Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Dynamisk billeddannelse af kimære antigenreceptor-T-celler med [18F]tetrafluorborat positronemissionstomografi/computertomografi

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

Denne protokol beskriver metoden til ikke-invasiv sporing af T-celler, der er genetisk manipuleret til at udtrykke kimære antigenreceptorer in vivo med en klinisk tilgængelig platform.

Abstract

T-celler, der er genetisk manipuleret til at udtrykke kimære antigenreceptorer (CAR), har vist hidtil usete resultater i pivotale kliniske forsøg for patienter med B-cellemaligniteter eller myelomatose (MM). Imidlertid begrænser mange hindringer effektiviteten og forbyder den udbredte anvendelse af CAR T-celleterapier på grund af dårlig handel og infiltration i tumorsteder samt manglende vedholdenhed in vivo. Desuden er livstruende toksiciteter, såsom cytokinfrigivelsessyndrom eller neurotoksicitet, store bekymringer. Effektiv og følsom billeddannelse og sporing af CAR T-celler muliggør evaluering af T-cellehandel, ekspansion og in vivo-karakterisering og muliggør udvikling af strategier til at overvinde de nuværende begrænsninger ved CAR T-celleterapi. Dette papir beskriver metoden til inkorporering af natriumiodidsymporteren (NIS) i CAR T-celler og til CAR T-cellebilleddannelse ved hjælp af [18F] tetrafluorborat-positronemissionstomografi ([18F] TFB-PET) i prækliniske modeller. De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes på andre CAR-konstruktioner og målgener ud over dem, der anvendes til denne undersøgelse.

Introduction

Kimær antigenreceptor T (CAR T) celleterapi er en hurtigt voksende og potentielt helbredende tilgang i hæmatologiske maligniteter1,2,3,4,5,6. Ekstraordinære kliniske resultater blev rapporteret efter CD19-rettet CAR T (CART19) eller B-cellemodningsantigen (BCMA) CAR T-celleterapi2. Dette førte til, at US Food and Drug Administration (FDA) godkendte CART19-celler til aggressivt B-cellelymfom (axicabtagen ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 og lisocabtagene maraleucel)7, akut lymfoblastær leukæmi (Tisa-Cel)5,8, mantelcellelymfom (brexucabtageneautoleuce)9 og follikulært lymfom (Axi-Cel)10 . Senest har FDA godkendt BCMA-rettet CAR T-celleterapi til patienter med myelomatose (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Desuden er CAR T-celleterapi til kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) i sen klinisk udvikling og forventes at modtage FDA-godkendelse inden for de næste tre år1.

På trods af de hidtil usete resultater af CAR T-celleterapi er dens udbredte anvendelse begrænset af 1) utilstrækkelig in vivo CAR T-celleudvidelse eller dårlig handel med tumorsteder, hvilket fører til lavere satser for varig respons12,13 og 2) udvikling af livstruende bivirkninger, herunder cytokinfrigivelsessyndrom (CRS)14,15 . Kendetegnene ved CRS omfatter ikke kun immunaktivering, hvilket resulterer i forhøjede niveauer af inflammatoriske cytokiner / kemokiner, men også massiv T-celleproliferation efter CAR T-celleinfusion15,16. Udviklingen af en valideret strategi af klinisk kvalitet til at afbilde CAR T-celler in vivo vil således gøre det muligt for 1) CAR T-cellesporing i realtid in vivo at overvåge deres handel til tumorsteder og afdække potentielle resistensmekanismer og 2) overvågning af CAR T-celleudvidelse og potentielt forudsigelse af deres toksiciteter såsom udvikling af CRS.

Kliniske træk ved mild CRS er høj feber, træthed, hovedpine, udslæt, diarré, artralgi, myalgi og utilpashed. Ved mere alvorlig CRS kan patienter udvikle takykardi/hypotension, kapillær lækage, hjertedysfunktion, nyre-/leversvigt og dissemineret intravaskulær koagulation17,18. Generelt har graden af forhøjelse af cytokiner, herunder interferon-gamma, granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor, interleukin (IL)-10 og IL-6, vist sig at korrelere med sværhedsgraden af kliniske symptomer17,19. Den omfattende anvendelse af "realtids" serumcytokinovervågning til forudsigelse af CRS er imidlertid vanskelig på grund af de høje omkostninger og den begrænsede tilgængelighed. For at udnytte de gavnlige egenskaber ved CAR T-celleterapi kan ikke-invasiv billeddannelse af adoptive T-celler potentielt bruges til at forudsige effektiviteten, toksiciteterne og tilbagefaldet efter CAR T-celleinfusion.

Flere forskere har udviklet strategier til at anvende radionuklidbaseret billeddannelse med positronemissionstomografi (PET) eller enkeltfotonemissionscomputertomografi (SPECT), som giver høj opløsning og høj følsomhed20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 for in vivo visualisering og overvågning af CAR T cellehandel. Blandt disse radionuklidbaserede billeddannelsesstrategier er natriumiodidsymporteren (NIS) udviklet som en følsom modalitet over for billedceller og vira ved hjælp af PET-scanninger31,32. NIS+CAR T-cellebilleddannelse med [18F]TFB-PET er en følsom, effektiv og praktisk teknologi til vurdering og diagnosticering af CAR T-celleudvidelse, -handel og -toksicitet30. Denne protokol beskriver 1) udviklingen af NIS + CAR T-celler gennem dobbelt transduktion med høj effektivitet og 2) en metode til billeddannelse af NIS + CAR T-celler med [18F] TFB-PET-scanning. BCMA-CAR T-celler til MM bruges som en proof-of-concept-model til at beskrive NIS som reporter for CAR T-cellebilleddannelse. Disse metoder kan dog anvendes på enhver anden CAR T-celleterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen følger retningslinjerne fra Mayo Clinic's Institutional Review Board, Institutional Biosafety Committee og Mayo Clinic's Institutional Animal Care and Use Committee.

1. NIS+ BCMA-CAR T-celleproduktion

BEMÆRK: Denne protokol følger retningslinjerne fra Mayo Clinic's Institutional Review Board (IRB 17-008762) og Institutional Biosafety Committee (IBC Bios00000006.04).

  1. Produktion af BCMA-CAR, NIS og luciferase-grønt fluorescerende protein (GFP)-kodende lentivirus.
    BEMÆRK: En anden generations BCMA-CAR-konstruktion blev syntetiseret de novo (se materialetabellen) og klonet til en tredje generations lentiviral vektor under kontrol af en forlængelsesfaktor-1 alfa (EF-1α) promotor. BCMA-CAR-konstruktionen (C11D5.3-41BBz) omfattede 4-1BB costimulation og et enkeltkædet variabelt fragment (scFv) afledt af en anti-human BCMA-antistofklon C11D5.333,34. NIS er under kontrol af EF-1α-promotoren og binder sig til puromycinresistensgenet via selvspaltende peptider (P2A). Den lentivirale vektor, der koder for luciferase-GFP (se materialetabellen), bruges til at transducere tumorceller, som derefter udtrykker GFP og luciferase.
    1. Forbered lentivirale vektorplasmider: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) og pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      BEMÆRK: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro og pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro indeholder puromycinresistensgenet. Derfor kan NIS- eller luciferase-GFP-transducerede celler udvælges med 1 μg/ml eller 2 μg/ml puromycindihydrochlorid som beskrevet tidligere14,35.
    2. Frø 20 × 106 af 293T-celler i en T175-kolbe og inkuberes i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2. Bekræft, at 293T-celler fordeles jævnt på kolben ved 70-90% sammenløb ved direkte visualisering under mikroskopet.
    3. Forbered en masterblanding på 15 μg af ekspressionsvektoren (f.eks. CAR, NIS eller luciferase-GFP lineært DNA), 7 μg af konvolutvektoren (VSV-G) og 18 μg af emballagevektoren (gag, pol, rev og tat). Fortynd DNA-masterblandingen i 4,5 ml transfektionsmediet, og tilsæt derefter 111 μL af det forkomplekserende reagens (blanding A).
    4. Der forberedes et nyt rør, og 129 μL af det liposomale transfektionsreagens fortyndes i 4,5 ml transfektionsmediet (blanding B).
    5. Kombiner blanding A og B, og svirp røret for at blande indholdet. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
    6. Efter inkubationen skal du blot aspirere cellesupernatanten uden at løsne cellerne og tilsætte 16 ml af et vækstmedium indeholdende 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin-glutamin. Derefter tilsættes blandingen af blandinger A og B på 293T-celler dråbevis. Til sidst inkuberes de transfekterede celler ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer.
    7. På dag 1 og 2 efter transfektion høstes supernatanten 293T, spindes ned ved 900 × g i 10 minutter og filtreres gennem et 0,45 μm nylonfilter. Filtratet koncentreres ved 24 og 48 timer ved ultracentrifugation ved 112,700 × g i 2 timer, og fryses ved -80 °C.
  2. Ex-vivo T-celleisolering (figur 1)
    BEMÆRK: Udfør alt cellekulturarbejde i et laminært flowskab ved hjælp af aseptisk teknik og personlige værnemidler. Mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) høstes fra sundt frivilligt donorblod indsamlet under aferese36. Patogenscreening blev udført på humane celler, der blev anvendt i denne undersøgelse.
    1. Brug standarddensitetsgradientteknikken til at isolere PBMC'er.
      1. Forsigtigt tilsættes 15 ml densitetsgradientmedium (massegrad på 1,077 g/ml) (indeholdende alfa-D-glucopyranosid, beta-D-fructofuranosylhomolymer og 3-(acetylamino)-5-(acetylmethylamino)-2,4,6-triodobenzoesyremonolatriumsalt) til et 50 ml densitetsgradientseparationsrør uden at skabe luftbobler (se materialetabellen).
      2. For at undgå cellefangst fortyndes blodprøven med fosfatbufret saltvand (PBS, 0,2 g/l kaliumchlorid, 0,2 g/l kaliumphosphatmonobasisk, 8 g/l natriumchlorid og 1,15 g/l natriumphosphatdibasisk) indeholdende 2 % FBS i et volumenforhold på 1:1. Overfør forsigtigt det fortyndede blod oven på densitetsgradientmediet uden at bryde grænsefladen mellem de to. Spin ned ved 1.200 × g i 10 minutter ved RT.
        BEMÆRK: Et 50 ml densitetsgradientseparationsrør kan anvendes til isolering af 4-17 ml af en blodprøve. Det 50 ml densitetsgradientseparationsrør (se materialetabellen), der anvendes i denne protokol, kræver ikke "bremsning" under centrifugering. Men når der anvendes standard 50 ml rør, skal bremsen være slukket og kræver 30 minutters centrifugering.
      3. Overfør supernatanten til et nyt 50 ml konisk rør, vask med PBS + 2% FBS ved at fylde op til 50 ml, og drej derefter ned ved 300 × g i 8 minutter ved RT.
      4. Aspirer supernatanten, og resuspend de pelleterede celler i 50 ml PBS + 2% FBS. Tæl antallet af celler, og drej derefter ned ved 300 × g i 8 minutter ved RT. Gentag det forrige trin for i alt 2 vaske.
    2. Aspirat supernatanten, og resuspend de pelleterede celler til en koncentration på 50 × 106 celler / ml med PBS + 2% FBS.
    3. Udfør T-celleisolering fra PBMC'er ved hjælp af et magnetisk perlesæt med negativt valg.
      BEMÆRK: Et ideelt negativt selektionssæt indeholder magnetiske perler bundet til antistoffer mod antigener udtrykt på andre celler end T-celler. Et almindeligt anvendt kit indeholder antistoffer konjugeret til magnetiske perler mod CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 og CD16 (se Tabel over materialer).
      1. Overfør PBMC'er til et 14 ml polystyren rør med rund bund. Anbring derefter PBMC'erne og den negative selektionsantistofcocktail i en fuldautomatisk celleseparator, og udfør T-celleisolering i henhold til producentens protokol.
  3. T-cellestimulering og T-celleudvidelse (figur 1)
    1. For at dyrke de isolerede T-celler skal du forberede T-celleudvidelsesmedium (TCM) fremstillet med serumfrit hæmatopoietisk cellemedium suppleret med 10% humant serumalbumin og 1% penicillin-streptomycin-glutamin14. Efter T-celleisolering tælles cellerne og kulturen i en koncentration på 2 × 106 celler/ml med TCM.
    2. Vask anti-CD3/CD28 perler tre gange med TCM, før de dyrkes med T-celler.
      1. Bland hætteglasset, der indeholder perlerne, ved at hvirvle. Derefter pipetteres det krævede volumen perler (3: 1 perler: celle) (f.eks. Når du stimulerer 1,0 × 106 celler af T-celler, skal du bruge 3,0 × 106 anti-CD3 / CD28-perler) i et sterilt mikrocentrifugerør (1,5 ml) og resuspend i 1 ml TCM.
    3. Placer mikrocentrifugerøret med perlerne på en magnet i 1 min., og aspirer supernatanten. Fjern røret fra magneten, og ophænd de vaskede perler igen i 1 ml TCM. Gentag de to foregående trin for i alt 3 vaske.
    4. Resuspend perlerne i 1 ml TCM og overfør dem til T-cellerne. Fortynd derefter T-cellerne til en endelig koncentration på 1,0 × 106 celler / ml med TCM. T-celle-/perlesuspensionen overføres til en vævskulturbehandlet 6-brøndsplade, og den anbringes i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
  4. Titrering af lentivirus (figur 2)
    1. Forbered T-celler til titreringsassay. Sørg for, at ca. 1,0 x 106 celler er tilgængelige til at titrere en type virus.
    2. T-celler som beskrevet i pkt. 1.3.2 stimuleres.
    3. Plade 1,0 × 105 celler af stimulerede T-celler i en 96-brønds plade (titerplade) og inkuberes ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer (figur 2A). T-cellerne isoleres og stimuleres som beskrevet i pkt. 1.2.
    4. En fortyndingsplade (96-brøndsplade) forberedes ved at tilsætte 100 μL TCM i brøndene i de angivne kolonner og de ikke-overførte kontrolbrønde (figur 2B).
    5. Tø et hætteglas med lentivirale partikler på is og pipetter forsigtigt op og ned for at blande godt. Overfør 50 μL af virussupernatanten til brøndene i kolonne 6 på 96-brøndspladen (fortynding 3) (figur 2B). Pipette op og ned for at blande godt.
    6. Udfør serielle fortyndinger (2 gange seriel fortynding): overfør 50 μL fra brønd A6 til brønd B6 og derefter 50 μL fra brønd B6 til brønd C6; gentag indtil G6. Derefter tilsættes 50 μL af den fortyndede virus til titerpladen (figur 2B).
    7. Inkuber titerpladen ved 37 °C, 5 % CO2 i 48 timer, og bestem procentdelene af CAR-, NIS- eller GFP-positive celler ved flowcytometri (figur 2C).
      1. Vask brøndene ved at dreje titerpladen ned to gange ved 650 × g ved 4 °C i 3 min.
      2. Pletter de transducerede T-celler som beskrevet i trin 1.5.3 til 1.5.9.
      3. Bestem titrerne baseret på procentdelene af CAR-, NIS- eller GFP-positive celler ved hjælp af formel (1):
        Titre = Procentdel af BCMA-CAR+ eller NIS+ T-celler × T-celletal ved transduktion × den specifikke fortynding/volumen (1)
  5. Transduktion af lentivirus og NIS+BCMA-CAR T-celleudvidelse
    1. Fireogtyve til 48 timer efter T-cellestimulering udfører lentiviral transduktion på stimulerede T-celler (T-celler skal danne klynger).
      1. Optø de frosne lentivirus, der koder for CAR eller NIS, ved 4 °C.
      2. Bland de stimulerede T-celler godt for at bryde klyngerne op, og tilsæt blot frisk optøet virus ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 5,0 (når du transducer 1,0 × 106 T-celler, skal du bruge 5,0 × 106 lentivironer). Inkuber de transducerede celler ved 37 °C, 5 % CO2.
      3. På dag 3, 4 og 5 tælles de transducerede T-celler ved hjælp af et hæmatocytometer37 eller en fuldautomatisk celletæller38 og justeres cellekoncentrationen til 1,0 × 106 celler / ml ved at tilføje frisk, forvarmet TCM. For NIS-transducerede T-celler, der bærer puromycinresistensgenet, behandles cellerne med 1 μg/ml puromycindihydrochlorid på dag 3, 4 og 5.
    2. På dag 6 skal du fjerne anti-CD3/CD28-perlerne fra de transducerede T-celler (fra trin 1.3.4) ved at blande godt for at bryde T-celleklyngerne op og placere dem i en magnet i 1 min. Derefter skal du blot placere de indsamlede transducerede T-celler tilbage i kultur i en koncentration på 1,0 × 106 celler / ml. Efter fjernelse af perlerne fra T-cellerne vurderes ekspressionen af CAR og NIS ved flowcytometri.
      BEMÆRK: Da det enkeltkædede variable fragment af BCMA-CAR er afledt af mus, kan det farves med ged anti-mus IgG (H + L) konjugeret med Alexa Fluor 647. NIS kan påvises ved anvendelse af anti-humant ETNL [syntetisk peptid svarende til aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)]. Dette antistof genkender den cytosoliske C-terminus af NIS. Derfor skal T-celler permeabiliseres før inkubation med et anti-humant NIS-antistof.
    3. Udfør overfladefarvning af BCMA-CAR ved hjælp af gede-anti-mus IgG (H + L).
      1. Tag en alikvote af kulturen (f.eks. 50.000 T-celler) og vask med flowbuffer (PBS, 1% FBS og 1% natriumazid). Derefter suspenderes cellerne igen med 50 μL flowbuffer og pletter cellerne med 1 μL gedeanti-mus-antistof til påvisning af CAR-ekspression og 0,3 μL levende-død aqua til udelukkelse af døde celler.
      2. Inkuber i 15 minutter i mørke ved RT, vask cellerne ved at tilsætte 150 μL flowbuffer, og centrifuger cellerne ved 650 × g i 3 minutter ved 4 °C.
    4. Efter overflade CAR-farvning fikseres og permeabiliseres cellerne ved at tilsætte 100 μL fikseringsmedium (PBS med 4,21% formaldehyd) og inkuberes i 20 minutter ved 4 °C. Cellerne vaskes to gange med 100 μL buffer, der indeholder et cellepermeabiliserende middel, såsom saponin (650 × g i 3 minutter ved 4 °C).
    5. Resuspend de faste/permeabiliserede celler i 50 μL af en permeabiliserende buffer. Derefter tilsættes 0,3 ng anti-humant ETNL NIS-antistof i 50 μL flowbuffer og inkuberes i 1 time ved 4 °C.
    6. Der tilsættes 150 μL flowbuffer, og cellerne centrifugeres ved 650 × g i 3 minutter ved 4 °C. Inkuber cellerne med 2,5 μL antikanin sekundært antistof i 50 μL flowbuffer i 30 minutter ved 4 °C, vask cellerne ved tilsætning af 150 μL flowbuffer og centrifuge ved 650 × g i 3 minutter ved 4 °C.
    7. Endelig resuspend i 200 μL flowbuffer og udfør flowcytometri for at bestemme transduktionseffektiviteten (figur 3A,B).
    8. På dag 8 tæller og spinder T-cellerne ned ved 300 × g i 8 minutter ved 4 ° C. Resuspend T-cellerne med frysemedium (90% FBS + 10% dimethylsulfoxid [DMSO]) i en koncentration på 10 × 106 / ml, og overfør derefter 1 ml hver til mærkede kryovialer.
    9. Anbring hætteglassene i en -80 °C fryser i 48 timer. Efter 48 timer (og på dag 10) overføres T-cellerne til flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Se figur 1 for oversigt over NIS+ CAR T-celleproduktion. Figur 3D viser eksempler på ex vivo T-celleudvidelse fra tre forskellige donorer.

2. NIS+ BCMA-CAR T-cellebilleddannelse med [ 18F]TFB-PET-scanning

BEMÆRK: Denne protokol følger retningslinjerne fra Mayo Clinic's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767-16), IRB og IBC (Bios00000006.04). OPM-2 er en BCMA + MM-cellelinje, som ofte bruges som en målcellelinje til BCMA-CAR T-celler39,40.

  1. Opret luciferase+ BCMA+ OPM-2 celler.
    1. Frø 500.000 OPM-2 celler i en vævskultur-behandlet 24-brønds plade. Optø lentivirus, der koder for luciferase-GFP ved 4 °C.
    2. Tilsæt den frisk optøede virus ved en MOI på 3,0 til OPM-2-celler og bland godt ved pipettering. Anbring pladen i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
    3. Otteogfyrre timer efter transduktionen tilsættes 2 μg/ml puromycin for at udvælge de transducerede celler. Fire dage efter transduktionen vurderes de GFP-positive celler (luciferase-positive) ved flowcytometri (figur 3E).
  2. Etabler BCMA+ OPM-2 xenograft musemodeller (figur 4).
    1. Tæl luciferase + OPM-2-celler og drej dem ned to gange for at fjerne alt cellekulturmedium. Opm-2-cellerne resuspenderes i en koncentration på 10 × 106 celler/ml med PBS.
    2. På dag -21 injiceres 100 μL (1,0 × 106 celler) luciferase+ OPM-2-celler i halerne på 8 til 12 uger gamle immunkompromitterede NOD-scid IL2rγnull (NSG) mus (figur 4).
    3. På dag 20 efter OPM-2-celleinjektionen (dag -1 af CAR T-celleinjektionen) skal du kontrollere tumorbyrden via bioluminescensbilleddannelse (BLI) (figur 4).
      BEMÆRK: OPM-2-celler danner en langsomt voksende tumor, som normalt tager 2-3 uger at indpode.
    4. Administrer 10 μL/g D-luciferin til OPM-2 xenograft-mus via intraperitoneal (IP) injektion. Efter 10 minutter udføres BLI på musene under 2% isoflurangas (figur 5A). Efter bekræftelse af tumorindkapslelse randomiseres musene i henhold til tumorbyrden.
    5. På dag -1 i CAR T-celleinjektionen optøes NIS+BCMA-CAR T-cellerne og frysemediet fjernes ved centrifugering (300 × g, 8 min, 4 °C). Derefter suspenderer resuspendcellerne med TCM ved 2,0 × 106 celler / ml og inkuberer natten over (37 ° C, 5% CO2).
    6. På dag 0 tælles og centrifugeres NIS+BCMA-CAR T-cellerne (300 × g, 8 min, 4 °C). Resuspend NIS+BCMA-CAR T-cellerne ved 50 × 106 celler/ml med PBS.
    7. Administrer 100 μL (5,0 × 106 celler) af NIS + BCMA-CAR T-celler via haleveneinjektion til OPM-2 xenograft-musene. På dag 7 og 15 afbildes musene ved hjælp af en PET-scanning.
  3. NIS+BCMA-CAR T-celle in vivo-billeddannelse ved hjælp af BCMA+OPM-2 xenograft-musemodel.
    1. Vej musene før billeddannelsen, og fjern eventuelle metaløremærker for at fjerne metalrelaterede artefakter.
    2. Forbered [18F]TFB som tidligere beskrevet41.
      BEMÆRK: [18F]TFB skal fremstilles på anvendelsesdagen. Radiokemisk renhed bør være >99%, og molær aktivitet >5 GBq / mmol.
    3. Injicer 9,25 MBq [18F]TFB intravenøst via haleveneinjektion. Tillad en optagelsesperiode på ~ 40 minutter for radiotraceren at blive fordelt i kroppen og rydde blodet.
    4. Anæstesi musen ved hjælp af isofluranindånding (2%).
      BEMÆRK: Isofluran er det foretrukne inhalerede bedøvelsesmiddel, da det har hurtig og pålidelig debut og genopretning.
    5. Før du bedøver musen, skal du rengøre alle overflader på anæstesimaskinen med desinfektionsmidler.
    6. Placer musen inde i induktionskammeret. Drej fordamperhjulet til 2%, og vent på, at musen bliver liggende og ikke-lydhør inden for 1-2 minutter.
    7. Overvåg musen for at undgå utilstrækkelig anæstesi eller overdreven depression af åndedrætsfunktioner. Kort sagt, klem tå for at bekræfte den utilstrækkelige anæstesi.
      BEMÆRK: Den normale respirationsfrekvens er op til 180 / min, og den acceptable faldhastighed er 50%.
    8. Påfør oftalmisk salve for at undgå hornhindetørring og traumer.
    9. Anskaf PET/CT-billeder 45 minutter efter injektion med den abestede mus i en mikro-PET/CT-billedbehandlingsarbejdsstation (se materialetabellen). Dernæst skal du erhverve statiske PET-billeder i 15 minutter efterfulgt af CT-billedoptagelse i 5 minutter med 360 ° rotation og 180 fremskrivninger ved 500 μA, 80 keV og 200 ms eksponering.
  4. Analyse af erhvervede billeddata
    1. Analysér billederne ved hjælp af PET-billedbehandlingssoftware (figur 5B og supplerende video S1).
    2. Definer mængden af interesse (VOI).
    3. Beregn den standardiserede optagelsesværdi (SUV) ved hjælp af formel (2).
      SUV i VOI = Koncentration af aktivitet i VOI (MBq/ml) × kropsvægt (g) / administreret dosis (MBq) (2)
  5. Bekræftelse af NIS + BCMA-CAR T-cellehandel til tumorstederne med flowcytometri
    1. Efter [18F]TFB-PET-billeddannelse skal musen placeres tilbage i buret. Efter ophør af anæstesi skal dyrene overvåges, indtil de er i stand til målrettet bevægelse og sikre, at de har adgang til mad og vand.
    2. Overvåg musene, indtil henfaldet af den injicerede [18F]TFB. Når radioisotopen ikke kan påvises, aflives musene med CO2.
    3. For at aflive skal musene placeres i buret (højst 5 mus pr. Bur).
    4. Udsæt musene for CO2 , indtil vejrtrækningen er helt ophørt i ca. 5-10 minutter.
      BEMÆRK: Denne eutanasimetode skal være i overensstemmelse med AVMA-retningslinjerne for eutanasi af dyr (2020-udgaven).
    5. For at sikre musenes død skal du udføre cervikal dislokation ved at gribe fat i bagsiden af hovedet og bunden af dyrets hale og derefter trække hænderne fra hinanden / væk fra hinanden.
    6. Høst knoglemarven for at bekræfte, at NIS + BCMA-CAR T-cellerne effektivt trafik til tumorstedet.
    7. Overfør de høstede lårben og skinneben til en 6-brønds plade indeholdende 5 ml cellekulturmedium. Fjern muskler og sener fra lårbenene og skinnebenet, og skær blot begge ender (over leddene) af lårbenene og skinnebenet.
    8. Fyld en insulinsprøjte med cellekulturmediet, og skyl knoglemarven på 6-brøndspladen. Til lårben skal du bruge 22 G nåle og 5 ml sprøjter, fordi lårbensdiameteren er større end skinnebenets.
    9. Brug den flade ende af stemplet til at male knoglemarven. Anbring en 70 μm cellesil på et sterilt 50 ml konisk rør, og filtrer det malede knoglemarv. Derefter fyldes røret op med flowbufferen, og røret centrifugeres ved 300 × g i 8 minutter ved 4 °C.
    10. Aspirer supernatanten, og resuspend knoglemarven med 5 ml flowbuffer. Overfør 200 μL knoglemarv til en plade med 96 brønde. Centrifugering af pladen ved 300 × g i 3 minutter ved 4 °C. Dekanter supernatanten, og resuspend cellerne med 50 μL flowbuffer.
    11. Plet knoglemarven med flowantistoffer mod 0,25 μg mus CD45, 0,03 μg human CD45, 0,06 μg human CD3, 0,24 μg human BCMA og 0,3 μL levende/død aqua. Inkuber pladen i 15 minutter ved RT i mørket.
    12. Centrifugering af pladen ved 300 × g i 3 minutter ved 4 °C. Tilsæt derefter 200 μL flowbuffer, og kør på flowcytometeret (figur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 repræsenterer trinnene til generering af NIS + BCMA-CAR T-celler. På dag 0 skal du isolere PBMC'er og derefter isolere T-celler ved negativ selektion. Derefter stimuleres T-celler med anti-CD3 / CD28 perler. På dag 1 transduceres T-celler med både NIS og BCMA-CAR lentivirus. På dag 3, 4 og 5 tælles T-celler og fodres med medier for at justere koncentrationen til at være 1,0 × 106 / ml. For NIS-transducerede T-celler tilsættes 1 μg/ml puromycin for at vælge NIS+- celler. På dag 6 skal du fjerne perlerne ved at placere cellerne i magneten i et minut. Derefter sættes de afperlede celler fra røret i en ny kolbe. Tag en alikvote af celler (f.eks. 50.000 celler) og plet med antistoffer for at kontrollere ekspressionen af NIS og CAR på overfladen af T-celler ved hjælp af flowcytometri. På dag 8 tælles T-cellerne og kryokonserven med frysemedier i en koncentration på 10 × 106/ml.

Figur 2 repræsenterer omridset af titrering af lentivirus. På dag 0 resuspend T-celler i en koncentration på 1,0 × 106 / ml i TCM. Derefter stimuleres T-celler med anti-CD3 / CD28 perler i et 1: 3 celle: perler forhold. Tilsæt 100 μL (100.000 celler) T-celler til de farvede brønde som angivet i figur 2A. Denne plade kaldes en "titerplade". Inkuber titerpladen ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer. På dag 1 skal du forberede fortyndingspladen. Der tilsættes 100 μL TCM til de farvede brønde som angivet i figur 2B. Derefter tilsættes 50 μL frisk optøede lentivirus i første række (f.eks. A6, A7 eller A8 som afbildet i figur 2B). Udfør seriel fortynding ved at overføre 50 μL fra A6 til B6 og derefter 50 μL fra B6 til C6, gentage indtil G6. Udfør også seriel fortynding for A7 og A8. Overfør derefter 50 μL af den fortyndede virus til titerpladen. Fireogtyve timer efter overførsel af viruset fra fortyndingspladen til titerpladen fodres cellerne med 100 μL TCM. På dag 3 pletter celler med antistoffer og analyserer ekspressionen af NIS og BCMA på T-cellerne via flowcytometri.

Figur 3A,B viser de repræsentative flowplotter for BCMA-CAR T- eller NIS+BCMA-CAR T-celler. T-celler er gated på FSC / SSC, efterfulgt af singlet og levende celle diskrimination. Over 90% af cellerne er NIS+ celler (figur 3B). Figur 3C viser det repræsentative flowplot for sammensætningen af NIS+BCMA-CAR T-celler. I lighed med figur 3A,B er T-celler gated på FSC / SSC, efterfulgt af singlet og levende celle diskrimination. Figur 3D viser T-celleudvidelseskurven fra dag 0 til 8. Der er ingen foldudvidelsesforskelle mellem UTD-, BCMA-CAR T- eller NIS+BCMA-CAR T-celler. Figur 3E viser GFP-udtrykket på OPM-2-celler efter transduktion af lentivirus, der koder for GFP og luciferase efterfulgt af puromycin-selektion.

Figur 4 er omridset af billeddannelse af NIS+BCMA-CAR T-celler in vivo med [18F]TFB-PET. Inokuler seks til otte uger gamle mus med 1,0 × 106 celler luciferase+ OPM-2-celler via haleveneinjektion på dag -21. Vurder tumorbyrden af BLI på dag -1. På dag 0 randomiseres musene i henhold til tumorbyrden, der skal behandles med NIS + BCMA-CAR T-celler gennem haleveneinjektion eller overvåges uden nogen behandling (ubehandlet xenograft). Forestil dig musene med BLI på dag 6. Udfør [18F]TFB-PET på dag 7 for at afbilde NIS+BCMA-CAR T-celler.

Figur 5A viser den repræsentative BLI 20 dage efter podningen af luciferase+OPM-2-celler i NSG-musene. Figur 5B viser den repræsentative PET-billeddannelse en uge efter administration af NIS+BCMA-CAR T-celler. [18F] TFB-optagelse observeres i brystbenet, rygsøjlerne, bækkenet og lårbenene. Derudover ses fysiologisk optagelse af [18F]TFB i skjoldbruskkirtlen og maven. Figur 5C viser de repræsentative strømningsdiagrammer af lårbensafledt knoglemarv høstet fra de ubehandlede xenograft eller NIS+BCMA-CAR T-cellebehandlede mus. Knoglemarvsprøver farves med mus CD45, human CD45, human CD3 og human BCMA. Celler er gated på FSC / SSC, efterfulgt af singlet, levende og human-celle diskrimination. Knoglemarvsprøver afledt af ubehandlet xenograft viser BCMA + -celler, mens NIS + BCMA-CAR T-cellebehandlet mus viser CD3 + - celler, som understøtter [18F] TFB-PET-fundet.

Figure 1
Figur 1: NIS+BCMA-CAR T-celleproduktionsskema. Normale donor CD3 T-celler (isoleret fra mononukleære celler i perifert blod) ved hjælp af negativ perleselektion. T-celler belægges ved 1,0 × 106 / ml og udvides i TCM ved hjælp af anti-CD3 / CD28-perler tilføjet på dyrkningsdag 0 og fjernet på dag 6. T-celler transduceres dobbelt med lentivirus, der koder for NIS eller BCMA-CAR på dag 1 (MOI = 5,0). NIS+BCMA-CAR T-celler behandles med 1 μg/ml puromycin på dag 3, 4 og 5. T-celler udvides i kultur i 8 dage. T-celler kryokonserveret i FBS med 10% DMSO til fremtidige eksperimenter. T-celler optøes og hviles natten over ved 37 °C før alle forsøg. Forkortelser: CD = klynge af differentiering; TCM = T-celleudvidelsesmedium; BCMA = B-cellemodningsantigen; CAR = kimær antigenreceptor; NIS = natriumiodidsymporter; GFP = grønt fluorescerende protein; PBMC'er = mononukleære celler i perifert blod; MOI = mangfoldighed af infektion; FBS = føtalt kvægserum; DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Lentivirus titrering. (A) På dag 0 stimuleres T-celler med anti-CD3/CD28 perler i et 3:1 perler:celleforhold. Tilsæt 100 μL 1,0 × 106/ml stimulerede T-celler til de farvede brønde som angivet i tegneserien. Derefter inkuberes titerpladen ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer. (B) Der fremstilles en fortyndingsplade ved at tilsætte 100 μL TCM til de farvede brønde som angivet i tegneserien. Tilsæt 50 μL frisk optøet virus til A6, A7 eller A8 (f.eks. BCMA-CAR til A6, NIS til A7 og luciferase-GFP til A8). Fortynd derefter viruset serielt ved at overføre 50 μL fra A6 til B6 og derefter 50 μL fra B6 til C6, gentage indtil G6. Udfør også seriel fortynding for A7 og A8. Overfør 50 μL af den fortyndede virus til titerpladen. (C) På dag 3 farves cellerne med tilsvarende antistoffer og analyseres titerpladen ved flowcytometri. Forkortelser: CD = klynge af differentiering; TCM = T-celleudvidelsesmedium; BCMA = B-cellemodningsantigen; CAR = kimær antigenreceptor; NIS = natriumiodidsymporter; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Generering af NIS+BCMA-CAR T-celler og luciferase-GFP-positive OPM-2-celler. (A og B) Celler er gated på FSC / SSC, efterfulgt af singlet og levende celle diskrimination. Repræsentative flowdiagrammer af (A) utransducerede T- og BCMA-CAR T-celler og (B) UTD og NIS+BCMA-CAR T er vist. NIS+BCMA-CAR T-celler genereres ved co-transduktion af to vira på dag 1 af T-celleudvidelsen, som beskrevet i figur 2. På dag 6 farves celler til CAR'er og NIS. C) Den fænotypiske analyse af NIS+BCMA-CAR T. Det repræsentative flowplot for NIS+BCMA-CAR T-celler er vist. D) Resumé af UTD-, BCMA-CAR T- eller NIS+BCMA-CAR T-cellevækstkinetik. Inkorporering af BCMA-CAR og/eller NIS påvirker ikke T-celleudvidelse (tovejs ANOVA, n = 3 biologiske replikater, gennemsnitlig ± SD). (E) Flowcytometrisk analyse af luciferase-GFP-transduceret OPM-2. OPM-2-celler transduceres med lentivirus, der koder for luciferase-GFP med puromycinresistens. Otteogfyrre timer efter transduktion behandles OPM-2-celler med 2 μg/ml puromycin. Celler udvides i yderligere to dage, og ekspressionen af GFP analyseres via flowcytometri. Forkortelser: CD = klynge af differentiering; BCMA = B-cellemodningsantigen; CAR = kimær antigenreceptor; NIS = natriumiodidsymporter; GFP = grønt fluorescerende protein; UTD = uudført; FSC/SSC = fremadrettet spredning/sidespredning; ANOVA = analyse af varians; n.s.= ikke signifikant; SD = standardafvigelse; FL-1-A = areal af fluorofor 1; FITC-A = areal af fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Skema for in vivo-smuglesmuglingsassay i en systemisk OPM2 xenograft-model. Injicer seks til otte uger gamle NSG-mus med 1,0 × 106 luciferase-positive OPM-2-celler via halevenen på dag -21. På dag -1 skal du udføre bioluminescerende billeddannelse på musene for at bekræfte engraftment af OPM-2-celler. På dag 0 injiceres mus med 5,0 × 106 nis+BCMA-CAR T-celler. Billede mus med [18F]TFB-PET/CT på dag 7 for at vurdere handelen med NIS+BCMA-CAR T-celler. Forkortelser: BCMA = B-cellemodningsantigen; CAR = kimær antigenreceptor; NIS = natriumiodidsymporter; BLI = bioluminescerende billeddannelse; NSG = immunkompromitteret NOD-scid IL2rγnull; luc = luciferase; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluorborat positronemissionstomografi/computertomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: In vivo-analyse af menneskehandel i en systemisk OPM2-xenograftmodel. (A og B) BCMA+luciferase+OPM2-celler injiceres intravenøst i NSG-mus. Mus modtager NIS+BCMA CAR T-celler tre uger efter podning af OPM-2-celler. (A) BLI bekræfter engraftmentet af OPM-2-celler. (B) [18F]TFB-PET afslører NIS+BCMA-CAR T-cellehandel til knoglemarven. (C) For at bekræfte, at OPM-2-celler engraft i knoglemarven og NIS + BCMA-CAR T-celler trafik til tumorstedet, aflives mus efter billeddannelsen, og knoglemarven høstes. Flowcytometrisk analyse afslørede, at OPM-2-celler er indpodet i knoglemarven (venstre), og NIS + BCMA-CAR T-celler er til stede i knoglemarven (højre). Forkortelser: BCMA = B-cellemodningsantigen; CAR = kimær antigenreceptor; NIS = natriumiodidsymporter; BLI = bioluminescerende billeddannelse; NSG = immunkompromitteret NOD-scid IL2rγnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluorborat positronemissionstomografi/computertomografi IVIS = in vivo-billeddannelsessystem ; CD = klynge af differentiering; SUV = standardiseret optagelsesværdi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende video S1: Tredimensionel (3D) gengivelse af PET/CT-data, der viser in vivo-fordelingen af [18F]TFB i skjoldbruskkirtlen, maven og knoglemarven. Forkortelser: BCMA = B-cellemodningsantigen; CAR = kimær antigenreceptor; NIS = natriumiodidsymporter; PET/CT = positronemissionstomografi/computertomografi. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir beskriver en metode til inkorporering af NIS i CAR T-celler og billeddannelse af infunderede CAR T-celler in vivo gennem [18F] TFB-PET. Som bevis på konceptet blev NIS + BCMA-CAR T-celler genereret via dobbelt transduktion. Vi har for nylig rapporteret, at inkorporering af NIS i CAR T-celler ikke forringer CAR T-cellefunktioner og effektivitet in vivo og tillader CAR T-cellehandel og -udvidelse30. Da CAR T-celleterapier fortsætter med at ekspandere ud over de nuværende B-cellemaligniteter til applikationer i CLL, vil der være et større behov for værktøjer, der muliggør ikke-invasiv in vivo-billeddannelse og overvågning af infunderede adoptiv-T-celler. Dynamisk billeddannelse af T-celler vil muliggøre validering af adoptiv T-cellehandel og potentielt muliggøre tidligere påvisning af effektivitet og toksicitet.

NIS er blevet undersøgt og valideret som en følsom modalitet over for billedceller og vira i kliniske forsøg32,42. Fysiologisk ophobning af sporstoffer til NIS ses hovedsageligt i skjoldbruskkirtlen/spytkirtlerne, maven og blæren, som ikke er almindelige organer, der er påvirket af flydende tumorer44. Især i MM fordeles maligne plasmaceller ofte i knoglemarven eller knoglerne, og et ekstramedullært plasmacytom i læsioner, hvor den fysiologiske ophobning af sporstoffer til NIS forekommer, er et sjældent fænomen44,45. Desuden er NIS ikke-immunogen og derfor velegnet til langsgående billeddannelsesundersøgelser46. NIS er et iboende membranprotein, der transporterer iodid ind i cytosolen og indeholder 13 formodede transmembransegmenter med et ekstracellulært aminoterminationssted og cytosolisk carboxyterminationsstation47.

NIS kan visualiseres med gamma- eller positron-emitterende radioisotoper såsom technetium-99m (99mTc) pertechnetat, iodid-123 (123I), 131I, 124I og [18F] TFB43. For nylig har [18F]TFB vist sig som en lovende iodidanalog til NIS-baseret PET-billeddannelse, da den har lignende biokemiske egenskaber og er radiosyntetiseret48. En fordel ved TFB er, at det ikke gennemgår organificering i skjoldbruskkirtelceller og derfor har en forholdsvis mild optagelse i normalt skjoldbruskkirtelvæv48. En anden fordel ved TFB er dens korte halveringstid på 109,8 minutter, mens halveringstiden for andre sporstoffer varierer fra 12 timer til 8 dage, hvilket kan give sikkerhedsproblemer til kliniske anvendelser49. Hovedbegrænsningen ved NIS-baseret CAR T-cellebilleddannelse er, at sporstoffer, herunder TFB, ikke trænger ind i blod-hjerne-barrieren (BBB), hvilket gør det vanskeligt at vurdere neurotoksicitet efter CAR T-cellebehandling50,51,52,53.

Neurotoksicitet er forbundet med infiltration af T-celler og aktivering af myeloide celler i centralnervesystemet. I de fleste tilfælde af neurotoksicitet efter CAR T-celleterapi forstyrres BBB's integritet imidlertid50,54. Derfor er det uklart, om sporstoffet ikke er i stand til at krydse BBB i denne kompromitterede indstilling. Der skal udføres yderligere undersøgelser for at validere, om neurotoksicitet efter CAR T-celleterapi kan afbildes med [18F]TFB-PET. Selv om den korte halveringstid for [18F]TFB er sikker for patienter og personale, gør det indkøb vanskeligt for hospitalet. Derfor skal institutter være udstyret med cyklotroner eller have adgang til en regional facilitet. Den metode, der er beskrevet i protokollen her, kan potentielt anvendes på en række andre CAR T-celler via dobbelt transduktion for at visualisere og vurdere CAR T-celler in vivo ved hjælp af [18F]TFB-PET-scanning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SSK er opfinder af patenter inden for CAR-immunterapi licenseret til Novartis (gennem en aftale mellem Mayo Clinic, University of Pennsylvania og Novartis) og Mettaforge (gennem Mayo Clinic). RS, MJC og SSK er opfindere på patenter inden for CAR-immunterapi, der er licenseret til Humanigen. SSK modtager forskningsmidler fra Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs og Lentigen. Figurer blev oprettet med BioRender.com.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet gennem Mayo Clinic K2R pipeline (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) og Predolin Foundation (RS). Figur 1, 2 og 4 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Tags

Kræftforskning udgave 180 CAR T-celle NIS-reporter [18F]TFB-PET ikke-invasiv billeddannelse
Dynamisk billeddannelse af kimære antigenreceptor-T-celler med [<sup>18F</sup>]tetrafluorborat positronemissionstomografi/computertomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter