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Summary
여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.
Abstract
초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 레이저 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 기술로, 전례 없는 시간 분해능으로 부하가 걸린 기존 및 비기존 미오신 모두의 화학 역학을 조사할 수 있습니다. 특히, 액틴-미오신 결합 형성 직후 일정한 힘으로 미오신 모터를 프로브 할 수있는 가능성과 높은 힘 피드백 속도 (200kHz)는 UFFCS가 미오신 작동 스트로크와 같은 빠른 역학의 부하 의존성을 연구하는 데 유용한 도구임을 보여주었습니다. 또한 UFFCS는 프로세스 및 비 프로세스 미오신 - 액틴 상호 작용이 적용된 힘의 강도와 방향에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 연구를 가능하게합니다.
이 프로토콜을 따르면 공정 미오신 -5 모터와 다양한 비 전통적인 미오신에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행 할 수 있습니다. 일부 조정에 의해, 프로토콜은 또한 키네신 및 다인과 같은 다른 종류의 프로세스 모터에 대한 연구로 쉽게 확장 될 수 있습니다. 프로토콜에는 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 교정 절차, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계가 포함됩니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 광학 핀셋은 구조적 변화와 효소 동역학 1,2의 동시 조작 및 측정의 놀라운 가능성으로 인해 단일 분자 수준에서 단백질 상호 작용의 기계 화학을 설명하는 데 유용한 도구였습니다. 특히, 나노미터 미만의 구조적 변화를 측정하는 능력과 함께 세포에서 분자 모터가 가하는 힘 범위의 힘을 적용하고 측정하는 기능은 광학 핀셋을 모터 단백질의 화학기계적 특성과 기계적 조절을 풀기 위한 고유한 단일 분자 도구로 만들었습니다.
초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 광학 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 포스 분광법 기술로, 3비드 형상(그림 1a)3,4에서 부하 상태에서 분자 모터의 빠른 동역학을 연구하기 위해 개발되었습니다. UFFCS는 광학 핀셋의 물리적 한계, 즉 시스템의 기계적 이완 시간까지 모터 단백질에 힘을 가하는 시간 지연을 줄여 미오신 실행 시작 후 (수십 마이크로 초) 힘을 빠르게 적용 할 수 있습니다 3. 이 기능은 빠른 골격 3 및 심장5 근육 미오신의 초기 기계적 이벤트를 조사하여 파워 스트로크의 부하 의존성, 약한 결합 및 강한 결합 상태, 생화학 적 (Pi) 및 기계적 (파워 스트로크) 이벤트의 순서를 밝히는 데 활용되었습니다.
3-비드 기하학은 일반적으로 비가공 모터를 연구하기 위해 사용되며, 힘 클램프가 있는 단일 비드 기하학은 일반적으로 미오신Va 6와 같은 가공성 비-통상적인 미오신을 조사하는 데 사용되었습니다. 그러나 처리성 미오신에 대해서도 3-비드 UFFCS 분석을 선호하는 몇 가지 이유가 있습니다. 첫째, 액틴-미오신 결합 직후 부하를 신속하게 적용하면 비공정 모터에서와 같이 힘 발달의 초기 이벤트를 측정할 수 있습니다. 또한 공정 모터의 경우 모터의 작동 길이와 진행 내내 일정한 힘 하에서 작동 시간을 정확하게 측정할 수 있습니다(그림 1b). 또한, 힘 피드백의 비율이 높기 때문에, 시스템은 미오신 작동 행정과 같은 위치의 빠른 변화 동안 힘을 일정하게 유지할 수 있으며, 따라서 모터 스테핑 동안 일정한 부하를 보장 할 수있다. 시스템의 높은 시간적 분해능은 서브 ms 상호 작용의 검출을 허용하여 미오신과 액틴의 약한 결합을 조사 할 가능성을 열어줍니다. 마지막으로, 분석 기하학은 힘이 액틴 필라멘트를 따라 적용되고 힘의 가로 및 수직 성분이 무시할 수 있음을 보장합니다. 이 점은 수직력 성분이 모터의 동역학 7,8의 부하 의존성에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타 났기 때문에 특히 관련이 있습니다. 이 기술을 사용하여 다양한 보조 및 저항 부하를 처리 myosin-5B에 적용하고광범위한 힘에 대한 가공성의 부하 의존성을 직접 측정할 수 있습니다4.
그림 1a에 표시된 바와 같이이 시스템에서 단일 액틴 필라멘트는 이중 광학 핀셋 ( "덤벨")의 초점에 갇힌 두 개의 폴리스티렌 비드 사이에 매달려 있습니다. 불균형 순 힘 F = F1-F 2 는 빠른 피드백 시스템을 통해 필라멘트에 부과되며, 이는 필라멘트가 순 힘이 반대 방향으로 반전되는 사용자 정의 반전 지점에 도달 할 때까지 한 방향으로 일정한 속도로 움직이게합니다. 운동 단백질이 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때 덤벨은 단일 운동 단백질이 부착된 받침대 비드에 걸쳐 삼각형 파형(그림 1b, 하단 패널)으로 앞뒤로 자유롭게 움직일 수 있습니다. 상호 작용이 확립되면 덤벨이 전달하는 힘이 운동 단백질로 매우 빠르게 전달되고 모터는 미오신이 액틴에서 분리 될 때까지 상호 작용시 피드백 시스템에 의해 적용된 힘의 강도와 방향으로 밟아 필라멘트를 변위하기 시작합니다. 갇힌 액틴 필라멘트의 극성에 의존하는 모터의 스테핑에 의해 생성되는 변위이기 때문에 적용된 힘의 방향에 따라 하중은 보조, 즉 모터 변위의 동일한 방향으로 밀기(그림 1b 상단 패널에서 푸시) 또는 저항, 즉 모터 변위에 대해 반대 방향으로 당기는 것일 수 있습니다(그림 1b에서 당김). 상부 패널)을 통해 적용된 하중의 강도와 방향성 모두에 의해 모터 과정성의 화학 역학적 조절을 연구 할 수 있습니다.
다음 섹션에서는 초고속 포스 클램프 분광법 설정을 사용하여 다양한 부하에서 액틴-미오신 -5B 상호 작용을 측정하는 모든 단계를 완전히 설명하며, 여기에는 1) 광학 설정 설정, 광학 트랩 정렬 및 교정 절차, 2) 샘플 챔버에서 모든 구성 요소 준비 및 조립, 3) 측정 절차, 4) 운동 단백질의 실행 길이, 스텝 크기 및 속도와 같은 중요한 물리적 매개 변수를 추출하기위한 대표 데이터 및 데이터 분석.
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Protocol
1. 광학 설정
알림: 실험 설정은 나노미터 포인팅 안정성과 < 1% 레이저 강도 변동이 있는 이중 광학 핀셋으로 구성됩니다. 이러한 조건에서 나노 미터 수준에서 덤벨의 안정성은 일반적인 트랩 강성 (0.1 pN / nm) 및 인장 (1 pN-수십 pN)에서 보장됩니다. 그림 2 는 광학 설정의 세부 체계를 보여줍니다.
- 광학 핀셋 설계 및 시공 9,10,11.
- 설정의 모든 구성 요소를 그림 2의 구성표에 따라 광학 테이블에 놓습니다. 광학 테이블에는 기계적 진동을 최소화하기 위한 능동 아이솔레이터가 포함되어 있습니다. 또한 현미경 구조는 탄성 잡음과 기계적 공명을 흡수하기 위해 엘라스토머 아이솔레이터에 장착됩니다.
- 광학 아이솔레이터를 레이저 소스( 그림 2의 "OI")에 가깝게 삽입하여 광학 피드백으로 인한 임의 진폭 변동을 방지합니다.
- 레이저 포인팅 안정성에 영향을 줄 수 있는 기류와 난기류를 줄이기 위해 닫힌 상자에 전체 경로를 밀봉하십시오.
- 주 레이저 소스(Nd:YAG 레이저, 그림 2의 1,064nm 파장)를 편광 빔 스플리터( PBS)를 사용하여 직교 편광이 있는 두 개의 분기로 나누어 이중 광학 핀셋을 만듭니다. 시간 공유 트랩은 장력12 하에서 덤벨의 진동을 유도하기 때문에 피해야합니다.
- 직접 디지털 합성기( DDS)로 구동되는 두 개의 음향 광학 디플렉터(그림 2의 AOD)를 사용하여 두 트랩의 미세하고 빠른 이동을 허용하고 현장 프로그래밍 가능 게이트 어레이 FPGA 보드의 디지털 출력을 통해 DDS를 직접 구동하여 액틴 장력을 정밀하게 조절합니다( 그림 2 참조).
알림: 전체 피드백 응답 시간은 <10μs여야 측정 중에 결합되지 않은 상태, 미오신 상호 작용 및 움직임을 포함하여 두 트랩에 일정한 힘을 신속하게 수정하고 유지할 수 있습니다. 이를 위해 위치 감지기는 >= 100kHz 대역폭을 가져야 하며 데이터는 >= 200kHz 샘플 속도로 수집되어야 합니다. 수집된 각 데이터 포인트(5μs 수집 시간)에 대해 두 트랩에 대한 비례 보정이 FPGA에 의해 계산되어 AOD를 구동하는 두 DDS로 전송됩니다. AOD 응답 시간은 필요한 피드백 응답 시간을 충족하려면 5μs 미만이어야 합니다. - 트랩된 비드 위치의 nm 검출을 위해 두 개의 사분면 포토다이오드 검출기( 그림 2의 QPD)를 콘덴서의 후면 초점면에 놓습니다. 콘덴서의 후면 초점면에 접합된 평면의 QPD와 대물렌즈의 후면 초점면에 접합된 평면의 AOD를 정확하게 정렬하면 QPD 신호가 AOD 주파수와 무관합니다.
- 마이크로 미터 드라이브가있는 선형 변환기에 AOD를 장착하고 크리스탈 가장자리가 레이저 빔에 가까워 질 때까지 변위하십시오. 그런 다음 대물렌즈를 나사산 대물렌즈 하우징 중앙에 있는 조리개로 교체하고 대물렌즈 후면 조리개 크기에 맞게 조리개를 조절합니다.
- 압전 크리스탈에 의해 차단 된 빔 부분이 홍채 다음에 보일 때까지 변환기를 레이저 빔쪽으로 이동하고 변환기를 약간 뒤로 돌려 빔이 아이리스 조리개를 다시 완전히 채우도록합니다.
- 두 번째 AOD에 대해 1.1.7-1.1.8단계를 반복합니다. 커버슬립(13)의 표면에 붙어 있는 비드 상에서 빔을 빠르게 이동시키면서 QPD로부터의 시간 지연을 측정함으로써 피드백 루프의 응답 시간을 확인한다.
알림: 위의 세 단계 (1.1.7-1-1-9)는 AOD 결정을주의 깊게 정렬합니다. 이들 단계들은 빔 편향 및 피드백(13) 모두의 시간 응답을 최적화하는데 중요하다.
- 포토다이오드를 사용하여 현미경 입구에서 트래핑 레이저의 강도 변동을 측정하여 1% 미만이어야 합니다. 광 다이오드 대역폭은 이미징 속도보다 커야 합니다.
- 두 트랩의 포인팅 안정성을 확인하십시오.
- 1mL의 아세톤에 20μL의 실리카 비드 (1.2μm, 10 % 고형분)를 희석하여 인산염 완충액 (PB)에서 실리카 비드를 준비하고, 30 초 동안 초음파 처리하고, 간단히 와동시키고, 19,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리합니다.
- 상층액을 제거하고 1mL의 아세톤에 재현탁하고 세척을 반복합니다. 50mM PB 1mL에 재현탁하고 2회 세척합니다. 마지막으로, 50 mM PB의 100 μL에 재현탁시킨다.
- 양면 테이프(약 60μm 두께)로 현미경 슬라이드에 커버슬립을 부착하여 실리카 비드로 광학 핀셋 보정을 수행하여 흐름 챔버를 구축합니다. 챔버에 1mg/mL BSA(소 혈청 알부민 단백질)를 채우고 3분 동안 기다립니다.
- PB에서 실리카 비드의 1:1000 희석액을 챔버로 흐릅니다. 실리콘 그리스로 채워진 주사기를 사용하여 챔버를 조심스럽게 밀봉하십시오. 각 트랩에 단일 비드를 트래핑하고 파워 스펙트럼 방법(14 )을 적용하여 교정합니다.
- 20 μL 실리카 비드 (1.2 μm 직경, 10 % 고체)를 1-1.5 mL의 아세톤, 와류에 용해시켜 펜틸 아세테이트 (실온에서)에서 실리카 비드를 준비하고 30 초 동안 초음파 처리합니다.
- 18,500 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 1mL의 아세톤에 재현탁 한 다음 세척을 반복하십시오. 1mL의 펜틸 아세테이트에 재현탁하고 펜틸 아세테이트에서 2회 세척(원심분리 및 재현탁)을 반복합니다. 펠릿을 100μL의 니트로셀룰로오스 1% 및 900μL 펜틸 아세테이트에 재현탁합니다. 4 ° C에서 2 개월 동안 보관하십시오.
- 24 x 24mm 유리 커버 슬립을 가지고 순수한 에탄올을 적신 종이로 조심스럽게 청소하십시오. 그런 다음 깨끗한 핀셋으로 잡고 순수한 에탄올로 직접 씻어 두 번째로 헹굽니다. 부드러운 질소 흐름으로 건조시키십시오. 필요한 경우이 작업을 반복하여 유리 표면에 보이는 모든 잔류 물을 제거하십시오.
- 실리카 비드 스톡을 가져 와서 소용돌이 치고 ~ 30 초 동안 잠깐 초음파 처리합니다.
- 두 번째 커버슬립(24 x 60mm)을 청소한 후 커버슬립의 한 표면에 실리카 비드 용액 2μL를 바르고 마를 때까지 기다립니다.
- 유량 챔버를 만드는 데 사용할 현미경 슬라이드(26 x 76mm)를 조심스럽게 청소하십시오.
- 그림 3과 같이 이중 접착 테이프(~3mm 대형, 두께 60-100μm)를 두 줄로 자르고 현미경 슬라이드의 한쪽에 부착합니다.
- 깨끗한 핀셋을 사용하여, 코팅된 커버슬립(1.3.9)을 끈적끈적한 테이프 라인과 접촉시키고, 니트로셀룰로스+ 비드 층이 챔버의 내부를 향하도록 함으로써 챔버(최종 부피 약 20μL)를 닫는다(도 3a에 도시된 바와 같이). 유동 챔버를 50mM 인산염 완충액으로 채우고 실리콘 그리스로 밀봉합니다.
- >1.4메가픽셀의 CCD(전하 결합 장치) 또는 CMOS(상보형 금속 산화물 반도체) 카메라를 사용하여 >200x 배율의 명시야 현미경으로 단일 실리카 비드를 이미지화합니다. 피드백 소프트웨어를 사용하여 피에조 스테이지(나노미터 정확도 이상)를 이동하여 열 드리프트(10)를 보상합니다.
- 왼쪽 트랩의 중심을 비드의 중심과 겹칩니다(QPD의 xy 신호 레벨은 보정의 신호 레벨과 일치해야 함). 그런 다음 이 트랩에 대한 위치 신호의 위치 노이즈와 표준 편차를 측정합니다.
- 오른쪽 트랩15에 대해 이전 단계를 반복합니다.
- 트랩 위치 교정: MHz에서 nm로
- 커버슬립 표면에 실리카 비드가 부착된 유동 챔버(1.3.5-1.3.12)와 플로팅 폴리스티렌 비드(다음 섹션 2.1과 같이 제조된 α-액티닌 공액 비드 사용)를 준비합니다.
- 시야(FOV)의 중심에서 약간 기울어진(~5μm) 커버슬립 표면에 실리카 비드의 초점을 맞추고 FOV의 이미지를 획득합니다. 피에조 스테이지를 사용하여 비드를 FOV 중심을 향해 10μm 이동하고 두 번째 이미지를 획득합니다. 중심 알고리즘 또는 이와 유사한 것을 사용하여 두 이미지에서 비드의 중심을 계산하고 두 비드 사이의 거리를 픽셀 단위로 계산하여 명시야 카메라의 nm/픽셀 보정을 얻습니다.
- 하나의 트랩에 단일 부동 입자를 트랩합니다. 그런 다음 AOD를 사용하여 트랩을 작은 단계(0.2MHz)로 이동하고 입자의 이미지와 각 단계에 대한 AOD의 해당 주파수를 획득합니다. 이전과 같이 중심 알고리즘을 사용하여 FOV에서 입자의 위치를 계산하고 이전 단계에서 얻은 nm/픽셀 보정을 사용하여 nm 단위로 변환합니다.
- 주파수-위치 데이터에 선형 피팅을 수행하고 교정 상수를 nm/MHz 단위로 계산합니다.
- 두 번째 트랩에 대해 보정을 반복합니다.
- 트랩 전력 및 강성 교정 (MHz 대 W), QPD (MHz 대 pN / nm)
- 커버슬립 표면(1.3.5-1.3.12)에 실리카 비드가 부착된 유동 챔버와 플로팅 폴리스티렌 비드(다음 섹션 2.1과 같이 준비된 α-액티닌 공액 비드 사용)를 준비하고 하나의 트랩에 단일 입자를 가둡니다. 그런 다음 AOD를 통해 두 트랩을 작은 단계(0.2MHz)로 대체하고 QPD와 AOD의 해당 주파수를 사용하여 두 트랩에서 입자의 브라운 운동을 기록합니다.
- 각 위치에서 검출기의 평균 전력을 계산하고 기록된 브라운 운동(13)의 전력 스펙트럼에 로렌치안 함수를 피팅하여 트랩 강성 및 QPD 교정 상수 베타를 얻습니다.
2. 샘플 준비
- α-액티닌 접합 형광 비드 준비
- 접합16 수행: 아미노 작용화 폴리스티렌 비드(직경 1μm, 고체 2.5%)를 취하여 500μL 증류수로 2회 세척하고 500μL의 PBS(pH 7.0)에 재현탁합니다. 1 mM HaloTag 숙신이미딜 에스테르O2 리간드를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 500 μL의 PBS로 3회 세척하고 100-200 μM HaloTag α-액티닌으로 재현탁시킨다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하고 500 μL의 PBS에서 3 회 세척합니다 (1.5 주 이내에 비드를 사용하거나 액체 질소에서 급속 냉동하고 -80 ° C에서 보관).
- 라벨링: 200μL의 비드 용액을 로다민-BSA와 함께 5μg/mL 최종 농도로 10분 동안 배양합니다. 50 mM PB로 3회 세척하고 50 mM PB 중 500 μL에 재현탁한다. 이것은 수개월 동안 -80 ° C에서 부분 표본에 저장할 수 있습니다).
- 앞서 설명한 바와 같이 비오티닐화된 미오신-5B를 발현하고 정제한다 4,17.
- F- 액틴13 중합 및 라벨링 :
- F- 액틴 중합 : 69μL의 초순수, 10μL의 액틴 중합 완충액 10x (100mM Tris HCl, 20mMMgCl2, 500mM KCl, 10mM ATP, 50mM 구아니딘 탄산염 pH 7.5), 20μL의 G- 액틴 10mg / mL 및 1μL의 DL-디티 오 트레이톨 (DTT) 1M을 혼합합니다. 1 시간 이상 얼음에 두십시오.
- 로다민을 사용한 F-액틴 라벨링(Ex/Em: 546/575nm): 중합된 F-액틴 25μL를 취하여 초순수 19.5μL, 액틴 중합 완충액 10x(100mM 트리스 HCl, 20mMMgCl2, 500mM KCl, 10mM ATP, 50mM 구아니딘 카보네이트 pH 7.5), 1M DTT 1μL, 250μM 로다민 팔로이딘 2μL를 추가합니다. 밤새 얼음 위에 두십시오. 트래핑 실험을 위해 로다민 F-액틴은 얼음에 보관하고 일주일 이내에 사용할 수 있습니다.
- 샘플 어셈블리
- 유동 챔버(1.3.5-1.3.12)를 취하여 1mg/mL 비오티닐화 BSA를 5분 동안 배양합니다. AB 완충액(25mM MOPS, 25mM KCl, 4mMMgCl2, 1mM EGTA, 1mM DTT, pH 7.2)으로 세척한 후 1mg/mL 스트렙타비딘을 5분 동안 배양하고 AB 완충액으로 다시 세척합니다. 비오티닐화된 미오신-5B 무거운 메로미오신 M5B 완충액(10mM MOPS pH 7.3, 0.5M NaCl, 0.1mM EGTA, 3mMNaN3)에서 3nM 농도로 2μM 칼모듈린(CaM)과 함께 5분 동안 인큐베이션합니다. AB에 2μM CaM이 보충된 3부피의 1mg/mL 비오티닐화 BSA로 세척하고 3분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션하는 동안 반응 믹스 (RM)를 준비한다: 0.005% α-액티닌 작용화 비드 (섹션 2.1), 1 nM 로다민 F-액틴 (섹션 2.3) 중 이미징 완충액 (IB: AB 완충액과 1.2 μM 글루코스-옥시다제, 0.2 μM 카탈라아제, 17 mM 글루코스, 20 mM DTT, 2 μM CaM 및 ATP를 갖는 실험에 필요한 농도에서).
- RM으로 세척하고 실리콘 그리스로 챔버를 밀봉하십시오. 이제 샘플을 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다.
3. 측정
- 덤벨을 조립하십시오.
- 장거리 번역기를 사용하여 샘플을 이동하여 떠 있는 α-액티닌 비드를 찾고 하나의 트랩을 켜고 하나의 비드를 트랩합니다.
- 첫 번째 트랩이 점유되면 변환기를 움직여 트랩된 비드를 커버슬립 표면 가까이에 배치하여 여러 비드가 트랩되지 않도록 하고 다른 비드를 두 번째 트랩에 트랩합니다.
- AOD 음파의 힘을 조정하여 두 트랩을 동일한 강성으로 조정합니다. 강성은 일반적으로 0.03에서 0.14 pN/nm 사이로 설정됩니다. 강성이 작을수록 특히 낮은 힘에서 힘 소음이 작아집니다.
- 그런 다음 전동 미러 M(그림 2)을 뒤집어 형광 현미경으로 전환하고 장거리 번역기(13)를 통해 샘플을 대체하여 용액에 떠 있는 액틴 필라멘트를 찾습니다. 긴 필라멘트 (>5 μm)를 선호하는데, 이는 처리 된 미오신이 그것을 대체하고 분리하기 전에 몇 미크론 동안 움직일 것이기 때문입니다.
- 샘플을 움직여 갇힌 비드 중 하나가 서로 부착될 때까지 필라멘트의 한쪽 끝에 접근하도록 합니다. 그런 다음 비드 거리를 대략적인 필라멘트 길이로 조정하고 스테이지를 해당 방향으로 이동하여 결합되지 않은 두 번째 비드 방향으로 흐름을 만듭니다. 필라멘트는 흐름에 의해 늘어나고 결국 필라멘트에 결합합니다13. 비드-액틴-비드 복합체를 "덤벨"이라고합니다.
- 액틴 - 미오신 접촉을 확립하십시오.
- 두 트랩을 멀리 떨어져 부드럽게 분리하여 필라멘트를 최대 약 3pN까지 미리 장력하고 두 개의 AOD 중 하나의 주파수를 변경하고 위치 신호를 통해 트레일링 비드로의 모션의 후속 전송을 확인하여 하나의 트랩을 삼각형파로 진동시켜 덤벨의 강성을 조사합니다.
- 스테이지를 이동하여 덤벨을 받침대 실리카 비드 근처에 놓고 실리카 비드 직경보다 약간 아래에 갇힌 비드 중심의 높이를 조정하여 필라멘트와 비드 표면에 부착된 단백질 사이의 접촉을 허용합니다. 그런 다음 갇힌 비드 사이에 실리카 비드의 중심을 배치합니다.
- 힘 클램프 및 nm 안정화 피드백:
- 2-3pN 힘과 200nm 진동으로 초고속 힘 클램프를 켜고 액틴 필라멘트에 수직 방향으로 약 20-30nm의 개별 단계로 받침대 비드를 스캔합니다. 각 위치에서 상호 작용이 발생할 때까지 기다린 다음(몇 초) 상호 작용이 관찰되지 않으면 앞으로 나아가십시오. 단백질-필라멘트 상호 작용이 확립되면 상호 작용이 더 빈번한 위치를 찾으십시오.
- 처리 미오신이 액틴 필라멘트의 한쪽 끝(일반적으로 + 끝)으로 이동할 때 + 끝에 부착된 갇힌 비드가 실리카 비드를 향해 이동하는지 확인합니다. 미오신이 결합되지 않은 경우 실리카 비드가 필라멘트의 -끝에 부착된 트랩된 비드에 최대한 가깝게 놓이도록 스테이지를 필라멘트의 -끝으로 이동하고 나노미터 안정화 피드백을 시작합니다. 이렇게 하면 필라멘트의 +끝에 부착된 포획된 비드가 실리카 비드에 충돌할 가능성이 최소화됩니다.
- 데이터를 기록합니다.
4. 데이터 분석4
알림: 설명된 분석 방법을 사용하면 미오신 스테핑으로 인한 덤벨 속도의 변화를 기반으로 처리 실행 및 빠른 스테핑 이벤트를 감지하고 측정할 수 있습니다. 공정 주행의 분석은 참조 3,4,13에 설명된 비공정 모터에 대한 데이터 분석 방법을 기반으로 수행됩니다.
- 단계별 실행 이벤트 감지를 허용하도록 속도 변경에 대한 임계값을 설정합니다. 이 경우 전진 및 후진 단계가 모두 예상되므로 임계 값의 교차가 양방향으로 허용됩니다.
- 각 단계를 해당 실행에 할당: 두 후속 단계 사이의 시간 간격이 3ms보다 짧고 단계의 진폭이 < 90nm이면 단계가 동일한 실행에 할당되고, 그렇지 않으면 단계가 다른 실행에 할당됩니다(4).
- 보조 힘에 대한 올바른 실행 길이4.
- 다음 방정식에서 측정된 평균 주행 길이 값<RLm>에서 실제 주행 길이 값 RL을 계산하여 보조력 하에서 올바른 주행 길이( 여기서 D 는 진동 범위)를 계산합니다.
참고: 이 방정식의 유도에 대한 자세한 내용은 참고자료4에서 확인할 수 있습니다.
- 다음 방정식에서 측정된 평균 주행 길이 값<RLm>에서 실제 주행 길이 값 RL을 계산하여 보조력 하에서 올바른 주행 길이( 여기서 D 는 진동 범위)를 계산합니다.
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Representative Results
대표 데이터는 그림 4와 같이 시간 경과에 따른 위치 레코드로 구성됩니다. 위치 기록에서 두 종류의 변위가 보입니다. 첫째, 미오신 모터가 액틴 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때 갇힌 비드는 용액의 점성 항력에 대해 일정한 속도로 움직이며 작업자가 삼각형 파3에서 설정 한 진동 범위 내에서 진동하는 선형 변위를 보여줍니다 (긴 시간 스케일로 인해 그림 4에서 보이지 않음). 둘째, 미오신 모터가 필라멘트와 상호 작용하면 움직이는 필라멘트가 전달하는 힘이 단백질로 매우 빠르게 전달되고 시스템 속도가 0으로 떨어지고 (그림 4의 빨간색 선) 스테핑 이벤트가 실행이 끝날 때까지 일정한 힘으로 발생합니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 피드백 시스템에 의해 힘이 양의 방향에서 음의 방향으로(또는 그 반대로) 전환되며, 피드백 시스템은 비드가 사용자가 설정한 진동 범위의 가장자리에 도달하면 힘 방향을 전환합니다. 어떤 경우에는 미오신이 필라멘트를 양의 방향으로 결합하고 변위 할 때 비드를 진동 범위의 (위쪽) 가장자리쪽으로 밀어 넣을 수 있습니다. 이것이 보조 힘 (즉, 그림 5에서 양의 변위, 푸시로 향함)에서 발생하면 미오신의 실행은 진동 가장자리 (그림 5의 화살표)에서 힘 방향 반전에 의해 중단되므로 실행 길이를 덤벨 진동 D의 진폭으로 제한합니다. 이를 위해서는 보조 힘의 경우 실행 길이를 수정해야합니다 (4.3.1).
그림 1: 공정 미오신 -5B 모터에 적용된 UFFCS의 개략도. (a) 단일 미오신 -5B 분자가 스트렙타비딘-비오틴 링크를 통해 유리 비드 받침대에 부착됩니다. 단일 액틴 필라멘트는 α-액티닌 코팅 비드(소위 "3-비드" 형상) 사이에 매달려 갇혀 있습니다. 검은색 화살표는 오른쪽(F1)과 왼쪽 비드(F2)에 클램핑된 힘을 나타내고, 빨간색 화살표는 덤벨에 가해지는 알짜 힘(F)을 나타냅니다. F는 미오신이 액틴에 결합하지 않을 때 제한된 진동 범위 내에서 덤벨을 유지하기 위해 앞뒤로 번갈아 가며 사용됩니다. (b) 보조 (푸시) 및 저항 (당김) 하중 하에서 덤벨 진동, myosin-5B 부착 및 프로세스 런의 해당 단계 동안 변위 및 힘을 보여주는 예제 추적. 이 수치는4에서 수정되었습니다. 200kHz 샘플 레이트에서 수집된 원시 데이터가 플로팅됩니다. 힘의 표준 개발은 약 0.27pN입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험 설정의 광학 구성표. 광학 현미경은 nm 안정화 피드백에 사용되는 할로겐 램프(H), 콘덴서(C), 샘플(S), 피에조 변환기(x-y 및 z), 대물렌즈(O), 저배율 카메라(CCD 200X) 및 고배율 카메라(CCD 2000X)로 구성됩니다. 이중 광학 핀셋은 이색성 거울(D2 및 D3)을 통해 현미경의 광축에서 삽입 및 추출되며 Nd:YAG 레이저(1064nm), 광학 아이솔레이터(OI), λ/2 파장판, 편광 빔 스플리터 큐브(PBS), 음향 광학 디플렉터(AOD), 1064nm 간섭 필터(F1 및 F2), 사분면 검출기 포토다이오드(QDP). QDP의 신호는 FPGA로 정교화되어 AOD(포스 피드백)를 구동하는 두 개의 맞춤형 직접 디지털 합성기(DDS)로 전송되었습니다. 형광 여기는 복제된 Nd:YAG 레이저(532nm)와 전자 곱셈 카메라(EMCCD)에 투사된 이미지에 의해 제공되었습니다. M은 가동거울이고, F3는 방출필터이다. 이 수치는 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유동 챔버 어셈블리 . (a) 챔버 준비. 실리카 비드로 얼룩진 유리 커버슬립을 이중 접착 테이프 줄무늬를 통해 현미경 슬라이드에 부착하여 약 20μL 부피의 플로우 셀을 형성합니다. b) 플로우 셀의 평면도. 용액은 피펫으로 챔버의 한쪽에서 날아가고 다른 쪽에서 여과지를 통해 흡입되어 화살표 방향을 따라 흐름을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표 위치 기록. myosin-5B 프로세스 실행 및 단계 및 실행 감지 알고리즘을 보여주는 위치 기록. 감지된 각 실행의 시작과 끝은 각각 녹색 및 청록색 수직선으로 표시됩니다. 빨간색 수평선은 감지된 단계를 나타냅니다. 이 수치는4에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 미오신 실행 중 강제 반전. 미오신이 필라멘트를 보조력 (푸시)으로 양의 방향으로 결합하고 움직일 때, 힘이 반전되는 진동 범위의 가장자리에 도달하여 (화살표로 표시) 보조력으로 미오신 달리기가 중단 될 수 있습니다. 반대로, 저항력 (당김) 하에서, 미오신 과정 스테핑은 덤벨이 힘 반전 지점에 도달하는 것을 방지합니다. 따라서 후자의 경우 실행 길이는 저항력에 대한 진동 범위에 의해 제한되지 않습니다. 이 수치는4에서 수정되었습니다. 200kHz 샘플 레이트에서 수집된 원시 데이터가 플로팅됩니다. 힘의 표준 개발은 약 0.27pN입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
3-비드 분석과 같은 단일 분자 기술은 기술적으로 까다롭고 처리량이 낮지만 UFFCS는 데이터의 높은 신호 대 잡음비 덕분에 분자 상호 작용 감지를 향상시킵니다. UFFCS는 모터 단백질의 부하 의존성을 연구 할 수있게하며, 모터가 필라멘트에 결합 할 때 힘을 매우 빠르게 적용하여 제어 된 힘 하에서 힘 생성 및 약한 결합 상태에서 조기에 매우 빠른 이벤트를 조사하는 주요 이점이 있습니다. 실행 내내 힘을 일정하게 유지하고 힘 방향성을 완전히 제어하여 모터 종속성을 조사합니다. 마지막 지점과 관련하여 여기에서 사용하는 3-비드 형상은 필라멘트 방향을 따라 힘을 적용하고 측정하는 데 매우 효율적이며 가로 또는 수직 구성 요소의 기여를 최소화합니다. 그러나, 모터 단백질이 능동적으로 횡방향 또는 수직력, 또는 심지어 토크를 생성할 것으로 예상되는 경우, 단일 비드 기하학적 구조와 같은 다른 구성이 더 적절하다(2,7,18). 또한 공간적 및 시간적 해상도 덕분에 UFFCS는 기존의 단일 분자 기술로는 방해받을 수 있는 분자 상호 작용의 기본 사항을 이해하는 고유한 도구입니다. 사실, UFFCS는 보조 및 저항력이 미오신 -5B의 기계적 반응을 조절하는 방법을 조사 할 수있게하여 세포4의 액틴 메쉬 내에서 집단 행동에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.
그러나 이러한 실험의 성공은이 프로토콜에있는 모든 지침에 따라 매우 신중하게 해결해야하는 몇 가지 중요한 요구 사항의 충족에 달려 있습니다 : 광학 설정의 정확한 정렬 및 격리는 최적의 공간 해상도에 도달하기위한 기본입니다. 광학 시스템의 신중한 교정은 적용된 힘의 값을 고정밀로 결정하는 데 필요합니다. 빠른 피드백 시스템의 설정은 높은 시간 해상도에 도달하는 데 필요합니다. 마지막으로 샘플 챔버에 조립되는 모든 구성 요소는 샘플 챔버의 불순물이 실험을 손상시킬 수 있으므로 가능한 한 멸균 상태로 유지하면서 통제 된 환경에서 준비되어야하며 최적의 보관 및 취급에 대한 모든 표시는 실험 프로토콜의 성공을 위해 엄격하게 존중되어야합니다. 중요한 것은 데이터 분석을 다양한 종류의 모터-필라멘트 상호 작용에 맞게 신중하게 조정하여 결과를 적절하게 해석하고 아티팩트를 방지해야 한다는 것입니다.
이 프로토콜에는 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 측정 및 데이터 분석에 이르기까지 공정 미오신 -5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 모든 단계가 포함되어 있으며, 이는 다양한 비 전통적인 미오신 및 키네신 및 다인 인과 같은 기타 종류의 공정 모터를 연구하는 데 편리하게 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 보조금 계약 No. 871124 Laserlab-Europe에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램, 이탈리아 대학 및 연구부(FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) 및 Ente Cassa di Risparmio di Firenze의 지원을 받았습니다. A.V. Kashchuk은 Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008 / 2020-C의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
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생물학 이슈 173 초고속 포스 클램프 분광법 광학 핀셋 3-비드 분석 분자 모터 미오신Erratum
Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021.
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy
