Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

Abstract

ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה (UFFCS) היא טכניקה של מולקולה בודדת המבוססת על פינצטה לייזר המאפשרת לחקור את הכימומכניקה של מיוזין קונבנציונלי ולא קונבנציונלי תחת עומס ברזולוציית זמן חסרת תקדים. בפרט, האפשרות לחקור מנועי מיוזין תחת כוח קבוע מיד לאחר היווצרות הקשר אקטין מיוזין, יחד עם השיעור הגבוה של משוב הכוח (200 קילוהרץ), הראתה UFFCS ככלי רב ערך לחקר התלות בעומס של דינמיקה מהירה כגון שבץ עבודה מיוזין. יתר על כן, UFFCS מאפשר לחקור כיצד אינטראקציות מיוזין-אקטין תהליכיות ולא תהליכיות מושפעות מהעוצמה והכיוון של הכוח המופעל.

על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן יהיה לבצע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים ועל מגוון מיוזין לא קונבנציונלי. על ידי התאמות מסוימות, ניתן להרחיב את הפרוטוקול בקלות גם לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים כגון קינזין ודינינים. הפרוטוקול כולל את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, הליכי כיול, איסוף נתונים וניתוחם.

Introduction

בעשורים האחרונים פינצטה אופטית הייתה כלי רב ערך להבהרת המכנוכימיה של אינטראקציות חלבונים ברמת המולקולה הבודדת, בשל האפשרות הבולטת של מניפולציה ומדידה בו זמנית של שינויי קונפורמציה וקינטיקה אנזימטית 1,2. בפרט, היכולת להפעיל ולמדוד כוחות בטווח של אלה המופעלים על ידי מנועים מולקולריים בתא, יחד עם היכולת למדוד שינויים קונפורמטיביים תת-ננומטריים, הפכו את הפינצטה האופטית לכלי ייחודי של מולקולה בודדת לפענוח התכונות הכימומכניות של חלבונים מוטוריים והוויסות המכני שלהם.

ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה (UFFCS) היא טכניקת ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה יחידה המבוססת על פינצטה אופטית, שפותחה כדי לחקור את הקינטיקה המהירה של מנועים מולקולריים תחת עומס בגאומטריה של שלושה חרוזים (איור 1a)3,4. UFFCS מפחית את השהיית הזמן להפעלת הכוח על חלבון המנוע עד לגבול הפיזיקלי של פינצטה אופטית, כלומר זמן ההרפיה המכנית של המערכת, ובכך מאפשר הפעלת הכוח במהירות לאחר תחילת ריצת מיוזין (כמה עשרות מיקרו-שניות)3. יכולת זו נוצלה כדי לחקור את האירועים המכניים המוקדמים בשריר השלד המהיר 3 ושריר הלב5 כדי לחשוף את התלות בעומס של מכת הכוח, מצבי הקישור החלשים והחזקים, כמו גם את סדר האירועים הביוכימיים (Pi) והמכניים (powerstroke).

גיאומטריית שלושת החרוזים משמשת בדרך כלל לחקר מנועים לא תהליכיים, גיאומטריית חרוז יחיד עם מהדק כוח שימשה בדרך כלל לחקר מיוזין לא קונבנציונלי תהליכי, כגון מיוזין Va6. עם זאת, ישנן מספר סיבות להעדיף בדיקת UFFCS בעלת שלושה חרוזים גם עבור מיוזין תהליכי. ראשית, היישום המהיר של עומס מיד לאחר קשירת אקטין מיוזין מאפשר מדידה של האירועים המוקדמים בהתפתחות הכוח כמו במנועים שאינם תהליכים. בנוסף, במקרה של מנועים תהליכיים זה גם מאפשר מדידה מדויקת של אורכי הריצה של המנוע ומשכי הריצה שלו תחת כוח קבוע לאורך כל ההתקדמות שלהם (איור 1b). יתר על כן, בגלל הקצב הגבוה של משוב הכוח, המערכת יכולה לשמור על כוח קבוע במהלך שינויים מהירים במיקום, כגון מכת עבודה מיוזין, ובכך להבטיח עומס קבוע במהלך דריכה מוטורית. הרזולוציה הטמפורלית הגבוהה של המערכת מאפשרת זיהוי אינטראקציות תת-אלפיות שנייה, ופותחת את האפשרות לחקור קשירה חלשה של מיוזין לאקטין. לבסוף, גיאומטריית הבדיקה מבטיחה שהכוח יופעל לאורך חוט האקטין עם רכיבים רוחביים ואנכיים זניחים של הכוח. נקודה זו רלוונטית במיוחד מכיוון שרכיב הכוח האנכי הוכח כמשפיע באופן משמעותי על התלות בעומס של קינטיקה מוטורית 7,8. על ידי שימוש בטכניקה זו, אנו יכולים ליישם מגוון של עומסים מסייעים והתנגדותיים על מיוזין-5B תהליכיים ולמדוד ישירות את תלות העומס של התהליכות שלו עבור מגוון רחב של כוחות4.

כפי שניתן לראות באיור 1a, במערכת זו חוט להט אקטין יחיד תלוי בין שני חרוזי פוליסטירן הכלואים במוקד של פינצטה אופטית כפולה ("משקולת"). כוח נטו לא מאוזן F = F1-F 2 מוטל על חוט הלהט, באמצעות מערכת משוב מהירה, אשר גורמת לחוט הלהט לנוע במהירות קבועה בכיוון אחד עד שהוא מגיע לנקודת היפוך מוגדרת על ידי המשתמש שבה הכוח נטו מתהפך בכיוון ההפוך. כאשר החלבון המוטורי אינו מתקשר עם חוט הלהט, המשקולת חופשייה לנוע קדימה ואחורה בצורת גל משולש (איור 1b, לוח תחתון) המשתרע על חרוז הכן שעליו מחובר חלבון מוטורי יחיד. ברגע שהאינטראקציה נוצרת, הכוח שנישא על ידי המשקולת מועבר במהירות רבה לחלבון המוטורי והמנוע מתחיל להזיז את חוט הלהט על ידי דריכה מתחת לעוצמת הכוח והכיוון שהופעלו על ידי מערכת המשוב בזמן האינטראקציה, עד שהמיוזין מתנתק מאקטין. בהיותו התזוזה הנוצרת על ידי דריכת המנוע התלויה בקוטביות של חוט האקטין הלכוד, על פי כיוון הכוח המופעל העומס יכול להיות מסייע, כלומר דוחף באותו כיוון של תזוזת המנוע (דחיפה בלוח העליון של איור 1b), או התנגדותי, כלומר משיכה בכיוון ההפוך ביחס לתזוזה המוטורית (משיכה באיור 1b פאנל עליון) המאפשר ללמוד את הרגולציה הכימומכנית של התהליכות המוטורית הן על ידי העוצמה והן על ידי הכיווניות של העומס המופעל.

בסעיפים הבאים מתוארים במלואם כל השלבים למדידת אינטראקציות אקטין מיוזין-5B תחת עומסים שונים עם מערך ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהיר במיוחד, כולל 1) הגדרת ההתקנה האופטית, הליכי יישור וכיול מלכודות אופטיות, 2) הכנת כל הרכיבים והרכבתם בתא הדגימה, 3) הליך המדידה, 4) נתונים מייצגים וניתוח נתונים כדי לחלץ פרמטרים פיזיקליים חשובים, כגון אורך הריצה, גודל הצעד ומהירות החלבון המוטורי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הגדרה אופטית

הערה: מערך הניסוי מורכב מפינצטה אופטית כפולה עם יציבות הצבעה ננומטרית ותנודות < של 1% בעוצמת הלייזר. בתנאים אלה, יציבות המשקולת ברמה הננומטרית מובטחת תחת קשיחות מלכודת אופיינית (0.1 pN/nm) ומתח (1 pN - כמה עשרות pN). איור 2 מראה סכימה מפורטת של המבנה האופטי.

  1. פינצטה אופטית תכנון ובנייה 9,10,11.
    1. מקם את כל רכיבי ההתקנה על שולחן אופטי בהתאם לסכמה באיור 2. שים לב שהטבלה האופטית כוללת מבודדים פעילים כדי למזער תנודות מכניות. בנוסף, מבנה המיקרוסקופ מורכב על מבודדים אלסטומריים כדי לספוג רעש אקוסטי ותהודה מכנית.
    2. הכניסו איזולטור אופטי קרוב למקור הלייזר ("OI" באיור 2), כדי למנוע תנודות משרעת אקראיות כתוצאה ממשוב אופטי.
    3. אטמו את כל הנתיב בקופסה סגורה כדי להפחית את זרם האוויר ואת המערבולות שעלולות להשפיע על יציבות כיוון הלייזר.
    4. צור את הפינצטה האופטית הכפולה על-ידי חלוקת מקור הלייזר הראשי (לייזר Nd:YAG, אורך גל של 1,064 ננומטר באיור 2) לשני ענפים עם קיטוב אורתוגונלי באמצעות שימוש במפצלי קרן מקטבים (PBS). יש להימנע ממלכודות משותפות בזמן מכיוון שהן גורמות לתנודה של המשקולת תחת מתח12.
    5. השתמשו בשני מסיטי אוויר אקוסטיים-אופטיים (AODs באיור 2) המונעים על-ידי Direct Digital Synthesizers (DDSs) כדי לאפשר תנועות עדינות ומהירות של שתי המלכודות וויסות מדויק של מתח האקטין על-ידי הנעת ה-DDSs ישירות דרך היציאות הדיגיטליות מלוח FPGA של מערך השער הניתן לתכנות בשטח (ראו איור 2).
      הערה: זמן התגובה הכולל למשוב חייב להיות <10 μs כדי לתקן במהירות ולשמור על כוח קבוע בשתי המלכודות במהלך המדידות, כולל המצב הלא מאוגד, אינטראקציה עם מיוזין ותנועה. לשם כך, גלאי מיקום חייבים להיות בעלי רוחב פס של >= 100 קילוהרץ ויש להשיג נתונים בקצב דגימה של >= 200 קילוהרץ. עבור כל נקודת נתונים שנרכשת (זמן רכישה של 5 מיקרוגרם), תיקונים פרופורציונליים עבור שתי המלכודות מחושבים על ידי ה- FPGA ונשלחים לשני ה- DDS המניעים את ה- AODs. זמן התגובה של AOD חייב להיות מתחת ל-5 μs כדי לספק את זמן התגובה הנדרש למשוב.
    6. לזיהוי ננומטר של מיקום החרוזים הלכודים, הניחו שני גלאי פוטודיודה רבעוניים (QPDs באיור 2) במישור המוקד האחורי של המעבה. יישור מדויק של ה-QPDs במישור המצומד למישור המוקד האחורי של המעבה, כמו גם של ה-AODs במישור המצומד למישור המוקד האחורי של המטרה, יבטיח שאותות ה-QPD יהיו בלתי תלויים בתדר ה-AODs.
    7. הרכיבו את ה-AOD על מתרגם ליניארי עם כונן מיקרומטר והזיזו אותו עד שקצה הגביש מתקרב לקרן הלייזר. לאחר מכן, החלף את המטרה בקשתית, הממורכזת בבית האובייקטיבי המושחל, וסת את הצמצם שלה כך שיתאים לגודל הצמצם האחורי של המטרה.
    8. הזיזו את המתרגם לכיוון קרן הלייזר עד שהחלק של הקרן שנחסם על ידי גביש הפיזו ייראה אחרי הקשתית, סובבו את המתרגם מעט לאחור כדי לגרום לקרן למלא שוב את הצמצם הקשתית לחלוטין.
    9. חזור על שלבים 1.1.7-1.1.8 עבור AOD השני. בדוק את זמן התגובה של לולאת המשוב על ידי מדידת פיגור הזמן מה- QPDs תוך הזזת קרן במהירות על חרוז תקוע על פני השטח של הכיסוי13.
      הערה: שלושת השלבים לעיל (1.1.7-1-1-9) מובילים ליישור זהיר של גבישי AOD. שלבים אלה חשובים כדי למטב את תגובת הזמן הן של הטיית הקרן והן של המשוב13.
  2. באמצעות פוטודיודה מודדים את תנודות העוצמה של לייזר הלכידה בפתח המיקרוסקופ, שחייבות להיות מתחת ל-1%. שים לב שרוחב הפס של הפוטודיודה חייב להיות גדול יותר מקצב ההדמיה.
  3. בדוק את יציבות ההצבעה של שתי המלכודות.
    1. הכינו חרוזי סיליקה בחיץ פוספט (PB) על ידי דילול 20 מיקרוליטר של חרוזי סיליקה (1.2 מיקרומטר, 10% מוצקים) ב-1 מ"ל אצטון, סוניקט למשך 30 שניות, מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה למשך 2 דקות ב-19,000 x גרם.
    2. הסר את supernatant, resuspend ב 1 מ"ל של אצטון, ולחזור על הכביסה. Resuspend ב 1 מ"ל של 50 mM PB, לשטוף 2 פעמים. לבסוף, resuspend ב 100 μL של 50 mM PB.
    3. בצע כיול פינצטה אופטית עם חרוזי סיליקה על ידי הדבקת כיסוי על מגלשת מיקרוסקופ עם סרט דו-צדדי (בעובי של כ-60 מיקרומטר) לבניית תא זרימה. מלאו את התא ב-BSA של 1 מ"ג/מ"ל (חלבון אלבומין בסרום בקר) והמתינו 3 דקות.
    4. הזרימו דילול של 1:1000 של חרוזי סיליקה ב-PB לתוך התא. השתמש מזרק מלא שומן סיליקון כדי לאטום בזהירות את החדר. לכדו חרוז יחיד בכל השמנה והחילו את שיטת ספקטרום ההספק14 כדי לכייל אותם.
    5. מכינים חרוזי סיליקה בפנטיל אצטט (בטמפרטורת החדר) על ידי המסת 20 מיקרוליטר חרוזי סיליקה (קוטר 1.2 מיקרומטר, 10% מוצק) ב-1-1.5 מ"ל אצטון, מערבולת וסוניקט למשך 30 שניות.
    6. צנטריפוגה ב 18,500 x גרם למשך 2 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש ב-1 מ"ל אצטון, ואז לחזור על השטיפה. השהה ב 1 מ"ל של פנטיל אצטט ושטיפה חוזרת (צנטריפוגה והשעיה) בפנטיל אצטט 2 פעמים. להשעות מחדש את הגלולה ב 100 μL של nitrocellulose 1% ו 900 μL pentyl אצטט. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך חודשיים.
    7. קח כיסוי זכוכית בגודל 24 x 24 מ"מ ונקה אותו בזהירות עם נייר ספוג באתנול טהור. לאחר מכן, תוך כדי החזקתו בפינצטה נקייה, שטפו אותו פעם נוספת על ידי שטיפה ישירה עם אתנול טהור. תנו לו להתייבש תחת זרימה עדינה של חנקן. במידת הצורך, חזור על פעולה זו כדי להסיר את כל השאריות הגלויות על משטח הזכוכית.
    8. קח את מלאי חרוזי סיליקה, מערבל אותו ו sonicate אותו לזמן קצר במשך ~ 30 שניות.
    9. לאחר ניקוי כיסוי שני (24 x 60 מ"מ), השתמשו בו כדי למרוח 2 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי סיליקה על משטח אחד של הכיסוי, והמתינו לייבוש.
    10. נקו היטב מגלשת מיקרוסקופ (26X76 מ"מ) שתשמש ליצירת תא הזרימה.
    11. חתכו שתי שורות של סרט דביק כפול (~3 מ"מ גודל, 60-100 מיקרומטר עובי) וחברו אותן בצד אחד של שקופית המיקרוסקופ, כפי שמוצג באיור 3.
    12. על-ידי שימוש בפינצטה נקייה, סגור את התא (כ-20 מיקרוליטר נפח סופי) על-ידי הנחת הכיסוי המצופה (1.3.9) במגע עם קווי הסרט הדביק, כאשר שכבת הניטרוצלולוז + חרוזים פונה לחלק הפנימי של התא, כפי שמוצג באיור 3a. מלאו את תא הזרימה במאגר פוספט 50 mM ואטמו אותו בשומן סיליקון.
    13. תמונה של חרוז סיליקה יחיד במיקרוסקופ brightfield בהגדלה של >200x באמצעות התקן מצמיד מטען (CCD) או מצלמת מוליכים למחצה משלימה של תחמוצת מתכת (CMOS) עם >1.4 מגה-פיקסל. השתמש בתוכנת משוב כדי להזיז את שלב Piezo (בדיוק ננומטרי או טוב יותר) כדי לפצות על סחף תרמי10.
    14. חפפו את מרכז המלכודת השמאלית למרכז החרוז (רמות אות x-y מה-QPD צריכות להתאים לאלה מהכיול). לאחר מכן מדוד את רעשי המיקום וסטיית התקן של אותות המיקום עבור מלכודת זו.
    15. חזור על השלב הקודם עבור המלכודת הימנית15.
  4. כיול מיקום ההשמנה: MHz לננומטר
    1. הכינו תא זרימה עם חרוזי סיליקה מחוברים על משטח הכיסוי (1.3.5-1.3.12) וחרוזי פוליסטירן צפים (השתמשו בחרוזים מצומדים α-אקטינין שהוכנו כמו בסעיף 2.1 הבא).
    2. מקדו חרוז סיליקה על משטח הכיסוי ששקע מעט (~5 מיקרומטר) ממרכז שדה הראייה (FOV) וקבלו תמונה של ה-FOV. הזיזו את החרוז ב-10 מיקרומטר לכיוון מרכז ה-FOV באמצעות שלב הפיזו וקבלו תמונה שנייה. חשב את מרכז החרוז בשתי התמונות באמצעות אלגוריתם צנטרואידי או דומה וחשב את המרחק בפיקסל בין שני החרוזים כדי לקבל את כיול nm/pixel של מצלמת brightfield.
    3. השמנת חלקיק צף יחיד בהשמנה אחת. לאחר מכן, הזז את ההשמנה באמצעות AOD בצעדים קטנים (0.2 MHz) וקבל תמונה של החלקיק ואת התדר המתאים של AOD עבור כל שלב. חשב את מיקום החלקיק ב- FOV באמצעות אלגוריתם צנטרואידים כמו קודם והמיר אותו בננומטר באמצעות כיול nm/pixel שהתקבל בשלב הקודם.
    4. בצע התאמה ליניארית לנתוני מיקום התדר וחשב את קבוע הכיול בננומטר/מגה-הרץ.
    5. כיול חוזר עבור המלכודת השנייה
  5. כיול עוצמת ההשמנה והקשיחות (MHz מול W), QPD (MHz מול pN/nm)
    1. הכינו תא זרימה עם חרוזי סיליקה מחוברים על משטח הכיסוי (1.3.5-1.3.12) וחרוזי פוליסטירן צפים (השתמשו בחרוזים מצומדים α-אקטינין שהוכנו כמו בסעיף 2.1 הבא) ולכדו חלקיק בודד במלכודת אחת. לאחר מכן הזיזו את שתי המלכודות דרך AODs בצעדים קטנים (0.2 MHz) ותיעדו תנועה בראונית של החלקיק בשתי המלכודות עם QPD והתדר המתאים של AODs.
    2. חשב הספק ממוצע על הגלאים בכל מיקום וקבל קשיחות מלכודת ובטא קבועה של כיול QPD על ידי התאמת פונקציה לורנציאנית לספקטרום הספק של התנועה הבראוניתהמתועדת 13.

2. הכנת מדגם

  1. הכנת חרוזים פלואורסצנטיים מצומדים α-אקטינין
    1. בצע צימוד16: קח חרוזי פוליסטירן פונקציונליים אמינו, (קוטר 1 מיקרומטר, 2.5% מוצקים), שטוף אותם פעמיים במים מזוקקים 500 μL והרחק מחדש ב 500 μL של PBS (pH 7.0). מוסיפים 1 mM HaloTag succinimidyl ester O2 ligand ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. יש לשטוף שלוש פעמים עם 500 μL של PBS ולהשעות מחדש עם 100-200 מיקרומטר HaloTag α-actinin. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ולשטוף שלוש פעמים ב-500 μL של PBS (יש להשתמש בחרוזים תוך שבוע וחצי או להקפיא בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C).
    2. תיוג: דגירה של 200 מיקרוליטר תמיסת חרוזים עם רודאמין-BSA בריכוז סופי של 5 מק"ג/מ"ל למשך 10 דקות. לשטוף עם 50 mM PB שלוש פעמים ולהשהות מחדש ב 500 μL של PB 50 mM. זה יכול להיות מאוחסן aliquots ב - 80 °C במשך חודשים).
  2. לבטא ולטהר biotinylated Myosin-5B כפי שתוארקודם 4,17.
  3. פולימריזציה ותיוג F-אקטין13:
    1. פילמור F-אקטין : יש לערבב 69 μL של מים טהורים במיוחד, 10 μL של חיץ פילמור אקטין 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidine carbonate pH 7.5), 20 μL של G-actin 10 mg/mL, ו-1 μL של DL -Dithiothreitol (DTT) 1 M. השאירו אותו על קרח למשך יותר משעה אחת.
    2. תיוג F-אקטין עם רודאמין (Ex/Em: 546/575 ננומטר): יש ליטול 25 μL של F-אקטין פולימרי ולהוסיף 19.5 μL מים טהורים במיוחד, 2.5 μL של חיץ פילמור אקטין 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidine carbonate pH 7.5), 1 μL של 1 M DTT,ו-2 μL של 250 μM רודאמין פאלואדין. השאירו אותו על קרח למשך הלילה. לניסויי לכידה ניתן לאחסן רודאמין F-אקטין על קרח ולהשתמש בו תוך שבוע.
  4. הרכבה לדוגמה
    1. קח את תא הזרימה (1.3.5-1.3.12) ודגור 1 מ"ג / מ"ל BSA biotinylated במשך 5 דקות. לאחר שטיפה עם AB buffer (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH7.2) יש לדגור על סטרפטאבידין 1 מ"ג/מ"ל למשך 5 דקות ולשטוף שוב עם AB buffer. לדגור על מיוזין-5B כבד מיוזין ביוטינילציה בריכוז 3 ננומטר במאגר M5B (10 mM MOPS pH 7.3, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3) עם 2 מיקרומטר קלמודולין (CaM) למשך 5 דקות. יש לשטוף עם שלושה נפחים של 1 מ"ג/מ"ל BSA ביוטינילציה בתוספת 2 מיקרומטר CaM ב-AB ולדגור במשך 3 דקות.
    2. בזמן הדגירה הכינו את תערובת התגובה (RM): 0.005% חרוזים פונקציונליים α-אקטינין (סעיף 2.1), 1 ננומטר רודאמין F-אקטין (סעיף 2.3) במאגר הדמיה (IB: חיץ AB עם 1.2 מיקרומטר גלוקוז-אוקסידאז, 0.2 מיקרומטר קטלאז, 17 מילימטר גלוקוז, 20 מילימטר DTT, 2 מיקרומטר CaM ו-ATP בריכוז הדרוש לניסוי).
    3. לשטוף עם RM ולאטום את החדר עם שומן סיליקון. הדגימה מוכנה כעת לצפייה תחת המיקרוסקופ.

3. מדידה

  1. הרכיבו את המשקולת.
    1. חפשו את חרוזי α-אקטינין הצפים על ידי הזזת הדגימה באמצעות מתרגמים ארוכי טווח, הפעילו מלכודת אחת ולכדו חרוז אחד.
    2. לאחר שהמלכודת הראשונה תפוסה, הזיזו את המתרגם כדי למקם את החרוז הלכוד קרוב למשטח הכיסוי כדי למנוע השמנה של חרוזים מרובים, ולכדו חרוז נוסף במלכודת השנייה.
    3. כוונן את שתי המלכודות לקשיחות שווה על ידי התאמת עוצמת הגלים האקוסטיים של AODs. נוקשות נקבעת בדרך כלל בין 0.03 ל- 0.14 pN/nm. ככל שהנוקשות קטנה יותר כך רעש הכוח קטן יותר, במיוחד בכוחות נמוכים.
    4. לאחר מכן הפכו את המראה הממונעת M (איור 2) כדי לעבור למיקרוסקופ פלואורסצנטי, וחפשו חוט להט אקטין שצף בתמיסה על-ידי העברת הדגימה דרך מתרגמים ארוכי טווח13. העדיפו חוטים ארוכים (>5 מיקרומטר) מכיוון שהמיוזין התהליכי יעקור אותו ויעביר אותו כמה מיקרונים לפני הניתוק.
    5. הזיזו את הדגימה כדי לאפשר לאחד החרוזים הלכודים להתקרב לקצה אחד של חוט הלהט עד שהם נצמדים זה לזה. לאחר מכן, התאימו את מרחק החרוזים לאורך חוט הלהט המשוער וצרו זרימה בכיוון החרוז השני הלא קשור על ידי הזזת הבמה לכיוונו. חוט הלהט יימתח על ידי הזרימה ובסופו של דבר הוא ייקשר אליו13. קומפלקס החרוזים-אקטין החרוזים נקרא "משקולת".
  2. ליצור קשר אקטין מיוזין.
    1. הפרידו בעדינות את שתי המלכודות המרוחקות זו מזו כדי למתוח מראש את חוט הלהט עד כ-3 pN ובדקו את קשיחות המשקולת על ידי יצירת מלכודת אחת מתנודדת בגל משולש על ידי שינוי התדר של אחד משני AODs ואימות העברת התנועה לחרוז הנגרר כתוצאה מכך באמצעות אות המיקום שלו.
    2. הזיזו את הבמה כדי להניח את המשקולת בקרבת חרוז סיליקה ואפשרו את המגע בין חוט הלהט לבין החלבון המחובר על פני החרוז על ידי התאמת גובה מרכזי החרוזים הכלואים מעט מתחת לקוטר חרוז הסיליקה. לאחר מכן מקמו את מרכז חרוז הסיליקה בין החרוזים הלכודים.
  3. מהדק כוח וייצוב ננומטר משוב:
    1. הפעל את מהדק הכוח המהיר במיוחד עם כוח 2-3 pN ותנודה של 200 ננומטר וסרוק את חרוז הכן בצעדים בדידים של כ 20-30 ננומטר בכיוון המאונך לחוט האקטין . המתן עד שיתרחשו אינטראקציות בכל מיקום (מספר שניות), ולאחר מכן צעד קדימה אם לא נצפתה אינטראקציה. ככל שהאינטראקציה חלבון-נימה נוצרת, חפש את המיקום שבו אינטראקציות שכיחות יותר.
    2. ודא שכאשר המיוזין התהליכי נע לעבר קצה אחד של חוט האקטין (בדרך כלל הקצה +), החרוז הלכוד המחובר לקצה + נע לכיוון חרוז הסיליקה. הזיזו את השלב לכיוון קצה חוט הלהט כך שחרוז הסיליקה יהיה קרוב ככל האפשר לחרוז הלכוד המחובר לקצה חוט הלהט כאשר מיוזין אינו קשור והתחילו את משוב הייצוב הננומטרי. בכך, ההסתברות שהחרוז הלכוד המחובר לקצה + של חוט הלהט יתרסק לתוך חרוז הסיליקה ממוזערת.
  4. רשום נתונים.

4. ניתוח נתונים4

הערה: שיטת הניתוח המתוארת מאפשרת זיהוי ומדידה של ריצות תהליכיות ואירועי דריכה מהירים בהתבסס על שינויים במהירות המשקולות, כפי שנגרמו על ידי דריכת מיוזין. ניתוח ריצות תהליכיות מתבצע על בסיס שיטת ניתוח נתונים עבור מנועים לא תהליכיים המתוארים בהפניות 3,4,13.

  1. הגדר סף לשינויי מהירות כדי לאפשר זיהוי אירוע צעד. מכיוון שבמקרה זה צפויים צעדים קדימה ואחורה, חציית הסף מתקבלת בשני הכיוונים.
  2. הקצה כל שלב לריצה המתאימה: אם מרווח הזמן בין שני שלבים עוקבים קצר מ- 3 אלפיות השנייה ומשרעת השלבים היא < 90 ננומטר, השלבים מוקצים לאותה ריצה, אחרת השלבים מוקצים לריצות שונות4.
  3. אורך ריצה נכון לכוחות עזר4.
    1. תקן אורכי ריצה תחת כוחות מסייעים על-ידי חישוב ערך אורך הריצה האמיתי RL מתוך ערך אורך הריצה הממוצע הנמדד <RLm> מהמשוואה הבאה, כאשר D הוא טווח התנודה:
      Equation 1
      הערה: פרטים על הנגזרת של משוואה זו ניתן למצוא בהפניה4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנתונים המייצגים מורכבים מרשומות מיקום לאורך זמן, כפי שמוצג באיור 4. ברשומת המיקום נראים שני סוגים של עקירה. ראשית, כאשר מנוע המיוזין אינו מתקשר עם חוט האקטין החרוזים הלכודים נעים במהירות קבועה כנגד כוח הגרר הצמיגי של התמיסה ומראים תזוזה ליניארית המתנדנדת בטווח התנודות שנקבע על ידי המפעיל בגל משולש3 (לא נראה באיור 4 בגלל קנה המידה הרקתי הארוך). שנית, ברגע שמנוע המיוזין מתקשר עם חוט הלהט, הכוח שנישא על ידי חוט הלהט הנע מועבר במהירות רבה לחלבון, מהירות המערכת יורדת לאפס (קווים אדומים באיור 4) ואירועי דריכה מתרחשים תחת כוח קבוע עד סוף הריצה. כפי שניתן לראות באיור 5, הכוח עובר מהכיוון החיובי לכיוון השלילי (ולהפך) על-ידי מערכת המשוב, אשר מחליפה את כיוון הכוח כאשר החרוז מגיע לקצה טווח התנודות שנקבע על-ידי המשתמש. במקרים מסוימים, זה יכול לקרות כי, כאשר מיוזין נקשר ומחליף את חוט הלהט לכיוון החיובי, הוא דוחף את החרוז לכיוון הקצה (העליון) של טווח התנודה. אם זה קורה תחת כוח מסייע (כלומר, מכוון לתזוזה חיובית, דחיפה, באיור 5), הריצה של המיוזין תופרע על ידי היפוך כיוון הכוח בקצה התנודה (חצים באיור 5), ובכך תגביל את אורך הריצה למשרעת תנודת המשקולות D. זה דורש תיקון אורך הריצה במקרה של כוח עזר (4.3.1).

Figure 1
איור 1: סכמה של UFFCS המיושמת על מנוע מיוזין-5B תהליכי. (a) מולקולת מיוזין-5B יחידה מחוברת למעמד חרוזי זכוכית דרך קישור סטרפטווידין-ביוטין. חוט להט אקטין יחיד נלכד על ידי תלייתו בין חרוזים מצופים α אקטינין (מה שנקרא גיאומטריית "שלושה חרוזים"). חצים שחורים מייצגים את הכוח המהודק מימין (F1) ומשמאל (F2), חץ אדום מייצג את הכוח נטו (F) על המשקולת. F משתנה לסירוגין קדימה ואחורה כדי לשמור על המשקולת בטווח תנודות מוגבל כאשר מיוזין אינו קשור לאקטין. (ב) עקבות לדוגמה המראות תזוזה וכוח במהלך השלבים המתאימים של תנודת משקולות, חיבור מיוזין-5B וריצות תהליכיות תחת עומסי עזר (דחיפה) והתנגדות (משיכה). נתון זה שונהמ-4. נתונים גולמיים המתקבלים בקצב דגימה של 200 קילוהרץ משורטטים. Std. Dev. של כוח הוא בערך 0.27 pN. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמה אופטית של מערך הניסוי. המיקרוסקופ האופטי מורכב מ: מנורת הלוגן (H), מעבה (C), דגימה (S), מתרגמי פייזו (x-y ו-z), אובייקטיבי (O), מצלמה בהגדלה נמוכה (CCD 200X) ומצלמה בהגדלה גבוהה (CCD 2000X) המשמשת למשוב ייצוב ננומטר. פינצטה אופטית כפולה מוחדרת ומופקת מהציר האופטי של המיקרוסקופ באמצעות מראות דיכרואיות (D2 ו-D3) וכוללת: לייזר Nd:YAG (1064 ננומטר), איזולטור אופטי (OI), לוחות גל λ/2, קוביות מפצל קרן מקטבת (PBS), מסיט אקוסטי-אופטי (AOD), מסנני הפרעה 1064 ננומטר (F1 ו-F2), פוטודיודות גלאי רביע (QDP). אותות מ-QDPs הורחבו באמצעות FPGA, שנשלחו לשני סינתיסייזרים דיגיטליים ישירים (DDS) שנבנו בהתאמה אישית, המניעים את ה-AODs (משוב כוח). עירור פלואורסצנטי סופק על ידי לייזר Nd:YAG משוכפל (532 ננומטר) והתמונה הוקרנה על מצלמה מוכפלת אלקטרונים (EMCCD). M היא מראה ניידת, F3 מסנן פליטה. נתון זה שונה מ-3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הרכבת תא זרימה . (א) הכנת התא. כיסוי זכוכית, מרוח בחרוזי סיליקה, מחובר למגלשת מיקרוסקופ דרך פסי סרט דביקים כפולים ליצירת תא זרימה בנפח של כ-20 מיקרוליטר. ב) מבט מלמעלה על תא הזרימה. תמיסות מוטסות מצד אחד של התא עם פיפטה ונשאבות מהצד השני דרך נייר סינון כדי ליצור זרימה לאורך כיוון החץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: רישום עמדות מייצגות. הקלטת מיקום המציגה ריצות מעבדיות של מיוזין-5B ואת אלגוריתם זיהוי השלבים והריצות. ההתחלה והסוף שזוהו של כל ריצה מסומנים על ידי קווים אנכיים ירוקים וציאן, בהתאמה. קווים אופקיים אדומים מציינים את השלבים שזוהו. נתון זה שונהמ-4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: היפוך כוח במהלך ריצות מיוזין. כאשר מיוזין נקשר ומזיז את חוט הלהט בכיוון החיובי תחת כוח מסייע (דחיפה), זה יכול לקרות שהוא מגיע לקצה טווח התנודה שבו הכוח מתהפך (מסומן על ידי החיצים), כך שהמיוזין לרוץ תחת כוח מסייע נקטע. לעומת זאת, תחת כוח התנגדות (משיכה), דריכה תהליכית מיוזין מונעת מהמשקולת להגיע לנקודת היפוך הכוח. לכן, במקרה האחרון, אורכי הריצה אינם מוגבלים על ידי טווח התנודה עבור כוחות התנגדות. נתון זה שונהמ-4. נתונים גולמיים המתקבלים בקצב דגימה של 200 קילוהרץ משורטטים. Std. Dev. של כוח הוא בערך 0.27 pN. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שטכניקות של מולקולות בודדות, כגון מבחן שלושת החרוזים, הן מאתגרות מבחינה טכנית ובעלות תפוקה נמוכה, UFFCS משפר את זיהוי האינטראקציות המולקולריות הודות ליחס האות לרעש הגבוה של הנתונים. UFFCS מאפשר לחקור את התלות בעומס של חלבונים מוטוריים, עם היתרונות העיקריים של הפעלת הכוח במהירות רבה עם קשירת המנוע לחוט הלהט כדי לחקור אירועים מוקדמים ומהירים מאוד בייצור כוח ומצבי קישור חלשים תחת כוח מבוקר; שמירה על כוח קבוע לאורך כל הריצה ובדיקת התלות המוטורית עם שליטה מלאה בכיווניות הכוח. לגבי הנקודה האחרונה, גיאומטריית שלושת החרוזים כפי שאנו משתמשים כאן יעילה מאוד ביישום ומדידת כוחות לאורך כיוון חוט הלהט, תוך מזעור תרומות מרכיבים רוחביים או אנכיים. עם זאת, כאשר החלבון המוטורי צפוי לייצר באופן פעיל כוחות רוחביים או אנכיים, או אפילו מומנטים, תצורות אחרות כגון גיאומטריית החרוז הבודד מתאימות יותר 2,7,18. יתר על כן, הודות לרזולוציה המרחבית והזמנית שלו, UFFCS מייצג כלי ייחודי להבנת יסודות האינטראקציות המולקולריות שאחרת היו מופרעות בטכניקות קונבנציונליות של מולקולות בודדות. למעשה, UFFCS איפשר לחקור כיצד כוחות מסייעים והתנגדות מווסתים את התגובה המכנית של מיוזין-5B, ובכך לתת תובנה חדשה על ההתנהגות הקולקטיבית שלו בתוך רשת האקטין בתא4.

עם זאת, הצלחתם של ניסויים אלה מסתמכת על מילוי כמה דרישות חשובות שיש להתייחס אליהן בזהירות רבה על ידי ביצוע כל ההוראות הנמצאות בפרוטוקול זה: היישור והבידוד המדויקים של המערך האופטי הם בסיסיים כדי להגיע לרזולוציה מרחבית אופטימלית; כיול זהיר של המערכת האופטית נחוץ כדי לקבוע את הערכים של הכוחות המופעלים בדיוק גבוה; הגדרת מערכת משוב מהירה נחוצה כדי להגיע לרזולוציה הטמפורלית הגבוהה; לבסוף יש להכין את כל הרכיבים המורכבים בתא הדגימה בסביבה מבוקרת, תוך שמירה עליהם סטריליים ככל האפשר, שכן כל טומאה בתא הדגימה עלולה לסכן את הניסוי, ויש לכבד בקפדנות את כל האינדיקציות לגבי אחסונם והטיפול האופטימלי בהם להצלחת פרוטוקול הניסוי. חשוב לציין, ניתוח נתונים צריך להיות מותאם בקפידה לסוגים שונים של אינטראקציות חוט להט מוטורי כדי לפרש כראוי את התוצאות ולהימנע מחפצים.

בפרוטוקול זה כלולים כל השלבים לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, החל מהתקנת מנגנון ניסיוני ועד להכנת דגימה, מדידה וניתוח נתונים, שניתן להתאים בנוחות לחקר מגוון מיוזין לא קונבנציונלי וסוגים אחרים של מנועים תהליכיים כגון קינזין ודינינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס '871124 Laserlab-Europe, על ידי משרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2), ועל ידי Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk נתמך על ידי תוכנית מדעי החזית האנושית מלגת LT008/2020-C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 173 ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה פינצטה אופטית בדיקת שלושה חרוזים מנועים מולקולריים מיוזין

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter