के साथ छह से आठ सप्ताह के चूहों को संक्रमित करें। दिन -1 पर BLI द्वारा ट्यूमर के बोझ का आकलन करें। दिन 0 पर, पूंछ शिरा इंजेक्शन के माध्यम से एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं के साथ इलाज करने के लिए ट्यूमर के बोझ के अनुसार चूहों को यादृच्छिक करें या बिना किसी उपचार के निगरानी करें (अनुपचारित)। दिन 6 पर BLI के साथ चूहों की छवि. NIS+ BCMA-CAR T कोशिकाओं की छवि के लिए दिन 7 पर [18F] TFB-PET निष्पादित करें.

चित्रा 5A एनएसजी चूहों में लूसिफेरस + ओपीएम -2 कोशिकाओं के टीकाकरण के 20 दिनों के बाद प्रतिनिधि बीएलआई को दिखाता है। चित्रा 5B NIS + BCMA-CAR T कोशिकाओं के प्रशासन के एक सप्ताह बाद प्रतिनिधि पीईटी इमेजिंग दिखाता है। [18F] टीएफबी अपटेक उरोस्थि, रीढ़, श्रोणि और फीमर में देखा जाता है। इसके अलावा, थायराइड और पेट में [18F] TFB का शारीरिक उत्थान देखा जाता है। चित्रा 5C फीमर-व्युत्पन्न अस्थि मज्जा के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंडों को अनुपचारित या एनआईएस + बीसीएमए-सीएआर टी सेल-उपचारित चूहों से काटा गया दिखाता है। अस्थि मज्जा के नमूनों को माउस CD45, मानव CD45, मानव CD3 और मानव BCMA के साथ दाग दिया जाता है। कोशिकाओं को एफएससी / एसएससी पर गेटेड किया जाता है, इसके बाद सिंगल, लाइव और मानव-सेल भेदभाव होता है। अनुपचारित से व्युत्पन्न अस्थि मज्जा के नमूने BCMA + कोशिकाओं को दिखाते हैं जबकि NIS + BCMA-CAR T सेल उपचारित माउस CD3 + कोशिकाओं को दिखाता है, जो [18F] TFB-PET खोज का समर्थन करता है।

Figure 1
चित्रा 1: NIS + BCMA-CAR टी सेल उत्पादन स्कीमा. सामान्य दाता सीडी 3 टी कोशिकाएं (परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से अलग) नकारात्मक मनका चयन का उपयोग करके। टी कोशिकाओं को 1.0 × 106 / एमएल पर चढ़ाया जाता है और एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों का उपयोग करके टीसीएम में विस्तारित किया जाता है, जो संस्कृति के दिन 0 पर जोड़ा जाता है और दिन 6 पर हटा दिया जाता है। टी कोशिकाओं को दोहरी रूप से दिन 1 (MOI = 5.0) पर एनआईएस या BCMA-CAR एन्कोडिंग lentiviruses के साथ transduced कर रहे हैं। एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं को दिन 3, 4 और 5 पर प्यूरोमाइसिन के 1 μg / mL के साथ इलाज किया जाता है। टी कोशिकाओं को 8 दिनों के लिए संस्कृति में विस्तारित किया जाता है। टी कोशिकाओं को भविष्य के प्रयोगों के लिए 10% डीएमएसओ के साथ एफबीएस में क्रायोप्रिजर्व्ड किया जाता है। टी कोशिकाओं को पिघलाया जाता है और सभी प्रयोगों से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आराम किया जाता है। संक्षेप: CD = विभेदन का समूह; TCM = टी सेल विस्तार माध्यम; BCMA = बी सेल परिपक्वता प्रतिजन; CAR = chimeric antigen receptor; एनआईएस = सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; PBMCs = परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं; MOI = संक्रमण की बहुलता; FBS = भ्रूण गोजातीय सीरम; DMSO = dimethylsulfoxide कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: लेंटिवायरस अनुमापन( A) दिन 0 पर, 3:1 मोतियों: सेल अनुपात पर एंटी-CD3/CD28 मोतियों के साथ T कोशिकाओं को उत्तेजित करें। कार्टून में दर्शाए गए रंगीन कुओं में 1.0 × 106/mL उत्तेजित T कोशिकाओं के 100 μL जोड़ें। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर टिटर प्लेट को इनक्यूबेट करें, 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 (बी) रंगीन कुओं में 100 μL TCM जोड़कर एक कमजोर पड़ने वाली प्लेट तैयार करें जैसा कि कार्टून में इंगित किया गया है। A6, A7, या A8 में ताजा पिघले हुए वायरस के 50 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, BCMA-CAR को A6, NIS से A7, और लूसिफेरस-GFP से A8)। फिर, क्रमिक रूप से ए 6 से बी 6 में 50 μL स्थानांतरित करके वायरस को पतला करें, और फिर B6 से C6 तक 50 μL, G6 तक दोहराते हुए। A7 और A8 के लिए सीरियल कमजोर पड़ने के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन करें. टिटर प्लेट में पतला वायरस के 50 μL स्थानांतरण. (सी) दिन 3 पर, संबंधित एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को दाग दें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा टिटर प्लेट का विश्लेषण करें। संक्षेप: CD = विभेदन का समूह; TCM = टी सेल विस्तार माध्यम; BCMA = बी सेल परिपक्वता प्रतिजन; CAR = chimeric antigen receptor; एनआईएस = सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं और लूसिफेरस-जीएफपी सकारात्मक ओपीएम -2 कोशिकाओं की पीढ़ी। (A और B) कोशिकाओं को एफएससी / एसएससी पर गेटेड किया जाता है, इसके बाद सिंगल और लाइव-सेल भेदभाव होता है। (ए) अपरिवर्तित टी और बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं और (बी) यूटीडी और एनआईएस + बीसीएमए-कार टी के प्रतिनिधि प्रवाह भूखंडों को दिखाया गया है। एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाएं टी सेल विस्तार के दिन 1 पर दो वायरस के सह-ट्रांसडक्शन द्वारा उत्पन्न होती हैं, जैसा कि चित्र 2 में वर्णित है। दिन 6 पर, कोशिकाओं को CARs और NIS के लिए दाग दिया जाता है। (c) NIS+BCMA-CAR T का फेनोटाइपिक विश्लेषण। NIS+ BCMA-CAR T कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रवाह प्लॉट दिखाया गया है। (डी) यूटीडी, बीसीएमए-कार टी, या एनआईएस + बीसीएमए-कार टी सेल ग्रोथ कैनेटीक्स का सारांश। BCMA-CAR और / या NIS का निगमन टी सेल विस्तार को प्रभावित नहीं करता है (दो-तरफ़ा एनोवा, एन = 3 जैविक प्रतिकृति, एसडी ± मतलब)। (ई) लूसिफेरस-जीएफपी-ट्रांसड्यूस्ड ओपीएम-2 का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। OPM-2 कोशिकाओं को ल्यूसिफेरस-जीएफपी एन्कोडिंग ल्यूसिफेरस-जीएफपी के साथ प्यूरोमाइसिन प्रतिरोध के साथ लेंटिवायरस के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है। ट्रांसडक्शन के अड़तालीस घंटे बाद, ओपीएम -2 कोशिकाओं को प्यूरोमाइसिन के 2 μg / mL के साथ इलाज किया जाता है। कोशिकाओं को दो और दिनों के लिए विस्तारित किया जाता है, और जीएफपी की अभिव्यक्ति का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से किया जाता है। संक्षेप: CD = विभेदन का समूह; BCMA = बी सेल परिपक्वता प्रतिजन; CAR = chimeric antigen receptor; एनआईएस = सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; UTD = untransduced; FSC/SSC = आगे प्रकीर्णन/पक्ष प्रकीर्णन; एनोवा = विचरण का विश्लेषण; n.s.= महत्वपूर्ण नहीं है; एसडी = मानक विचलन; FL-1-A = फ्लोरोफोर 1 का क्षेत्रफल; FITC-A = फ्लोरोसीन आइसोथियोसाइनेट का क्षेत्रफल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक प्रणालीगत OPM2 मॉडल में in vivo तस्करी परख के लिए योजना. दिन -21 पर पूंछ शिरा के माध्यम से लूसिफेरस-पॉजिटिव ओपीएम -2 कोशिकाओं के 1.0 × 106 के साथ छह से आठ सप्ताह पुराने एनएसजी चूहों को इंजेक्ट करें। दिन -1 पर, ओपीएम -2 कोशिकाओं के एनग्राफ्टमेंट की पुष्टि करने के लिए चूहों पर बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग करें। दिन 0 पर, एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं के 5.0 × 106 के साथ चूहों को इंजेक्ट करें। एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं की तस्करी का आकलन करने के लिए दिन 7 पर [18F] TFB-PET / CT के साथ छवि चूहों। संक्षिप्त रूप: BCMA = बी सेल परिपक्वता प्रतिजन; CAR = chimeric antigen receptor; एनआईएस = सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर; BLI = bioluminescent इमेजिंग; NSG = immunocompromised NOD-scid IL2rπnull; ल्यूक = लूसिफेरस; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक प्रणालीगत OPM2 मॉडल में विवो तस्करी परख में. (A और B) BCMA + लूसिफेरस + OPM2 कोशिकाओं को अंतःशिरा रूप से एनएसजी चूहों में इंजेक्ट किया जाता है। चूहों को ओपीएम -2 कोशिकाओं के टीकाकरण के तीन सप्ताह बाद एनआईएस + बीसीएमए कार टी कोशिकाएं प्राप्त होती हैं। (ए) बीएलआई ओपीएम -2 कोशिकाओं के एनग्राफ्टमेंट की पुष्टि करता है। (बी) [18 एफ] टीएफबी-पीईटी अस्थि मज्जा के लिए एनआईएस + बीसीएमए-कार टी सेल तस्करी का खुलासा करता है। (सी) यह पुष्टि करने के लिए कि अस्थि मज्जा में ओपीएम -2 कोशिकाएं और एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं को ट्यूमर साइट पर यातायात करती हैं, चूहों को इमेजिंग के बाद euthanized किया जाता है, और अस्थि मज्जा काटा जाता है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि ओपीएम -2 कोशिकाओं को अस्थि मज्जा (बाएं) में एनग्राफ्ट किया जाता है, और एनआईएस + बीसीएमए-सीएआर टी कोशिकाएं अस्थि मज्जा (दाएं) में मौजूद होती हैं। संक्षिप्त रूप: BCMA = बी सेल परिपक्वता प्रतिजन; CAR = chimeric antigen receptor; एनआईएस = सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर; BLI = bioluminescent इमेजिंग; NSG = immunocompromised NOD-scid IL2rπnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography; IVIS = विवो इमेजिंग सिस्टम में; CD = विभेदन का समूह; SUV = मानकीकृत अपटेक मूल्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S1: पीईटी / सीटी डेटा का तीन आयामी (3 डी) प्रतिपादन थायरॉयड, पेट और अस्थि मज्जा में [18F] TFB के विवो वितरण में दिखा रहा है। संक्षिप्त रूप: BCMA = बी सेल परिपक्वता प्रतिजन; CAR = chimeric antigen receptor; एनआईएस = सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर; पीईटी / सीटी = पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी / गणना टोमोग्राफी। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह पेपर एनआईएस को सीएआर टी कोशिकाओं में शामिल करने और [18F] TFB-PET के माध्यम से विवो में CAR T कोशिकाओं को इमेजिंग करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, एनआईएस + बीसीएमए-कार टी कोशिकाओं को दोहरे ट्रांसडक्शन के माध्यम से उत्पन्न किया गया था। हमने हाल ही में बताया है कि सीएआर टी कोशिकाओं में एनआईएस को शामिल करने से सीएआर टी सेल कार्यों और विवो में प्रभावकारिता को बाधित नहीं किया जाता है और सीएआर टी सेल तस्करी और विस्तार 30 की अनुमति मिलती है। जैसा कि सीएआर टी सेल थेरेपी सीएलएल में अनुप्रयोगों के लिए वर्तमान बी सेल दुर्दमताओं से परे विस्तार करना जारी रखती है, ऐसे उपकरणों की अधिक आवश्यकता होगी जो विवो इमेजिंग में गैर-इनवेसिव और संक्रमित दत्तक टी कोशिकाओं की निगरानी की अनुमति देते हैं। टी कोशिकाओं की गतिशील इमेजिंग दत्तक टी सेल तस्करी के सत्यापन को सक्षम करेगी और संभावित रूप से प्रभावकारिता और विषाक्तता का पहले का पता लगाने की अनुमति देगी।

एनआईएस की जांच की गई है और नैदानिक परीक्षणों में छवि कोशिकाओं और वायरस के लिए एक संवेदनशील रूपरेखा के रूप में मान्य किया गया है32,42। एनआईएस के लिए अनुरेखकों का शारीरिक संचय मुख्य रूप से थायरॉयड / लार ग्रंथियों, पेट और मूत्राशय में देखा जाता है, जो तरल ट्यूमर से प्रभावित सामान्य अंग नहीं हैं44। विशेष रूप से एमएम में, घातक प्लाज्मा कोशिकाओं को अक्सर अस्थि मज्जा या हड्डियों में वितरित किया जाता है, और घावों में एक एक्स्ट्रामेडुलरी प्लाज्मासाइटोमा, जहां एनआईएस के लिए ट्रेसर्स का शारीरिक संचय होता है, एक दुर्लभ घटना है44,45। इसके अलावा, एनआईएस गैर-इम्युनोजेनिक है और इसलिए अनुदैर्ध्य इमेजिंग अध्ययन 46 के लिए उपयुक्त है। एनआईएस एक आंतरिक झिल्ली प्रोटीन है जो आयोडाइड को साइटोसोल में ले जाता है और इसमें एक बाहरी अमीनो टर्मिनस साइट और साइटोसोलिक कार्बोक्सी टर्मिनस 47 के साथ 13 परिष्कृत ट्रांसमेम्ब्रेन सेगमेंट होते हैं।

एनआईएस को गामा- या पॉज़िट्रॉन-उत्सर्जक रेडियोआइसोटोप जैसे टेक्नीशियम-99 मीटर (99mTc) pertechnetate, आयोडाइड-123 (123I), 131I, 124I, और [18F] TFB43 के साथ देखा जा सकता है। हाल ही में, [18F] TFB एनआईएस-आधारित पीईटी इमेजिंग के लिए एक होनहार आयोडाइड एनालॉग के रूप में उभरा है, क्योंकि इसमें समान जैव रासायनिक गुण हैं और रेडियोसिंथेसिस 48 है। टीएफबी का एक लाभ यह है कि यह थायरॉयड कोशिकाओं में ऑर्गेनिफिकेशन से नहीं गुजरता है और इसलिए सामान्य थायरॉयड ऊतक 48 में तुलनात्मक रूप से हल्का अपटेक होता है। टीएफबी का एक और लाभ 109.8 मिनट का छोटा आधा जीवन है, जबकि अन्य अनुरेखकों का आधा जीवन 12 घंटे से 8 दिनों तक होता है, जो नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए सुरक्षा मुद्दों को पेश कर सकता है। एनआईएस-आधारित सीएआर टी सेल इमेजिंग की मुख्य सीमा यह है कि टीएफबी सहित ट्रेसर, रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) में प्रवेश नहीं करते हैं, जिससे सीएआर टी सेल उपचार 50,51,52,53 के बाद न्यूरोटॉक्सिसिटी का आकलन करना मुश्किल हो जाता है।

न्यूरोटॉक्सिसिटी टी कोशिकाओं की घुसपैठ और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में माइलॉयड कोशिकाओं के सक्रियण से जुड़ा हुआ है। हालांकि, सीएआर टी सेल थेरेपी के बाद न्यूरोटॉक्सिसिटी के अधिकांश मामलों में, बीबीबी की अखंडता 50,54 बाधित होती है। इसलिए, यह स्पष्ट नहीं है कि अनुरेखक इस समझौता सेटिंग में BBB को पार करने में असमर्थ है या नहीं। यह सत्यापित करने के लिए आगे के अध्ययन किए जाने की आवश्यकता है कि क्या सीएआर टी सेल थेरेपी के बाद न्यूरोटॉक्सिसिटी को [18 एफ] टीएफबी-पीईटी के साथ चित्रित किया जा सकता है। हालांकि [18F] TFB का छोटा आधा जीवन रोगियों और कर्मचारियों के लिए सुरक्षित है, यह अस्पताल के लिए इसकी खरीद को मुश्किल बनाता है। इसलिए, संस्थानों को साइक्लोट्रॉन से लैस होना चाहिए या क्षेत्रीय सुविधा तक पहुंच होनी चाहिए। यहां प्रोटोकॉल में वर्णित पद्धति को संभावित रूप से [18F] TFB-PET स्कैन का उपयोग करके विवो में CAR T कोशिकाओं की कल्पना और आकलन करने के लिए दोहरे ट्रांसडक्शन के माध्यम से विभिन्न प्रकार की अन्य CAR T कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

एसएसके नोवार्टिस को लाइसेंस प्राप्त सीएआर इम्यूनोथेरेपी में पेटेंट पर एक आविष्कारक है (मेयो क्लिनिक, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय और नोवार्टिस के बीच एक समझौते के माध्यम से) और मेट्टाफोर्ज (मेयो क्लिनिक के माध्यम से)। आरएस, एमजेसी, और एसएसके कार इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में पेटेंट पर आविष्कारक हैं जो ह्यूमनिजेन के लिए लाइसेंस प्राप्त हैं। एसएसके को पतंग, गिलियड, जूनो, सेलजीन, नोवार्टिस, ह्यूमैनिजेन, मोर्फोसिस, टोलेरो, सनेसिस, लेहलैब्स और लेंटिजेन से अनुसंधान धन प्राप्त होता है। आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से मेयो क्लिनिक K2R पाइपलाइन (SSK), मेयो क्लिनिक सेंटर फॉर इंडिविजुअलाइज्ड मेडिसिन (एसएसके), और प्रेडोलिन फाउंडेशन (आरएस) के माध्यम से समर्थित किया गया था। आंकड़े 1, 2, और 4 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

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