Этот протокол описывает методологию неинвазивного отслеживания Т-клеток, генетически модифицированных для экспрессии рецепторов химерного антигена in vivo с помощью клинически доступной платформы.
Т-клетки, генетически модифицированные для экспрессии рецепторов химерного антигена (CAR), показали беспрецедентные результаты в ключевых клинических испытаниях для пациентов со злокачественными новообразованиями В-клеток или множественной миеломой (ММ). Однако многочисленные препятствия ограничивают эффективность и запрещают широкое использование терапии Т-клетками CAR из-за плохого трафика и инфильтрации в опухолевые участки, а также отсутствия персистенции in vivo. Кроме того, опасные для жизни токсичные вещества, такие как синдром высвобождения цитокинов или нейротоксичность, являются основными проблемами. Эффективная и чувствительная визуализация и отслеживание Т-клеток CAR позволяет оценить трафик, расширение и характеристику Т-клеток in vivo и позволяет разработать стратегии для преодоления текущих ограничений терапии Т-клетками CAR. В данной работе описывается методология включения симпортера йодида натрия (NIS) в Т-клетки CAR и визуализации Т-клеток CAR с использованием [18F]тетрафторборат-позитронно-эмиссионной томографии ([18F]TFB-PET) в доклинических моделях. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням в дополнение к тем, которые используются для этого исследования.
Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CAR T) является быстро развивающимся и потенциально излечительным подходом при гематологических злокачественных новообразованиях1,2,3,4,5,6. Сообщалось о экстраординарных клинических исходах после CD19-направленной CAR T (CART19) или антигена созревания В-клеток (BCMA) CAR T-клеточной терапии2. Это привело к одобрению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) клеток CART19 для агрессивной В-клеточной лимфомы (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, тизагенлеклюцела (Tisa-Cel)3 и лизокабтагена маралеуцеля)7, острого лимфобластного лейкоза (Tisa-Cel)5,8, лимфомы мантийных клеток (brexucabtagene autoleuce)9 и фолликулярной лимфомы (Axi-Cel)10 . Совсем недавно FDA одобрило BCMA-направленную CAR T-клеточную терапию у пациентов с множественной миеломой (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Кроме того, CAR T-клеточная терапия хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) находится на поздней стадии клинической разработки и, как ожидается, получит одобрение FDA в течение следующих трех лет1.
Несмотря на беспрецедентные результаты ТЕРАПИИ Т-клетками CAR, ее широкое применение ограничено 1) недостаточным расширением Т-клеток CAR in vivo или плохой транспортировкой к опухолевым участкам, что приводит к снижению показателей длительного ответа12,13 и 2) развитием опасных для жизни нежелательных явлений, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS)14,15 . Отличительные признаки CRS включают не только иммунную активацию, приводящую к повышенным уровням воспалительных цитокинов / хемокинов, но и массивную пролиферацию Т-клеток после инфузии Т-клеток CAR15,16. Таким образом, разработка валидированной стратегии клинического уровня для изображения Т-клеток CAR in vivo позволит 1) отслеживать Т-клетки CAR в режиме реального времени in vivo для мониторинга их перемещения в опухолевые участки и выявления потенциальных механизмов резистентности и 2) мониторинга расширения Т-клеток CAR и потенциального прогнозирования их токсичности, такой как развитие CRS.
Клиническими особенностями легкой СВК являются высокая температура, усталость, головная боль, сыпь, диарея, артралгия, миалгия и недомогание. При более тяжелой СВК у пациентов может развиться тахикардия/гипотония, капиллярная утечка, сердечная дисфункция, почечная/печеночная недостаточность и диссеминированная внутрисосудистая коагуляция17,18. В целом, было показано, что степень повышения цитокинов, включая интерферон-гамма, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин (IL)-10 и IL-6, коррелирует с тяжестью клинических симптомов17,19. Тем не менее, широкое применение мониторинга цитокинов сыворотки «в режиме реального времени» для прогнозирования CRS затруднено из-за высокой стоимости и ограниченной доступности. Чтобы использовать полезные характеристики ТЕРАПИИ Т-клетками CAR, неинвазивная визуализация приемных Т-клеток может быть потенциально использована для прогнозирования эффективности, токсичности и рецидива после инфузии Т-клеток CAR.
Несколько исследователей разработали стратегии использования радионуклидной визуализации с позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографией (ОФЭКТ), которая обеспечивает высокое разрешение и высокую чувствительность20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 для визуализация in vivo и мониторинг незаконного оборота Т-клеток CAR. Среди этих стратегий визуализации на основе радионуклидов был разработан симпортер йодида натрия (NIS) в качестве чувствительного метода к клеткам изображения и вирусам с использованием ПЭТ-сканирования31,32. Визуализация Т-клеток NIS+CAR с помощью [18F]TFB-PET является чувствительной, эффективной и удобной технологией для оценки и диагностики расширения, трафика и токсичности Т-клеток CAR30. Этот протокол описывает 1) разработку Т-клеток NIS+CAR посредством двойной трансдукции с высокой эффективностью и 2) методологию визуализации Т-клеток NIS+CAR с помощью [18F]TFB-ПЭТ-сканирования. Т-клетки BCMA-CAR для MM используются в качестве экспериментальной модели для описания NIS в качестве репортера для визуализации Т-клеток CAR. Однако эти методологии могут быть применены к любой другой терапии Т-клетками CAR.
В данной работе описывается методология включения NIS в Т-клетки CAR и визуализации инфузионных CAR T-клеток in vivo через [18F]TFB-PET. В качестве доказательства концепции, Т-клетки NIS + BCMA-CAR были сгенерированы с помощью двойной трансдукции. Недавно мы сообщили, что включение NIS в CAR T-?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана через трубопровод Mayo Clinic K2R (SSK), Центр индивидуализированной медицины клиники Майо (SSK) и Фонд Предолина (RS). Рисунки 1, 2 и 4 были созданы с BioRender.com.
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |