Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

Abstract

Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), lazer cımbızına dayanan tek moleküllü bir tekniktir ve yük altındaki hem geleneksel hem de konvansiyonel olmayan miyosinlerin kemomekaniğinin benzeri görülmemiş bir zaman çözünürlüğü ile araştırılmasını sağlar. Özellikle, aktin-miyozin bağ oluşumundan hemen sonra sabit kuvvet altında miyozin motorlarının araştırılması olasılığı, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı (200 kHz) ile birlikte, UFFCS'nin miyozin çalışma inmesi gibi hızlı dinamiklerin yük bağımlılığını incelemek için değerli bir araç olduğunu göstermiştir. Ayrıca, UFFCS, prosesif ve prosesif olmayan miyosin-aktin etkileşimlerinin uygulanan kuvvetin yoğunluğu ve yönünden nasıl etkilendiğinin incelenmesini sağlar.

Bu protokolü izleyerek, prosesif miyosin-5 motorlarında ve çeşitli geleneksel olmayan miyosinlerde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri yapmak mümkün olacaktır. Bazı ayarlamalarla, protokol kinesinler ve dineinler gibi diğer proses motor sınıflarının incelenmesine de kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlamaya, kalibrasyon prosedürlerine, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları içerir.

Introduction

Son yıllarda optik cımbız, eşzamanlı manipülasyon ve konformasyonel değişikliklerin ve enzimatik kinetiğin ölçülmesinin çarpıcı olasılığı nedeniyle, tek molekül düzeyinde protein etkileşimlerinin mekanokimyasını aydınlatmak için değerli bir araç olmuştur 1,2. Özellikle, hücredeki moleküler motorlar tarafından uygulananlar aralığındaki kuvvetleri uygulama ve ölçme yeteneği, nanometre altı konformasyonel değişiklikleri ölçme kapasitesiyle birlikte, optik cımbızları, motor proteinlerinin kemomekanik özelliklerini ve mekanik düzenlemelerini çözmek için benzersiz bir tek moleküllü araç haline getirmiştir.

Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), üç boncuklu bir geometride yük altındaki moleküler motorların hızlı kinetiğini incelemek için geliştirilmiş, optik cımbızlara dayanan tek moleküllü bir kuvvet-spektroskopi tekniğidir (Şekil 1a)3,4. UFFCS, motor proteine kuvvet uygulama gecikmesini optik cımbızların fiziksel sınırına, yani sistemin mekanik gevşeme süresine indirir, böylece bir miyozin çalışmasının başlamasından sonra kuvvetin hızla uygulanmasına izin verir (birkaç on mikrosaniye)3. Bu yetenek, hızlı iskelet 3 ve kardiyak5 kas miyozinindeki erken mekanik olayları araştırmak için güç çarpmasının yük bağımlılığını, zayıf ve güçlü bağlanma durumlarını ve ayrıca biyokimyasal (Pi) ve mekanik (powerstroke) olayların sırasını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır.

Üç boncuklu geometri genellikle işlemsel olmayan motorları incelemek için kullanılır, kuvvet kelepçeli tek bir boncuk geometrisi, miyozin Va6 gibi işlemsel geleneksel olmayan miyosinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, işlemsel miyosinler için de üç boncuklu bir UFFCS testini tercih etmenin birkaç nedeni vardır. İlk olarak, aktin-miyozin bağlanmasından hemen sonra yükün hızlı bir şekilde uygulanması, işlemsel olmayan motorlarda olduğu gibi kuvvet gelişimindeki erken olayların ölçülmesine izin verir. Ek olarak, prosesir motorlar söz konusu olduğunda, motorun çalışma uzunluklarının ve çalışma sürelerinin, ilerlemeleri boyunca sabit kuvvet altında doğru bir şekilde ölçülmesini de sağlar (Şekil 1b). Ayrıca, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı nedeniyle, sistem miyozin çalışma stroku gibi pozisyondaki hızlı değişiklikler sırasında kuvveti sabit tutabilir, böylece motor basamağı sırasında sabit bir yükü garanti eder. Sistemin yüksek zamansal çözünürlüğü, sub-ms etkileşimlerinin tespit edilmesine izin verir ve miyozinin aktin'e zayıf bağlanmasını araştırma olasılığını açar. Son olarak, tahlil geometrisi, kuvvetin ihmal edilebilir enine ve dikey bileşenleri ile aktin filamenti boyunca uygulandığını garanti eder. Bu nokta, dikey kuvvet bileşeninin, motorun kinetik 7,8'inin yüke bağımlılığını önemli ölçüde etkilediği gösterildiğinden, özellikle önemlidir. Bu tekniği kullanarak, prosesif miyosin-5B'ye bir dizi yardımcı ve dirençli yük uygulayabilir ve çok çeşitli kuvvetler için prosesinin yük bağımlılığını doğrudan ölçebiliriz4.

Şekil 1a'da gösterildiği gibi, bu sistemde çift optik cımbızın ("dambıl") odağında sıkışmış iki polistiren boncuk arasında tek bir aktin filament asılıdır. Dengesiz bir net kuvvet F = F1-F 2, filamente hızlı bir geri besleme sistemi aracılığıyla empoze edilir, bu da filamentin net kuvvetin ters yönde tersine çevrildiği kullanıcı tanımlı bir ters çevirme noktasına ulaşana kadar bir yönde sabit hızda hareket etmesini sağlar. Motor protein filament ile etkileşime girmediğinde, dambıl, üzerine tek bir motor proteininin tutturulduğu kaide boncuğuna yayılan üçgen dalga şeklinde (Şekil 1b, alt panel) ileri geri hareket etmekte serbesttir. Etkileşim kurulduktan sonra, dambıl tarafından taşınan kuvvet çok hızlı bir şekilde motor proteinine aktarılır ve motor, miyozin aktinden ayrılana kadar, etkileşim sırasında geri besleme sistemi tarafından uygulanan kuvvet yoğunluğu ve yönü altında adım atarak filamenti yerinden oynatmaya başlar. Sıkışmış aktin filamentinin polaritesine bağlı olarak motorun kademelendirilmesiyle üretilen yer değiştirme, uygulanan kuvvetin yönüne göre yük ya yardımcı olabilir, yani motor deplasmanının aynı yönünde itilebilir (Şekil 1b üst panelde itme) veya dirençli, yani motor deplasmanına göre ters yönde çekme (Şekil 1b'de çekme) olabilir. üst panel), motor işlenebilirliğinin kemomekanik regülasyonunu, uygulanan yükün hem yoğunluğu hem de yönlülüğü ile incelemeyi mümkün kılar.

Sonraki bölümlerde, ultra hızlı bir kuvvet-kelepçe spektroskopisi kurulumu ile farklı yükler altında aktin-miyosin-5B etkileşimlerini ölçmek için tüm adımlar, 1) optik kurulumun kurulumu, optik tuzakların hizalanması ve kalibrasyon prosedürleri, 2) tüm bileşenlerin hazırlıkları ve numune odasındaki montajları, 3) ölçüm prosedürü, 4) çalışma uzunluğu, adım boyutu ve motor proteinin hızı gibi önemli fiziksel parametreleri çıkarmak için temsili veri ve veri analizi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optik kurulum

NOT: Deney düzeneği, nanometre işaretleme kararlılığına sahip çift optik cımbızdan ve %1 lazer yoğunluğu dalgalanmalarına < oluşur. Bu koşullar altında, dambılın nanometre seviyesindeki stabilitesi, tipik tuzak sertliği (0.1 pN / nm) ve gerginlik (1 pN - birkaç on pN) altında garanti edilir. Şekil 2 , optik kurulumun ayrıntılı bir şemasını göstermektedir.

  1. Optik cımbız tasarım ve yapımı 9,10,11.
    1. Kurulumun tüm bileşenlerini Şekil 2'deki şemaya göre optik bir tabloya yerleştirin. Optik tablanın mekanik titreşimleri en aza indirmek için aktif izolatörler içerdiğini unutmayın. Ek olarak, mikroskop yapısı akustik gürültüyü ve mekanik rezonansları emmek için elastomerik izolatörlere monte edilir.
    2. Optik geri bildirimden kaynaklanan rastgele genlik dalgalanmalarını önlemek için lazer kaynağına (" Şekil 2'de "OI") yakın bir optik izolatör yerleştirin.
    3. Hava akımını ve lazer işaret etme kararlılığını etkileyebilecek türbülansları azaltmak için tüm yolu kapalı bir kutuda kapatın.
    4. Ana lazer kaynağını (Nd:YAG lazer, Şekil 2'deki 1.064 nm dalga boyu) polarize edici ışın ayırıcılar (PBS) kullanarak ortogonal polarizasyonlu iki dala bölerek çift optik cımbızı oluşturun. Zaman paylaşımlı tuzaklardan kaçınılmalıdır, çünkü gerginlik altında dambılın salınımını indüklerler12.
    5. İki tuzağın ince ve hızlı hareketlerine izin vermek için Doğrudan Dijital Sentezleyiciler (DDS'ler) tarafından tahrik edilen iki akusto-optik deflektör (Şekil 2'deki AOD'ler) kullanın ve DDS'leri doğrudan alan programlanabilir kapı dizisi FPGA kartından dijital çıkışlardan geçirerek aktin geriliminin hassas bir şekilde düzenlenmesini sağlayın (bkz. Şekil 2).
      NOT: Bağlanmamış durum, miyozin etkileşimi ve hareket dahil olmak üzere ölçümler sırasında her iki tuzak üzerindeki sabit kuvveti hızlı bir şekilde düzeltmek ve korumak için genel geri besleme tepki süresi <10 μs olmalıdır. Bu amaçla, konum dedektörleri >= 100 kHz bant genişliğine sahip olmalı ve veriler >= 200 kHz örnekleme hızında elde edilmelidir. Elde edilen her veri noktası için (5 μs edinme süresi), iki tuzak için orantılı düzeltmeler FPGA tarafından hesaplanır ve AOD'leri süren iki DDS'ye gönderilir. AOD yanıt süresi, gerekli geri bildirim yanıt süresini karşılamak için 5 μs'nin altında olmalıdır.
    6. Sıkışmış boncuk konumunun nm tespiti için, kondenserin arka odak düzlemine iki Kadranlı Fotodiyot Dedektörü (Şekil 2'deki QPD'ler) koyun. QPD'lerin kondenserin arka odak düzlemine konjuge edilmiş bir düzlemde ve ayrıca hedefin arka odak düzlemine konjuge edilmiş bir düzlemdeki AOD'lerin doğru hizalanması, QPD sinyallerinin AOD'lerin frekansından bağımsız olmasını sağlayacaktır.
    7. AOD'yi mikrometre tahrikli doğrusal bir tercümana monte edin ve kristal kenar lazer ışınına yaklaşana kadar yerini alın. Ardından, hedefi dişli objektif muhafazasına ortalanmış bir iris ile değiştirin ve diyafram açıklığını objektif arka diyafram açıklığı boyutuna uyacak şekilde düzenleyin.
    8. Piezo kristali tarafından bloke edilen ışının iristen sonra görülebilen kısmı görünene kadar çeviriciyi lazer ışınına doğru hareket ettirin, ışının iris açıklığını tekrar tamamen doldurmasını sağlamak için çevirmeni hafifçe geriye doğru çevirin.
    9. İkinci AOD için 1.1.7-1.1.8 arasındaki adımları yineleyin. QPD'lerden gelen gecikme süresini ölçerek geri besleme döngüsünün tepki süresini kontrol edin ve kapak kayması13'ün yüzeyine sıkışmış bir boncuk üzerindeki bir kirişi hızla hareket ettirin.
      NOT: Yukarıdaki üç adım (1.1.7-1-1-9), AOD kristallerinin dikkatli bir şekilde hizalanmasına yol açar. Bu adımlar, hem ışın sapmasının hem de geri beslemenin zaman tepkisini optimize etmek için önemlidir13.
  2. Bir fotodiyot vasıtasıyla, mikroskop girişindeki yakalama lazerinin yoğunluk dalgalanmalarını% 1'in altında olması gereken şekilde ölçün. Fotodiyot bant genişliğinin görüntüleme hızından daha büyük olması gerektiğini unutmayın.
  3. Her iki tuzağın işaret kararlılığını kontrol edin.
    1. 1 mL asetonda 20 μL silika boncukları (1.2 μm,% 10 katılar) seyrelterek, 30 s için sonikat, kısaca vorteks ve 19.000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yaparak fosfat tamponunda (PB) silika boncuklar hazırlayın.
    2. Süpernatanı çıkarın, 1 mL asetonda tekrar askıya alın ve yıkamayı tekrarlayın. 50 mM PB'nin 1 mL'sinde tekrar askıya alın, 2 kez yıkayın. Son olarak, 50 mM PB'nin 100 μL'sinde yeniden askıya alın.
    3. Bir akış odası oluşturmak için çift taraflı bir bantla (yaklaşık 60 μm kalınlığında) bir mikroskop slaytına bir kapak kayması yapıştırarak silika boncuklarla optik cımbız kalibrasyonu gerçekleştirin. Odayı 1 mg/mL BSA (Sığır Serumu Albümin proteini) ile doldurun ve 3 dakika bekleyin.
    4. PB'deki silika boncukların 1:1000 seyreltilmesini hazneye akıtın. Odayı dikkatlice kapatmak için silikon gres ile doldurulmuş bir şırınga kullanın. Her tuzağa tek bir boncuk yakalayın ve kalibre etmek için güç spektrumu yöntemi14'ü uygulayın.
    5. 20 μL silika boncukları (1.2 μm çapta,% 10 katı) 1-1.5 mL aseton, vorteks ve 30 s için sonikat içinde çözerek pentil asetat içinde (oda sıcaklığında) silika boncuklar hazırlayın.
    6. 2 dakika boyunca 18.500 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve 1 mL asetonda tekrar askıya alın, ardından yıkamayı tekrarlayın. 1 mL pentil asetat içinde tekrar askıya alın ve pentil asetat içinde 2 kez tekrar yıkayın (santrifüj ve yeniden süspansiyon). Peleti 100 μL nitroselüloz% 1 ve 900 μL pentil asetat içinde yeniden askıya alın. 2 ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
    7. 24 x 24 mm'lik bir cam kapak kapağı alın ve saf etanol ile ıslatılmış kağıtla dikkatlice temizleyin. Daha sonra, temiz cımbızla tutarken, doğrudan saf etanol ile yıkayarak ikinci kez durulayın. Yumuşak bir azot akışı altında kurumasını bekleyin. Gerekirse, cam yüzeydeki tüm görünür kalıntıları gidermek için bu işlemi tekrarlayın.
    8. Silika boncuk stoğunu alın, vorteks yapın ve ~ 30 s için kısaca sonikleştirin.
    9. İkinci bir kapak kaymasını (24 x 60 mm) temizledikten sonra, kapak kaymasının bir yüzeyine 2 μL silika boncuk çözeltisi bulaştırmak için kullanın ve kurumasını bekleyin.
    10. Akış odasını oluşturmak için kullanılacak bir mikroskop slaytını (26 x 76 mm) dikkatlice temizleyin.
    11. İki çizgi çift yapışkan bant (~ 3 mm genişliğinde, 60-100 μm kalınlığında) kesin ve bunları Şekil 3'te gösterildiği gibi mikroskop slaytının bir tarafına takın.
    12. Temiz cımbız kullanarak, kaplanmış kapak kaymasını (1.3.9) yapışkan bant hatlarıyla temas ettirerek, nitroselüloz + boncuk tabakası odanın içine bakacak şekilde, Şekil 3a'da gösterildiği gibi odayı (yaklaşık 20 μL nihai hacim) kapatın. Akış odasını 50 mM fosfat tamponu ile doldurun ve silikon gres ile kapatın.
    13. Şarj bağlantılı bir cihaz (CCD) veya >1,4 megapiksel tamamlayıcı metal oksit-yarı iletken (CMOS) kamera kullanarak parlak alan mikroskobunda >200x büyütmede tek bir silika boncuğu görüntüleyin. Termal sürüklenmeleri telafi etmek için piezo aşamasını (nanometre doğruluğu veya daha iyisi ile) hareket ettirmek için bir geri bildirim yazılımı kullanın10.
    14. Sol tuzağın merkezini boncuğun merkezi ile örtüştür (QPD'den gelen x-y sinyal seviyeleri kalibrasyondakilerle eşleşmelidir). Ardından, bu tuzak için konum gürültüsünü ve konum sinyallerinin standart sapmasını ölçün.
    15. Sağ tuzak15 için önceki adımı tekrarlayın.
  4. Tuzak konumu kalibrasyonu: MHz - nm
    1. Kapak kayma yüzeyine (1.3.5-1.3.12) tutturulmuş silika boncuklar ve yüzer polistiren boncuklar (aşağıdaki bölüm 2.1'de olduğu gibi hazırlanmış α-aktinin konjuge boncuklar kullanın) içeren bir akış odası hazırlayın.
    2. Görüş alanının (FOV) merkezinden hafifçe yarılatılmış (~ 5 μm) örtü yüzeyine bir silika boncuk odaklayın ve FOV'un bir görüntüsünü elde edin. Piezo sahnesini kullanarak boncuğu FOV merkezine doğru 10 μm hareket ettirin ve ikinci bir görüntü elde edin. Bir merkezcil algoritma veya benzeri bir yöntem kullanarak iki görüntüdeki boncuğun merkezini hesaplayın ve parlak alan kamerasının nm / piksel kalibrasyonunu elde etmek için iki boncuk arasındaki piksel cinsinden mesafeyi hesaplayın.
    3. Tek bir yüzen parçacığı tek bir tuzakta yakalayın. Ardından, AOD'yi kullanarak tuzağı küçük adımlarla (0,2 MHz) hareket ettirin ve parçacığın bir görüntüsünü ve her adım için AOD'nin karşılık gelen frekansını elde edin. Daha önce olduğu gibi merkezcil algoritmayı kullanarak parçacığın FOV içindeki konumunu hesaplayın ve önceki adımda elde edilen nm / piksel kalibrasyonunu kullanarak nm cinsinden dönüştürün.
    4. Frekans-konum verilerine doğrusal bir uyum sağlayın ve kalibrasyon sabitini nm/MHz cinsinden hesaplayın.
    5. İkinci tuzak için kalibrasyonu tekrarlayın
  5. Tuzak gücü ve sertlik kalibrasyonu (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
    1. Kapak kayma yüzeyine (1.3.5-1.3.12) tutturulmuş silika boncuklar ve yüzer polistiren boncuklar (aşağıdaki bölüm 2.1'de olduğu gibi hazırlanmış α-aktinin konjuge boncuklar kullanın) içeren bir akış odası hazırlayın ve tek bir parçacığı tek bir tuzakta yakalayın. Daha sonra her iki tuzağı da AOD'ler aracılığıyla küçük adımlarla (0.2 MHz) yerinden oynatın ve parçacığın QPD ile her iki tuzağında ve AOD'lerin karşılık gelen frekansında parçacığın Brownian hareketini kaydedin.
    2. Her pozisyondaki dedektörlerde ortalama bir güç hesaplayın ve kaydedilen Brownian hareketinin13 güç spektrumuna bir Lorentzian fonksiyonu takarak tuzak sertliği ve QPD kalibrasyon sabiti beta elde edin.

2. Numune hazırlama

  1. α-aktininin konjuge floresan boncuklar hazırlayın
    1. Konjugasyon16: Amino işlevselleştirilmiş polistiren boncukları (1 μm çapında,% 2.5 katılar) alın, 500 μL damıtılmış suda iki kez yıkayın ve 500 μL PBS'de (pH 7.0) yeniden askıya alın. 1 mM HaloTag süksinimidil esterO2 ligand ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. 500 μL PBS ile üç kez yıkayın ve 100-200 μM HaloTag α-aktinin ile tekrar askıya alın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin ve 500 μL PBS'de üç kez yıkayın (1,5 hafta içinde boncuk kullanın veya sıvı azotta dondurulmuş halde kullanın ve -80 ° C'de saklayın).
    2. Etiketleme: 200 μL boncuk çözeltisini Rhodamine-BSA ile 10 dakika boyunca 5 μg / mL nihai konsantrasyonda inkübe edin. 50 mM PB ile üç kez yıkayın ve 500 μL PB 50 mM'de yeniden askıya alın. Bu, aylarca - 80 ° C'de alikotlarda saklanabilir).
  2. Biyotinile Miyosin-5B'yi daha önce tarif edildiği gibi eksprese edin ve saflaştırın 4,17.
  3. F-aktin13'ü polimerize edin ve etiketleyin:
    1. F-aktin polimerizasyonu: 69 μL ultra saf su, 10 μL aktin polimerizasyon tamponu 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidin karbonat pH 7.5), 20 μL G-aktin 10 mg / mL ve 1 μL DL-Dithiothreitol (DTT) 1 M. 1 saatten fazla buz üzerinde bırakın.
    2. Rodamin ile f-aktin etiketleme (Ex/Em: 546/575 nm): 25 μL polimerize F-aktin alın ve 19,5 μL ultra saf su, 2,5 μL aktin polimerizasyon tamponu 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidin karbonat pH 7,5), 1 μL 1 M DTT ve2 μL 250 μM rodamin faloidin ekleyin. Gece boyunca buz üzerinde bırakın. Tuzak deneyleri için rodamin F-aktin buz üzerinde saklanabilir ve bir hafta içinde kullanılabilir.
  4. Örnek montaj
    1. Akış odasını (1.3.5-1.3.12) alın ve 5 dakika boyunca 1 mg / mL biyotinile BSA'yı inkübe edin. AB tamponu ile yıkadıktan sonra (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH7.2) 5 dakika boyunca 1 mg/mL streptavidin inkübe edin ve AB tamponu ile tekrar yıkayın. Biyotinile miyosin-5B ağır meromiyozini, M5B tamponunda (10 mM MOPS pH 7.3, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3) 3 nM konsantrasyonda 5 dakika boyunca 2 μM Kalmodülin (CaM) ile inkübe edin. AB'de 2 μM CaM ile desteklenmiş üç hacim 1 mg/mL biyotinillenmiş BSA ile yıkayın ve 3 dakika boyunca inkübe edin.
    2. İnkübasyon sırasında Reaksiyon Karışımını (RM) hazırlayın: Görüntüleme Tamponunda %0,005 α-aktinin işlevselleştirilmiş boncuklar (bölüm 2.1), 1 nM rodamin F-Aktin (bölüm 2.3) (IB: deney için gereken konsantrasyonda 1.2 μM Glikoz-Oksidaz, 0.2 μM katalaz, 17 mM glikoz, 20 mM DTT, 2 μM CaM ve ATP içeren AB tamponu).
    3. RM ile yıkayın ve odayı silikon gres ile kapatın. Örnek şimdi mikroskop altında izlenmeye hazır.

3. Ölçüm

  1. Dambıl monte edin.
    1. Uzun menzilli çevirmenler kullanarak numuneyi hareket ettirerek yüzen α-aktinin boncuklarını arayın, bir tuzağı açın ve bir boncuğu yakalayın.
    2. İlk tuzak işgal edildikten sonra, birden fazla boncuğun sıkışmasını önlemek için sıkışmış boncuğu kapak kayması yüzeyine yakın konumlandırmak için çevirmeni hareket ettirin ve ikinci tuzakta başka bir boncuk yakalayın.
    3. AOD'lerin akustik dalgalarının gücünü ayarlayarak iki tuzağı eşit sertliklere ayarlayın. Sertlikler genellikle 0,03 ila 0,14 pN/nm arasında ayarlanır. Sertlik ne kadar küçük olursa, özellikle düşük kuvvetlerde kuvvet gürültüsü o kadar küçük olur.
    4. Ardından, floresan mikroskobuna geçmek için motorlu ayna M'yi (Şekil 2) çevirin ve numuneyi uzun menzilli çevirmenler13 aracılığıyla yerinden oynatarak çözelti içinde yüzen bir aktin filament arayın. Uzun filamentleri (>5 μm) tercih edin, çünkü işlemsel miyozin onu yerinden çıkaracak ve ayrılmadan önce birkaç mikron boyunca hareket ettirecektir.
    5. Sıkışmış boncuklardan birinin birbirine yapışana kadar filamentin bir ucuna yaklaşmasına izin vermek için numuneyi hareket ettirin. Ardından, boncuk mesafesini yaklaşık filament uzunluğuna ayarlayın ve sahneyi kendi yönünde hareket ettirerek bağlanmamış ikinci boncuk yönünde bir akış oluşturun. Filament akış tarafından gerilecek ve sonunda ona bağlanacaktır13. Boncuk-aktin-boncuk kompleksine "dambıl" denir.
  2. Aktin-miyozin teması kurun.
    1. Filamenti yaklaşık 3 pN'ye kadar önceden gerdirmek için iki tuzağı birbirinden çok uzaklara ayırın ve iki AOD'den birinin frekansını değiştirerek ve bunun sonucunda hareketin konum sinyali aracılığıyla takip eden boncuğa iletimini doğrulayarak üçgen bir dalgada bir tuzak salınımını sağlayarak dambılın sertliğini araştırın.
    2. Dambılın bir kaide silika boncuğunun yakınına koymak için sahneyi hareket ettirin ve sıkışmış boncuk merkezlerinin yüksekliğini silika boncuk çapının biraz altına ayarlayarak filament ile boncuk yüzeyine bağlı protein arasındaki temasa izin verin. Daha sonra silika boncuğun merkezini sıkışmış boncukların arasına yerleştirin.
  3. Kuvvet kelepçesi ve nm stabilizasyon geri bildirimi:
    1. Ultra hızlı kuvvet kelepçesini 2-3 pN kuvvet ve 200 nm salınımla açın ve kaide boncuğunu, aktin filamentine dik yönde yaklaşık 20-30 nm'lik ayrı adımlarla tarayın. Etkileşimlerin her pozisyonda (birkaç saniye) gerçekleşmesini bekleyin, ardından etkileşim gözlenmezse öne geçin. Protein-filament etkileşimi kuruldukça, etkileşimlerin daha sık olduğu konumu arayın.
    2. İşlemsel miyozin aktin filamentinin bir ucuna (genellikle + ucuna) doğru hareket ettiğinde, + ucuna bağlı sıkışmış boncuğun silika boncuğuna doğru hareket ettiğinden emin olun. Sahneyi filamentin -ucuna doğru hareket ettirin, böylece silika boncuk, miyozin bağlanmadığında filamentin -ucuna bağlı sıkışmış boncuğa mümkün olduğunca yakın durur ve nanometre stabilizasyon geri bildirimini başlatır. Bunu yaparken, filamentin + ucuna tutturulmuş sıkışmış boncuğun silika boncuğuna çarpma olasılığı en aza indirilir.
  4. Verileri kaydedin.

4. Veri analizi4

NOT: Açıklanan analiz yöntemi, miyozin adımlamasının neden olduğu gibi, dambıl hızındaki değişikliklere bağlı olarak prosesif koşuların ve hızlı adım atma olaylarının tespitine ve ölçülmesine izin verir. İşlemsel çalışmaların analizi, 3,4,13 referanslarında açıklanan işlemsel olmayan motorlar için bir veri analizi yöntemine dayanarak gerçekleştirilir.

  1. Adım adım olay algılamasına izin vermek için hız değişiklikleri için bir eşik ayarlayın. Bu durumda hem ileri hem de geri adımlar beklendiğinden, eşiğin her iki yönde de aşılması kabul edilir.
  2. Her adımı karşılık gelen çalışmaya atayın: Birbirini izleyen iki adım arasındaki zaman aralığı 3 ms'den kısaysa ve adımların genliği 90 nm <, adımlar aynı çalıştırmaya atanır, aksi takdirde adımlar farklı çalıştırmalara atanır4.
  3. Yardımcı kuvvetler için doğru çalışma uzunluğu4.
    1. Ölçülen ortalama çalışma uzunluğu değerinden <RLm> gerçek çalışma uzunluğu değerini hesaplayarak yardımcı kuvvetler altında doğru çalışma uzunlukları, burada D , salınım aralığıdır:
      Equation 1
      NOT: Bu denklemin türetilmesiyle ilgili ayrıntılar referans4'te bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Temsili veriler, Şekil 4'te gösterildiği gibi zaman içindeki pozisyon kayıtlarından oluşur. Konum kaydında iki tür yer değiştirme görülebilir. İlk olarak, miyozin motoru aktin filamenti ile etkileşime girmediğinde, sıkışmış boncuklar, çözücünün viskoz sürükleme kuvvetine karşı sabit bir hızda hareket eder ve operatör tarafından üçgen bir dalga3'te ayarlanan salınım aralığında salınan doğrusal bir yer değiştirmeyi gösterir (uzun zamansal ölçek nedeniyle Şekil 4'te görünmez). İkincisi, miyozin motoru filament ile etkileşime girdiğinde, hareketli filament tarafından taşınan kuvvet proteine çok hızlı bir şekilde aktarılır, sistem hızı sıfıra düşer (Şekil 4'teki kırmızı çizgiler) ve adım atma olayları koşunun sonuna kadar sabit kuvvet altında gerçekleşir. Şekil 5'te gösterildiği gibi, kuvvet, boncuk kullanıcı tarafından ayarlanan salınım aralığının kenarına ulaştığında kuvvet yönünü değiştiren geri besleme sistemi tarafından pozitiften negatif yöne (ve tam tersi) geçirilir. Bazı durumlarda, miyozin filamenti pozitif yöne doğru bağladığında ve değiştirdiğinde, boncuğu salınım aralığının (üst) kenarına doğru itebilir. Bu, yardımcı kuvvet altında gerçekleşirse (yani, pozitif yer değiştirmeye, itmeye, Şekil 5'e yönelik), miyozinin çalışması, salınım kenarındaki kuvvet yönü ters çevrilmesiyle kesintiye uğrayacaktır (Şekil 5'teki oklar), böylece koşunun uzunluğunu dambıl salınımının genliği ile sınırlandıracaktır D. Bu, yardımcı kuvvet durumunda çalışma uzunluğunun düzeltilmesini gerektirir (4.3.1).

Figure 1
Şekil 1: İşlemsel bir miyosin-5B motoruna uygulanan UFFCS'nin şeması. (a) Tek bir miyosin-5B molekülü, bir streptavidin-biyotin bağlantısı aracılığıyla bir cam boncuk kaidesine tutturulur. Tek bir aktin filament, α aktinin kaplı boncuklar ("üç boncuk" geometrisi olarak adlandırılır) arasında askıya alınarak hapsedilir. Siyah oklar sağda (F1) ve sol boncukta (F2) kenetlenmiş kuvveti, kırmızı ok dambıl üzerindeki net kuvveti (F) temsil eder. F, miyozin aktine bağlı olmadığında dambılın sınırlı bir salınım aralığında tutulması için ileri geri değiştirilir. (b) Dambıl salınımının, miyosin-5B bağlantısının ve yardımcı (itme) ve dirençli (çekme) yükler altında işlemsel çalışmaların ilgili aşamaları sırasında yer değiştirmeyi ve kuvveti gösteren örnek iz. Bu rakam4'ten değiştirilmiştir. 200 kHz örnekleme hızında elde edilen ham veriler çizilir. Std. Dev. kuvvet yaklaşık 0.27 pN'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: Deney düzeneğinin optik şeması. Optik mikroskop şunlardan oluşur: halojen lamba (H), kondenser (C), numune (S), piezo çevirmenler (x-y ve z), objektif (O), düşük büyütmeli kamera (CCD 200X) ve nm stabilizasyon geri bildirimi için kullanılan yüksek büyütmeli kamera (CCD 2000X). Çift optik cımbız, dikroik aynalar (D2 ve D3) aracılığıyla mikroskobun optik ekseninden yerleştirilir ve çıkarılır ve şunları içerir: Nd: YAG lazer (1064 nm), optik izolatör (OI), λ / 2 dalga plakaları, polarize edici ışın ayırıcı küpler (PBS), akusto-optik deflektörler (AOD), 1064 nm müdahale filtreleri (F1 ve F2), kadran dedektör fotodiyotları (QDP). QDP'lerden gelen sinyaller, AOD'leri (kuvvet geri bildirimi) kullanan iki özel yapım doğrudan dijital sentezleyiciye (DDS) gönderilen bir FPGA ile detaylandırıldı. Floresan uyarımı, çoğaltılmış bir Nd: YAG lazer (532 nm) ve bir elektron çarpılmış kameraya (EMCCD) yansıtılan görüntü ile sağlandı. M hareketli bir ayna, F3 bir emisyon filtresidir. Bu rakam 3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Resim 3: Akış odası düzeneği . (a) Oda hazırlığı. Silika boncuklarla bulaşmış bir cam kapak kayması, yaklaşık 20 μL hacimli bir akış hücresi oluşturmak için çift yapışkan bant şeritlerinden geçen bir mikroskop slaytına tutturulur. b) Akış hücresinin üstten görünümü. Çözeltiler, haznenin bir tarafından bir pipetle uçurulur ve ok yönü boyunca bir akış oluşturmak için diğer taraftan bir filtre kağıdı aracılığıyla emilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Temsili pozisyon kaydı. Miyosin-5B işlemsel koşuları ve adım ve çalıştırma algılama algoritmasını gösteren pozisyon kaydı. Her koşunun algılanan başlangıcı ve sonu, sırasıyla yeşil ve camgöbeği dikey çizgilerle gösterilir. Kırmızı yatay çizgiler algılanan adımları gösterir. Bu rakam4'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Miyozin çalışmaları sırasında kuvvet ters çevirme. Miyozin, filamenti yardımcı kuvvet (itme) altında pozitif yönde bağladığında ve hareket ettirdiğinde, kuvvetin tersine çevrildiği (oklarla belirtilen) salınım aralığının kenarına ulaşması ve böylece miyozinin yardımcı kuvvet altında çalışması kesintiye uğrayabilir. Aksine, dirençli kuvvet (çekme) altında, miyozin işlemsel adımlama, dambılın kuvvet ters çevirme noktasına ulaşmasını önler. Bu nedenle, ikinci durumda, çalışma uzunlukları dirençli kuvvetler için salınım aralığı ile sınırlı değildir. Bu rakam4'ten değiştirilmiştir. 200 kHz örnekleme hızında elde edilen ham veriler çizilir. Std. Dev. kuvvet yaklaşık 0.27 pN'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Üç boncuklu tahlil gibi tek moleküllü teknikler teknik olarak zorlu ve düşük verim olmasına rağmen, UFFCS, verilerin yüksek sinyal-gürültü oranı sayesinde moleküler etkileşimlerin tespitini geliştirir. UFFCS, motor proteinlerinin yüke bağımlılığının incelenmesine izin verir, motorun filamente bağlanması üzerine kuvvetin çok hızlı bir şekilde uygulanmasının temel avantajlarıyla, kuvvet üretimindeki erken ve çok hızlı olayları ve kontrollü kuvvet altındaki zayıf bağlanma durumlarını araştırmak için; Kuvveti tüm çalışma boyunca sabit tutmak ve kuvvet yönlülüğü üzerinde tam kontrol ile motor bağımlılığını araştırmak. Son nokta ile ilgili olarak, burada kullandığımız üç boncuklu geometri, filament yönü boyunca kuvvetlerin uygulanmasında ve ölçülmesinde, enine veya dikey bileşenlerden gelen katkıları en aza indirmede çok etkilidir. Bununla birlikte, motor proteinin aktif olarak enine veya dikey kuvvetler veya hatta torklar üretmesi beklendiğinde, tek boncuk geometrisi gibi diğer konfigürasyonlar daha uygundur 2,7,18. Dahası, mekansal ve zamansal çözünürlüğü sayesinde UFFCS, aksi takdirde geleneksel tek moleküllü tekniklerle engellenecek moleküler etkileşimlerin temellerini anlamak için eşsiz bir aracı temsil eder. Aslında, UFFCS, yardımcı ve dirençli kuvvetlerin miyosin-5B'nin mekanik tepkisini nasıl düzenlediğini araştırmayı mümkün kıldı, böylece hücre4'teki aktin ağı içindeki kolektif davranışı hakkında yeni bir fikir verdi.

Bununla birlikte, bu deneylerin başarısı, bu protokolde bulunan tüm talimatları izleyerek çok dikkatli bir şekilde ele alınması gereken bazı önemli gereksinimlerin yerine getirilmesine bağlıdır: optik kurulumun hassas hizalanması ve izolasyonu, optimum bir mekansal çözünürlüğe ulaşmak için esastır; uygulanan kuvvetlerin değerlerini yüksek hassasiyetle belirlemek için optik sistemin dikkatli kalibrasyonu gereklidir; yüksek zamansal çözünürlüğe ulaşmak için hızlı bir geri besleme sisteminin ayarlanması gereklidir; Son olarak, numune odasında bir araya getirilen tüm bileşenler kontrollü bir ortamda hazırlanmalı ve mümkün olduğunca steril tutulmalıdır, çünkü numune odasındaki herhangi bir safsızlık deneyi tehlikeye atabilir ve deney protokolünün başarısı için optimum depolama ve kullanımlarıyla ilgili tüm göstergelere kesinlikle saygı gösterilmelidir. Önemli olarak, veri analizi, sonuçları doğru bir şekilde yorumlamak ve eserlerden kaçınmak için farklı motor-filament etkileşimlerine dikkatlice uyarlanmalıdır.

Bu protokolde, deneysel cihazların kurulumundan numune hazırlama, ölçüm ve veri analizine kadar, çeşitli geleneksel olmayan miyosinleri ve kinesinler ve dineinler gibi diğer proses motor sınıflarını incelemek için uygun şekilde uyarlanabilecek prosesir miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için tüm adımlar dahil edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Laserlab-Europe 871124 Hibe Anlaşması kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Hibe No. RBFR13V4M2) ve Ente Cassa di Risparmio di Firenze tarafından desteklenmiştir. A.V. Kashchuk, Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Tags

Biyoloji Sayı 173 ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi optik cımbız üç boncuklu tahlil moleküler motorlar miyozin

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter