Summary
Denne protokollen beskriver metodikken for ikke-invasiv sporing av T-celler genetisk konstruert for å uttrykke chimeriske antigenreseptorer in vivo med en klinisk tilgjengelig plattform.
Abstract
T-celler genetisk utviklet for å uttrykke chimeric antigen reseptorer (CAR) har vist enestående resultater i pivotale kliniske studier for pasienter med B celle maligniteter eller flere myeloma (MM). Imidlertid begrenser mange hindringer effekten og forbyr utbredt bruk av CAR T-cellebehandlinger på grunn av dårlig menneskehandel og infiltrasjon på tumorsteder, samt mangel på utholdenhet in vivo. Videre er livstruende toksisiteter, som cytokinfrigjøringssyndrom eller nevrotoksisitet, store bekymringer. Effektiv og sensitiv bildebehandling og sporing av CAR T-celler muliggjør evaluering av T-cellehandel, ekspansjon og in vivo-karakterisering og gjør det mulig å utvikle strategier for å overvinne de nåværende begrensningene ved CAR T-celleterapi. Dette dokumentet beskriver metodikken for å inkorporere natriumjodidsymporteren (NIS) i CAR T-celler og for CAR T-celleavbildning ved hjelp av [18F]tetrafluoroborate-positron utslipp tomografi ([18F]TFB-PET) i prekliniske modeller. Metodene beskrevet i denne protokollen kan brukes på andre CAR-konstruksjoner og målgener i tillegg til de som brukes til denne studien.
Introduction
Chimeric antigen reseptor T (CAR T) celleterapi er en raskt fremvoksende og potensielt kurativ tilnærming i hematologiske maligniteter1,2,3,4,5,6. Ekstraordinære kliniske utfall ble rapportert etter CD19-rettet CAR T (CART19) eller B celle modning antigen (BCMA) CAR T celleterapi2. Dette førte til at US Food and Drug Administration (FDA) godkjenning av CART19-celler for aggressiv B-celle lymfom (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 og lisocabtagene maraleucel)7, akutt lymfoblastisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellelymfom (breksucabtagen autoleuce)9, og follikulært lymfom (Axi-Cel)10 . Nylig godkjente FDA BCMA-rettet CAR T-cellebehandling hos pasienter med myelomatose (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Videre er CAR T celleterapi for kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) i sen klinisk utvikling og forventes å motta FDA-godkjenning i løpet av de neste tre årene1.
Til tross for de enestående resultatene av CAR T celleterapi, er den utbredte bruken begrenset av 1) utilstrekkelig in vivo CAR T celleutvidelse eller dårlig menneskehandel til tumorsteder, noe som fører til lavere rater av holdbar respons12,13 og 2) utviklingen av livstruende bivirkninger, inkludert cytokinfrigjøringssyndrom (CRS) 14,15 . Kjennetegnene til CRS inkluderer ikke bare immunaktivering som resulterer i forhøyede nivåer av inflammatoriske cytokiner / kjemokiner, men også massiv T-celleproliferasjon etter CAR T-celleinfusjon15,16. Dermed vil utviklingen av en validert, klinisk strategi for å bilde CAR T-celler in vivo tillate 1) CAR T cellesporing i sanntid in vivo for å overvåke deres menneskehandel til tumorsteder og avdekke potensielle motstandsmekanismer, og 2) overvåking av CAR T celleutvidelse og potensielt forutsi deres toksisiteter som utvikling av CRS.
Kliniske egenskaper ved mild CRS er høy feber, tretthet, hodepine,, diaré, artralgi, myalgi og ubehag. Ved mer alvorlig CRS kan pasienter utvikle takykardi/hypotensjon, kapillærlekkasje, hjertedysfunksjon, nyre-/leversvikt og spre intravaskulær koagulasjon17,18. Generelt har graden av forhøyelse av cytokiner, inkludert interferon-gamma, granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor, interleukin (IL)-10 og IL-6 vist seg å korrelere med alvorlighetsgraden av kliniske symptomer17,19. Imidlertid er den omfattende anvendelsen av "sanntids" serumcytokinovervåking for å forutsi CRS vanskelig på grunn av høye kostnader og begrenset tilgjengelighet. For å utnytte de fordelaktige egenskapene ved CAR T-celleterapi, kan ikke-invasiv avbildning av adoptiv T-celler potensielt brukes til å forutsi effekt, toksisiteter og tilbakefall etter CAR T-celleinfusjon.
Flere forskere har utviklet strategier for å bruke radionuklidbasert avbildning med positronutslippstomografi (PET) eller enkeltfotoutslippsberegnet tomografi (SPECT), som gir høy oppløsning og høy følsomhet20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 for in vivo visualisering og overvåking av CAR T cellehandel. Blant de radionuklidbaserte bildestrategiene er natriumjodidsympporteren (NIS) utviklet som en sensitiv modalitet for bildeceller og virus ved hjelp av PET-skanninger31,32. NIS+CAR T celleavbildning med [18F]TFB-PET er en sensitiv, effektiv og praktisk teknologi for å vurdere og diagnostisere CAR T-celleutvidelse, menneskehandel og toksisitet30. Denne protokollen beskriver 1) utviklingen av NIS+CAR T-celler gjennom dobbel transduksjon med høy effekt og 2) en metodikk for avbildning av NIS+CAR T-celler med [18F]TFB-PET-skanning. BCMA-CAR T-celler for MM brukes som konseptgodkjenningsmodell for å beskrive NIS som reporter for CAR T-celleavbildning. Imidlertid kan disse metodene brukes på enhver annen CAR T-celleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene fra Mayo Clinics institusjonelle kontrollutvalg, Institutional Biosafety Committee og Mayo Clinics institusjonelle dyrepleie- og brukskomité.
1. NIS+ BCMA-CAR T celleproduksjon
MERK: Denne protokollen følger retningslinjene fra Mayo Clinic's Institutional Review Board (IRB 17-008762) og Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).
- Produksjon av BCMA-CAR, NIS og luciferase-grønn fluorescerende protein (GFP)-koding av lentivirus.
MERK: En andregenerasjons BCMA-CAR-konstruksjon ble syntetisert de novo (se materialtabellen) og klonet inn i en tredjegenerasjons lentiviral vektor under kontroll av en forlengelsesfaktor-1 alfa (EF-1α) promotor. BCMA-CAR-konstruksjonen (C11D5.3-41BBz) inkluderte 4-1BB costimulation og et enkeltkjedet variabelt fragment (scFv) avledet fra en anti-menneskelig BCMA antistoff klone C11D5.333,34. NIS er under kontroll av EF-1α promotorisk og binder seg til puromycinresistensgenet via selvklebende peptider (P2A). Den lentivirale vektorkodingen luciferase-GFP (se materialtabellen) brukes til å transdusere tumorceller, som deretter uttrykker GFP og luciferase.- Forbered lentiviral vektorplasmider: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) og pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
MERK: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro og pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro inneholder puromycinresistensgenet. Derfor kan NIS- eller luciferase-GFP-transduced celler velges med 1 μg/ml eller 2 μg/ml puromycindihydroklorid, som beskrevet tidligere14,35. - Frø 20 × 106 av 293T celler i en T175 kolbe og inkubere i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2. Bekreft at 293T celler er jevnt fordelt på kolben ved 70-90% samløp ved direkte visualisering under mikroskopet.
- Forbered en mesterblanding på 15 μg av uttrykksvektoren (f.eks. CAR, NIS eller luciferase-GFP lineært DNA), 7 μg av konvoluttvektoren (VSV-G) og 18 μg av emballasjevektoren (gag, pol, rev og tat). Fortynn DNA-masterblandingen i 4,5 ml av transfeksjonsmediet, og tilsett deretter 111 μL av det pre-komplekse reagenset (blanding A).
- Forbered et nytt rør, og fortynn 129 μL liposomal transfeksjonsreagens i 4,5 ml av transfeksjonsmediet (blanding B).
- Kombiner blanding A og B og sveip røret for å blande innholdet. Inkuber i 30 min ved romtemperatur (RT).
- Etter inkubasjonen aspirerer du bare cellen supernatant uten å løsne cellene og tilsett 16 ml av et vekstmedium som inneholder 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin-glutamin. Tilsett deretter blandingen av blanding A og B på 293T celler dråpevis. Til slutt inkuberer du de transfekterte cellene ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer.
- På dag 1 og 2 etter transfeksjon, høst supernatanten på 293T, spinn ned ved 900 × g i 10 minutter, og filtrer gjennom et 0,45 μm nylonfilter. Konsentrer filtratet ved 24 og 48 timer ved ultracentrifugation ved 112 700 × g i 2 timer, og frys ved -80 °C.
- Forbered lentiviral vektorplasmider: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) og pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
- Eks-vivo T-celleisolasjon (figur 1)
MERK: Utfør alt cellekulturarbeid i et laminært strømningsskap ved hjelp av aseptisk teknikk og personlig verneutstyr. Perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer) høstes fra sunt frivillig donorblod som samles inn under aferese36. Patogenscreening ble utført på menneskelige celler som brukes i denne studien.- Bruk teknikken for standard tetthetsgradient til å isolere PBMCer.
- Tilsett forsiktig 15 ml tetthetsgradientmedium (tetthet på 1,077 g/ml) (som inneholder alfa-D-glucopyranoside, beta-D-fructofuranosyl homopolymer, og, 3-(acetylamino)-5-(acetylmethylamino)-2,4,6-triodobenzoic acid monosodium salt) til en 50 ml tetthet gradient separasjonsrør uten å lage luftbobler (se materialtabellen).
- For å unngå cellefangst, fortynn blodprøven med fosfatbufret saltvann (PBS, 0,2 g/l kaliumklorid, 0,2 g/l kaliumfosfatmonobasisk, 8 g/l natriumklorid og 1,15 g/l natriumfosfatdibasic) som inneholder 2 % FBS ved et volumforhold på 1:15 g/l. Overfør forsiktig det fortynnede blodet på toppen av tetthetsgradientmediet uten å bryte grensesnittet mellom de to. Spinn ned på 1200 × g i 10 min på RT.
MERK: Et separasjonsrør med 50 ml tetthet kan brukes til isolering av 4-17 ml blodprøve. Separasjonsrøret med 50 ml tetthet (se materialtabellen) som brukes i denne protokollen, krever ikke "brems av" under sentrifugering. Men når standard 50 ml rør brukes, må bremsen være av og krever 30 min sentrifugering. - Overfør supernatanten til et nytt konisk rør på 50 ml, vask med PBS + 2% FBS ved å fylle opptil 50 ml, og spinn deretter ned ved 300 × g i 8 minutter ved RT.
- Aspirer supernatanten, og resuspender pelletedcellene i 50 ml PBS + 2% FBS. Tell antall celler, og spinn deretter ned ved 300 × g i 8 min på RT. Gjenta forrige trinn for totalt 2 vasker.
- Aspirer supernatanten, og resuspend pelleted cellene til en konsentrasjon på 50 × 106 celler / ml med PBS + 2% FBS.
- Utfør T-celleisolasjon fra PBMCer ved hjelp av et magnetisk perlesett med negativ merking.
MERK: Et ideelt negativt utvalgssett inkluderer magnetiske perler festet til antistoffer mot antigener uttrykt på andre celler enn T-celler. Et vanlig brukt sett inneholder antistoffer som er konjugert mot magnetiske perler mot CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 og CD16 (se Materialfortegnelse).- Overfør PBMCer til et 14 ml polystyren rundbunnsrør. Plasser deretter PBMC-ene og den negative antistoffcocktailen i et helautomatisk celleskiller, og utfør T-celleisolasjon i henhold til produsentens protokoll.
- Bruk teknikken for standard tetthetsgradient til å isolere PBMCer.
- T cellestimulering og T-celleutvidelse (figur 1)
- For å dyrke de isolerte T-cellene, lag T-celleutvidelsesmedium (TCM) laget med serumfritt hematopoietisk cellemedium supplert med 10% humant serumalbumin og 1% penicillin-streptomycin-glutamin14. Etter T-celleisolasjon teller du cellene og kulturen i en konsentrasjon på 2 × 106 celler/ml med TCM.
- Vask anti-CD3/CD28 perler tre ganger med TCM før du dyrker med T-celler.
- Bland hetteglasset som inneholder perlene ved å virvle. Deretter pipetterer du det nødvendige volumet av perler (3:1 perler:celle) (f.eks. Ved stimulering av 1,0 × 106 celler med T-celler, bruk 3,0 × 106 anti-CD3/CD28 perler) i et sterilt mikrosenterrifugerør (1,5 ml) og resuspend i 1 ml TCM.
- Plasser mikrocentrifugerøret med perlene på en magnet i 1 min, og aspirer supernatanten. Fjern røret fra magneten, og resuspend de vaskede perlene i 1 ml TCM. Gjenta de to foregående trinnene for totalt 3 vasker.
- Resuspend perlene i 1 ml TCM og overføre dem til T-cellene. Fortynn deretter T-cellene til en endelig konsentrasjon på 1,0 × 106 celler / ml med TCM. Overfør T-celle/perle suspensjon til en vev-kulturbehandlet 6-brønns plate og plasser den i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Titrering av lentivirus (figur 2)
- Forbered T-celler for titreringsanalyse. Forsikre deg om at omtrent 1,0 x 106 celler er tilgjengelige for titrate en type virus.
- Stimulere T-celler som beskrevet i pkt. 1.3.2.
- Plate 1,0 × 105 celler stimulerte T-celler i en 96-brønnsplate (titerplate) og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer (figur 2A). Isoler og stimmuler T-cellene som beskrevet i pkt. 1.2.
- Forbered en fortynningsplate (96-brønnsplate) ved å tilsette 100 μL TCM i brønnene i de angitte søylene og de utransduserte kontrollbrønnene (figur 2B).
- Tine ett hetteglass med lentivirale partikler på is og rør forsiktig opp og ned for å blande godt. Overfør 50 μL av viruset supernatant inn i brønnene i kolonne 6 i 96-brønnsplaten (fortynning 3) (figur 2B). Pipette opp og ned for å blande godt.
- Utfør seriell fortynning (2 ganger seriell fortynning): overfør 50 μL fra brønn A6 til brønn B6 og deretter 50 μL fra brønn B6 til brønn C6; gjenta til G6. Tilsett deretter 50 μL av det fortynnede viruset til titerplaten (figur 2B).
- Inkuber titerplaten ved 37 °C, 5 % CO2 i 48 timer, og bestem prosentandelene av CAR-, NIS- eller GFP-positive celler ved strømningscytometri (figur 2C).
- Vask brønnene ved å spinne ned titerplaten to ganger ved 650 × g ved 4 °C i 3 minutter.
- Flekk de transinduserte T-cellene som beskrevet i trinn 1.5.3 til 1.5.9.
- Bestem titerne basert på prosentandelene av KAR-, NIS- eller GFP-positive celler ved hjelp av formel (1):
Titers = Prosentandelen av BCMA-CAR+ eller NIS+ T-celler × T-celleantall ved transduksjon × den spesifikke fortynning / volum (1)
- Transduksjon av lentivirus og NIS+UTVIDELSE AV BCMA-CAR T-celler
- Tjuefire til 48 timer etter T-cellestimulering, utfør lentiviral transduksjon på stimulerte T-celler (T-celler skal danne klynger).
- Tine de frosne lentivirusene som koder CAR eller NIS ved 4 °C.
- Bland de stimulerte T-cellene godt for å bryte opp klyngene, og bare legg til ny tint virus ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 5,0 (når du transduserer 1,0 × 106 T-celler, bruk 5,0 × 106 av lentivironer). Inkuber de transinduserte cellene ved 37 °C, 5 % CO2.
- På dag 3, 4 og 5 teller du de transinduserte T-cellene ved hjelp av et hematocytometer37 eller en helautomatisk celleteller38 og justerer cellekonsentrasjonen til 1,0 × 106 celler/ml ved å tilsette fersk, forvarmet TCM. For NIS-transduced T-celler som bærer puromycinresistensgenet, behandle cellene med 1 μg/ml puromycindihydroklorid på dag 3, 4 og 5.
- På dag 6 fjerner du anti-CD3/CD28-perlene fra de transinduserte T-cellene (fra trinn 1.3.4) ved å blande godt for å bryte opp T-celleklyngene og plassere dem i en magnet i 1 min. Deretter plasserer du bare de innsamlede transinduserte T-cellene tilbake i kulturen i en konsentrasjon på 1,0 × 106 celler / ml. Etter å ha fjernet perlene fra T-cellene, vurder uttrykket av CAR og NIS ved strømningscytometri.
MERK: Ettersom det variable fragmentet av BCMA-CAR er avledet fra musen, kan det farges med geit antimus IgG (H +L) konjugert med Alexa Fluor 647. NIS kan påvises ved hjelp av antimenneskelig ETNL [syntetisk peptid tilsvarende aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQETNL)]. Dette antistoffet gjenkjenner den cytosoliske C-terminus av NIS. Derfor må T-celler permeabiliseres før inkubasjon med et antimenneskelig NIS-antistoff. - Utfør overflatefarging av BCMA-CAR ved hjelp av geit antimus IgG (H +L).
- Ta en aliquot av kulturen (f.eks. 50 000 T-celler) og vask med strømningsbuffer (PBS, 1% FBS og 1% natriumazid). Deretter resuspenderer cellene med 50 μL strømningsbuffer, og flekker cellene med 1 μL geit antimus antistoff for å oppdage CAR-uttrykk og 0,3 μL levende dødt vann for å ekskludere døde celler.
- Inkuber i 15 min i mørket ved RT, vask cellene ved å legge til 150 μL strømningsbuffer, og sentrifuger cellene ved 650 × g i 3 minutter ved 4 °C.
- Etter overflate CAR farging, fikse og permeabilisere cellene ved å legge 100 μL fikseringsmedium (PBS med 4,21% formaldehyd) og inkubere i 20 min ved 4 °C. Vask cellene to ganger med 100 μL buffer som inneholder et cellepermeabiliserende middel som saponin (650 × g i 3 minutter ved 4 °C).
- Resuspend de faste/permeabiliserte cellene i 50 μL av en permeabiliserende buffer. Tilsett deretter 0,3 ng antimenneskelig ETNL NIS-antistoff i 50 μL strømningsbuffer og inkuber i 1 time ved 4 °C.
- Tilsett 150 μL strømningsbuffer, og sentrifuger cellene ved 650 × g i 3 minutter ved 4 °C. Inkuber cellene med 2,5 μL antikanin sekundært antistoff i 50 μL strømningsbuffer i 30 min ved 4 °C, vask cellene ved å tilsette 150 μL strømningsbuffer og sentrifuger ved 650 × g i 3 minutter ved 4 °C.
- Til slutt, resuspend i 200 μL strømningsbuffer og utføre strømningcytometri for å bestemme transduksjonseffektiviteten (figur 3A, B).
- På dag 8 teller og spinner du ned T-cellene ved 300 × g i 8 minutter ved 4 °C. Resuspend T-cellene med frysemedium (90% FBS + 10% dimetylsulfoksid [DMSO]) i en konsentrasjon på 10 × 106 / ml, og overfør deretter 1 ml hver til merkede kryolegemer.
- Plasser hetteglassene i en -80 °C fryser i 48 timer. Etter 48 timer (og etter dag 10) overfører du T-cellene til flytende nitrogen.
MERK: Se figur 1 for oversikt over NIS+ CAR T celleproduksjon. Figur 3D representerer eksempler på ex vivo T celleutvidelse fra tre forskjellige givere.
- Tjuefire til 48 timer etter T-cellestimulering, utfør lentiviral transduksjon på stimulerte T-celler (T-celler skal danne klynger).
2. NIS+ BCMA-CAR T celleavbildning med [ 18F]TFB-PET-skanning
MERK: Denne protokollen følger retningslinjene i Mayo Clinics institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (IACUC A00001767-16), IRB og IBC (Bios00000006.04). OPM-2 er en BCMA+ MM-cellelinje, som ofte brukes som en målcellelinje for BCMA-CAR T-celler39,40.
- Etabler luciferase+ BCMA+ OPM-2 celler.
- Frø 500.000 OPM-2 celler i en vevskulturbehandlet 24-brønnsplate. Tine lentiviruskoding luciferase-GFP ved 4 °C.
- Tilsett det nytinte viruset på en MOI på 3,0 til OPM-2-celler og bland godt ved pipettering. Plasser platen i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
- Førtiåtte timer etter transduksjonen, tilsett 2 μg/ml puromycin for å velge de transinduserte cellene. Fire dager etter transduksjonen, vurder GFP-positive celler (luciferase-positive) ved strømningscytometri (figur 3E).
- Opprett BCMA+ OPM-2 xenograftmusemodeller (figur 4).
- Tell luciferase+ OPM-2 celler og snurr dem ned to ganger for å fjerne alle cellekulturmedier. Resuspend OPM-2-cellene i en konsentrasjon på 10 × 106 celler/ml med PBS.
- På dag -21 injiserer du 100 μL (1,0 × 106 celler) luciferase+ OPM-2 celler i halene til 8-12 uker gamle immunkompromitterte NOD-scid IL2rγnull (NSG)-mus (figur 4).
- På dag 20 etter OPM-2 celleinjeksjon (dag -1 av CAR T celleinjeksjon), kontroller tumorbyrden via bioluminescensavbildning (BLI) (figur 4).
MERK: OPM-2 celler danner en langsomt voksende svulst, som vanligvis tar 2-3 uker å engraft. - Administrer 10 μL/g D-luciferin til OPM-2 xenograftmus via intraperitoneal (IP) injeksjon. Etter 10 min, utfør BLI på musene under 2% isoflurangass (figur 5A). Etter å ha bekreftet tumor engraftment, randomiser musene i henhold til tumorbyrden.
- På dag -1 av CAR T celleinjeksjon, tine NIS + BCMA-CAR T celler, og fjern frysemediet ved sentrifugering (300 × g, 8 min, 4 °C). Deretter resuspend cellene med TCM på 2,0 × 106 celler / ml og inkubere over natten (37 °C, 5 % CO2).
- På dag 0 teller og sentrifugerer NIS+BCMA-CAR T-cellene (300 × g, 8 min, 4 °C). Bruk NIS+BCMA-CAR T-cellene på nytt ved 50 × 106 celler/ml med PBS.
- Administrer 100 μL (5,0 × 106 celler) av NIS+BCMA-CAR T-celler via hale veneinjeksjon til OPM-2 xenograftmusene. På dag 7 og 15, bilde musene ved hjelp av en PET-skanning.
- NIS+BCMA-CAR T-celle in vivo-avbildning ved hjelp av BCMA+OPM-2 xenograftmusmodell.
- Vei musene før avbildningen, og fjern eventuelle øremerker av metall for å eliminere metallrelaterte artefakter.
- Forbered [18F]TFB som tidligere beskrevet41.
MERK: [18F]TFB må produseres den dagen den brukes. Radiokjemisk renhet bør være >99% og molar aktivitet >5 GBq / mmol. - Injiser 9,25 MBq [18F]TFB intravenøst via hale vene injeksjon. La en opptaksperiode på ~ 40 min for radiotraceren fordeles i kroppen og fjern blodet.
- Bedøv musen ved hjelp av isofluraninnånding (2%).
MERK: Isofluran er det foretrukne inhalerte bedøvelsesmiddelet, da det har rask og pålitelig utbrudd og gjenoppretting. - Før du bedøver musen, rengjør alle overflater av anestesimaskinen med desinfeksjonsmidler.
- Plasser musen inne i induksjonskammeret. Vri fordamperhjulet til 2% og vent til musen blir liggende og ikke-responsiv innen 1-2 min.
- Overvåk musen for å unngå utilstrekkelig anestesi eller overdreven depresjon av åndedrettsfunksjoner. Kort sagt, klyp tå for å bekrefte utilstrekkelig anestesi.
MERK: Den normale åndedrettsfrekvensen er opptil 180/min, og akseptabel fallfrekvens er 50%. - Påfør oftalmisk salve for å unngå hornhinnetørking og traumer.
- Skaff PET/CT-bilder 45 min etter injeksjon med den bedøvede musen i en micro PET/CT-bildearbeidsstasjon (se materialtabellen). Deretter skaffer du statiske PET-bilder i 15 minutter etterfulgt av CT-bildeanskaffelse i 5 minutter med 360 ° rotasjon og 180 projeksjoner ved 500 μA, 80 keV og 200 ms eksponering.
- Analysere innsamvede bildedata
- Analyser bildene ved hjelp av PET-bildebehandlingsprogramvare (figur 5B og ekstra video S1).
- Definer rentevolumet (VOI).
- Beregn den standardiserte opptaksverdien (SUV) ved hjelp av formelen (2).
SUV i VOI = Konsentrasjon av aktivitet i VOI (MBq/ml) × kroppsvekt (g) / administrert dose (MBq) (2)
- Bekreftelse av NIS+BCMA-CAR T cellehandel til tumorstedene med strømningscytometri
- Etter [18F]TFB-PET-avbildning, plasser musen tilbake i buret. Etter opphør av anestesi, overvåke dyrene til de er i stand til målrettet bevegelse og sikre at de har tilgang til mat og vann.
- Overvåk musene til forfallet av den injiserte [18F]TFB. Når radioisotopen ikke kan påvises, avlive musene med CO2.
- For å euthanize, plasser musene i buret (ikke mer enn 5 mus per bur).
- Utsett musene for CO2 til fullstendig opphør av pusten på ca. 5-10 min.
MERK: Denne eutanasimetoden må være i samsvar med AVMA-retningslinjene for Dyrs eutanasi (2020-utgaven). - For å sikre musenes død, utfør cervical dislokasjon ved å gripe baksiden av hodet og bunnen av halen av dyret, og trekk deretter hendene fra hverandre / bort fra hverandre.
- Høst benmargen for å bekrefte at NIS +BCMA-CAR T-cellene effektivt trafikkerer til tumorstedet.
- Overfør de høstede lårbenene og tibia til en 6-brønns plate som inneholder 5 ml cellekulturmedium. Fjern muskler og sener fra lårben og tibia, og bare kutt begge ender (over leddene) av lårbenene og tibia.
- Fyll en insulinsprøyte med cellekulturmediet, og skyll benmargen på 6-brønnsplaten. For lårben, bruk 22 G nåler og 5 ml sprøyter fordi lårdiameteren er større enn tibia.
- Bruk den flate enden av stempelet til å male benmargen. Plasser en 70 μm cellesil på et sterilt 50 ml konisk rør, og filtrer jordbenmargen. Fyll deretter røret med strømningsbufferen, og sentrifuger røret ved 300 × g i 8 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten, og resuspender benmargen med 5 ml strømningsbuffer. Overfør 200 μL benmarg til en 96-brønnsplate. Sentrifuger platen ved 300 × g i 3 min ved 4 °C. Dekanter supernatanten, og resuspender cellene med 50 μL strømningsbuffer.
- Flekk benmargen med strømningsantistoffer mot 0,25 μg mus CD45, 0,03 μg menneskelig CD45, 0,06 μg menneskelig CD3, 0,24 μg menneskelig BCMA og 0,3 μL levende / dødt vann. Inkuber platen i 15 min på RT i mørket.
- Sentrifuger platen ved 300 × g i 3 min ved 4 °C. Deretter legger du til 200 μL strømningsbuffer og kjører på strømningscytometeret (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerer trinnene for å generere NIS+BCMA-CAR T-celler. På dag 0 isolerer du PBMCer og isolerer deretter T-celler ved negativ merking. Stimulere deretter T-celler med anti-CD3 / CD28 perler. På dag 1 transduce T celler med både NIS og BCMA-CAR lentivirus. På dag 3, 4 og 5 teller du T-celler og mater med medier for å justere konsentrasjonen til 1,0 × 106/ml. For NIS-transduserede T-celler legger du til 1 μg/ml puromycin for å velge NIS+- celler. På dag 6 fjerner du perlene ved å plassere cellene i magneten i et minutt. Legg deretter de av-beaded cellene fra røret i en ny kolbe. Ta en aliquot av celler (f.eks. 50.000 celler) og flekk med antistoffer for å sjekke uttrykket av NIS og CAR på overflaten av T-celler ved hjelp av strømningscytometri. På dag 8 teller du T-cellene og kryopreservereren med frysemedier i konsentrasjonen på 10 × 106/ml.
Figur 2 representerer omrisset av titrering av lentivirusene. På dag 0, resuspend T-celler i konsentrasjonen av 1,0 × 106 / ml i TCM. Deretter stimulerer du T-celler med anti-CD3/CD28 perler med et 1:3 celle:perler-forhold. Tilsett 100 μL (100 000 celler) T-celler i de fargede brønnene som angitt i figur 2A. Denne platen kalles en "titerplate". Inkuber titerplaten ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer. På dag 1, forbered fortynningsplaten. Tilsett 100 μL TCM i de fargede brønnene som angitt i figur 2B. Deretter legger du til 50 μL nytinte lentivirus i første rad (f.eks. A6, A7 eller A8 som vist i figur 2B). Utfør seriell fortynning ved å overføre 50 μL fra A6 til B6, og deretter 50 μL fra B6 til C6, gjenta til G6. Utfør seriell fortynning for A7 og A8 også. Overfør deretter 50 μL av det fortynnede viruset til titerplaten. Tjuefire timer etter overføring av viruset fra fortynningsplaten til titerplaten, mate cellene med 100 μL TCM. På dag 3, flekk celler med antistoffer og analysere uttrykket av NIS og BCMA på T-cellene via strømning cytometri.
Figur 3A,B viser de representative strømningsplottene for BCMA-CAR T- eller NIS+BCMA-CAR T-celler. T-celler er inngjerdet på FSC/SSC, etterfulgt av singlet og live-celle diskriminering. Over 90 % av cellene er NIS+-celler (figur 3B). Figur 3C viser den representative strømningsplottet for sammensetningen av NIS+BCMA-CAR T-celler. I likhet med figur 3A, B, er T-celler inngjerdet på FSC / SSC, etterfulgt av singlet og live-celle diskriminering. Figur 3D viser T-celleutvidelseskurven fra dag 0 til 8. Det er ingen forskjeller mellom UTD-, BCMA-CAR T- eller NIS+BCMA-CAR T-celler. Figur 3E viser GFP-uttrykket på OPM-2-celler etter transduksjonen av lentivirus som koder GFP og luciferase etterfulgt av puromycinvalg.
Figur 4 er omrisset av bildebehandling av NIS+BCMA-CAR T-celler in vivo med [18F]TFB-PET. Inokuler seks til åtte uker gamle mus med 1,0 × 106 celler luciferase+ OPM-2 celler via hale vene injeksjon på dag -21. Vurder tumorbyrden med BLI på dag -1. På dag 0, randomiser musene i henhold til tumorbyrden som skal behandles med NIS + BCMA-CAR T-celler gjennom hale veneinjeksjon eller overvåket uten behandling (ubehandlet xenograft). Bilde musene med BLI på dag 6. Utfør [18F]TFB-PET på dag 7 til bilde NIS+BCMA-CAR T-celler.
Figur 5A viser den representative BLI 20 dager etter inokulering av luciferase+OPM-2 celler i NSG-musene. Figur 5B viser den representative PET-avbildningen en uke etter administrering av NIS+BCMA-CAR T-celler. [18F] TFB-opptak observeres i brystbenet, spines, bekken og lårben. I tillegg ses fysiologisk opptak av [18F]TFB i skjoldbruskkjertelen og magen. Figur 5C viser de representative strømningsplottene til lårbensavledede benmarg høstet fra de ubehandlede xenograft- eller NIS+BCMA-CAR T-cellebehandlede musene. Benmargsprøver er farget med mus CD45, menneskelig CD45, menneskelig CD3 og menneskelig BCMA. Celler er inngjerdet på FSC/SSC, etterfulgt av singlet, live og menneskecellediskriminering. Benmargsprøver avledet fra ubehandlet xenograft viser BCMA+ -celler, mens NIS+BCMA-CAR T cellebehandlet mus viser CD3+ -celler, som støtter [18F]TFB-PET-funnet.
Figur 1: NIS+BCMA-CAR T-celleproduksjonsskjema. Normal donor CD3 T celler (isolert fra perifere blod mononukleære celler) ved hjelp av negativ perle utvalg. T-celler er belagt på 1,0 × 106 / ml og utvidet i TCM ved hjelp av anti-CD3 / CD28 perler lagt på dag 0 av kulturen og fjernet på dag 6. T-celler transduseres med lentivirus som koder NIS eller BCMA-CAR på dag 1 (MOI=5,0). NIS+BCMA-CAR T-celler behandles med 1 μg/ml puromycin på dag 3, 4 og 5. T-celler utvides i kultur i 8 dager. T-celler er kryopreservert i FBS med 10% DMSO for fremtidige eksperimenter. T-celler tines og hviles over natten ved 37 °C før alle eksperimenter. Forkortelser: CD = klynge av differensiering; TCM = T celleutvidelsesmedium; BCMA = B celle modning antigen; CAR = chimeric antigen reseptor; NIS = natriumjodid symporter; GFP = grønt fluorescerende protein; PBMC = perifere mononukleære celler i blodet; MOI = multiplisitet av infeksjon; FBS = foster bovint serum; DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lentivirustitrering. (A) På dag 0 stimulerer du T-celler med anti-CD3/CD28-perler med et 3:1 perle:celleforhold. Tilsett 100 μL 1,0 × 106/ml stimulerte T-celler til de fargede brønnene som angitt i tegneserien. Deretter inkuberer du titerplaten ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer (B) Forbered en fortynningsplate ved å tilsette 100 μL TCM til de fargede brønnene som angitt i tegneserien. Tilsett 50 μL ny tint virus til A6, A7 eller A8 (f.eks. BCMA-CAR til A6, NIS til A7 og luciferase-GFP til A8). Deretter fortynner du viruset serielt ved å overføre 50 μL fra A6 til B6, og deretter 50 μL fra B6 til C6, gjenta til G6. Utfør seriell fortynning for A7 og A8 også. Overfør 50 μL av det fortynnede viruset til titerplaten. (C) På dag 3, flekk cellene med tilsvarende antistoffer og analyser titerplaten ved strømningscytometri. Forkortelser: CD = klynge av differensiering; TCM = T celleutvidelsesmedium; BCMA = B celle modning antigen; CAR = chimeric antigen reseptor; NIS = natriumjodid symporter; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Genereringen av NIS+BCMA-CAR T-celler og luciferase-GFP positive OPM-2-celler. (A og B) Celler er inngjerdet på FSC/ SSC, etterfulgt av singlet og live-celle diskriminering. Representative strømningsplott av (A) utransduserede T- og BCMA-CAR T-celler og (B) UTD og NIS+BCMA-CAR T vises. NIS+BCMA-CAR T-celler genereres ved samtidig transduksjon av to virus på dag 1 av T-celleutvidelse, som beskrevet i figur 2. På dag 6 er cellene farget for CARs og NIS. (C) Fenotypisk analyse av NIS+BCMA-CAR T. Den representative strømningsplottet for NIS+BCMA-CAR T-celler vises. (D) Sammendrag av UTD, BCMA-CAR T eller NIS+BCMA-CAR T cellevekstkinetikk. Inkorporering av BCMA-CAR og/eller NIS påvirker ikke T-celleutvidelsen (toveis ANOVA, n=3 biologiske replikeringer, gjennomsnitt ± SD). (E) Strømningscytometrisk analyse av luciferase-GFP-transdusert OPM-2. OPM-2 celler transduseres med lentiviruskoding luciferase-GFP med puromycinmotstand. Førtiåtte timer etter transduksjon behandles OPM-2 celler med 2 μg/ml puromycin. Celler utvides i to dager til, og uttrykket for GFP analyseres via strømningscytometri. Forkortelser: CD = klynge av differensiering; BCMA = B celle modning antigen; CAR = chimeric antigen reseptor; NIS = natriumjodid symporter; GFP = grønt fluorescerende protein; UTD = utransdusert; FSC/SSC = fremoverspredning/sidespredning; ANOVA = variansanalyse; n.s.= ikke signifikant; SD = standardavvik; FL-1-A = arealet av fluorofor 1; FITC-A = arealet av fluorescein isothiocyanate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ordning for in vivo trafficking analyse i en systemisk OPM2 xenograft modell. Injiser seks til åtte uker gamle NSG-mus med 1,0 × 106 luciferasepositive OPM-2-celler via halevenen på dag -21. På dag -1, utfør bioluminescent avbildning på musene for å bekrefte engraftment av OPM-2 celler. På dag 0 injiserer du mus med 5,0 × 106 NIS+BCMA-CAR T-celler. Bildemus med [18F]TFB-PET/CT på dag 7 for å vurdere smuglingen av NIS+BCMA-CAR T-celler. Forkortelser: BCMA = B celle modning antigen; CAR = chimeric antigen reseptor; NIS = natriumjodid symporter; BLI = bioluminescent avbildning; NSG = immunkompromittert NOD-scid IL2rγnull; luc = luciferase; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroborate positron utslipp tomografi/beregnet tomografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: In vivo trafficking analyse i en systemisk OPM2 xenograft modell. (A og B) BCMA+luciferase+OPM2-celler injiseres intravenøst i NSG-mus. Mus får NIS+BCMA CAR T-celler tre uker etter inokulering av OPM-2-celler. (A) BLI bekrefter engraftment av OPM-2 celler. (B) [18F]TFB-PET avslører NIS+BCMA-CAR T cellehandel til benmargen. (C) For å bekrefte at OPM-2 celler engraft i benmargen og NIS + BCMA-CAR T celler trafikk til svulststedet, mus er euthanized etter avbildning, og benmargen er høstet. Flow cytometrisk analyse viste at OPM-2 celler er engrafted i benmargen (venstre), og NIS + BCMA-CAR T celler er til stede i benmargen (høyre). Forkortelser: BCMA = B celle modning antigen; CAR = chimeric antigen reseptor; NIS = natriumjodid symporter; BLI = bioluminescent avbildning; NSG = immunkompromittert NOD-scid IL2rγnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroborate positron utslipp tomografi / beregnet tomografi; IVIS = in vivo bildebehandlingssystem; CD = differensieringsklynge; SUV = standardisert opptaksverdi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ekstra video S1: Tredimensjonal (3D) gjengivelse av PET/CT-data som viser in vivo-fordelingen av [18F]TFB i skjoldbruskkjertelen, magen og benmargen. Forkortelser: BCMA = B celle modning antigen; CAR = chimeric antigen reseptor; NIS = natriumjodid symporter; PET/CT = positronutslippstomografi/beregnet tomografi. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver en metodikk for å inkorporere NIS i CAR T-celler og avbildning infundert CAR T celler in vivo gjennom [18F]TFB-PET. Som konseptbevis ble NIS+BCMA-CAR T-celler generert via dobbel transduksjon. Vi har nylig rapportert at inkorporering av NIS i CAR T-celler ikke svekker CAR T-cellefunksjoner og effekt in vivo og tillater CAR T cellehandel og utvidelse30. Ettersom CAR T-celleterapier fortsetter å ekspandere utover dagens B-celle maligniteter til applikasjoner i CLL, vil det være et større behov for verktøy som tillater ikke-invasiv in vivo-avbildning og overvåking av infunderte adoptive T-celler. Dynamisk avbildning av T-celler vil muliggjøre validering av adoptiv T-cellehandel og potensielt tillate tidligere påvisning av effekt og toksisitet.
NIS er undersøkt og validert som en sensitiv modalitet for bildeceller og virus i kliniske studier32,42. Fysiologisk akkumulering av sporstoffer for NIS er hovedsakelig sett i skjoldbruskkjertelen / spyttkjertlene, magen og blæren, som ikke er vanlige organer påvirket av flytende svulster44. Spesielt i MM fordeles ondartede plasmaceller ofte i benmargen eller beinene, og et ekstramedullært plasmacytom i lesjoner, hvor den fysiologiske opphopningen av sporstoffer for NIS oppstår, er et sjeldent fenomen44,45. Videre er NIS ikke-immunogen og derfor egnet for langsgående avbildningsstudier46. NIS er et iboende membranprotein som transporterer jod inn i cytosolen og inneholder 13 putative transmembrane segmenter med et ekstracellulært amino terminussted og cytosolisk karboksy terminus47.
NIS kan visualiseres med gamma- eller positron-emitterende radioisotoper som technetium-99m (99mTc) pertechnetate, jod-123 (123I), 131I, 124I og [18F]TFB43. Nylig har [18F]TFB dukket opp som en lovende jodanalog for NIS-basert PET-avbildning, da den har lignende biokjemiske egenskaper og er radiosyntetisert48. En fordel med TFB er at den ikke gjennomgår organifisering i skjoldbruskceller og derfor har et relativt mildt opptak i normalt skjoldbruskvev48. En annen fordel med TFB er den korte halveringstiden på 109,8 min, mens halveringstiden til andre tracere varierer fra 12 timer til 8 dager, noe som kan presentere sikkerhetsproblemer for kliniske applikasjoner49. Hovedbegrensningen ved NIS-basert CAR T-celleavbildning er at sporstoffer, inkludert TFB, ikke trenger inn i blod-hjernebarrieren (BBB), noe som gjør det vanskelig å vurdere nevrotoksisitet etter CAR T-cellebehandling50,51,52,53.
Nevrotoksisitet er forbundet med infiltrasjon av T-celler og aktivering av myeloide celler i sentralnervesystemet. Men i de fleste tilfeller av nevrotoksisitet etter CAR T celleterapi, er integriteten til BBB forstyrret50,54. Derfor er det uklart om traceren ikke klarer å krysse BBB i denne kompromitterte innstillingen. Videre studier må utføres for å validere om nevrotoksisitet etter CAR T celleterapi kan avbildes med [18F]TFB-PET. Selv om den korte halveringstiden til [18F]TFB er trygg for pasienter og ansatte, gjør det anskaffelsen vanskelig for sykehuset. Derfor må institutter være utstyrt med syklotroner eller ha tilgang til et regionalt anlegg. Metodikken som er beskrevet i protokollen her, kan potensielt brukes på en rekke andre CAR T-celler via dobbel transduksjon for å visualisere og vurdere CAR T-celler in vivo ved hjelp av [18F]TFB-PET-skanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SSK er oppfinner på patenter i CAR-immunterapi lisensiert til Novartis (gjennom en avtale mellom Mayo Clinic, University of Pennsylvania og Novartis) og Mettaforge (gjennom Mayo Clinic). RS, MJC og SSK er oppfinnere på patenter innen CAR-immunterapi som er lisensiert til Humanigen. SSK mottar forskningsmidler fra Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs og Lentigen. Tall ble opprettet med BioRender.com.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet gjennom Mayo Clinic K2R-rørledningen (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) og Predolin Foundation (RS). Figur 1, 2 og 4 ble opprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
| 28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
| Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
| Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
| Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
| Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
| BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
| CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
| CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
| Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
| Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
| Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
| IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
| IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
| Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
| Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
| OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
| pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
| RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
| SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| T175 flask | Corning | 353112 | |
| Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
References
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
- Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
- Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
- Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
- Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
- Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
- Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
- Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
- Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
- Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
- Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
- Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
- Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
- Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
- Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
- Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
- Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
- Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
- Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
- Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
- Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
- Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
- Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
- Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
- Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
- Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
- Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
- Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
- Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
- Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
- Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
- Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
- Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
- Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
- Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
- Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
- Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
- Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
- Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
- Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
- Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
- Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
- Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
- Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
- Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
- Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
- Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
- Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
- Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
- Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
![Dynamisk avbildning av chimeriske antigenreseptor T-celler med [<sup>18F</sup>]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/62334.jpg)
