Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Dynamisk avbildning av chimeriska antigenreceptor T-celler med [18F]Tetrafluorborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

Detta protokoll beskriver metoden för icke-invasiv spårning T-celler genetiskt konstruerade för att uttrycka chimeric antigen receptorer in vivo med en kliniskt tillgänglig plattform.

Abstract

T-celler som är genetiskt konstruerade för att uttrycka chimeriska antigenreceptorer (CAR) har visat oöverträffade resultat i pivotala kliniska prövningar för patienter med B-cells maligniteter eller multipelt myelom (MM). Många hinder begränsar dock effektiviteten och förbjuder utbredd användning av CAR T-cellterapier på grund av dålig handel och infiltration i tumör platser samt brist på uthållighet in vivo. Dessutom är livshotande toxiciteter, såsom cytokinfrisättningssyndrom eller neurotoxicitet, stora problem. Effektiv och känslig avbildning och spårning av CAR T-celler möjliggör utvärdering av T-cellhandel, expansion och in vivo-karakterisering och möjliggör utveckling av strategier för att övervinna de nuvarande begränsningarna för CAR T-cellterapi. I detta dokument beskrivs metoden för att införliva natriumjodid symportören (NIS) i CAR T-celler och för CAR T-cell imaging med [18F]tetrafluorborate-positron emission tomography ([18F]TFB-PET) i prekliniska modeller. De metoder som beskrivs i detta protokoll kan tillämpas på andra CAR-konstruktioner och målgener utöver de som används för denna studie.

Introduction

Chimeric antigen receptor T (CAR T) cellterapi är en snabbt framväxande och potentiellt botande strategi i hematologiska maligniteter1,2,3,4,5,6. Extraordinära kliniska resultat rapporterades efter CD19-riktad CAR T (CART19) eller B cell mognad antigen (BCMA) CAR T cellterapi2. Detta ledde till det amerikanska food and drug administration (FDA) godkännandet av CART19-celler för aggressivt B-cellslymfom (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3, och lisocabtagene maraleucel)7, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene autoleuce)9, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene autoleuce)7, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene autoleuce)9, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene autoleuce)9, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene autoleuce)9, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene autoleuce)9, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene autoleuce)9, akut lymfatisk leukemi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellslymfom (brexucabtagene auto . Senast godkände FDA BCMA-riktad CAR T-cellbehandling hos patienter med multipelt myelom (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Dessutom är CAR T-cellterapi för kronisk lymfatisk leukemi (KLL) i sen klinisk utveckling och förväntas få FDA-godkännande inom de närmaste tre åren1.

Trots de oöverträffade resultaten av CAR T-cellterapi begränsas dess utbredda användning av 1) otillräcklig in vivo CAR T-cellexpansion eller dålig handel med tumörplatser, vilket leder till lägre frekvenser av varaktig respons12,13 och 2) utvecklingen av livshotande biverkningar, inklusive cytokinfrisättningssyndrom (CRS)14,15 . Kännetecknen för CRS inkluderar inte bara immunaktivering som resulterar i förhöjda nivåer av inflammatoriska cytokiner/ kemoker utan också massiv T-cellsproliferation efter CAR T-cellsinfusion15,16. Utvecklingen av en validerad, klinisk strategi för att avbilda CAR T-celler in vivo skulle således möjliggöra 1) CAR T-cellspårning i realtid in vivo för att övervaka deras handel med tumörplatser och avslöja potentiella resistensmekanismer, och 2) övervakning av CAR T-cellexpansion och potentiellt förutsäga deras toxicitet såsom utvecklingen av CRS.

Kliniska funktioner av mild CRS är hög feber, trötthet, huvudvärk, utslag, diarré, artralgi, myalgi och sjukdom. I allvarligare CRS kan patienter utveckla takykardi/hypotoni, kapillär läcka, hjärt dysfunktion, njurmedicinska/lever misslyckande och spridas intravaskulära koagulering17,18. I allmänhet har graden av höjning av cytokiner, inklusive interferon-gamma, granulocyt-makrofag koloni-stimulerande faktor, interleukin (IL)-10 och IL-6, visat sig korrelera med svårighetsgraden av kliniska symtom17,19. Den omfattande tillämpningen av "realtid" serum cytokin övervakning för att förutsäga CRS är dock svårt på grund av den höga kostnaden och begränsad tillgänglighet. För att utnyttja de fördelaktiga egenskaperna hos CAR T cellterapi, icke-invasiv imaging av adoptiv T celler kan potentiellt användas för att förutsäga effekt, toxicitet och återfall efter CAR T cell infusion.

Flera forskare har utvecklat strategier för att använda radionuklidbaserad avbildning med positrutsläppstomografi (PET) eller enfotonutsläppsberäkningstomografi (SPECT), vilket ger hög upplösning och hög känslighet20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 för in vivo visualisering och övervakning av CAR T-cellhandel. Bland dessa radionuklidbaserade bildstrategier har natriumjodid symportören (NIS) utvecklats som en känslig modalitet för bildceller och virus med PET-skanningar31,32. NIS + CAR T-cellavbildning med [18F]TFB-PET är en känslig, effektiv och bekväm teknik för att bedöma och diagnostisera CAR T-cellsexpansion, handel och toxicitet30. Detta protokoll beskriver 1) utvecklingen av NIS + CAR T-celler genom dubbel transduktion med hög effekt och 2) en metod för avbildning NIS + CAR T celler med [18F]TFB-PET scan. BCMA-CAR T celler för MM används som en proof-of-concept modell för att beskriva NIS som en reporter för CAR T cell imaging. Dessa metoder kan dock tillämpas på alla andra CAR T-cellterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet följer riktlinjerna från Mayo Clinics institutionella granskningsnämnd, institutional biosafety committee och Mayo Clinic's Institutional Animal Care and Use Committee.

1. NIS+ BCMA-CAR T-cellproduktion

OBS: Detta protokoll följer riktlinjerna från Mayo Clinic's Institutional Review Board (IRB 17-008762) och Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).

  1. Produktion av BCMA-CAR, NIS och luciferasgrönt fluorescerande protein (GFP)-kodning lentivirus.
    OBS: En andra generationens BCMA-CAR konstruktion syntetiserades de novo (se tabellen över material) och klonades till en tredje generationens lentiviral vektor under kontroll av en förlängning faktor-1 alfa (EF-1α) promotor. BCMA-CAR konstruktionen (C11D5.3-41BBz) inkluderade 4-1BB costimulering och en enda kedja variabel fragment (scFv) härrör från en anti-human BCMA antikropp klon C11D5.333,34. NIS kontrolleras av EF-1α promotor och binder till puromycinresistensgenen via självklyvande peptider (P2A). Den lentivirala vektorkodning luciferas-GFP (se tabellen över material) används för att omvandla tumörceller, som sedan uttrycker GFP och luciferas.
    1. Förbered lentivirala vektorplasmider: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) och pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      OBS: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro och pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro innehåller puromycinresistensgenen. Därför kan NIS- eller luciferas-GFP-transduced celler väljas med 1 μg/ml eller 2 μg/ml puromycin dihydroklorid, enligt beskrivningen tidigare14,35.
    2. Frö 20 × 106 av 293T celler i en T175-kolv och inkubera i 24 timmar vid 37 °C med 5% CO2. Bekräfta att 293T-celler är jämnt fördelade på kolven vid 70-90% sammanflöde genom direkt visualisering under mikroskopet.
    3. Förbered en huvudblandning av 15 μg av uttrycksvektorn (t.ex. CAR, NIS eller luciferas-GFP linjärt DNA), 7 μg av kuvertvektorn (VSV-G) och 18 μg av förpackningsvektorn (munkavle, pol, rev och tat). Späd UT DNA-masterblandningen i 4,5 ml av transfekteringsmediet och tillsätt sedan 111 μL av förkomplexeringsreagenset (blandning A).
    4. Förbered ett nytt rör och späd 129 μL av liposomomtransfekteringsreagenset i 4,5 ml av transfekteringsmediet (blandning B).
    5. Kombinera blandningar A och B och snärta röret för att blanda innehållet. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur (RT).
    6. Efter inkubationen, aspirera helt enkelt cellen supernatant utan att lossa cellerna och tillsätt 16 ml av ett tillväxtmedium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin-glutamin. Tillsätt sedan blandningen av blandningar A och B på 293T-celler droppvis. Slutligen inkubera de transfekterade cellerna vid 37 °C, 5% CO2 för 24 h.
    7. På dag 1 och 2 efter transfektering, skörda supernatanten på 293T, snurra ner vid 900 × g i 10 min och filtrera genom ett 0,45 μm nylonfilter. Koncentrera filtratet vid 24 och 48 h genom ultracentrifugation vid 112 700 × g i 2 timmar och frys vid -80 °C.
  2. Ex-vivo Isolering av T-celler (bild 1)
    OBS: Utför allt cellodlingsarbete i ett laminärt flödesskåp med aseptisk teknik och personlig skyddsutrustning. Perifera blod mononukleära celler (PBMCs) skördas från friska frivilliga donatorblod som samlats in under aferes36. Patogen screening utfördes på mänskliga celler som används i denna studie.
    1. Använd standarddensitetsgradienttekniken för att isolera PBBC: er.
      1. Tillsätt försiktigt 15 ml densitetsgradientmedium (densitet på 1,077 g/mL) (innehållande alfa-D-glukoskopiranoside, beta-D-fructofuranosyl homopolymer och, 3-(acetylamino)-5-(acetylmethylamino)-2,4,6-triodobenzosyra monosodiumsalt) till en 50 ml densitetsseparationsrör).
      2. För att undvika cellfångst, späd ut blodprovet med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,2 g/L kaliumklorid, 0,2 g/L kaliumfosfatmonbasisk, 8 g/L natriumklorid och 1,15 g/L natriumfosfatdibasic) innehållande 2 % FBS vid ett volymförhållande på 1:1. Överför försiktigt det utspädda blodet ovanpå densitetsgradientmediet utan att bryta gränssnittet mellan de två. Snurra ner på 1200 × g i 10 min på RT.
        OBS: Ett 50 ml densitet gradient separationsrör kan användas för isolering av 4-17 ml av ett blodprov. Det 50 ml densitetsgradientsseparationsrör (se materialtabellen) som används i detta protokoll kräver inte "broms av" under centrifugeringen. Men när standardrör på 50 ml används måste bromsen vara avstängd och kräver 30 minuters centrifugering.
      3. Överför supernatanten till ett nytt koniskt rör på 50 ml, tvätta med PBS + 2% FBS genom att fylla upp till 50 ml och snurra sedan ner vid 300 × g i 8 min på RT.
      4. Aspirera supernatanten och återanvänd de pelleterade cellerna i 50 ml PBS + 2% FBS. Räkna antalet celler och snurra sedan ner vid 300 × g i 8 min vid RT. Upprepa föregående steg för totalt 2 tvättar.
    2. Aspirera på supernatanten och återanvänd de pelleterade cellerna till en koncentration av 50 × 106 celler/ml med PBS + 2% FBS.
    3. Utför T-cellsisolering från PBBC med hjälp av ett negativt urval magnetiskt pärlkit.
      OBS: Ett idealiskt negativt urvalskit innehåller magnetiska pärlor fästa vid antikroppar mot antigener uttryckta på andra celler än T-celler. Ett vanligt kit innehåller antikroppar som är konjugerade med magnetiska pärlor mot CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 och CD16 (se Tabell över material).
      1. Överför PBMCs till ett 14 mL polystyren rundbottnat rör. Placera sedan PBMCs och den negativa urvalsantikroppscocktailen i en helautomatisk cellavskiljare och utför T-cellsisolering enligt tillverkarens protokoll.
  3. T-cellsstimulering och T-cellsexpansion (figur 1)
    1. För att odla de isolerade T-cellerna, förbered T cell expansion medium (TCM) gjord med serumfria hematopoetiska cellmedium kompletterat med 10% humant serum albumin och 1% penicillin-streptomycin-glutamin14. Efter T-cellsisolering, räkna cellerna och kulturen vid en koncentration av 2 × 106 celler/ml med TCM.
    2. Tvätta anti-CD3/CD28 pärlor tre gånger med TCM innan du odling med T-celler.
      1. Blanda injektionsflaskan som innehåller pärlorna genom att virvla runt. Pipettera sedan den önskade volymen pärlor (3:1 pärlor: cell) (t.ex. när du stimulerar 1,0 × 106 celler av T-celler, använd 3,0 × 106 anti-CD3 / CD28 pärlor) i ett sterilt mikrocentrifugerör (1,5 ml) och återanvänds i 1 mL TCM.
    3. Placera mikrocentrifugeröret med pärlorna på en magnet i 1 min och aspirera supernatanten. Ta bort röret från magneten och återanvänd de tvättade pärlorna i 1 ml TCM. Upprepa de föregående två stegen för totalt 3 tvättar.
    4. Återsuspend pärlor i 1 ml TCM och överföra dem till T-cellerna. Späd sedan ut T-cellerna till en slutlig koncentration av 1,0 × 106 celler/ml med TCM. Överför T-cells-/pärlsuspensionen till en vävnadsodlingsbehandlad 6-brunnsplatta och placera den i inkubatorn (37 °C, 5% CO2).
  4. Titrering av lentivirus (figur 2)
    1. Förbered T-celler för titreringsanalys. Se till att cirka 1,0 x 106 celler är tillgängliga för att titrera en typ av virus.
    2. Stimulera T-celler enligt beskrivningen i avsnitt 1.3.2.
    3. Platta 1,0 × 105 celler av stimulerade T-celler i en 96-välplatta (titerplatta) och inkubera vid 37 °C, 5% CO2 för 24 h (figur 2A). Isolera och stimulera T-cellerna enligt beskrivningen i avsnitt 1.2.
    4. Förbered en utspädningsplatta (96-brunnsplatta) genom att tillsätta 100 μL TCM i brunnarna i de avsedda kolonnerna och de oöversatta kontrollbrunnarna (figur 2B).
    5. Tina en flaska lentivirala partiklar på is och rör försiktigt upp och ner för att blanda väl. Överför 50 μL av virussövernatanten till brunnarna i kolumn 6 på 96-brunnsplattan (utspädning 3) (figur 2B). Pipettera upp och ner för att blanda väl.
    6. Utför seriella utspädningar (2-faldig seriell utspädning): överför 50 μL från brunn A6 till brunn B6 och sedan 50 μL från brunn B6 till brunn C6; upprepa till G6. Tillsätt sedan 50 μL av det utspädda viruset till titerplattan (figur 2B).
    7. Inkubera titerplattan vid 37 °C, 5% CO2 i 48 timmar och bestäm procentandelarna av CAR-, NIS- eller GFP-positiva celler efter flödescytometri (figur 2C).
      1. Tvätta brunnarna genom att snurra ner titerplattan två gånger vid 650 × g vid 4 °C i 3 min.
      2. Färga de transduced T-cellerna enligt beskrivningen i steg 1.5.3 till 1.5.9.
      3. Bestäm titererna baserat på procentandelarna CAR-, NIS- eller GFP-positiva celler med hjälp av formeln (1):
        Titrar = Procentandel BCMA-CAR+ eller NIS+ T-celler × T-cellantal vid transduktion × den specifika utspädningen/ volymen (1)
  5. Transduktion av lentivirus och NIS+BCMA-CAR T-cellsexpansion
    1. Tjugofyra till 48 h efter T-cellsstimulering, utför lentiviral transduktion på stimulerade T-celler (T-celler bör bilda kluster).
      1. Tina de frysta lentivirus som kodar CAR eller NIS vid 4 °C.
      2. Blanda de stimulerade T-cellerna väl för att bryta upp klustren och tillsätt helt enkelt nyupptinat virus vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 5,0 (när du omvandlar 1,0 × 106 T-celler, använd 5,0 × 106 av lentivirons). Inkubera de transduced cellerna vid 37 °C, 5% CO2.
      3. På dag 3, 4 och 5 räknar du de transduced T-cellerna med hjälp av en hematocytometer37 eller en helautomatisk cellräknare38 och justerar cellkoncentrationen till 1,0 × 106 celler/ml genom att tillsätta färsk, förvärmd TCM. För NIS-transduced T-celler som bär puromycinresistensgenen, behandla cellerna med 1 μg/ml puromycindihydroklorid dag 3, 4 och 5.
    2. På dag 6, ta bort anti-CD3/ CD28 pärlor från de transduced T-cellerna (från steg 1.3.4) genom att blanda väl för att bryta upp T-cellklustren och placera dem i en magnet i 1 min. Placera sedan helt enkelt de insamlade transduced T-cellerna tillbaka i kulturen vid en koncentration av 1,0 × 106 celler/ ml. Efter att ha tagit bort pärlor från T-cellerna, utvärdera uttrycket av CAR och NIS genom flöde cytometri.
      OBS: Eftersom det enkedjiga variabelfragmentet i BCMA-CAR härleds från musen kan det färgas med get antimus IgG (H +L) konjugerad med Alexa Fluor 647. NIS kan detekteras med anti-human ETNL [syntetisk peptid motsvarande aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Denna antikropp känner igen den cytosoliska C-ändstationen av NIS. Därför måste T-celler permeabiliseras före inkubation med en anti-human NIS-antikropp.
    3. Utför ytfärgning av BCMA-CAR med get antimus IgG (H +L).
      1. Ta en alikvot av kulturen (t.ex. 50 000 T-celler) och tvätta med flödesbuffert (PBS, 1% FBS och 1% natriumazid). Därefter återanvänder du cellerna med 50 μL flödesbuffert och färgar cellerna med 1 μL getantikropp för påvisande av CAR-uttryck och 0,3 μL levande död aqua för uteslutning av döda celler.
      2. Inkubera i 15 minuter i mörker vid RT, tvätta cellerna genom att tillsätta 150 μL flödesbuffert och centrifugera cellerna vid 650 × g i 3 min vid 4 °C.
    4. Efter ytan CAR färgning, fixera och permeabilisera cellerna genom att tillsätta 100 μL fixeringsmedel (PBS med 4,21% formaldehyd) och inkubera i 20 min vid 4 °C. Tvätta cellerna två gånger med 100 μL av en buffert som innehåller ett cellpermeabiliserande medel som saponin (650 × g i 3 min vid 4 °C).
    5. Återsuspend de fasta/permeabiliserade cellerna i 50 μL av en permeabiliserande buffert. Tillsätt sedan 0,3 ng anti-human ETNL NIS-antikropp i 50 μL flödesbuffert och inkubera i 1 h vid 4 °C.
    6. Tillsätt 150 μL flödesbuffert och centrifugera cellerna vid 650 × g i 3 min vid 4 °C. Inkubera cellerna med 2,5 μL sekundär antikropp mot kanin i 50 μL flödesbuffert i 30 min vid 4 °C, tvätta cellerna genom att tillsätta 150 μL flödesbuffert och centrifugera vid 650 × g i 3 min vid 4 °C.
    7. Slutligen, återutnyttja i 200 μL flödesbuffert och utföra flödescytometri för att bestämma transduktionseffektiviteten (figur 3A,B).
    8. På dag 8 räknar och snurrar du ner T-cellerna vid 300 × g i 8 min vid 4 °C. Resuspend T-cellerna med frysmedium (90% FBS + 10% dimetyllsulfoxid [DMSO]) vid en koncentration av 10 × 106/ml, överför sedan 1 ml vardera till märkta cryovials.
    9. Placera injektionsflaskan i en frys på -80 °C i 48 timmar. Efter 48 timmar (och dag 10), överför T-cellerna till flytande kväve.
      OBS: Se figur 1 för översikt över NIS+ CAR T-cellproduktion. Figur 3D representerar exempel på ex vivo T-cellexpansion från tre olika givare.

2. NIS+ BCMA-CAR T-cellsavbildning med [ 18F]TFB-PET-skanning

OBS: Detta protokoll följer riktlinjerna från Mayo Clinic's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767-16), IRB och IBC (Bios00000006.04). OPM-2 är en BCMA+ MM-cellinje, som ofta används som en målcelllinje för BCMA-CAR T-celler39,40.

  1. Upprätta luciferas+ BCMA+ OPM-2-celler.
    1. Frö 500,000 OPM-2 celler i en vävnad kulturbehandlad 24-väl tallrik. Tina lentivirus kodning luciferas-GFP vid 4 °C.
    2. Tillsätt det nyupptinade viruset vid en MOI på 3,0 till OPM-2-celler och blanda väl genom pipettering. Placera plattan i inkubatorn (37 °C, 5% CO2).
    3. Fyrtioåtta timmar efter transduktionen tillsätt 2 μg/ml puromycin för att välja de transduced cellerna. Fyra dagar efter transduktionen, utvärdera de GFP-positiva cellerna (luciferaspositiva) efter flödescytometri (figur 3E).
  2. Upprätta BCMA+ OPM-2 xenograftmusmodeller (figur 4).
    1. Räkna luciferas+ OPM-2-celler och snurra ner dem två gånger för att ta bort alla cellodlingsmedium. Återsuspend OPM-2 cellerna vid en koncentration av 10 × 106 celler/ml med PBS.
    2. På dag -21 injicerar du 100 μL (1,0 × 106 celler) av luciferas+ OPM-2-celler i svansarna på 8 till 12 veckor gamla immunkomprometterade NOD-scid IL2rγnull (NSG) möss (figur 4).
    3. På dag 20 efter OPM-2 cell injektion (dag -1 av CAR T cell injektion), kontrollera tumörbördan via bioluminescens imaging (BLI) (figur 4).
      OBS: OPM-2 celler bildar en långsamt växande tumör, som vanligtvis tar 2-3 veckor att engraft.
    4. Administrera 10 μL/g D-luciferin till OPM-2 xenograft möss via intraperitoneal (IP) injektion. Efter 10 min, utför BLI på mössen under 2% isoflurangas (figur 5A). Efter att ha bekräftat tumör engraftment, randomisera mössen enligt tumörbördan.
    5. På dag -1 av CAR T-cellsinjektionen tina NIS+BCMA-CAR T-celler och avlägsna frysmediet genom centrifugering (300 × g, 8 min, 4 °C). Därefter återanvänds cellerna med TCM vid 2,0 × 106 celler/ ml och inkuberar över natten (37 °C, 5% CO2).
    6. På dag 0 räknar och centrifugerar NIS+BCMA-CAR T-cellerna (300 × g, 8 min, 4 °C). Återanvänd NIS+BCMA-CAR T-cellerna vid 50 × 106 celler/ml med PBS.
    7. Administrera 100 μL (5,0 × 106 celler) NIS+BCMA-CAR T-celler via svansveninjektion till OPM-2 xenograftmöss. På dag 7 och 15, avbilda mössen med en PET-skanning.
  3. NIS+BCMA-CAR T-cell in vivo imaging med BCMA+OPM-2 xenograft musmodell.
    1. Väg mössen före avbildningen och ta bort eventuella öronmärken i metall för att eliminera metallrelaterade artefakter.
    2. Förbered [18F]TFB enligt tidigare beskrivna41.
      OBS: [18F]TFB måste framställas samma dag som den används. Radiokemisk renhet bör vara >99% och molaraktivitet >5 GBq/mmol.
    3. Injicera 9,25 MBq [18F]TFB intravenöst via svansveninjektion. Låt en upptagsperiod på ~40 min för radiotraceret fördelas i kroppen och rensa blodet.
    4. Bedöva musen med isofluraninandning (2%).
      OBS: Isofluran är det föredragna inhalerade bedövningsmedlet eftersom det har snabb och tillförlitlig debut och återhämtning.
    5. Innan du bedövar musen, rengör alla ytor på anestesimaskinen med desinfektionsmedel.
    6. Placera musen inuti induktionskammaren. Vrid vaporizer-ratten till 2% och vänta på att musen blir liggande och svarar inte inom 1-2 min.
    7. Övervaka musen för att undvika otillräcklig anestesi eller överdriven depression av andningsfunktioner. Kort sagt, nyp toe för att bekräfta den otillräckliga anestesin.
      OBS: Den normala andningsfrekvensen är upp till 180/min, och den acceptabla fallfrekvensen är 50%.
    8. Applicera oftalmisk salva för att undvika hornhinnans torkning och trauma.
    9. Skaffa PET/CT-bilder 45 min efter injektionen med den sövda musen i en mikro PET/CT-bildstation (se materialförteckningen). Därefter skaffa statiska PET-bilder för 15 min följt av CT-bildförvärv för 5 min med 360° rotation och 180 projektioner vid 500 μA, 80 keV och 200 ms exponering.
  4. Analysera förvärvade bilddata
    1. Analysera bilderna med hjälp av PET-bildbehandlingsprogram (figur 5B och kompletterande video S1).
    2. Definiera intressevolymen (VOI).
    3. Beräkna det standardiserade upptagningsvärdet (SUV) med hjälp av formel (2).
      SUV i VOI = Koncentration av aktivitet i VOI (MBq/mL) × kroppsvikt (g) / administrerad dos (MBq) (2)
  5. Bekräftelse av NIS+BCMA-CAR T-cellhandel till tumörplatserna med flödescytometrin
    1. Efter [18F]TFB-PET imaging, placera musen tillbaka i buret. Efter avslutad anestesi, övervaka djuren tills de kan målmedvetet röra sig och se till att de har tillgång till mat och vatten.
    2. Övervaka mössen tills de injicerade [18F]TFB förfaller. När radioisotopen inte kan upptäckas avlivas mössen med CO2.
    3. För att avliva, placera mössen i buret (högst 5 möss per bur).
    4. Utsätt mössen för CO2 tills andningen är klar på cirka 5-10 minuter.
      OBS: Denna dödshjälpsmetod måste vara förenlig med AVMA:s riktlinjer för djurs dödshjälp (2020 års utgåva).
    5. För att säkerställa mössens död, utför livmoderhalsförskjutning genom att ta tag i baksidan av huvudet och basen av djurets svans och dra sedan händerna isär / bort från varandra.
    6. Skörda benmärgen för att bekräfta att NIS + BCMA-CAR T-cellerna effektivt trafikerar till tumörplatsen.
    7. Överför de skördade lårbenen och skenbenet till en 6-välplatta som innehåller 5 ml cellodlingsmedium. Ta bort musklerna och senorna från lårbenen och skenbenet och skär helt enkelt båda ändarna (ovanför lederna) i lårbenen och skenbenet.
    8. Fyll en insulinspruta med cellodlingsmediet och spola benmärgen på 6-brunnsplattan. För lårben, använd 22 G nålar och 5 ml sprutor eftersom lårbensdiametern är större än skenbenets.
    9. Använd kolvens plana ände för att mala benmärgen. Placera en 70 μm cellsil på ett sterilt koniskt rör på 50 ml och filtrera den malda benmärgen. Fyll sedan röret med flödesbufferten och centrifugera röret vid 300 × g i 8 min vid 4 °C.
    10. Aspirera supernatanten och återanvända benmärgen med 5 ml flödesbuffert. Överför 200 μL benmärg till en 96-väl tallrik. Centrifugera plattan vid 300 × g i 3 min vid 4 °C. Dekantera supernatanten och återanvänd cellerna med 50 μL flödesbuffert.
    11. Färga benmärgen med flödesantikroppar mot 0,25 μg mus CD45, 0,03 μg human CD45, 0,06 μg human CD3, 0,24 μg human BCMA och 0,3 μL levande/död aqua. Inkubera plattan i 15 minuter på RT i mörker.
    12. Centrifugera plattan vid 300 × g i 3 min vid 4 °C. Tillsätt sedan 200 μL flödesbuffert och kör på flödescytometern (figur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 representerar stegen för att generera NIS+BCMA-CAR T-celler. På dag 0 isolerar du PBMCs och isolerar sedan T-celler genom negativ markering. Stimulera sedan T-celler med anti-CD3 / CD28 pärlor. På dag 1, transducera T-celler med både NIS och BCMA-CAR lentiviruses. På dag 3, 4 och 5, räkna T-celler och mata med media för att justera koncentrationen till 1,0 × 106/ml. För NIS-transduced T-celler, tillsätt 1 μg/ml puromycin för att välja NIS+ celler. På dag 6, ta bort pärlorna genom att placera cellerna i magneten i en minut. Lägg sedan de-pärlcellerna från röret i en ny kolv. Ta en alikvot av celler (t.ex. 50 000 celler) och fläcka med antikroppar för att kontrollera uttrycket av NIS och CAR på ytan av T-celler med flödescytometri. På dag 8, räkna T-cellerna och kryopreserve med frysande medier i koncentrationen av 10 × 106/ml.

Figur 2 representerar konturen av titrering av lentivirusen. På dag 0 återanvänder T-celler i koncentrationen av 1,0 × 106/ml i TCM. Stimulera sedan T-celler med anti-CD3 / CD28 pärlor på ett 1: 3 cell: pärlor förhållande. Tillsätt 100 μL (100 000 celler) T-celler till de färgade brunnarna enligt figur 2A. Denna tallrik kallas en "titerplatta". Inkubera titerplattan vid 37 °C, 5% CO2 i 24 timmar. Förbered utspädningsplattan på dag 1. Tillsätt 100 μL TCM till de färgade brunnarna enligt figur 2B. Tillsätt sedan 50 μL nyupptinade lentivirus i den första raden (t.ex. A6, A7 eller A8 enligt figur 2B). Utför seriell utspädning genom att överföra 50 μL från A6 till B6 och sedan 50 μL från B6 till C6, upprepa till G6. Utför även seriell utspädning för A7 och A8. Överför sedan 50 μL av det utspädda viruset till titerplattan. Tjugofyra timmar efter överföring av viruset från utspädningsplattan till titerplattan, mata cellerna med 100 μL TCM. På dag 3, fläckceller med antikroppar och analysera uttrycket av NIS och BCMA på T-cellerna via flödescytometri.

Figur 3A,B visar de representativa flödesområdena för BCMA-CAR T- eller NIS+BCMA-CAR T-celler. T-celler är gated på FSC/SSC, följt av singlet och levande cell diskriminering. Över 90% av cellerna är NIS+ celler (figur 3B). Figur 3C visar det representativa flödesdiagrammet för sammansättningen av NIS+BCMA-CAR T-celler. I likhet med figur 3A, B, T-celler är gated på FSC/SSC, följt av singlet och levande cell diskriminering. Bild 3D visar T-cellsexpansionskurvan från dag 0 till 8. Det finns inga vikexpansionsskillnader mellan UTD-, BCMA-CAR T- eller NIS+BCMA-CAR T-celler. Figur 3E visar GFP-uttrycket på OPM-2 celler efter transduktion av lentivirus som kodar GFP och luciferas följt av puromycin urval.

Figur 4 är konturen av avbildning NIS+BCMA-CAR T celler in vivo med [18F]TFB-PET. Inokulera sex till åtta veckor gamla möss med 1,0 × 106 celler av luciferas+ OPM-2 celler via svansveninjektion dag -21. Utvärdera tumörbördan med BLI på dag -1. På dag 0, randomisera mössen enligt tumörbördan som ska behandlas med NIS + BCMA-CAR T-celler genom svansveninjektion eller övervakas utan någon behandling (obehandlat xenograft). Föreställ mössen med BLI på dag 6. Utför [18F]TFB-PET på dag 7 för att avbilda NIS+BCMA-CAR T-celler.

Figur 5A visar den representativa BLI 20 dagar efter inokulering av luciferas+OPM-2 celler i NSG-mössen. Figur 5B visar den representativa PET-avbildningen en vecka efter administrering av NIS+BCMA-CAR T-celler. [18F] TFB-upptag observeras i bröstbenet, ryggraden, bäckenet och lårbenen. Dessutom ses fysiologiskt upptag av [18F]TFB i sköldkörteln och magen. Figur 5C visar de representativa flödesområdena för lårbensdygnad benmärg som skördats från det obehandlade xenograftet eller NIS+BCMA-CAR T-cellsbehandlade möss. Benmärg prover är färgade med mus CD45, mänskliga CD45, mänskliga CD3 och mänskliga BCMA. Cellerna är gated på FSC/SSC, följt av singlet, live och human-cell diskriminering. Benmärgsprover som härrör från obehandlade xenograft visar BCMA+ celler medan NIS +BCMA-CAR T cellbehandlad mus visar CD3 + celler, som stöder [18F]TFB-PET-fyndet.

Figure 1
Bild 1: NIS+BCMA-CAR T-cellproduktionsschema. Normala donator CD3 T celler (isolerade från perifera blod mononukleära celler) med negativa pärla urval. T-celler pläteras vid 1,0 × 106/ml och utökas i TCM med anti-CD3/CD28 pärlor läggs till på dag 0 av kultur och tas bort på dag 6. T-celler transduced vederbörligen med lentiviruses kodning NIS eller BCMA-CAR på dag 1 (MOI = 5.0). NIS+BCMA-CAR T-celler behandlas med 1 μg/ml puromycin dag 3, 4 och 5. T-celler utökas i kultur i 8 dagar. T-celler är kryopreserverade i FBS med 10% DMSO för framtida experiment. T-celler tinas upp och vilas över natten vid 37 °C före alla experiment. Förkortningar: CD = differentieringskluster; TCM = T-cellsexpansionsmedium; BCMA = B-cellsmognadsantigen; CAR = chimerisk antigenreceptor; NIS = natriumjodid symportör; GFP = grönt fluorescerande protein; PBMCs = perifera mononukleära celler i perifert blod; MOI = multiplicitet av infektion; FBS = fetalt bovinserum; DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Lentivirus titrering. (A) På dag 0, stimulera T-celler med anti-CD3/CD28 pärlor vid en 3:1 pärlor: cellförhållande. Tillsätt 100 μL av 1,0 × 106/ml stimulerade T-celler till de färgade brunnarna enligt tecknad film. Inkubera sedan titerplattan vid 37 °C, 5% CO2 för 24 h. (B) Förbered en utspädningsplatta genom att tillsätta 100 μL TCM till de färgade brunnarna som anges i tecknad film. Tillsätt 50 μL nyupptinat virus till A6, A7 eller A8 (t.ex. BCMA-CAR till A6, NIS till A7 och luciferas-GFP till A8). Späd sedan ut viruset seriellt genom att överföra 50 μL från A6 till B6 och sedan 50 μL från B6 till C6, upprepa till G6. Utför även seriell utspädning för A7 och A8. Överför 50 μL av det utspädda viruset till titerplattan. (C) På dag 3, färga cellerna med motsvarande antikroppar och analysera titerplattan efter flödescytometri. Förkortningar: CD = differentieringskluster; TCM = T-cellsexpansionsmedium; BCMA = B-cellsmognadsantigen; CAR = chimerisk antigenreceptor; NIS = natriumjodid symportör; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Generering av NIS+BCMA-CAR T-celler och luciferas-GFP-positiva OPM-2-celler. (A och B) Cellerna är gated på FSC/SSC, följt av singlet och levande cell diskriminering. Representativa flödesdiagram för (A) oöverförsedd T- och BCMA-CAR T-celler och (B) UTD och NIS+BCMA-CAR T visas. NIS+BCMA-CAR T-celler genereras genom samtransduktion av två virus på dag 1 av T-cellsexpansion, enligt beskrivningen i figur 2. På dag 6 färgas cellerna för CAR och NIS. C) Fenotypisk analys av NIS+BCMA-CAR T. Det representativa flödesdiagrammet för NIS+BCMA-CAR T-celler visas. D) Sammanfattning av UTD, BCMA-CAR T eller NIS+BCMA-CAR T-cellstillväxtkinetik. Inkorporering av BCMA-CAR och/eller NIS påverkar inte T-cellsexpansion (tvåvägs ANOVA, n=3 biologiska replikat, medelvärde ± SD). (E) Flöde cytometrisk analys av luciferas-GFP-transduced OPM-2. OPM-2 celler transduced med lentivirus kodning luciferas-GFP med puromycin motstånd. Fyrtioåtta timmar efter transduktion behandlas OPM-2 celler med 2 μg/ml puromycin. Cellerna expanderas i ytterligare två dagar, och uttrycket av GFP analyseras via flödescytometri. Förkortningar: CD = differentieringskluster; BCMA = B-cellsmognadsantigen; CAR = chimerisk antigenreceptor; NIS = natriumjodid symportör; GFP = grönt fluorescerande protein; UTD = oöversatt; FSC/SSC = spridning framåt/sidospridning; ANOVA = analys av varians; n.s.= inte signifikant; SD = standardavvikelse; FL-1-A = fluoroforare 1; FITC-A = område med fluorescein isotiiocyananate. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: System för in vivo-smugglingsanalys i en systemisk OPM2 xenograftmodell. Injicera sex till åtta veckor gamla NSG möss med 1,0 × 106 av luciferaspositiva OPM-2 celler via svans venen på dag -21. På dag -1, utför bioluminescerande imaging på mössen för att bekräfta engraftment av OPM-2 celler. På dag 0 injicera möss med 5,0 × 106 NIS + BCMA-CAR T-celler. Bildmöss med [18F]TFB-PET/CT dag 7 för att bedöma handeln med NIS+BCMA-CAR T-celler. Förkortningar: BCMA = B-cellsmognadsantigen; CAR = chimerisk antigenreceptor; NIS = natriumjodid symportör; BLI = bioluminescerande avbildning; NSG = immunkomprometterad NOD-scid IL2rγnull; luc = luciferas; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluorborate positron emission tomografi/datortomografi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: In vivo trafficking assay i en systemisk OPM2 xenograft modell. (A och B) BCMA+luciferas+OPM2-celler injiceras intravenöst i NSG-möss. Möss får NIS+ BCMA CAR T-celler tre veckor efter inokulering av OPM-2-celler. (A) BLI bekräftar inympning av OPM-2-celler. B) [18F]TFB-PET avslöjar nis+BCMA-CAR T cellhandel till benmärgen. (C) För att bekräfta att OPM-2-celler engraft i benmärgen och NIS +BCMA-CAR T-celler trafikerar till tumörplatsen avlivas möss efter avbildningen och benmärgen skördas. Flöde cytometrisk analys visade att OPM-2 celler är inymmpade i benmärgen (vänster) och NIS +BCMA-CAR T celler finns i benmärgen (höger). Förkortningar: BCMA = B-cellsmognadsantigen; CAR = chimerisk antigenreceptor; NIS = natriumjodid symportör; BLI = bioluminescerande avbildning; NSG = immunkomprometterad NOD-scid IL2rγnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluorborate positron emissionstomografi/datortomografi; IVIS = in vivo imaging system; CD = differentieringskluster; SUV = standardiserat upptagningsvärde. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande video S1: Tredimensionell (3D) rendering av PET/CT data som visar in vivo fördelning av [18F]TFB i sköldkörteln, magen och benmärgen. Förkortningar: BCMA = B-cellsmognadsantigen; CAR = chimerisk antigenreceptor; NIS = natriumjodid symportör; PET/CT = positron emissionstomografi/datortomografi. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument beskriver en metod för att införliva NIS i CAR T celler och imaging infunderade CAR T celler in vivo genom [18F]TFB-PET. Som bevis på koncept genererades NIS + BCMA-CAR T-celler via dubbel transduktion. Vi har nyligen rapporterat att införliva NIS i CAR T celler inte försämrar CAR T cell funktioner och effektivitet in vivo och tillåter CAR T cell handel och expansion30. Eftersom CAR T-cellterapier fortsätter att expandera utöver de nuvarande B-cells maligniteterna till tillämpningar i KLL, kommer det att finnas ett större behov av verktyg som möjliggör icke-invasiv in vivo-avbildning och övervakning av infunderade adoptiv T-celler. Dynamisk avbildning av T-celler kommer att möjliggöra validering av adoptiv T-cellhandel och potentiellt möjliggöra tidigare upptäckt av effekt och toxicitet.

NIS har undersökts och validerats som en känslig modalitet för bildceller och virus i kliniska prövningar32,42. Fysiologisk ackumulering av spårämnen för NIS ses främst i sköldkörteln / salivkörtlarna, magen och urinblåsan, som inte är vanliga organ som påverkas av flytande tumörer44. Särskilt i MM distribueras maligna plasmaceller ofta i benmärgen eller benen, och en extramedullary plasmacytoma i lesioner, där den fysiologiska ackumuleringen av spårämnen för NIS förekommer, är ett sällsynt fenomen44,45. Dessutom är NIS icke-immunogent och därför lämpligt för longitudinella avbildningsstudier46. NIS är ett inneboende membranprotein som transporterar jodid till cytosolen och innehåller 13 förmodade transmembransegment med en extracellulär amino ändstation och cytosolisk karbox ändstation47.

NIS kan visualiseras med gamma- eller positronemitterande radioisotoper som teknetium-99m (99mTc) pertechnetat, jodid-123 (123I), 131I, 124I och [18F]TFB43. Nyligen har [18F]TFB dykt upp som en lovande jodidanalog för NIS-baserad PET-avbildning, eftersom den har liknande biokemiska egenskaper och är radiosyntesiserad48. En fördel med TFB är att den inte genomgår organifiering i sköldkörtelceller och därför har ett jämförelsevis milt upptag i normal sköldkörtelvävnad48. En annan fördel med TFB är dess korta halveringstid på 109,8 min, medan halveringstiden för andra spårämnen sträcker sig från 12 timmar till 8 dagar, vilket kan presentera säkerhetsproblem för kliniska tillämpningar49. Den huvudsakliga begränsningen av NIS-baserad CAR T-cellavbildning är att spårämnen, inklusive TFB, inte tränger in i blod- hjärnbarriären (BBB), vilket gör det svårt att bedöma neurotoxicitet efter CAR T-cellbehandling50,51,52,53.

Neurotoxicitet är associerad med infiltration av T-celler och aktivering av myeloiska celler i centrala nervsystemet. I de flesta fall av neurotoxicitet efter CAR T cell terapi störs dock integriteten hos BBB50,54. Därför är det oklart om spåraren inte kan korsa BBB i denna komprometterade inställning. Ytterligare studier måste utföras för att validera om neurotoxicitet efter CAR T cellterapi kan avbildas med [18F]TFB-PET. Även om den korta halveringstiden för [18F]TFB är säker för patienter och personal, gör det upphandlingen svår för sjukhuset. Därför måste institut vara utrustade med cyklotroner eller ha tillgång till en regional anläggning. Den metod som beskrivs i protokollet här kan potentiellt tillämpas på en mängd andra CAR T-celler via dubbel transduktion för att visualisera och bedöma CAR T-celler in vivo med hjälp av [18F]TFB-PET-skanning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SSK är uppfinnare av patent inom CAR-immunterapi licensierad till Novartis (genom ett avtal mellan Mayo Clinic, University of Pennsylvania och Novartis) och Mettaforge (genom Mayo Clinic). RS, MJC och SSK är uppfinnare av patent inom området CAR immunterapi som är licensierade till Humanigen. SSK erhåller forskningsfinansiering från Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs och Lentigen. Siffror skapades med BioRender.com.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis genom Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) och Predolin Foundation (RS). Figurerna 1, 2 och 4 skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Tags

Cancerforskning nummer 180 CAR T-cell NIS-reporter [18F]TFB-PET icke-invasiv avbildning
Dynamisk avbildning av chimeriska antigenreceptor T-celler med [<sup>18F</sup>]Tetrafluorborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter