Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dissekering af mekanoenzymatiske egenskaber af processive myosiner med ultrahurtig kraftklemmespektroskopi

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Præsenteret her er en omfattende protokol til udførelse af ultrahurtige kraftklemmeforsøg på processive myosin-5-motorer, som let kan udvides til undersøgelsen af andre klasser af processive motorer. Protokollen beskriver alle de nødvendige trin, fra opsætning af forsøgsapparatet til prøveforberedelse, dataindsamling og analyse.

Abstract

Ultrafast force-clamp spektroskopi (UFFCS) er en enkelt molekyleteknik baseret på laserpincet, der muliggør undersøgelse af kemomekanikken af både konventionelle og ukonventionelle myosiner under belastning med hidtil uset tidsopløsning. Især muligheden for at undersøge myosinmotorer under konstant kraft lige efter actin-myosinbindingsdannelsen sammen med den høje hastighed af kraftfeedbacken (200 kHz) har vist, at UFFCS er et værdifuldt værktøj til at studere belastningsafhængigheden af hurtig dynamik såsom myosin-arbejdsslag. Desuden muliggør UFFCS undersøgelsen af, hvordan processive og ikke-processive myosin-actin-interaktioner påvirkes af intensiteten og retningen af den påførte kraft.

Ved at følge denne protokol vil det være muligt at udføre ultrahurtige kraftklemmeeksperimenter på processive myosin-5-motorer og på en række ukonventionelle myosiner. Ved nogle justeringer kunne protokollen også let udvides til studiet af andre klasser af processive motorer såsom kinesiner og dyneiner. Protokollen indeholder alle de nødvendige trin, fra opsætning af forsøgsapparatet til prøveforberedelse, kalibreringsprocedurer, dataindsamling og analyse.

Introduction

I de sidste årtier har optiske pincetter været et værdifuldt værktøj til at belyse mekanokemien af proteininteraktioner på enkeltmolekyleniveau på grund af den slående mulighed for samtidig manipulation og måling af konformationsændringer og enzymatisk kinetik 1,2. Især evnen til at anvende og måle kræfter inden for dem, der udøves af molekylære motorer i cellen, sammen med evnen til at måle subnanometer konformationelle ændringer, gjorde optiske pincetter til et unikt enkeltmolekyleværktøj til at optrævle de kemomekaniske egenskaber af motorproteiner og deres mekaniske regulering.

Ultrafast force-clamp spektroscopy (UFFCS) er en enkeltmolekyle kraftspektroskopiteknik baseret på optisk pincet, udviklet til at studere den hurtige kinetik af molekylære motorer under belastning i en tre-perlegeometri (figur 1a)3,4. UFFCS reducerer tidsforsinkelsen for kraftpåføring på motorproteinet til den fysiske grænse for optisk pincet, dvs. systemets mekaniske afslapningstid, hvilket muliggør påføring af kraften hurtigt efter begyndelsen af en myosinkørsel (få titalls mikrosekunder)3. Denne evne er blevet udnyttet til at undersøge de tidlige mekaniske hændelser i hurtig skelet 3 og hjerte5 muskelmyosin for at afsløre belastningsafhængigheden af kraftslaget, de svage og stærke bindingstilstande samt rækkefølgen af biokemiske (Pi) og mekaniske (powerstroke) begivenheder.

Tre-perlegeometrien anvendes normalt til at studere ikke-processive motorer, en enkelt perlegeometri med en kraftklemme er blevet almindeligt anvendt til at undersøge processive ikke-konventionelle myosiner såsom myosin Va6. Der er dog flere grunde til at foretrække et tre-perle UFFCS-assay også for processive myosiner. For det første tillader den hurtige påføring af belastning lige efter actin-myosinbinding måling af de tidlige begivenheder i kraftudvikling som i ikke-processive motorer. Derudover giver det i tilfælde af procesmotorer også mulighed for en nøjagtig måling af motorens driftslængder og driftsvarighed under konstant kraft gennem hele deres progression (figur 1b). På grund af den høje hastighed af kraftfeedbacken kan systemet desuden opretholde kraftkonstanten under hurtige positionsændringer, såsom myosinarbejdsslaget, hvilket garanterer en konstant belastning under motortrin. Systemets høje tidsmæssige opløsning tillader påvisning af sub-ms-interaktioner, hvilket åbner muligheden for at undersøge svag binding af myosin til actin. Endelig garanterer analysegeometrien, at kraften påføres langs actinfilamentet med ubetydelige tværgående og lodrette komponenter af kraften. Dette punkt er af særlig relevans, da den vertikale kraftkomponent har vist sig at påvirke belastningsafhængigheden af motorens kinetikbetydeligt 7,8. Ved at bruge denne teknik kunne vi anvende en række assisterende og resistive belastninger til processiv myosin-5B og direkte måle belastningsafhængigheden af dens processivitet for en lang række kræfter4.

Som vist i figur 1a er der i dette system ophængt en enkelt actinglødetråd mellem to polystyrenperler, der er fanget i fokus på dobbelt optisk pincet ("håndvægten"). Glødetråden pålægges en ubalanceret nettokraft F= F 1-F2 gennem et hurtigt feedbacksystem, som får glødetråden til at bevæge sig med konstant hastighed i én retning, indtil den når et brugerdefineret inversionspunkt, hvor nettokraften vendes i modsat retning. Når motorproteinet ikke interagerer med glødetråden, er håndvægten fri til at bevæge sig frem og tilbage i en trekantet bølgeform (figur 1b, bundpanel), der spænder over piedestalperlen, hvorpå et enkelt motorprotein er fastgjort. Når interaktionen er etableret, overføres kraften, der bæres af håndvægten, meget hurtigt til motorproteinet, og motoren begynder at forskyde glødetråden ved at træde under den kraftintensitet og retning, der blev anvendt af feedbacksystemet på tidspunktet for interaktionen, indtil myosin løsner sig fra actin. Da belastningen er den forskydning, der frembringes ved motorens trin, afhængig af polariteten af det fangede actinfilament, kan belastningen i henhold til retningen af den påførte kraft enten være hjælpende, dvs. skubbe i samme retning af motorforskydningen (skub i figur 1b øverste panel) eller resistiv, dvs. trække i modsat retning i forhold til motorforskydningen (træk i figur 1b øverste panel), hvilket gør det muligt at studere den kemomekaniske regulering af motorprocessiviteten ved både intensiteten og retningen af den påførte belastning.

I de næste afsnit beskrives alle trin til måling af actin-myosin-5B-interaktioner under forskellige belastninger med en ultrahurtig kraftklemmespektroskopiopsætning fuldt ud, herunder 1) opsætning af den optiske opsætning, justering af optiske fælder og kalibreringsprocedurer, 2) forberedelserne af alle komponenter og deres samling i prøvekammeret, 3) måleproceduren, 4) Repræsentative data og dataanalyse for at udtrække vigtige fysiske parametre, såsom kørselslængden, trinstørrelsen og hastigheden af motorproteinet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optisk opsætning

BEMÆRK: Den eksperimentelle opsætning består af dobbelt optisk pincet med nanometerpegestabilitet og < 1% laserintensitetsudsving. Under disse forhold garanteres håndvægtens stabilitet på nanometerniveau under typisk fældestivhed (0,1 pN/nm) og spænding (1 pN - få titalls pN). Figur 2 viser et detaljeret skema over den optiske opsætning.

  1. Optisk pincet design og konstruktion 9,10,11.
    1. Placer alle komponenterne i opsætningen på et optisk bord i henhold til skemaet i figur 2. Bemærk, at det optiske bord indeholder aktive isolatorer for at minimere mekaniske vibrationer. Derudover er mikroskopstrukturen monteret på elastomere isolatorer for at absorbere akustisk støj og mekaniske resonanser.
    2. Indsæt en optisk isolator tæt på laserkilden ("OI" i figur 2) for at undgå tilfældige amplitudeudsving på grund af optisk feedback.
    3. Forsegl hele banen i en lukket kasse for at reducere luftstrøm og turbulenser, der kan påvirke laserpegestabiliteten.
    4. Opret den dobbelte optiske pincet ved at dividere hovedlaserkilden (Nd: YAG-laser, 1,064 nm bølgelængde i figur 2) i to grene med ortogonale polariseringer ved brug af polariserende strålesplittere (PBS). Timedelte fælder bør undgås, fordi de fremkalder svingning af håndvægten under spænding12.
    5. Brug to akustooptiske deflektorer (AOD'er i figur 2) drevet af Direct Digital Synthesizers (DDS'er) for at tillade fine og hurtige bevægelser af de to fælder og præcis regulering af actinspændingen ved direkte at drive DDS'erne gennem de digitale udgange fra det feltprogrammerbare gate array FPGA-kort (se figur 2).
      BEMÆRK: Den samlede feedbackresponstid skal være <10 μs for hurtigt at korrigere og opretholde konstant kraft på begge fælder under målinger, herunder ubundet tilstand, myosininteraktion og bevægelse. Til dette formål skal positionsdetektorer have en >= 100 kHz båndbredde, og data skal indsamles ved >= 200 kHz samplinghastighed. For hvert datapunkt, der er erhvervet (5 μs indsamlingstid), beregnes proportionale korrektioner for de to fælder af FPGA'en og sendes til de to DDS, der driver AOD'erne. AOD-responstiden skal være under 5 μs for at opfylde den krævede feedbackresponstid.
    6. For nm detektion af den fangede perlers position anbringes to kvadrantfotodiodedetektorer (QPD'er i figur 2) i kondensatorens bageste brændplan. Nøjagtig justering af QPD'erne i et plan, der er konjugeret til kondensatorens bageste brændplan, såvel som AOD'erne i et plan, der er konjugeret til målets bageste brændplan, vil sikre, at QPD'ernes signaler vil være uafhængige af AOD'ernes frekvens.
    7. Monter AOD'en på en lineær oversætter med mikrometerdrev, og fortræng den, indtil krystalkanten kommer tæt på laserstrålen. Udskift derefter målet med en iris, centreret på det gevindskårne objektivhus, og reguler dets blænde, så det passer til målets bagblændestørrelse.
    8. Flyt oversætteren mod laserstrålen, indtil den del af strålen, der er blokeret af piezokrystallen, er synlig efter iris, drej oversætteren lidt bagud for at få strålen til helt at fylde irisblænden igen.
    9. Gentag trin 1.1.7-1.1.8 for den anden AOD. Kontroller responstiden for feedback-sløjfen ved at måle tidsforsinkelsen fra QPD'erne, mens du hurtigt bevæger en stråle på en perle, der sidder fast på overfladen af dækslet13.
      BEMÆRK: Ovenstående tre trin (1.1.7-1-1-9) fører til omhyggelig justering af AOD-krystaller. Disse trin er vigtige for at optimere tidsresponsen for både stråleafbøjningen og feedbacken13.
  2. Ved hjælp af en fotodiode måles intensitetsudsvingene i fangstlaseren ved mikroskopindgangen, som skal være under 1%. Bemærk, at fotodiodebåndbredden skal være større end billedhastigheden.
  3. Kontroller pegestabiliteten for begge fælder.
    1. Forbered silicaperler i fosfatbuffer (PB) ved at fortynde 20 μL silicaperler (1,2 μm, 10% faste stoffer) i 1 ml acetone, sonikere i 30 s, hvirvel kort og centrifugere i 2 minutter ved 19.000 x g.
    2. Supernatanten fjernes, opslæmmes i 1 ml acetone, og vask gentages. Resuspender i 1 ml 50 mM PB, vask 2 gange. Til sidst resuspenderes i 100 μL 50 mM PB.
    3. Udfør optisk pincetkalibrering med silicaperler ved at klæbe en dæksel på et mikroskopglas med et dobbeltsidet tape (ca. 60 μm tykt) for at opbygge et flowkammer. Fyld kammeret med et 1 mg/ml BSA (bovin serumalbuminprotein) og vent i 3 minutter.
    4. Flow en 1:1000 fortynding af silicaperler i PB ind i kammeret. Brug en sprøjte fyldt med siliciumfedt til forsigtigt at forsegle kammeret. Fang en enkelt perle i hver fælde, og anvend effektspektrummetoden14 til at kalibrere dem.
    5. Forbered silicaperler i pentylacetat (ved stuetemperatur) ved at opløse 20 μL silicaperler (1,2 μm diameter, 10% faststof) i 1-1,5 ml acetone, hvirvel og sonikat i 30 s.
    6. Centrifuger ved 18.500 x g i 2 min. Supernatanten kasseres og opslæmmes igen i 1 ml acetone, hvorefter vasken gentages. Resuspender i 1 ml pentylacetat og gentag vask (centrifuge og resuspension) i pentylacetat 2 gange. Pellet resuspenderes i 100 μL nitrocellulose 1% og 900 μL pentylacetat. Opbevares ved 4 °C i 2 måneder.
    7. Tag et 24 x 24 mm glasdæksel, og rengør det omhyggeligt med papir gennemvædet med ren ethanol. Skyl det derefter, mens du holder det med en ren pincet, skyl det en anden gang ved at vaske direkte med ren ethanol. Lad det tørre under en mild strøm af nitrogen. Gentag om nødvendigt denne operation for at fjerne alle synlige rester på glasoverfladen.
    8. Tag silicaperlerne, hvirvel det og sonikere det kort i ~ 30 s.
    9. Efter rengøring af et andet dæksel (24 x 60 mm) skal du bruge det til at smøre 2 μL silicaperleopløsning på den ene overflade af dækslet og vente på, at det tørrer.
    10. Rengør omhyggeligt et mikroskopglas (26 x 76 mm), der skal bruges til at skabe flowkammeret.
    11. Klip to linjer dobbelt klæbende tape (~ 3 mm stor, 60-100 μm tyk) og fastgør dem på den ene side af mikroskopets dias, som vist i figur 3.
    12. Ved hjælp af en ren pincet lukkes kammeret (ca. 20 μL slutvolumen) ved at sætte det coatede dæksel (1.3.9) i kontakt med klæbebåndslinjerne med nitrocellulose + perlelaget vendt mod kammerets inderside som vist i figur 3a. Fyld flowkammeret med 50 mM fosfatbuffer og forsegl det med siliciumfedt.
    13. Billede af en enkelt silicaperle i brightfieldmikroskopi ved >200x forstørrelse ved hjælp af et CCD-kamera (charge-coupled device) eller CMOS-kamera (complementary metal-oxide-semiconductor) med >1,4 megapixel. Brug en feedback-software til at flytte piezo-trinnet (med nanometernøjagtighed eller bedre) for at kompensere for termiske drifter10.
    14. Overlap midten af venstre fælde med midten af perlen (x-y signalniveauer fra QPD skal matche dem fra kalibreringen). Mål derefter positionsstøj og standardafvigelse for positionssignalerne for denne fælde.
    15. Gentag det forrige trin for den rigtige fælde15.
  4. Kalibrering af trapposition: MHz til nm
    1. Der fremstilles et strømningskammer med silicaperler fastgjort på dækslipfladen (1.3.5-1.3.12) og flydende polystyrenperler (der anvendes konjugerede α-actininperler fremstillet som beskrevet i det følgende punkt 2.1).
    2. Fokuser en silicaperle på dækselfladen let fortrængt (~ 5 μm) fra midten af synsfeltet (FOV) og få et billede af FOV. Flyt perlen med 10 μm mod synsfeltet ved hjælp af piezo-trinnet, og få et andet billede. Beregn midten af perlen i de to billeder ved hjælp af en centroid algoritme eller lignende, og beregn afstanden i pixel mellem de to perler for at opnå nm / pixel-kalibrering af brightfield-kameraet.
    3. Fang en enkelt flydende partikel i en fælde. Flyt derefter fælden ved hjælp af AOD i små trin (0,2 MHz) og få et billede af partiklen og den tilsvarende frekvens af AOD for hvert trin. Partiklens position i synsfeltet beregnes ved hjælp af centroidalgoritmen som før, og omregningen til nm ved hjælp af nm/pixel-kalibreringen opnået i det foregående trin.
    4. Udfør en lineær tilpasning af frekvenspositionsdataene, og kalibreringskonstanten beregnes i nm/MHz.
    5. Gentag kalibreringen for den anden fælde
  5. Trapeffekt og stivhedskalibrering (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
    1. Der fremstilles et strømningskammer med silicaperler fastgjort på dækslipfladen (1.3.5-1.3.12) og flydende polystyrenperler (der anvendes konjugerede α-actininperler fremstillet som beskrevet i det følgende punkt 2.1), og en enkelt partikel fanges i én fælde. Fortræng derefter begge fælder gennem AOD'er i små trin (0,2 MHz), og optag en brunsk bevægelse af partiklen i begge fælder med QPD og den tilsvarende frekvens af AOD'erne.
    2. Beregn en gennemsnitlig effekt på detektorerne ved hver position, og opnå fældestivhed og QPD-kalibreringskonstant beta ved at montere en Lorentzian-funktion på et effektspektrum af den registrerede brownske bevægelse13.

2. Forberedelse af prøver

  1. Forbered α-actinin konjugerede fluorescerende perler
    1. Udfør konjugering16: Tag aminofunktionaliserede polystyrenperler (1 μm diameter, 2,5% faste stoffer), vask dem to gange i 500 μL destilleret vand og resuspenderet i 500 μL PBS (pH 7,0). Der tilsættes 1 mM HaloTag succinimidylesterO2-ligand og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time. Der vaskes tre gange med 500 μL PBS og resuspenderes med 100-200 μM HaloTag α-actinin. Der inkuberes i 1 time ved 37 °C og vaskes tre gange i 500 μL PBS (brug perler inden for 1,5 uger eller lynfrosne i flydende nitrogen og opbevar dem ved -80 °C).
    2. Mærkning: Inkuber 200 μL perleopløsning med Rhodamin-BSA ved 5 μg/ml slutkoncentration i 10 min. Der vaskes med 50 mM PB tre gange og opslæmmes igen i 500 μL PB 50 mM. Dette kan opbevares i alikvoter ved - 80 °C i flere måneder).
  2. Ekspress og oprens biotinyleret Myosin-5B som beskrevet tidligere 4,17.
  3. Polymeriser og mærk F-actin13:
    1. F-actinpolymerisation: Bland 69 μL ultrarent vand, 10 μL actinpolymerisationsbuffer 10x (100 mM Tris HCI, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidincarbonat pH 7,5), 20 μL G-actin 10 mg / ml og 1 μL DL-Dithiothreitol (DTT) 1 M. Lad det stå på is i mere end 1 time.
    2. F-actinmærkning med rhodamin (Ex/Em: 546/575 nm): Tag 25 μL polymeriseret F-actin og tilsæt 19,5 μL ultrarent vand, 2,5 μL actinpolymerisationsbuffer 10x (100 mM Tris HCI, 20 mMMgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidincarbonat pH 7,5), 1 μL 1 M DTT og 2 μL 250 μM rhodamin phalloidin. Lad det ligge på is natten over. Til fangstforsøg kan rhodamin F-actin opbevares på is og anvendes inden for en uge.
  4. Prøve samling
    1. Der udtages flowkammeret (1.3.5-1.3.12) og inkuberes 1 mg/ml biotinyleret BSA i 5 min. Efter vask med AB-buffer (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH7,2) inkuberes 1 mg/ml streptavidin i 5 minutter og vaskes igen med AB-buffer. Biotinyleret myosin-5B tung meromyosin inkuberes ved 3 nM koncentration i M5B buffer (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3) med 2 μM Calmodulin (CaM) i 5 min. Der vaskes med tre volumener 1 mg/ml biotinyleret BSA suppleret med 2 μM CaM i AB og inkuberes i 3 min.
    2. Under inkubation fremstilles reaktionsblandingen (RM): 0,005% α-actinin funktionaliserede perler (afsnit 2.1), 1 nM rhodamin F-Actin (afsnit 2.3) i billedbuffer (IB: AB-buffer med 1,2 μM glucoseoxidase, 0,2 μM katalase, 17 mM glucose, 20 mM DTT, 2 μM CaM og ATP ved den koncentration, der er nødvendig til eksperimentet).
    3. Vask med RM og forsegl kammeret med silikonefedt. Prøven er nu klar til at blive set under mikroskopet.

3. Måling

  1. Saml håndvægten.
    1. Se efter de flydende α-actininperler ved at flytte prøven ved hjælp af langtrækkende oversættere, tænd for en fælde og fang en perle.
    2. Når den første fælde er optaget, skal du flytte oversætteren for at placere den fangede perle tæt på dækslipfladen for at undgå fangst af flere perler og fange en anden perle i den anden fælde.
    3. Juster de to fælder til lige stivheder ved at justere effekten af AODs akustiske bølger. Stivheder er normalt indstillet mellem 0,03 og 0,14 pN / nm. Jo mindre stivhed jo mindre kraftstøj, især ved lave kræfter.
    4. Vend derefter det motoriserede spejl M (figur 2) for at skifte til fluorescensmikroskopi, og se efter et actinfilament, der flyder i opløsning ved at forskyde prøven gennem langtrækkende oversættere13. Foretrækker lange filamenter (>5 μm), da det processive myosin vil fortrænge det og flytte det i et par mikron, før det løsnes.
    5. Flyt prøven for at lade en af de fangede perler nærme sig den ene ende af glødetråden, indtil de fastgøres til hinanden. Juster derefter perleafstanden til den omtrentlige filamentlængde, og skab et flow i retning af den ubundne anden perle ved at flytte trinnet i dets retning. Filamentet vil blive strakt af strømmen, og det vil til sidst binde til det13. Perle-actin-perlekomplekset kaldes "håndvægt".
  2. Etabler actin-myosinkontakt.
    1. Adskil forsigtigt de to fælder langt fra hinanden for at forspænde glødetråden op til ca. 3 pN, og sonder håndvægtens stivhed ved at få en fælde til at svinge i en trekantet bølge ved at ændre frekvensen af en af de to AOD'er og verificere den deraf følgende transmission af bevægelsen til den bageste perle gennem dens positionssignal.
    2. Flyt scenen for at placere håndvægten i nærheden af en piedestal silicaperle og tillad kontakten mellem filamentet og proteinet, der er fastgjort på perleoverfladen ved at justere højden på de fangede perlecentre lidt under silicaperlediameteren. Placer derefter midten af silicaperlen mellem de fangede perler.
  3. Kraftklemme og nm stabilisering feedback:
    1. Tænd for den ultrahurtige kraftklemme med 2-3 pN-kraft og 200 nm-svingning, og scan piedestalperlen i diskrete trin på ca. 20-30 nm i retning vinkelret på actinfilamentet. Vent på, at interaktioner finder sted i hver position (få sekunder), og træd derefter foran, hvis der ikke observeres nogen interaktion. Når protein-filament-interaktionen er etableret, skal du kigge efter den position, hvor interaktioner er hyppigere.
    2. Sørg for, at når det processive myosin bevæger sig mod den ene ende af actinfilamentet (normalt +-enden), bevæger den fangede perle, der er fastgjort til +-enden, sig mod silicaperlen. Flyt trinnet mod -enden af filamentet, så silicaperlen ligger så tæt som muligt på den fangede perle, der er fastgjort til -enden af filamentet, når myosin ikke er bundet, og start nanometerstabiliseringsfeedbacken. Dermed minimeres sandsynligheden for, at den fangede perle, der er fastgjort til +enden af filamentet, styrter ned i silicaperlen.
  4. Optag data.

4. Analyseaf data 4

BEMÆRK: Den beskrevne analysemetode giver mulighed for påvisning og måling af processive kørsler og hurtige trinhændelser baseret på ændringer i håndvægthastigheden, som forårsaget af myosintrin. Analyse af processive kørsler udføres på grundlag af en dataanalysemetode for ikke-processive motorer beskrevet i referencerne 3,4,13.

  1. Angiv en tærskel for hastighedsændringer for at muliggøre trinvis hændelsesregistrering. Da der i dette tilfælde forventes både fremadgående og bagudrettede trin, accepteres overskridelsen af tærsklen i begge retninger.
  2. Tildel hvert trin til den tilsvarende kørsel: Hvis tidsintervallet mellem to på hinanden følgende trin er kortere end 3 ms, og trinets amplitude er < 90 nm, tildeles trin til samme kørsel, ellers tildeles trin til forskellige kørsler4.
  3. Korrekt løbelængde for hjælpekræfter4.
    1. Kørselslængder under hjælpekræfter korrigeres ved at beregne den reelle kørselslængdeværdi RL ud fra den målte gennemsnitlige kørselslængdeværdi <RLm> ud fra følgende ligning, hvor D er svingningsområdet:
      Equation 1
      BEMÆRK: Nærmere oplysninger om afledningen af denne ligning findes i reference4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative data består af positionsregistreringer over tid som vist i figur 4. I stillingsposten er to slags forskydninger synlige. For det første, når myosinmotoren ikke interagerer med actinfilamentet, bevæger de fangede perler sig med konstant hastighed mod opløsningens viskøse trækkraft, hvilket viser en lineær forskydning, der oscillerer inden for oscillationsområdet, der er indstillet af operatøren i en trekantet bølge3 (ikke synlig i figur 4 på grund af den lange tidsmæssige skala). For det andet, når myosinmotoren interagerer med glødetråden, overføres kraften, der bæres af det bevægelige filament, meget hurtigt til proteinet, systemhastigheden falder til nul (røde linjer i figur 4), og trinvise begivenheder forekommer under konstant kraft indtil slutningen af løbet. Som vist i figur 5 skiftes kraften fra positiv til negativ retning (og omvendt) af feedbacksystemet, som skifter kraftretning, når perlen når kanten af det svingningsområde, der er indstillet af brugeren. I nogle tilfælde kan det ske, at når myosinet binder og fortrænger filamentet mod den positive retning, skubber det perlen mod den (øverste) kant af svingningsområdet. Hvis dette sker under hjælpekraft (dvs. rettet mod positiv forskydning, skub, i figur 5), afbrydes myosinets løb af kraftretningsinversionen ved svingningskanten (pile i figur 5), hvilket begrænser længden af løbet til amplituden af håndvægtsvingningen D. Dette kræver en korrektion af løbelængden i tilfælde af hjælpekraft (4.3.1).

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over UFFCS anvendt på en processiv myosin-5B-motor. a) Et enkelt myosin-5B-molekyle er bundet til en glasperlepiedestal gennem en streptavidin-biotinforbindelse. En enkelt actinfilament fanges ved at suspendere den mellem α-actininbelagte perler (den såkaldte "tre-perle" geometri). Sorte pile repræsenterer kraften fastspændt til højre (F1) og venstre perle (F2), rød pil repræsenterer nettokraften (F) på håndvægten. F skiftes frem og tilbage for at opretholde håndvægten inden for et begrænset svingningsområde, når myosin ikke er bundet til actin. b) Eksempelspor, der viser forskydning og kraft i de tilsvarende faser af håndvægtsvingning, myosin-5B-fastgørelse og processive kørsler under hjælpende (skub) og resistiv (træk) belastning. Dette tal er ændret fra4. Rådata, der er indsamlet ved 200 kHz samplinghastighed, afbildes. Std. Dev. af kraft er ca. 0,27 pN. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Optisk skema for den eksperimentelle opsætning. Det optiske mikroskop består af: halogenlampe (H), kondensator (C), prøve (S), piezooversættere (x-y og z), objektiv (O), et kamera med lav forstørrelse (CCD 200X) og et kamera med høj forstørrelse (CCD 2000X), der bruges til nm-stabiliseringsfeedback. Dobbelt optisk pincet indsættes og ekstraheres fra mikroskopets optiske akse gennem dikroiske spejle (D2 og D3) og omfatter: Nd: YAG-laser (1064 nm), optisk isolator (OI), λ / 2-bølgeplader, polariserende strålesplitterterninger (PBS), akustooptiske deflektorer (AOD), 1064 nm interferentielle filtre (F1 og F2), kvadrantdetektorfotodioder (QDP). Signaler fra QDP'er blev udarbejdet med en FPGA, sendt til to specialbyggede direkte digitale synthesizere (DDS), der driver AOD'erne (force feedback). Fluorescensexcitation blev tilvejebragt af en duplikeret Nd:YAG-laser (532 nm), og billedet projiceres på et elektronmultipliceret kamera (EMCCD). M er et bevægeligt spejl, F3 et emissionsfilter. Dette tal er ændret fra 3. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Samling af flowkammer . a) Forberedelse af kammeret. En glasdæksel, smurt med silicaperler, fastgøres på et mikroskopglas gennem dobbelte klæbende tapestriber for at danne en flowcelle med et volumen på ca. 20 μL. b) Set ovenfra af flowcellen. Opløsninger flyves fra den ene side af kammeret med en pipette og suges fra den anden side gennem et filterpapir for at skabe et flow langs pilretningen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Registrering af repræsentativ position. Positionsoptagelse, der viser myosin-5B-processive kørsler og trin- og kørselsdetekteringsalgoritmen. Detekteret begyndelse og slutning af hver kørsel er angivet med henholdsvis grønne og cyan lodrette linjer. Røde vandrette linjer angiver de registrerede trin. Dette tal er ændret fra4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Tving inversion under myosinkørsler. Når myosin binder og bevæger filamentet i positiv retning under hjælpekraft (skub), kan det ske, at det når kanten af svingningsområdet, hvor kraften vendes (angivet med pilene), således at myosinløbet under hjælpekraft afbrydes. I modsætning hertil, under resistiv kraft (træk), forhindrer myosin processive trin håndvægten i at nå kraftinversionspunktet. Derfor er løbelængder i sidstnævnte tilfælde ikke begrænset af svingningsområdet for resistive kræfter. Dette tal er ændret fra4. Rådata, der er indsamlet ved 200 kHz samplinghastighed, afbildes. Std. Dev. af kraft er ca. 0,27 pN. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom enkeltmolekyleteknikker, såsom treperleassayet, er teknisk udfordrende og lav gennemstrømning, forbedrer UFFCS detektionen af molekylære interaktioner takket være dataenes høje signal-støj-forhold. UFFCS tillader undersøgelse af belastningsafhængigheden af motorproteiner med de vigtigste fordele ved at anvende kraften meget hurtigt ved binding af motoren til glødetråden for at undersøge tidlige og meget hurtige begivenheder i kraftproduktion og svage bindingstilstande under kontrolleret kraft; Opretholdelse af kraften konstant gennem hele kørslen og sondering af motorafhængigheden med fuld kontrol over kraftretningsvirkning. Med hensyn til det sidste punkt er treperlegeometrien, som vi bruger her, meget effektiv til at anvende og måle kræfter langs glødetrådsretningen, hvilket minimerer bidrag fra tværgående eller lodrette komponenter. Men når motorproteinet forventes aktivt at producere tværgående eller lodrette kræfter eller endda drejningsmomenter, er andre konfigurationer såsom enkeltperlegeometrien mere passende 2,7,18. Takket være sin rumlige og tidsmæssige opløsning repræsenterer UFFCS desuden et unikt værktøj til forståelse af grundlæggende molekylære interaktioner, der ellers ville blive hindret med konventionelle enkeltmolekyleteknikker. Faktisk gjorde UFFCS det muligt at undersøge, hvordan hjælpemidler og resistive kræfter regulerer myosin-5B's mekaniske respons og dermed gav ny indsigt i dets kollektive adfærd inden for actinnettet i celle4.

Succesen med disse eksperimenter afhænger imidlertid af opfyldelsen af nogle vigtige krav, der skal behandles meget omhyggeligt ved at følge alle instruktionerne i denne protokol: den præcise justering og isolering af den optiske opsætning er grundlæggende for at nå en optimal rumlig opløsning; omhyggelig kalibrering af det optiske system er nødvendigt for at bestemme værdierne for de påførte kræfter med høj præcision; indstillingen af et hurtigt feedback-system er nødvendigt for at nå den høje tidsmæssige opløsning; Endelig skal alle komponenter, der samles i prøvekammeret, fremstilles i et kontrolleret miljø og holdes så sterile som muligt, da enhver urenhed i prøvekammeret kan kompromittere forsøget, og alle indikationer på deres optimale opbevaring og håndtering skal respekteres nøje for forsøgsprotokollens succes. Det er vigtigt, at dataanalyse omhyggeligt tilpasses de forskellige former for motor-filament-interaktioner for korrekt at fortolke resultater og undgå artefakter.

I denne protokol er inkluderet alle trin til at udføre ultrahurtige kraftklemmeeksperimenter på processive myosin-5-motorer, fra opsætning af eksperimentelt apparat til prøveforberedelse, måling og dataanalyse, der bekvemt kan tilpasses til at studere en række ukonventionelle myosiner og andre klasser af processive motorer såsom kinesiner og dyneiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 871124 Laserlab-Europe, af det italienske universitets- og forskningsministerium (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013-bevilling nr. RBFR13V4M2) og af Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk blev støttet af Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Tags

Biologi udgave 173 ultrahurtig kraftklemmespektroskopi optisk pincet treperleanalyse molekylære motorer myosin

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Dissekering af mekanoenzymatiske egenskaber af processive myosiner med ultrahurtig kraftklemmespektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter