Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Abstract

Ultrasnelle force-clamp spectroscopie (UFFCS) is een techniek met één molecuul op basis van een laserpincet die het onderzoek mogelijk maakt naar de chemomechanica van zowel conventionele als onconventionele myosinen onder belasting met een ongekende tijdresolutie. Met name de mogelijkheid om myosinemotoren onder constante kracht te onderzoeken direct na de vorming van de actine-myosinebinding, samen met de hoge snelheid van de force feedback (200 kHz), heeft aangetoond dat UFFCS een waardevol hulpmiddel is om de belastingsafhankelijkheid van snelle dynamiek zoals de myosine-werkslag te bestuderen. Bovendien maakt UFFCS de studie mogelijk van hoe processieve en niet-processieve myosine-actine interacties worden beïnvloed door de intensiteit en richting van de toegepaste kracht.

Door dit protocol te volgen, zal het mogelijk zijn om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren en op een verscheidenheid aan onconventionele myosines. Door enkele aanpassingen zou het protocol ook gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen van processieve motoren zoals kinesines en dyneinen. Het protocol omvat alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, kalibratieprocedures, gegevensverzameling en analyse.

Introduction

In de afgelopen decennia zijn optische pincetten een waardevol hulpmiddel geweest om de mechanochemie van eiwitinteracties op het niveau van één molecuul op te helderen, vanwege de opvallende mogelijkheid van gelijktijdige manipulatie en meting van conformatieveranderingen en enzymatische kinetiek 1,2. In het bijzonder het vermogen om krachten toe te passen en te meten in het bereik van die uitgeoefend door moleculaire motoren in de cel, samen met de capaciteit om conformatieveranderingen van subnanometer te meten, maakte optische pincetten een uniek hulpmiddel met één molecuul voor het ontrafelen van de chemomechanische eigenschappen van motoreiwitten en hun mechanische regulatie.

Ultrasnelle krachtklemspectroscopie (UFFCS) is een krachtspectroscopietechniek met één molecuul op basis van een optisch pincet, ontwikkeld om de snelle kinetiek van moleculaire motoren onder belasting te bestuderen in een geometrie met drie kralen (figuur 1a)3,4. UFFCS vermindert de tijdsvertraging voor krachttoediening op het motoreiwit tot de fysieke limiet van een optisch pincet, d.w.z. de mechanische ontspanningstijd van het systeem, waardoor de kracht snel na het begin van een myosinerun kan worden uitgeoefend (enkele tientallen microseconden)3. Dit vermogen is gebruikt om de vroege mechanische gebeurtenissen in snelle skelet 3 en cardiale5 spiermyosine te onderzoeken om de belastingsafhankelijkheid van de powerstroke, de zwakke en sterk bindende toestanden, evenals de volgorde van biochemische (Pi) en mechanische (powerstroke) gebeurtenissen te onthullen.

De drie-kralengeometrie wordt meestal gebruikt om niet-processieve motoren te bestuderen, een enkele kraalgeometrie met een krachtklem is vaak gebruikt om processieve niet-conventionele myosines zoals myosine Va6 te onderzoeken. Er zijn echter verschillende redenen om de voorkeur te geven aan een UFFCS-test met drie kralen, ook voor processieve myosines. Ten eerste maakt de snelle toepassing van belasting direct na actine-myosinebinding de meting mogelijk van de vroege gebeurtenissen in krachtontwikkeling zoals in niet-processieve motoren. Bovendien maakt het in het geval van processieve motoren ook een nauwkeurige meting van de looplengtes en looptijden van de motor onder constante kracht gedurende hun hele progressie mogelijk (figuur 1b). Bovendien kan het systeem door de hoge snelheid van de force feedback de kracht constant houden tijdens snelle positiewisselingen, zoals de myosine werkslag, waardoor een constante belasting tijdens het stappen van de motor wordt gegarandeerd. De hoge temporele resolutie van het systeem maakt de detectie van sub-ms-interacties mogelijk, waardoor de mogelijkheid ontstaat om zwakke binding van myosine aan actine te onderzoeken. Ten slotte garandeert de testgeometrie dat de kracht wordt uitgeoefend langs de actinefilament, met verwaarloosbare dwarse en verticale componenten van de kracht. Dit punt is van bijzonder belang omdat is aangetoond dat de verticale krachtcomponent de belastingsafhankelijkheid van de motorkinetiek aanzienlijk beïnvloedt 7,8. Door deze techniek te gebruiken, konden we een reeks ondersteunende en resistieve belastingen toepassen op processieve myosine-5B en direct de belastingsafhankelijkheid van zijn processiviteit meten voor een breed scala aan krachten4.

Zoals te zien is in figuur 1a, wordt in dit systeem een enkel actinefilament opgehangen tussen twee polystyreenparels die vastzitten in de focus van een dubbel optisch pincet (de "dumbbell"). Een onevenwichtige nettokracht F = F1-F 2 wordt opgelegd aan de gloeidraad, door middel van een snel feedbacksysteem, waardoor het filament met constante snelheid in één richting beweegt totdat het een door de gebruiker gedefinieerd inversiepunt bereikt waar de nettokracht in de tegenovergestelde richting wordt omgekeerd. Wanneer het motoreiwit geen interactie heeft met het filament, is de halter vrij om heen en weer te bewegen in een driehoekige golfvorm (figuur 1b, onderste paneel) over de voetstukkraal waarop een enkel motoreiwit is bevestigd. Zodra de interactie is vastgesteld, wordt de kracht die door de halter wordt gedragen zeer snel overgebracht naar het motoreiwit en begint de motor het filament te verdringen door onder de krachtintensiteit en richting te stappen die door het feedbacksysteem werd toegepast op het moment van de interactie, totdat myosine loskomt van actine. Omdat de verplaatsing die wordt geproduceerd door het stappen van de motor afhankelijk is van de polariteit van de ingesloten actinefilament, kan de belasting volgens de richting van de uitgeoefende kracht ofwel ondersteunend zijn, d.w.z. duwen in dezelfde richting van de motorverplaatsing (duw in figuur 1b bovenpaneel), of resistief, d.w.z. trekken in de tegenovergestelde richting ten opzichte van de motorverplaatsing (trek in figuur 1b bovenste paneel) waardoor het mogelijk is om de chemomechanische regulatie van de motorische processiviteit te bestuderen door zowel de intensiteit als de directionaliteit van de uitgeoefende belasting.

In de volgende secties worden alle stappen voor het meten van actine-myosine-5B-interacties onder verschillende belastingen met een ultrasnelle krachtklemspectroscopie-opstelling volledig beschreven, inclusief 1) het instellen van de optische opstelling, optische vallenuitlijning en kalibratieprocedures, 2) de preparaten van alle componenten en hun assemblage in de monsterkamer, 3) de meetprocedure, 4) representatieve gegevens en gegevensanalyse om belangrijke fysische parameters te extraheren, zoals de looplengte, de stapgrootte en de snelheid van het motoreiwit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optische installatie

OPMERKING: De experimentele opstelling bestaat uit een dubbel optisch pincet met nanometer richtstabiliteit en < 1% laserintensiteitsfluctuaties. Onder deze omstandigheden wordt de stabiliteit van de halter op nanometerniveau gegarandeerd onder typische valstijfheid (0,1 pN / nm) en spanning (1 pN - enkele tientallen pN). Figuur 2 toont een gedetailleerd schema van de optische opstelling.

  1. Ontwerp en constructie van een optisch pincet 9,10,11.
    1. Plaats alle componenten van de opstelling op een optische tafel volgens het schema in figuur 2. Merk op dat de optische tafel actieve isolatoren bevat om mechanische trillingen te minimaliseren. Bovendien is de microscoopstructuur gemonteerd op elastomeerisolatoren om akoestische ruis en mechanische resonanties te absorberen.
    2. Plaats een optische isolator dicht bij de laserbron ("OI" in figuur 2), om willekeurige amplitudeschommelingen als gevolg van optische feedback te voorkomen.
    3. Sluit het hele pad af in een gesloten doos om luchtstroom en turbulenties te verminderen die de stabiliteit van de laseraanwijsheid kunnen beïnvloeden.
    4. Maak het dubbele optische pincet door de hoofdlaserbron (Nd:YAG-laser, 1.064 nm golflengte in figuur 2) te verdelen in twee takken met orthogonale polarisaties door het gebruik van polariserende bundelsplitsers (PBS). Time-shared traps moeten worden vermeden omdat ze oscillatie van de dumbbell veroorzaken onder spanning12.
    5. Gebruik twee acousto-optische deflectoren (AODs in figuur 2) aangedreven door Direct Digital Synthesizers (DDSs) om fijne en snelle bewegingen van de twee vallen en nauwkeurige regeling van de actinespanning mogelijk te maken door de DDS'en rechtstreeks door de digitale uitgangen van het veldprogrammeerbare gate array FPGA-bord te leiden (zie figuur 2).
      OPMERKING: De totale feedbackresponstijd moet < 10 μs zijn om snel te corrigeren en een constante kracht op beide vallen te behouden tijdens metingen, inclusief de ongebonden toestand, myosine-interactie en beweging. Hiertoe moeten positiedetectoren een > = 100 kHz bandbreedte hebben en moeten gegevens worden verkregen met > = 200 kHz samplefrequentie. Voor elk verkregen datapunt (5 μs acquisitietijd) worden proportionele correcties voor de twee traps berekend door de FPGA en verzonden naar de twee DDS die de AOD's aansturen. De AOD-responstijd moet lager zijn dan 5 μs om aan de vereiste feedbackresponstijd te voldoen.
    6. Voor nm-detectie van de positie van de gevangen kralen plaatst u twee Quadrant Photodiode Detectors (QPD's in figuur 2) in het achterste brandpuntsvlak van de condensor. Nauwkeurige uitlijning van de QPD's in een vlak dat is geconjugeerd aan het achterste brandpuntsvlak van de condensor, evenals de AOD's in een vlak dat is geconjugeerd aan het achterste brandpuntsvlak van het objectief, zal ervoor zorgen dat QPDs-signalen onafhankelijk zijn van de AODs-frequentie.
    7. Monteer de AOD op een lineaire vertaler met micrometeraandrijving en verplaats deze totdat de kristalrand dicht bij de laserstraal komt. Vervang vervolgens het objectief door een iris, gecentreerd op de behuizing van het schroefdraadobjectief, en regel het diafragma om te passen bij de grootte van het diafragma van het objectief.
    8. Beweeg de vertaler naar de laserstraal totdat het deel van de straal dat door het piëzokristal wordt geblokkeerd zichtbaar is na de iris, draai de vertaler iets naar achteren om de straal de irisopening weer volledig te laten vullen.
    9. Herhaal stap 1.1.7-1.1.8 voor de tweede AOD. Controleer de reactietijd van de feedbacklus door de vertraging van de QPD's te meten terwijl u snel een straal beweegt op een kraal die op het oppervlak van de coverslip is geplakt13.
      OPMERKING: De bovenstaande drie stappen (1.1.7-1-1-9) leiden tot de zorgvuldige uitlijning van AOD-kristallen. Deze stappen zijn belangrijk om de tijdrespons van zowel de bundelafbuiging als de feedback13 te optimaliseren.
  2. Meet door middel van een fotodiode de intensiteitsfluctuaties van de vanglaser bij de ingang van de microscoop die lager moet zijn dan 1%. Houd er rekening mee dat de fotodiodebandbreedte groter moet zijn dan de beeldsnelheid.
  3. Controleer de aanwijsstabiliteit van beide vallen.
    1. Bereid silicaparels in fosfaatbuffer (PB) door 20 μL silicaparels (1,2 μm, 10% vaste stoffen) te verdunnen in 1 ml aceton, soniceren gedurende 30 s, vortex kort en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 19.000 x g.
    2. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml aceton en herhaal de was. Resuspend in 1 ml van 50 mM PB, was 2 keer. Ten slotte resuspensie in 100 μL van 50 mM PB.
    3. Voer optische pincetkalibratie uit met silicaparels door een coverslip op een microscoopglaasje te plakken met een dubbelzijdige tape (ongeveer 60 μm dik) om een stroomkamer te bouwen. Vul de kamer met een 1 mg /ml BSA (Bovine Serum Albumin protein) en wacht 3 minuten.
    4. Laat een 1:1000 verdunning van silicaparels in PB in de kamer stromen. Gebruik een spuit gevuld met siliciumvet om de kamer zorgvuldig af te sluiten. Vang een enkele kraal in elke val en pas de vermogensspectrummethode14 toe om ze te kalibreren.
    5. Bereid silicaparels in pentylacetaat (bij kamertemperatuur) door 20 μL silicakralen (1,2 μm diameter, 10% vast) op te lossen in 1-1,5 ml aceton, vortex en sonicaat gedurende 30 s.
    6. Centrifugeer bij 18.500 x g gedurende 2 min. Gooi het supernatant weg en resuspenseer in 1 ml aceton en herhaal de was. Resuspensie in 1 ml pentylacetaat en herhaal wassen (centrifuge en resuspensie) in pentylacetaat 2 keer. Resuspendeer de pellet in 100 μL nitrocellulose 1% en 900 μL pentylacetaat. Bewaren bij 4 °C gedurende 2 maanden.
    7. Neem een glazen afdekplaat van 24 x 24 mm en maak deze zorgvuldig schoon met papier gedrenkt in pure ethanol. Spoel het vervolgens, terwijl u het vasthoudt met een schoon pincet, een tweede keer af door het rechtstreeks te wassen met pure ethanol. Laat het drogen onder een zachte stroom stikstof. Herhaal indien nodig deze bewerking om alle zichtbare resten op het glasoppervlak te verwijderen.
    8. Neem de silica kralen voorraad, vortex het en sonicate het kort voor ~ 30 s.
    9. Na het reinigen van een tweede coverslip (24 x 60 mm), gebruik deze om 2 μL silicaparelsoplossing op één oppervlak van de coverslip te smeren en wacht tot deze droog is.
    10. Reinig zorgvuldig een microscoopglaasje (26 x 76 mm) dat zal worden gebruikt om de stroomkamer te maken.
    11. Knip twee lijnen dubbele plakband (~ 3 mm groot, 60-100 μm dik) en bevestig ze aan één kant van de microscoopglaas, zoals weergegeven in figuur 3.
    12. Sluit met een schoon pincet de kamer (ongeveer 20 μL eindvolume) door de gecoate coverslip (1.3.9) in contact te brengen met de kleverige tapelijnen, met de nitrocellulose + kralenlaag naar de binnenkant van de kamer gericht, zoals weergegeven in figuur 3a. Vul de stroomkamer met 50 mM fosfaatbuffer en sluit deze af met siliciumvet.
    13. Stel een enkele silicakraal in brightfield-microscopie voor met een vergroting van > 200x met behulp van een CCD-camera (charge-coupled device) of cmos-camera (complementary metal-oxide-semiconductor) met >1,4 megapixels. Gebruik een feedbacksoftware om het piëzo-stadium te verplaatsen (met nanometernauwkeurigheid of beter) om thermische driften te compenseren10.
    14. Overlap het midden van de linkerval met het midden van de kraal (x-y-signaalniveaus van de QPD moeten overeenkomen met die van de kalibratie). Meet vervolgens de positieruis en standaarddeviatie van de positiesignalen voor deze val.
    15. Herhaal de vorige stap voor de juiste trap15.
  4. Kalibratie van de valpositie: MHz tot nm
    1. Bereid een stroomkamer met silicaparels bevestigd op het oppervlak van de deklip (1.3.5-1.3.12) en zwevende polystyreenparels (gebruik α-actine geconjugeerde kralen bereid zoals in het volgende punt 2.1).
    2. Richt een silicakraal op het oppervlak van de coverslip enigszins gedecentreerd (~ 5 μm) vanuit het midden van het gezichtsveld (FOV) en verkrijg een beeld van de FOV. Verplaats de kraal met 10 μm naar het FOV-centrum met behulp van het piëzo-stadium en verkrijg een tweede afbeelding. Bereken het midden van de kraal in de twee afbeeldingen met behulp van een centroïde algoritme of iets dergelijks en bereken de afstand in pixel tussen de twee kralen om de nm / pixel-kalibratie van de brightfield-camera te verkrijgen.
    3. Vang een enkel zwevend deeltje in één val. Verplaats vervolgens de val met behulp van AOD in kleine stappen (0,2 MHz) en verkrijg een beeld van het deeltje en de bijbehorende frequentie van de AOD voor elke stap. Bereken de positie van het deeltje in de FOV met behulp van het centroïde algoritme zoals voorheen en converteer het in nm met behulp van de nm / pixelkalibratie verkregen in de vorige stap.
    4. Voer een lineaire aanpassing uit aan de frequentiepositiegegevens en bereken de kalibratieconstante in nm/MHz.
    5. Herhaal kalibratie voor de tweede val
  5. Trapvermogen en stijfheidskalibratie (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
    1. Bereid een stromingskamer met silicaparels bevestigd op het dekvlak (1.3.5-1.3.12) en zwevende polystyreenparels (gebruik α-actinine geconjugeerde kralen bereid zoals in het volgende punt 2.1) en vang een enkel deeltje in één val. Verplaats vervolgens beide vallen door AOD's in kleine stapjes (0,2 MHz) en registreer een Brownse beweging van het deeltje in beide vallen met QPD en de bijbehorende frequentie van de AODs.
    2. Bereken een gemiddeld vermogen op de detectoren op elke positie en verkrijg valstijfheid en QPD-kalibratieconstante bèta door een Lorentziaanse functie aan te passen aan een vermogensspectrum van de geregistreerde Brownse beweging13.

2. Monstervoorbereiding

  1. Bereid α-actinine geconjugeerde fluorescerende kralen voor
    1. Voer conjugatie16 uit: Neem amino-gefunctionaliseerde polystyreenparels (1 μm diameter, 2,5% vaste stoffen), was ze tweemaal in 500 μL gedestilleerd water en geresuspendeerd in 500 μL PBS (pH 7,0). Voeg 1 mM HaloTag succinimidylester O2 ligand toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Driemaal wassen met 500 μL PBS en resuspendeerd met 100-200 μM HaloTag α-actine. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en was driemaal in 500 μL PBS (gebruik kralen binnen 1,5 week of flash-frozen in vloeibare stikstof en bewaar bij −80 °C).
    2. Etikettering: Incubeer 200 μL kralenoplossing met Rhodamine-BSA bij 5 μg/ml eindconcentratie gedurende 10 min. Driemaal wassen met 50 mM PB en resuspenseren in 500 μL PB 50 mM. Dit kan maandenlang worden bewaard in aliquots bij - 80 °C).
  2. Express en zuiver biotinylated Myosin-5B zoals eerder beschreven 4,17.
  3. Polymeriseren en etiketteren van F-actine13:
    1. F-actinepolymerisatie: Meng 69 μL ultrapuur water, 10 μL actinepolymerisatiebuffer 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidinecarbonaat pH 7,5), 20 μL G-actine 10 mg/ml en 1 μL DL-Dithiothreitol (DTT) 1 M. Laat het langer dan 1 uur op ijs staan.
    2. F-actine-etikettering met rhodamine (Ex/Em: 546/575 nm): Neem 25 μL gepolymeriseerd F-actine en voeg 19,5 μL ultrapuur water, 2,5 μL actinepolymerisatiebuffer 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidinecarbonaat pH 7,5), 1 μL van 1 M DTT en 2 μL van 250 μM rhodamine falloidine toe. Laat het een nacht op ijs staan. Voor vangexperimenten kan rhodamine F-actine op ijs worden bewaard en binnen een week worden gebruikt.
  4. Monster assemblage
    1. Neem de stroomkamer (1.3.5-1.3.12) en incubeer 1 mg/ml gebiotinyleerd BSA gedurende 5 min. Na het wassen met AB buffer (25 mM MOPS ,25 mM KCl, 4mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH 7,2) incubeer 1 mg/ml streptavidin gedurende 5 min en was opnieuw met AB buffer. Incubeer gebiotinyleerd myosine-5B zwaar meromyosine bij 3 nM concentratie in M5B buffer (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3) met 2 μM Calmodulin (CaM) gedurende 5 min. Wassen met drie volumes van 1 mg/ml gebiotinyleerd BSA aangevuld met 2 μM CaM in AB en incuberen gedurende 3 minuten.
    2. Bereid tijdens het incuberen de reactiemix (RM): 0,005% α-actine gefunctionaliseerde kralen (sectie 2.1), 1 nM rhodamine F-Actine (sectie 2.3) in Imaging Buffer (IB: AB-buffer met 1,2 μM glucose-oxidase, 0,2 μM catalase, 17 mM glucose, 20 mM DTT, 2 μM CaM en ATP in de concentratie die nodig is voor het experiment).
    3. Was met RM en sluit de kamer af met siliconenvet. Het monster is nu klaar om onder de microscoop te worden bekeken.

3. Meting

  1. Monteer de dumbbell.
    1. Zoek naar de zwevende α-actininekralen door het monster te verplaatsen met behulp van langeafstandsvertalers, schakel één val in en val één kraal.
    2. Zodra de eerste val bezet is, verplaatst u de vertaler om de gevangen kraal dicht bij het oppervlak van de coverslip te plaatsen om te voorkomen dat meerdere kralen worden gevangen en een andere kraal in de tweede val te vangen.
    3. Pas de twee vallen aan op gelijke stijfheid door het vermogen van de akoestische golven van de AODs aan te passen. Stijfheid wordt meestal ingesteld tussen 0,03 en 0,14 pN/nm. Hoe kleiner de stijfheid, hoe kleiner het krachtgeluid, met name bij lage krachten.
    4. Draai vervolgens de gemotoriseerde spiegel M (figuur 2) om over te schakelen naar fluorescentiemicroscopie en zoek naar een actinefilament dat in oplossing drijft door het monster te verplaatsen via langeafstandsvertalers13. Geef de voorkeur aan lange filamenten (>5 μm) omdat de processieve myosine het zal verdringen en een paar micron zal verplaatsen voordat het loskomt.
    5. Verplaats het monster om een van de ingesloten kralen het ene uiteinde van de gloeidraad te laten naderen totdat ze zich aan elkaar hechten. Pas vervolgens de afstand van de kralen aan de geschatte filamentlengte aan en creëer een stroom in de richting van de ongebonden tweede kraal door het podium in zijn richting te bewegen. Het filament wordt uitgerekt door de stroom en zal er uiteindelijk aan binden13. Het kraal-actine-kraalcomplex wordt "dumbbell" genoemd.
  2. Leg actine-myosine contact op.
    1. Scheid de twee vallen voorzichtig ver uit elkaar om de gloeidraad tot ongeveer 3 pN voor te spannen en de stijfheid van de halter te onderzoeken door één val te laten oscilleren in een driehoekige golf door de frequentie van een van de twee AOD's te veranderen en de daaruit voortvloeiende overdracht van de beweging naar de achtergebleven kraal via zijn positiesignaal te verifiëren.
    2. Verplaats het podium om de halter in de buurt van een voetstuk silicakraal te plaatsen en laat het contact tussen het filament en het eiwit dat op het kraaloppervlak is bevestigd toe door de hoogte van de gevangen kraalcentra iets onder de diameter van de silicakraal aan te passen. Plaats vervolgens het midden van de silicakraal tussen de gevangen kralen.
  3. Force clamp en nm stabilisatie feedback:
    1. Schakel de ultrasnelle krachtklem in met 2-3 pN kracht en 200 nm oscillatie en scan de voetstukkraal in discrete stappen van ongeveer 20-30 nm in de richting loodrecht op de actinefilament. Wacht tot er interacties plaatsvinden op elke positie (enkele seconden) en stap dan vooruit als er geen interactie wordt waargenomen. Naarmate de eiwit-filamentinteractie wordt vastgesteld, zoekt u naar de positie waar interacties frequenter zijn.
    2. Zorg ervoor dat wanneer de processieve myosine naar het ene uiteinde van het actinefilament beweegt (meestal het + -uiteinde), de gevangen kraal die aan het + -uiteinde is bevestigd, naar de silicakraal beweegt. Verplaats het stadium naar het -einde van het filament, zodat de silicakraal zo dicht mogelijk bij de gevangen kraal ligt die aan het uiteinde van het filament is bevestigd wanneer myosine niet gebonden is en start de nanometerstabilisatiefeedback. Daarbij wordt de kans geminimaliseerd dat de gevangen kraal die aan het +-uiteinde van het filament is bevestigd, in de silicakraal crasht.
  4. Gegevens vastleggen.

4. Gegevensanalyse4

OPMERKING: De analysemethode die wordt beschreven, maakt de detectie en meting van processieve runs en snelle stapgebeurtenissen mogelijk op basis van veranderingen in de dumbbell-snelheid, zoals veroorzaakt door myosinestappen. De analyse van processieve runs wordt uitgevoerd op basis van een data-analysemethode voor niet-processieve motoren zoals beschreven in referenties 3,4,13.

  1. Stel een drempel in voor snelheidswijzigingen om detectie van stapgebeurtenissen mogelijk te maken. Omdat in dit geval zowel voorwaartse als achterwaartse stappen worden verwacht, wordt het overschrijden van de drempel in beide richtingen geaccepteerd.
  2. Wijs elke stap toe aan de overeenkomstige run: als het tijdsinterval tussen twee opeenvolgende stappen korter is dan 3 ms en de amplitude van de stappen < 90 nm is, worden stappen toegewezen aan dezelfde run, anders worden stappen toegewezen aan verschillende runs4.
  3. Juiste looplengte voor hulpkrachten4.
    1. Corrigeer de looplengtes onder ondersteunende krachten door de reële run length-waarde RL te berekenen op basis van de gemeten gemiddelde run length-waarde <RLm> uit de volgende vergelijking, waarbij D het oscillatiebereik is:
      Equation 1
      OPMERKING: Details over de afleiding van deze vergelijking zijn te vinden in referentie4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve gegevens bestaan uit positierecords in de loop van de tijd, zoals weergegeven in figuur 4. In het positierecord zijn twee soorten verplaatsing zichtbaar. Ten eerste, wanneer de myosinemotor geen interactie heeft met het actinefilament, bewegen de gevangen kralen met constante snelheid tegen de viskeuze weerstandskracht van de oplossing met een lineaire verplaatsing die oscilleert binnen het oscillatiebereik dat door de operator is ingesteld in een driehoekige golf3 (niet zichtbaar in figuur 4 vanwege de lange temporele schaal). Ten tweede, zodra de myosinemotor interageert met het filament, wordt de kracht die door de bewegende gloeidraad wordt gedragen zeer snel overgebracht naar het eiwit, daalt de systeemsnelheid tot nul (rode lijnen in figuur 4) en treden stapgebeurtenissen op onder constante kracht tot het einde van de run. Zoals te zien is in figuur 5 wordt de kracht van de positieve naar de negatieve richting (en vice versa) geschakeld door het feedbacksysteem, dat de krachtrichting verandert wanneer de kraal de rand van het door de gebruiker ingestelde oscillatiebereik bereikt. In sommige gevallen kan het gebeuren dat, wanneer de myosine bindt en het filament naar de positieve richting verplaatst, het de kraal naar de (boven)rand van het oscillatiebereik duwt. Als dit gebeurt onder ondersteunende kracht (d.w.z. gericht op positieve verplaatsing, duw, in figuur 5), zal de loop van de myosine worden onderbroken door de krachtrichtingsinversie aan de oscillatierand (pijlen in figuur 5), waardoor de lengte van de run wordt beperkt tot de amplitude van de halteroscillacillatie D. Dit vereist een correctie van de looplengte in geval van hulpkracht (4.3.1).

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van UFFCS toegepast op een processieve myosine-5B motor. (a) Een enkel myosine-5B molecuul is bevestigd aan een glazen kraal voetstuk via een streptavidin-biotine link. Een enkel actinefilament wordt gevangen door het op te hangen tussen α-actinine gecoate kralen (de zogenaamde "drie-kraal" geometrie). Zwarte pijlen vertegenwoordigen de kracht die rechts (F1) en linker kraal (F2) zijn geklemd, rode pijl vertegenwoordigt de nettokracht (F) op de halter. F wordt heen en weer afgewisseld om de halter binnen een beperkt oscillatiebereik te houden wanneer myosine niet gebonden is aan actine. (b) Voorbeeldspoor dat verplaatsing en kracht toont tijdens de overeenkomstige fasen van dumbbell-oscillatie, myosine-5B-bevestiging en processieve runs onder ondersteunende (duw) en resistieve (trek) belastingen. Dit cijfer is gewijzigd van4. Ruwe gegevens verkregen met een samplefrequentie van 200 kHz worden uitgezet. Std. Dev. van kracht is ongeveer 0,27 pN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Optisch schema van de experimentele opstelling. De optische microscoop bestaat uit: halogeenlamp (H), condensor (C), sample (S), piëzovertalers (x-y en z), objectief (O), een low-magnification camera (CCD 200X) en een high-magnification camera (CCD 2000X) die gebruikt wordt voor de nm-stabilisatie feedback. Dubbele optische pincetten worden ingebracht en geëxtraheerd uit de optische as van de microscoop door dichroïsche spiegels (D2 en D3) en omvatten: Nd: YAG-laser (1064 nm), optische isolator (OI), λ / 2 golfplaten, polariserende bundelsplitserkubussen (PBS), acousto-optische deflectoren (AOD), 1064 nm interferitaire filters (F1 en F2), kwadrantdetectorfotodiodes (QDP). Signalen van QDP's werden uitgewerkt met een FPGA, verzonden naar twee op maat gemaakte direct digitale synthesizers (DDS) die de AOD's aansturen (force feedback). Fluorescentie-excitatie werd geleverd door een gedupliceerde Nd:YAG-laser (532 nm) en het beeld geprojecteerd op een elektronenvermenigvuldigingscamera (EMCCD). M is een beweegbare spiegel, F3 een emissiefilter. Dit cijfer is gewijzigd van 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Montage van de stroomkamer. (a) Kamervoorbereiding. Een glazen coverslip, besmeurd met silicaparels, wordt bevestigd op een microscoopglaasje door dubbele kleverige tapestrepen om een stroomcel van ongeveer 20 μL volume te vormen. b) Bovenaanzicht van de stroomcel. Oplossingen worden vanaf de ene kant van de kamer met een pipet gevlogen en van de andere kant door een filterpapier gezogen om een stroom langs de pijlrichting te creëren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve positieregistratie. Positieregistratie met myosine-5B processieve runs en het step and run detectiealgoritme. Gedetecteerd begin en einde van elke run worden aangegeven door respectievelijk groene en cyaan verticale lijnen. Rode horizontale lijnen geven de gedetecteerde stappen aan. Dit cijfer is gewijzigd van4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Forceer inversie tijdens myosine runs. Wanneer myosine het filament bindt en in de positieve richting beweegt onder ondersteunende kracht (duw), kan het gebeuren dat het de rand van het oscillatiebereik bereikt waar de kracht wordt omgekeerd (aangegeven door de pijlen), zodat de myosineloop onder ondersteunende kracht wordt onderbroken. Integendeel, onder resistieve kracht (pull) voorkomt myosine processief stappen dat de dumbbell het krachtinversiepunt bereikt. Daarom worden in het laatste geval de looplengtes niet beperkt door het oscillatiebereik voor resistieve krachten. Dit cijfer is gewijzigd van4. Ruwe gegevens verkregen met een samplefrequentie van 200 kHz worden uitgezet. Std. Dev. van kracht is ongeveer 0,27 pN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel technieken met één molecuul, zoals de drie-kralentest, technisch uitdagend en een lage doorvoersnelheid hebben, verbetert UFFCS de detectie van moleculaire interacties dankzij de hoge signaal-ruisverhouding van de gegevens. UFFCS maakt de studie van de belastingsafhankelijkheid van motoreiwitten mogelijk, met als belangrijkste voordelen dat de kracht zeer snel wordt uitgeoefend bij binding van de motor aan het filament om vroege en zeer snelle gebeurtenissen in krachtproductie en zwakke bindingstoestanden onder gecontroleerde kracht te onderzoeken; het constant houden van de kracht gedurende de hele run en het onderzoeken van de motorische afhankelijkheid met volledige controle over de richting van de kracht. Wat het laatste punt betreft, is de geometrie met drie kralen zoals we hier gebruiken zeer efficiënt in het toepassen en meten van krachten langs de filamentrichting, waardoor bijdragen van transversale of verticale componenten worden geminimaliseerd. Wanneer echter wordt verwacht dat het motoreiwit actief dwarse of verticale krachten of zelfs koppels produceert, zijn andere configuraties zoals de geometrie van de enkele kraal geschikter 2,7,18. Bovendien vertegenwoordigt UFFCS dankzij zijn ruimtelijke en temporele resolutie een uniek hulpmiddel voor het begrijpen van de basisprincipes van moleculaire interacties die anders zouden worden belemmerd met conventionele technieken met één molecuul. In feite maakte UFFCS het mogelijk om te onderzoeken hoe ondersteunende en resistieve krachten de mechanische respons van myosine-5B reguleren, waardoor nieuw inzicht werd verkregen in het collectieve gedrag binnen het actinegaas in de cel4.

Het succes van deze experimenten is echter afhankelijk van de vervulling van enkele belangrijke vereisten die zeer zorgvuldig moeten worden aangepakt door alle instructies in dit protocol te volgen: de precieze uitlijning en isolatie van de optische opstelling is van fundamenteel belang om een optimale ruimtelijke resolutie te bereiken; zorgvuldige kalibratie van het optische systeem is noodzakelijk om de waarden van de uitgeoefende krachten met hoge precisie te bepalen; de instelling van een snel feedbacksysteem is noodzakelijk om de hoge temporele resolutie te bereiken; ten slotte moeten alle componenten die in de monsterkamer worden geassembleerd, in een gecontroleerde omgeving worden bereid, waarbij ze zo steriel mogelijk blijven, aangezien elke onzuiverheid in de monsterkamer het experiment in gevaar kan brengen, en alle aanwijzingen over hun optimale opslag en hantering strikt moeten worden gerespecteerd voor het succes van het experimentele protocol. Belangrijk is dat gegevensanalyse zorgvuldig moet worden aangepast aan de verschillende soorten motor-filamentinteracties om resultaten correct te interpreteren en artefacten te voorkomen.

In dit protocol zijn alle stappen opgenomen om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, van de opstelling van experimentele apparatuur tot monstervoorbereiding, meting en gegevensanalyse, die gemakkelijk kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan onconventionele myosines en andere klassen van processieve motoren zoals kinesines en dyneinen te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 871124 Laserlab-Europe, door het Italiaanse ministerie van Universiteit en Onderzoek (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) en door Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk werd ondersteund door Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Tags

Biologie Nummer 173 ultrasnelle krachtklemspectroscopie optisch pincet drie-kralentest moleculaire motoren myosine

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter