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Biology

अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ प्रोसेसिव मायोसिन के मेकानोएनजाइमेटिक गुणों का विच्छेदन

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां प्रस्तुत प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 मोटर्स पर अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप प्रयोगों को करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है, जिसे आसानी से प्रक्रियात्मक मोटर्स के अन्य वर्गों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक उपकरण के सेटअप से लेकर नमूना तैयार करने, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण तक सभी आवश्यक चरणों का विवरण देता है।

Abstract

अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूएफएफसीएस) लेजर ट्वीज़र्स पर आधारित एक एकल अणु तकनीक है जो अभूतपूर्व समय संकल्प के साथ लोड के तहत पारंपरिक और अपरंपरागत मायोसिन दोनों के केमोमैकेनिक्स की जांच की अनुमति देती है। विशेष रूप से, एक्टिन-मायोसिन बॉन्ड गठन के ठीक बाद निरंतर बल के तहत मायोसिन मोटर्स की जांच करने की संभावना, बल प्रतिक्रिया (200 kHz) की उच्च दर के साथ, यूएफसी को मायोसिन वर्किंग स्ट्रोक जैसे तेज गतिशीलता की भार निर्भरता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण दिखाया गया है। इसके अलावा, यूएफएफसीएस इस अध्ययन को सक्षम बनाता है कि कैसे प्रक्रियात्मक और गैर-प्रक्रियात्मक मायोसिन-एक्टिन इंटरैक्शन लागू बल की तीव्रता और दिशा से प्रभावित होते हैं।

इस प्रोटोकॉल का पालन करके, प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 मोटर्स और विभिन्न प्रकार के अपरंपरागत मायोसिन पर अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप प्रयोग करना संभव होगा। कुछ समायोजनों द्वारा, प्रोटोकॉल को आसानी से किन्सिन और डायनिन जैसे प्रक्रियात्मक मोटर्स के अन्य वर्गों के अध्ययन के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल में प्रयोगात्मक उपकरण के सेटअप से लेकर नमूना तैयार करने, अंशांकन प्रक्रियाओं, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण तक सभी आवश्यक कदम शामिल हैं।

Introduction

पिछले दशकों में ऑप्टिकल चिमटी एकल अणु स्तर पर प्रोटीन इंटरैक्शन के मेकेनोकेमिस्ट्री को स्पष्ट करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण रहा है, समवर्ती हेरफेर और संवहन परिवर्तनों और एंजाइमेटिक कैनेटीक्स 1,2 के माप की हड़ताली संभावना के कारण। विशेष रूप से, सेल में आणविक मोटर्स द्वारा लगाए गए बलों की सीमा में बलों को लागू करने और मापने की क्षमता, साथ ही उप-नैनोमीटर संवहन परिवर्तनों को मापने की क्षमता ने ऑप्टिकल ट्वीज़र्स को मोटर प्रोटीन के केमोमेकैनिकल गुणों और उनके यांत्रिक विनियमन को उजागर करने के लिए एक अद्वितीय एकल-अणु उपकरण बना दिया।

अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूएफएफसीएस) ऑप्टिकल ट्वीज़र्स पर आधारित एक एकल-अणु बल-स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है, जिसे तीन-मोती ज्यामिति (चित्रा 1 ए) 3,4 में लोड के तहत आणविक मोटर्स के तेज कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यूएफएफसीएस मोटर प्रोटीन के लिए बल आवेदन के लिए समय अंतराल को ऑप्टिकल ट्वीज़र्स की भौतिक सीमा तक कम कर देता है, यानी, सिस्टम का यांत्रिक विश्राम समय, इस प्रकार मायोसिन रन (कुछ दसियों माइक्रोसेकंड) की शुरुआत के बाद बल के आवेदन को तेजी से अनुमति देता है। इस क्षमता का उपयोग तेजी से कंकाल 3 और कार्डियक5 मांसपेशी मायोसिन में प्रारंभिक यांत्रिक घटनाओं की जांच करने के लिए किया गया है ताकि पावरस्ट्रोक, कमजोर और मजबूत-बाध्यकारी अवस्थाओं की भार निर्भरता को प्रकट किया जा सके, साथ ही जैव रासायनिक (पीआई) और यांत्रिक (पावरस्ट्रोक) घटनाओं का क्रम भी प्रकट किया जा सके।

तीन-मोती ज्यामिति को आमतौर पर गैर-प्रक्रियात्मक मोटर्स का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाता है, बल-क्लैंप के साथ एक एकल मोती ज्यामिति का उपयोग आमतौर पर मायोसिन वीए 6 जैसे प्रक्रियात्मक गैर-पारंपरिक मायोसिनकी जांच के लिए किया जाता है। हालांकि, प्रक्रियात्मक मायोसिन के लिए तीन-बीड्स यूएफआईसीएस परख को प्राथमिकता देने के कई कारण हैं। सबसे पहले, एक्टिन-मायोसिन बाइंडिंग के ठीक बाद लोड का तेजी से आवेदन गैर-प्रक्रियात्मक मोटर्स के रूप में बल विकास में शुरुआती घटनाओं के माप की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रोसेसिव मोटर्स के मामले में यह मोटर की रन लंबाई और उनकी प्रगति के माध्यम से निरंतर बल के तहत चलने की अवधि का सटीक माप भी देता है (चित्रा 1 बी)। इसके अलावा, बल प्रतिक्रिया की उच्च दर के कारण, सिस्टम स्थिति में तेजी से बदलाव के दौरान बल स्थिर रख सकता है, जैसे कि मायोसिन वर्किंग स्ट्रोक, जिससे मोटर स्टेपिंग के दौरान निरंतर भार की गारंटी मिलती है। सिस्टम का उच्च-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन उप-एमएस इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे एक्टिन के लिए मायोसिन के कमजोर बंधन की जांच की संभावना खुल जाती है। अंत में, परख ज्यामिति गारंटी देती है कि बल को एक्टिन फिलामेंट के साथ लागू किया जाता है, जिसमें बल के नगण्य अनुप्रस्थ और ऊर्ध्वाधर घटक होते हैं। यह बिंदु विशेष रूप से प्रासंगिक है क्योंकि ऊर्ध्वाधर बल घटक को मोटर के कैनेटीक्स 7,8 की लोड-निर्भरता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। इस तकनीक का उपयोग करके, हम प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 बी के लिए सहायक और प्रतिरोधक भार की एक श्रृंखला लागू कर सकते हैं औरसीधे बलों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इसकी प्रक्रिया की भार निर्भरता को माप सकते हैं।

जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, इस प्रणाली में एक एकल एक्टिन फिलामेंट डबल ऑप्टिकल ट्वीज़र्स ("डंबल") के फोकस में फंसे दो पॉलीस्टाइनिन मोतियों के बीच निलंबित हो जाता है। एक असंतुलित शुद्ध बल F = F1-F2 को फिलामेंट पर एक तेज प्रतिक्रिया प्रणाली के माध्यम से लगाया जाता है, जो फिलामेंट को एक दिशा में निरंतर वेग से तब तक चलता है जब तक कि यह उपयोगकर्ता-परिभाषित व्युत्क्रम बिंदु तक नहीं पहुंच जाता है जहां शुद्ध बल विपरीत दिशा में उलट हो जाता है। जब मोटर प्रोटीन फिलामेंट के साथ बातचीत नहीं कर रहा होता है, तो डंबल एक त्रिकोणीय तरंग आकार (चित्रा 1 बी, नीचे पैनल) में आगे और पीछे जाने के लिए स्वतंत्र होता है, जो पेडस्टल मोती को फैलाता है जिस पर एक एकल मोटर प्रोटीन जुड़ा होता है। एक बार बातचीत स्थापित हो जाने के बाद डंबल द्वारा ले जाया जाने वाला बल बहुत तेजी से मोटर प्रोटीन में स्थानांतरित हो जाता है और मोटर बातचीत के समय प्रतिक्रिया प्रणाली द्वारा लागू बल तीव्रता और दिशा के तहत कदम रखकर फिलामेंट को विस्थापित करना शुरू कर देता है, जब तक कि मायोसिन एक्टिन से अलग नहीं हो जाता। फंसे हुए एक्टिन फिलामेंट की ध्रुवीयता पर निर्भर मोटर के कदम से उत्पन्न विस्थापन होने के नाते, लागू बल की दिशा के अनुसार भार या तो सहायक हो सकता है, यानी, मोटर विस्थापन की एक ही दिशा में धक्का देना (चित्रा 1 बी ऊपरी पैनल में धक्का), या प्रतिरोधक, यानी, मोटर विस्थापन के संबंध में विपरीत दिशा में खींचना (चित्रा 1 बी में खींचना) ऊपरी पैनल) लागू भार की तीव्रता और दिशात्मकता दोनों द्वारा मोटर प्रक्रिया के केमोमैकेनिकल विनियमन का अध्ययन करना संभव बनाता है।

अगले खंडों में अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी सेटअप के साथ विभिन्न भार के तहत एक्टिन-मायोसिन -5 बी इंटरैक्शन को मापने के लिए सभी चरणों का पूरी तरह से वर्णन किया गया है, जिसमें 1) ऑप्टिकल सेटअप की स्थापना, ऑप्टिकल ट्रैप संरेखण और अंशांकन प्रक्रियाएं, 2) नमूना कक्ष में सभी घटकों और उनकी असेंबली की तैयारी, 3) माप प्रक्रिया, 4) महत्वपूर्ण भौतिक मापदंडों को निकालने के लिए प्रतिनिधि डेटा और डेटा विश्लेषण, जैसे रन की लंबाई, चरण आकार और मोटर प्रोटीन का वेग।

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Protocol

1. ऑप्टिकल सेटअप

नोट: प्रायोगिक सेटअप नैनोमीटर पॉइंटिंग स्थिरता और 1% लेजर तीव्रता में उतार-चढ़ाव के < डबल ऑप्टिकल ट्वीज़र्स से बना है। इन स्थितियों के तहत, नैनोमीटर स्तर पर डंबल की स्थिरता को विशिष्ट जाल कठोरता (0.1 pN / nm) और तनाव (1 pN - कुछ दसियों pN) के तहत गारंटी दी जाती है। चित्रा 2 ऑप्टिकल सेटअप की एक विस्तृत योजना दिखाता है।

  1. ऑप्टिकल चिमटी डिजाइन और निर्माण 9,10,11।
    1. सेटअप के सभी घटकों को चित्रा 2 में योजना के अनुसार एक ऑप्टिकल टेबल पर रखें। ध्यान दें कि ऑप्टिकल तालिका में यांत्रिक कंपन को कम करने के लिए सक्रिय आइसोलेटर्स शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप संरचना ध्वनिक शोर और यांत्रिक अनुनाद को अवशोषित करने के लिए इलास्टोमेरिक आइसोलेटर्स पर लगाई जाती है।
    2. ऑप्टिकल प्रतिक्रिया के कारण यादृच्छिक आयाम में उतार-चढ़ाव से बचने के लिए लेजर स्रोत ( चित्रा 2 में "ओआई") के करीब एक ऑप्टिकल आइसोलेटर डालें।
    3. हवा के प्रवाह और अशांति को कम करने के लिए एक बंद बॉक्स में पूरे रास्ते को सील करें जो लेजर पॉइंटिंग स्थिरता को प्रभावित कर सकता है।
    4. ध्रुवीकरण बीम स्प्लिटर्स (पीबीएस) के उपयोग से ऑर्थोगोनल ध्रुवीकरण के साथ मुख्य लेजर स्रोत (एनडी: याग लेजर, चित्रा 2 में 1,064 एनएम तरंग दैर्ध्य) को दो शाखाओं में विभाजित करके डबल ऑप्टिकल चिमटी बनाएं। समय-साझा जाल से बचा जाना चाहिए क्योंकि वे तनाव12 के तहत डंबल के दोलन को प्रेरित करते हैं।
    5. प्रत्यक्ष डिजिटल सिंथेसाइज़र (डीडीएस) द्वारा संचालित दो एकोस्टो-ऑप्टिक डिफ्लेक्टर्स ( चित्रा 2 में एओडी) का उपयोग करें ताकि दो जालों के ठीक और तेजी से आंदोलनों और फील्ड-प्रोग्रामेबल गेट सरणी एफपीजीए बोर्ड से डिजिटल आउटपुट के माध्यम से डीडीएस को सीधे चलाकर एक्टिन तनाव के सटीक विनियमन की अनुमति मिल सके ( चित्रा 2 देखें)।
      नोट: अनबाउंड स्थिति, मायोसिन इंटरैक्शन और आंदोलन सहित माप के दौरान दोनों जालों पर तेजी से सही करने और निरंतर बल बनाए रखने के लिए समग्र प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया समय <10 μ होना चाहिए। इसके लिए, स्थिति डिटेक्टरों में > = 100 kHz बैंडविड्थ होना चाहिए और डेटा को > = 200 kHz नमूना दर पर प्राप्त किया जाना चाहिए। अधिग्रहित प्रत्येक डेटा बिंदु (5 μs अधिग्रहण समय) के लिए, दो जालों के लिए आनुपातिक सुधार की गणना FPGA द्वारा की जाती है और AODs को चलाने वाले दो DDS को भेजा जाता है। आवश्यक प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया समय को पूरा करने के लिए एओडी प्रतिक्रिया समय 5 μs से नीचे होना चाहिए।
    6. फंसे हुए मोतियों की स्थिति का पता लगाने के लिए, कंडेनसर के पीछे फोकल प्लेन में दो क्वाड्रंट फोटोडायोड डिटेक्टर ( चित्रा 2 में क्यूपीडी) लगाएं। कंडेनसर के पिछले फोकल प्लेन से संयुग्मित विमान में क्यूपीडी का सटीक संरेखण, साथ ही उद्देश्य के पीछे के फोकल प्लेन से संयुग्मित विमान में एओडी, यह सुनिश्चित करेगा कि क्यूपीडी सिग्नल एओडी आवृत्ति से स्वतंत्र होंगे।
    7. माइक्रोमीटर ड्राइव के साथ एक रैखिक अनुवादक पर एओडी माउंट करें और इसे तब तक विस्थापित करें जब तक कि क्रिस्टल किनारा लेजर बीम के करीब न हो जाए। फिर, उद्देश्य को एक आईरिस के साथ बदलें, जो थ्रेडेड ऑब्जेक्टिव हाउसिंग पर केंद्रित है, और ऑब्जेक्टिव बैक एपर्चर आकार को फिट करने के लिए इसके एपर्चर को विनियमित करता है।
    8. अनुवादक को लेजर बीम की ओर ले जाएं जब तक कि पीजो क्रिस्टल द्वारा अवरुद्ध बीम का हिस्सा आईरिस के बाद दिखाई न दे, अनुवादक को थोड़ा पीछे की ओर घुमाएं ताकि बीम को फिर से आईरिस एपर्चर को पूरी तरह से भर दिया जा सके।
    9. दूसरे AOD के लिए चरण 1.1.7-1.1.8 दोहराएँ। कवरस्लिप13 की सतह पर फंसे एक मोती पर बीम को तेजी से स्थानांतरित करते हुए क्यूपीडी से समय अंतराल को मापकर फीडबैक लूप के प्रतिक्रिया समय की जांच करें।
      नोट: उपरोक्त तीन चरण (1.1.7-1-1-9) एओडी क्रिस्टल के सावधानीपूर्वक संरेखण की ओर ले जाते हैं। ये चरण बीम विक्षेपण और प्रतिक्रिया13 दोनों की समय प्रतिक्रिया को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
  2. एक फोटोडायोड के माध्यम से माइक्रोस्कोप प्रवेश द्वार पर ट्रैपिंग लेजर की तीव्रता में उतार-चढ़ाव को मापता है जो 1% से नीचे होना चाहिए। ध्यान दें कि फोटोडायोड बैंडविड्थ इमेजिंग दर से बड़ा होना चाहिए।
  3. दोनों जालों की इंगित स्थिरता की जांच करें।
    1. फॉस्फेट बफर (पीबी) में सिलिका मोतियों को 1 एमएल एसीटोन में 20 μL सिलिका मोतियों (1.2 μm, 10% ठोस पदार्थ) को पतला करके सिलिका मोती तैयार करें, 30 s के लिए सोनिकेट, संक्षेप में भंवर, और 19,000 x g पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सतह पर तैरने वाले को निकालें, एसीटोन के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें, और धोने को दोहराएं। 50 mM PB के 1 mL में पुन: निलंबित करें, 2 बार धोएं। अंत में, 50 mM PB के 100 μL में पुन: निलंबित करें।
    3. प्रवाह कक्ष बनाने के लिए एक डबल-साइडेड टेप (लगभग 60 μm मोटी) के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक कवरस्लिप चिपकाकर सिलिका मोतियों के साथ ऑप्टिकल ट्वीज़र्स अंशांकन करें। 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए (बोवाइन सीरम एल्बुमिन प्रोटीन) के साथ कक्ष भरें और 3 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    4. कक्ष में पीबी में सिलिका मोतियों के 1: 1000 कमजोर पड़ने का प्रवाह करें। कक्ष को सावधानीपूर्वक सील करने के लिए सिलिकॉन ग्रीस से भरे सिरिंज का उपयोग करें। प्रत्येक जाल में एक एकल मोती फंसाएं और उन्हें कैलिब्रेट करने के लिए पावर स्पेक्ट्रम विधि14 लागू करें।
    5. 1-1.5 एमएल एसीटोन, भंवर और सोनिकेट में 30 सेकंड के लिए 20 μL सिलिका मोतियों (1.2 μm व्यास, 10% ठोस) को भंग करके पेंटाइल एसीटेट (कमरे के तापमान पर) में सिलिका मोती तैयार करें।
    6. 2 मिनट के लिए 18,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और एसीटोन के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें, फिर धोने को दोहराएं। 1 एमएल पेंटिल एसीटेट में पुन: निलंबित करें और पेंटिल एसीटेट में 2 बार दोहराएं (सेंट्रीफ्यूज और रीसस्पेंशन)। पेलेट को नाइट्रोसेल्यूलोज 1% और 900 μL पेंटिल एसीटेट के 100 μL में पुन: निलंबित करें। 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. एक 24 x 24 मिमी ग्लास कवरस्लिप लें और इसे शुद्ध इथेनॉल से भिगोए गए कागज से सावधानीपूर्वक साफ करें। फिर, इसे साफ चिमटी के साथ पकड़ते समय, इसे शुद्ध इथेनॉल से सीधे धोकर दूसरी बार कुल्ला करें। इसे नाइट्रोजन के कोमल प्रवाह के तहत सूखने दें। यदि आवश्यक हो, तो कांच की सतह पर सभी दिखाई देने वाले अवशेषों को हटाने के लिए इस ऑपरेशन को दोहराएं।
    8. सिलिका मोतियों का स्टॉक लें, इसे भंवर करें और इसे ~ 30 सेकंड के लिए संक्षेप में लिखें।
    9. एक दूसरे कवरस्लिप (24 x 60 मिमी) को साफ करने के बाद, कवरस्लिप की एक सतह पर सिलिका मोतियों के घोल के 2 μL को मलने के लिए इसका उपयोग करें, और इसे सूखने की प्रतीक्षा करें।
    10. सावधानी से एक माइक्रोस्कोप स्लाइड (26 x 76 मिमी) साफ करें जिसका उपयोग प्रवाह कक्ष बनाने के लिए किया जाएगा।
    11. डबल चिपचिपा टेप की दो लाइनों को काटें (~ 3 मिमी बड़ा, 60-100 μm मोटी) और उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड के एक तरफ संलग्न करें, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।
    12. साफ चिमटी का उपयोग करके, लेपित कवरस्लिप (1.3.9) को चिपचिपे टेप लाइनों के संपर्क में रखकर कक्ष (लगभग 20 μL अंतिम मात्रा) को बंद करें, जिसमें नाइट्रोसेल्यूलोज + मोतियों की परत कक्ष के अंदर की ओर होती है, जैसा कि चित्र 3 ए में दिखाया गया है। प्रवाह कक्ष को 50 एमएम फॉस्फेट बफर के साथ भरें और इसे सिलिकॉन ग्रीस के साथ सील करें।
    13. >1.4 मेगापिक्सेल के साथ चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) या पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक (सीएमओएस) कैमरे का उपयोग करके >200x आवर्धन पर ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी में एक सिलिका मोती की छवि बनाएं। थर्मल बहाव10 की भरपाई के लिए पीजो चरण (नैनोमीटर सटीकता या बेहतर के साथ) को स्थानांतरित करने के लिए एक फीडबैक सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    14. मोती के केंद्र के साथ बाएं जाल के केंद्र को ओवरलैप करें (क्यूपीडी से एक्स-वाई सिग्नल स्तर अंशांकन से मेल खाना चाहिए)। फिर इस जाल के लिए स्थिति के शोर और स्थिति संकेतों के मानक विचलन को मापें।
    15. सही जाल15 के लिए पिछले चरण को दोहराएं।
  4. ट्रैप स्थिति अंशांकन: MHz से nm
    1. कवरस्लिप सतह (1.3.5-1.3.12) और फ्लोटिंग पॉलीस्टाइनिन मोतियों (निम्नलिखित खंड 2.1 में तैयार α-एक्टिनिन संयुग्मित मोतियों का उपयोग करें) पर जुड़े सिलिका मोतियों के साथ एक प्रवाह कक्ष तैयार करें।
    2. कवरस्लिप सतह पर एक सिलिका मोती को क्षेत्र (एफओवी) के केंद्र से थोड़ा विकेंद्रित (~ 5 μm) केंद्रित करें और एफओवी की एक छवि प्राप्त करें। पीजो चरण का उपयोग करके एफओवी केंद्र की ओर मोती को 10 μm तक ले जाएं और एक दूसरी छवि प्राप्त करें। एक केन्द्रक एल्गोरिथ्म या समान का उपयोग करके दो छवियों में मोती के केंद्र की गणना करें और ब्राइटफील्ड कैमरे के एनएम / पिक्सेल अंशांकन प्राप्त करने के लिए दो मोतियों के बीच पिक्सेल में दूरी की गणना करें।
    3. एक एकल तैरते हुए कण को एक जाल में फंसाएं। फिर, छोटे चरणों (0.2 मेगाहर्ट्ज) में एओडी का उपयोग करके जाल को स्थानांतरित करें और प्रत्येक चरण के लिए कण की छवि और एओडी की संबंधित आवृत्ति प्राप्त करें। पहले की तरह केन्द्रक एल्गोरिथ्म का उपयोग करके एफओवी में कण की स्थिति की गणना करें और पिछले चरण में प्राप्त एनएम / पिक्सेल अंशांकन का उपयोग करके इसे एनएम में परिवर्तित करें।
    4. आवृत्ति-स्थिति डेटा के लिए एक रैखिक फिट करें और एनएम / मेगाहर्ट्ज में अंशांकन स्थिरांक की गणना करें।
    5. दूसरे जाल के लिए अंशांकन दोहराएँ
  5. ट्रैप पावर और कठोरता अंशांकन (MHz बनाम W), QPD (MHz बनाम pN / nm)
    1. कवरस्लिप सतह (1.3.5-1.3.12) और फ्लोटिंग पॉलीस्टाइनिन मोतियों (निम्नलिखित खंड 2.1 में तैयार α-एक्टिनिन संयुग्मित मोतियों का उपयोग करें) पर जुड़े सिलिका मोतियों के साथ एक प्रवाह कक्ष तैयार करें और एक एकल कण को एक जाल में फंसाएं। फिर छोटे चरणों (0.2 मेगाहर्ट्ज) में एओडी के माध्यम से दोनों जालों को विस्थापित करें और क्यूपीडी और एओडी की संबंधित आवृत्ति के साथ दोनों जालों में कण की ब्राउनियन गति रिकॉर्ड करें।
    2. प्रत्येक स्थिति में डिटेक्टरों पर एक औसत शक्ति की गणना करें और रिकॉर्ड किए गए ब्राउनियन गति13 के पावर स्पेक्ट्रम में लोरेंत्ज़ियन फ़ंक्शन फिट करके ट्रैप कठोरता और क्यूपीडी अंशांकन निरंतर बीटा प्राप्त करें।

2. नमूना तैयारी

  1. α-एक्टिनिन संयुग्मित फ्लोरोसेंट मोती तैयार करें
    1. संयुग्मन16 करें: अमीनो-कार्यात्मक पॉलीस्टाइनिन मोती (1 μm व्यास, 2.5% ठोस) लें, उन्हें 500 μL आसुत पानी में दो बार धोएं और पीबीएस (पीएच 7.0) के 500 μL में पुन: निलंबित करें। 1 mM HaloTag सक्सिनिमिडिल एस्टर O2 लिगैंड जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस के 500 μL के साथ तीन बार धोएं और 100-200 μM हेलोटैग α-एक्टिनिन के साथ फिर से निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और पीबीएस के 500 μL में तीन बार धोएं (1.5 सप्ताह के भीतर मोतियों का उपयोग करें या तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें)।
    2. लेबलिंग: 10 मिनट के लिए 5 μg / mL अंतिम एकाग्रता पर Rhodamine-BSA के साथ मोतियों के घोल के 200 μL को इनक्यूबेट करें। 50 mM PB के साथ तीन बार धोएं और PB 50 mM के 500 μL में पुन: निलंबित करें। इसे महीनों के लिए - 80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में संग्रहीत किया जा सकता है)।
  2. बायोटिनिलेटेड मायोसिन -5 बी को व्यक्त और शुद्ध करें जैसा कि पहले 4,17 वर्णित है।
  3. पॉलीमराइज़ और लेबल एफ-एक्टिन13:
    1. एफ-एक्टिन पोलीमराइजेशन: अल्ट्राप्योर पानी के 69 μL, एक्टिन पोलीमराइजेशन बफर 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM Guanidine कार्बोनेट pH 7.5), 20 μL G-actin 10 mg/mL, और 1 μL DL-Dithiotéitol (DTT) 1 m से अधिक के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
    2. रोडामाइन के साथ एफ-एक्टिन लेबलिंग (एक्स/ ईएम: 546/575 एनएम): पॉलीमराइज्ड एफ-एक्टिन के 25 μL लें और अल्ट्राप्योर पानी के 19.5 μL, एक्टिन पोलीमराइजेशन बफर 10x (100 mM Tris HCl,20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM gulidine pH 7.5), 1 50 mM ganidine कार्बोनेट pH 7.5, 1 50 mM Rhodamine pH 7.5 का 1 μL का मिश्रण जोड़ें। इसे रात भर बर्फ पर छोड़ दें। ट्रैपिंग प्रयोगों के लिए रोडामाइन एफ-एक्टिन को बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है और एक सप्ताह के भीतर उपयोग किया जा सकता है।
  4. नमूना असेंबली
    1. प्रवाह कक्ष (1.3.5-1.3.12) लें और 5 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल बायोटिनिलेटेड बीएसए को इनक्यूबेट करें। एबी बफर (25 एमएम एमओपीएस, 25 एमएम केसीएल, 4 एमएम एमजीसीएल2, 1 एमएम ईजीटीए, 1 एमएम डीटीटी, पीएच 7.2) से धोने के बाद 5 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टाविडिन को इनक्यूबेट करें और एबी बफर के साथ फिर से धो लें। 5 मिनट के लिए 2 μM कैलमोडुलिन (CaM) के साथ M5B बफर (10 mM MOPS pH 7.3, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN 3) में3 nM सांद्रता पर बायोटिनिलेटेड मायोसिन -5B भारी मेरोमायोसिन को इनक्यूबेट करें। 1 मिलीग्राम / एमएल बायोटिनाइलेटेड बीएसए के तीन संस्करणों के साथ धोएं और एबी में 2 μM CaM के साथ पूरक करें और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. इनक्यूबेटिंग करते समय रिएक्शन मिक्स (आरएम): 0.005% α-एक्टिनिन कार्यात्मक मोतियों (खंड 2.1), 1 एनएम रोडामाइन एफ-एक्टिन (धारा 2.3) इमेजिंग बफर में (आईबी: 1.2 μM ग्लूकोज-ऑक्सीडेज के साथ एबी बफर, 0.2 μM कैटालेस, 17 mM ग्लूकोज, 20 mM DTT, 2 `M CaM और ATP प्रयोग के लिए आवश्यक एकाग्रता पर)।
    3. आरएम के साथ धोएं और सिलिकॉन ग्रीस के साथ कक्ष को सील करें। नमूना अब माइक्रोस्कोप के तहत देखने के लिए तैयार है।

3. माप

  1. डंबल को इकट्ठा करें।
    1. लंबी दूरी के अनुवादकों का उपयोग करके नमूने को स्थानांतरित करके फ्लोटिंग α-एक्टिनिन मोतियों की तलाश करें, एक जाल पर स्विच करें और एक मोती को फंसाएं।
    2. एक बार जब पहला जाल कब्जा कर लिया जाता है, तो अनुवादक को कई मोतियों के फंसने से बचने के लिए कवरस्लिप सतह के करीब फंसे हुए मोती को रखने के लिए ले जाएं, और दूसरे जाल में एक और मोती फंसाएं।
    3. एओडी ध्वनिक तरंगों की शक्ति को समायोजित करके दो जालों को समान कठोरता में समायोजित करें। कठोरता आमतौर पर 0.03 और 0.14 pN / nm के बीच सेट की जाती है। कठोरता जितनी छोटी होती है, बल शोर उतना ही छोटा होता है, विशेष रूप से कम बलों पर।
    4. फिर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर स्विच करने के लिए मोटरचालित दर्पण एम (चित्रा 2) को फ्लिप करें, और लंबी दूरी के अनुवादकोंके माध्यम से नमूने को विस्थापित करके समाधान में तैरने वाले एक्टिन फिलामेंट की तलाश करें। लंबे फिलामेंट्स (>5 μm) को प्राथमिकता दें क्योंकि प्रक्रियात्मक मायोसिन इसे विस्थापित करेगा और अलग होने से पहले इसे कुछ माइक्रोन के लिए स्थानांतरित करेगा।
    5. फंसे हुए मोतियों में से एक को फिलामेंट के एक छोर तक पहुंचने के लिए नमूने को स्थानांतरित करें जब तक कि वे एक दूसरे से जुड़ न जाएं। फिर, मोतियों की दूरी को अनुमानित फिलामेंट लंबाई में समायोजित करें और मंच को अपनी दिशा में स्थानांतरित करके अनबाउंड दूसरे मोती की दिशा में प्रवाह बनाएं। फिलामेंट प्रवाह से फैला होगा और यह अंततः13 से बंध जाएगा। मोती-एक्टिन-मोती परिसर को "डंबल" कहा जाता है।
  2. एक्टिन-मायोसिन संपर्क स्थापित करें।
    1. धीरे-धीरे दो जालों को अलग-अलग करें ताकि फिलामेंट को लगभग 3 pN तक पूर्व-तनाव दिया जा सके और दो एओडी में से एक की आवृत्ति को बदलकर त्रिकोणीय लहर में एक जाल को उतार-चढ़ाव करके डंबल की कठोरता की जांच की जा सके और इसकी स्थिति संकेत के माध्यम से पीछे के मोती में गति के परिणामी संचरण को सत्यापित किया जा सके।
    2. डंबल को पेडस्टल सिलिका बीड की निकटता में रखने के लिए मंच को स्थानांतरित करें और सिलिका मोती व्यास से थोड़ा नीचे फंसे हुए मोती केंद्रों की ऊंचाई को समायोजित करके मोती की सतह पर जुड़े फिलामेंट और प्रोटीन के बीच संपर्क की अनुमति दें। फिर सिलिका मोती के केंद्र को फंसे हुए मोतियों के बीच में रखें।
  3. बल क्लैंप और एनएम स्थिरीकरण प्रतिक्रिया:
    1. 2-3 पीएन बल और 200 एनएम दोलन के साथ अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप पर स्विच करें और एक्टिन फिलामेंट के लंबवत दिशा में लगभग 20-30 एनएम के असतत चरणों में पेडस्टल बीड को स्कैन करें। प्रत्येक स्थिति (कुछ सेकंड) पर बातचीत होने की प्रतीक्षा करें, फिर यदि कोई बातचीत नहीं देखी जाती है तो आगे बढ़ें। जैसा कि प्रोटीन-फिलामेंट इंटरैक्शन स्थापित होता है, उस स्थिति की तलाश करें जहां इंटरैक्शन अधिक बार होते हैं।
    2. सुनिश्चित करें कि जब प्रक्रियात्मक मायोसिन एक्टिन फिलामेंट (आमतौर पर + अंत) के एक छोर की ओर बढ़ता है, तो + अंत से जुड़ा फंसा हुआ मोती सिलिका मोती की ओर बढ़ता है। चरण को फिलामेंट के अंत की ओर ले जाएं ताकि सिलिका मोती फिलामेंट के अंत से जुड़े फंसे हुए मोती के जितना संभव हो उतना करीब हो जब मायोसिन बाध्य नहीं होता है और नैनोमीटर-स्थिरीकरण प्रतिक्रिया शुरू करता है। ऐसा करने में, फिलामेंट के +छोर से जुड़ा फंसा हुआ मोती सिलिका मोती में दुर्घटनाग्रस्त होने की संभावना कम हो जाती है।
  4. डेटा रिकॉर्ड करें.

4. डेटा विश्लेषण4

नोट: विश्लेषण विधि जो वर्णित है, डंबल वेग में परिवर्तन के आधार पर प्रक्रियात्मक रन और तेजी से कदम उठाने की घटनाओं का पता लगाने और माप की अनुमति देती है, जैसा कि मायोसिन स्टेपिंग के कारण होता है। प्रक्रियात्मक रन का विश्लेषण संदर्भ 3,4,13 में वर्णित गैर-प्रक्रियात्मक मोटर्स के लिए डेटा विश्लेषण विधि के आधार पर किया जाता है।

  1. घटना का पता लगाने की अनुमति देने के लिए वेग परिवर्तनों के लिए एक सीमा निर्धारित करें। चूंकि इस मामले में आगे और पीछे दोनों कदमों की उम्मीद है, इसलिए सीमा को पार करना दोनों दिशाओं में स्वीकार किया जाता है।
  2. प्रत्येक चरण को संबंधित रन पर असाइन करें: यदि दो परिणामी चरणों के बीच का समय अंतराल 3 एमएस से कम है और चरणों का आयाम 90 एनएम < है, तो चरणों को एक ही रन को सौंपा जाता है, अन्यथाचरणों को अलग-अलग रन 4 को सौंपा जाता है।
  3. सहायक बलों के लिए सही रन लंबाई4.
    1. निम्नलिखित समीकरण से मापा औसत रन लंबाई मान <आरएल एम> से वास्तविक रन लंबाई मान आरएल की गणना करके बलों की सहायता के तहत सही रन लंबाई, जहां डी दोलन सीमा है:
      Equation 1
      नोट: इस समीकरण की व्युत्पत्ति पर विवरण संदर्भ 4 में पाया जा सकताहै।

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Representative Results

प्रतिनिधि डेटा समय के साथ स्थिति रिकॉर्ड में शामिल होता है जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। स्थिति रिकॉर्ड में दो प्रकार के विस्थापन दिखाई देते हैं। सबसे पहले, जब मायोसिन मोटर एक्टिन फिलामेंट के साथ बातचीत नहीं कर रहा होता है, तो फंसे हुए मोती समाधान के चिपचिपे ड्रैग बल के खिलाफ निरंतर वेग से आगे बढ़ रहे होते हैं, जो त्रिकोणीय तरंग3 में ऑपरेटर द्वारा निर्धारित दोलन सीमा के भीतर एक रैखिक विस्थापन को दर्शाता है (लंबे अस्थायी पैमाने के कारण चित्रा 4 में दिखाई नहीं देता है)। दूसरा, एक बार जब मायोसिन मोटर फिलामेंट के साथ बातचीत करता है तो चलती फिलामेंट द्वारा ले जाया जाने वाला बल बहुत तेजी से प्रोटीन में स्थानांतरित हो जाता है, सिस्टम वेग शून्य (चित्रा 4 में लाल रेखाएं) तक गिर जाता है और रन के अंत तक निरंतर बल के तहत स्टेपिंग घटनाएं होती हैं। जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, बल को प्रतिक्रिया प्रणाली द्वारा सकारात्मक से नकारात्मक दिशा (और इसके विपरीत) में बदल दिया जाता है, जो बल दिशा को बदल देता है जब मोती उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित दोलन सीमा के किनारे तक पहुंचता है। कुछ मामलों में, ऐसा हो सकता है कि, जब मायोसिन फिलामेंट को सकारात्मक दिशा की ओर बांधता और विस्थापित करता है, तो यह मोती को दोलन सीमा के (ऊपरी) किनारे की ओर धकेलता है। यदि यह सहायक बल (यानी, सकारात्मक विस्थापन की ओर निर्देशित, चित्र 5 में, धक्का की ओर निर्देशित) के तहत होता है, तो मायोसिन का रन दोलन किनारे (चित्रा 5 में तीर) पर बल दिशा व्युत्क्रमण द्वारा बाधित होगा, इस प्रकार रन की लंबाई को डंबल दोलन डी के आयाम तक सीमित कर दिया जाएगा। इसके लिए सहायक बल (4.3.1) के मामले में रन की लंबाई में सुधार की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्र 1: यूएफएस का योजनाबद्ध एक प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 बी मोटर पर लागू होता है। (ए) एक एकल मायोसिन -5 बी अणु एक स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन लिंक के माध्यम से ग्लास बीड पेडस्टल से जुड़ा होता है। एक एकल एक्टिन फिलामेंट को α-एक्टिन लेपित मोतियों (तथाकथित "तीन-मोती" ज्यामिति) के बीच निलंबित करके फंसाया जाता है। काले तीर दाएं (एफ1) और बाएं मोती (एफ2) पर दबाए गए बल का प्रतिनिधित्व करते हैं, लाल तीर डंबल पर शुद्ध बल (एफ) का प्रतिनिधित्व करता है। जब मायोसिन एक्टिन के लिए बाध्य नहीं होता है, तो डंबल को एक सीमित दोलन सीमा के भीतर बनाए रखने के लिए एफ को आगे और पीछे वैकल्पिक किया जाता है। (ख) उदाहरण ट्रेस जो डंबल दोलन, मायोसिन-5बी अटैचमेंट के संगत चरणों के दौरान विस्थापन और बल को दर्शाता है, और सहायक (पुश) और प्रतिरोधक (पुल) भार के तहत प्रक्रियात्मक रन करता है। इस आंकड़े को4 से संशोधित किया गया है। 200 kHz नमूना दर पर प्राप्त कच्चे डेटा प्लॉट किए जाते हैं। बल की कक्षा लगभग 0.27 pN है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगात्मक सेटअप की ऑप्टिकल योजना। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप में शामिल हैं: हैलोजन लैंप (एच), कंडेनसर (सी), नमूना (एस), पीजो अनुवादक (एक्स-वाई और जेड), उद्देश्य (ओ), एक कम-आवर्धन कैमरा (सीसीडी 200 एक्स) और एनएम-स्थिरीकरण प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किया जाने वाला एक उच्च-आवर्धन कैमरा (सीसीडी 2000एक्स)। डबल ऑप्टिकल ट्वीज़र्स को डिक्रोइक दर्पण (डी 2 और डी 3) के माध्यम से माइक्रोस्कोप के ऑप्टिकल अक्ष से डाला और निकाला जाता है और इसमें शामिल हैं: एनडी: याग लेजर (1064 एनएम), ऑप्टिकल आइसोलेटर (ओआई), ए / 2 वेवप्लेट, ध्रुवीकरण बीम स्प्लिटर क्यूब्स (पीबीएस), एकोस्टो-ऑप्टिक डिफ्लेक्टर (एओडी), 1064 एनएम इंटरवेंटेंटियल फिल्टर (एफ 1 और एफ 2), क्वाड्रंट डिटेक्टर फोटोडायोड (क्यूडीपी)। क्यूडीपी के संकेतों को एफपीजीए के साथ विस्तृत किया गया था, जो एओडी (बल प्रतिक्रिया) को चलाने वाले दो कस्टम निर्मित प्रत्यक्ष डिजिटल सिंथेसाइज़र (डीडीएस) को भेजा गया था। फ्लोरेसेंस उत्तेजना एक डुप्लिकेट एनडी: याग लेजर (532 एनएम) और इलेक्ट्रॉन गुणा कैमरा (ईएमसीसीडी) पर अनुमानित छवि द्वारा प्रदान की गई थी। एम एक जंगम दर्पण है, एफ 3 एक उत्सर्जन फिल्टर है। इस आंकड़े को 3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: प्रवाह कक्ष विधानसभा। (क) कक्ष की तैयारी। सिलिका मोतियों से सना एक ग्लास कवरस्लिप, डबल चिपचिपा टेप धारियों के माध्यम से माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जोड़ा जाता है ताकि लगभग 20 μL वॉल्यूम का प्रवाह-सेल बनाया जा सके। बी) प्रवाह-सेल का शीर्ष दृश्य। घोल को कक्ष के एक तरफ से पिपेट के साथ उड़ाया जाता है और तीर की दिशा के साथ प्रवाह बनाने के लिए फ़िल्टर पेपर के माध्यम से दूसरी तरफ से चूसा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि स्थिति रिकॉर्डिंग। मायोसिन -5 बी प्रोसेसिव रन और स्टेप एंड रन डिटेक्शन एल्गोरिदम दिखाने वाली स्थिति रिकॉर्डिंग। प्रत्येक रन की शुरुआत और अंत क्रमशः हरे और सियान ऊर्ध्वाधर लाइनों द्वारा इंगित किए जाते हैं। लाल क्षैतिज रेखाएँ पता लगाए गए चरणों को इंगित करती हैं। इस आंकड़े को4 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: मायोसिन रन के दौरान बल व्युत्क्रमण। जब मायोसिन सहायक बल (धक्का) के तहत सकारात्मक दिशा में फिलामेंट को बांधता और स्थानांतरित करता है, तो ऐसा हो सकता है कि यह दोलन सीमा के किनारे तक पहुंच जाता है जहां बल उलट जाता है (तीर द्वारा इंगित), ताकि सहायक बल के तहत चलने वाला मायोसिन बाधित हो। इसके विपरीत, प्रतिरोधक बल (खिंचाव) के तहत, मायोसिन प्रोसेसिव स्टेपिंग डंबल को बल व्युत्क्रम बिंदु तक पहुंचने से रोकता है। इसलिए, बाद के मामले में, प्रतिरोधक बलों के लिए दोलन सीमा द्वारा रन की लंबाई सीमित नहीं है। इस आंकड़े को4 से संशोधित किया गया है। 200 kHz नमूना दर पर प्राप्त कच्चे डेटा प्लॉट किए जाते हैं। बल की कक्षा लगभग 0.27 pN है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यद्यपि एकल अणु तकनीक, जैसे कि तीन-मोती परख, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और कम थ्रूपुट हैं, यूएफएफसीएस डेटा के उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के लिए आणविक इंटरैक्शन का पता लगाने में सुधार करता है। यूएफएफसीएस मोटर प्रोटीन की भार-निर्भरता के अध्ययन की अनुमति देता है, जिसमें बल उत्पादन में शुरुआती और बहुत तेजी से घटनाओं और नियंत्रित बल के तहत कमजोर बाध्यकारी अवस्थाओं की जांच करने के लिए फिलामेंट में मोटर के बंधन पर बल को बहुत तेजी से लागू करने के मुख्य फायदे हैं; पूरे रन के दौरान बल को स्थिर बनाए रखना और बल दिशात्मकता पर पूर्ण नियंत्रण के साथ मोटर निर्भरता की जांच करना। अंतिम बिंदु के बारे में, तीन-मोती ज्यामिति जैसा कि हम यहां उपयोग करते हैं, फिलामेंट दिशा के साथ बलों को लागू करने और मापने में बहुत कुशल है, अनुप्रस्थ या ऊर्ध्वाधर घटकों से योगदान को कम करता है। हालांकि, जब मोटर प्रोटीन को सक्रिय रूप से अनुप्रस्थ या ऊर्ध्वाधर बलों, या यहां तक कि टोक़ का उत्पादन करने की उम्मीद है, तो एकल मोती ज्यामिति जैसे अन्य विन्यास अधिक उपयुक्तहैं 2,7,18। इसके अलावा, इसके स्थानिक और लौकिक संकल्प के लिए धन्यवाद, यूएफएफसीएस आणविक इंटरैक्शन की मूल बातें समझने के लिए एक अद्वितीय उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है जो अन्यथा पारंपरिक एकल-अणु तकनीकों के साथ बाधित होगा। वास्तव में, यूएफएफसीएस ने यह जांचना संभव बना दिया कि कैसे सहायक और प्रतिरोधक बल मायोसिन -5 बी की यांत्रिक प्रतिक्रिया को नियंत्रित करते हैं, इस प्रकार सेल4 में एक्टिन जाल के भीतर इसके सामूहिक व्यवहार में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

हालांकि, इन प्रयोगों की सफलता कुछ महत्वपूर्ण आवश्यकताओं की पूर्ति पर निर्भर करती है जिन्हें इस प्रोटोकॉल में पाए गए सभी निर्देशों का पालन करके बहुत सावधानी से संबोधित किया जाना चाहिए: ऑप्टिकल सेटअप का सटीक संरेखण और अलगाव एक इष्टतम स्थानिक संकल्प तक पहुंचने के लिए मौलिक है; उच्च परिशुद्धता के साथ लागू बलों के मूल्यों को निर्धारित करने के लिए ऑप्टिकल सिस्टम का सावधानीपूर्वक अंशांकन आवश्यक है; उच्च अस्थायी संकल्प तक पहुंचने के लिए एक तेज प्रतिक्रिया प्रणाली की स्थापना आवश्यक है; अंत में नमूना कक्ष में इकट्ठे होने वाले सभी घटकों को एक नियंत्रित वातावरण में तैयार किया जाना चाहिए, उन्हें यथासंभव बाँझ रखना चाहिए, क्योंकि नमूना कक्ष में कोई भी अशुद्धता प्रयोग से समझौता कर सकती है, और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की सफलता के लिए उनके इष्टतम भंडारण और हैंडलिंग के बारे में सभी संकेतों का सख्ती से सम्मान किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, परिणामों की ठीक से व्याख्या करने और कलाकृतियों से बचने के लिए डेटा विश्लेषण को विभिन्न प्रकार के मोटर-फिलामेंट इंटरैक्शन के लिए सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 मोटर्स पर अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप प्रयोगों को करने के लिए सभी चरण शामिल हैं, प्रयोगात्मक उपकरण के सेटअप से नमूना तैयारी, माप और डेटा विश्लेषण तक, जिन्हें विभिन्न प्रकार के अपरंपरागत मायोसिन और प्रक्रियात्मक मोटर्स के अन्य वर्गों जैसे किन्सिन और डायनिन का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा अनुदान समझौते संख्या 871124 लेजरलैब-यूरोप के तहत, इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय (एफआईआरबी "फ्यूचरो इन राइसर्का" 2013 ग्रांट नंबर आरबीएफआर 13 वी 4 एम 2) और एंटे कसा डी रिस्पार्मियो डी फायरेंज़ द्वारा समर्थित किया गया था। ए.वी. काशचुक को ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम क्रॉस-डिसिप्लिनरी फैलोशिप एलटी008/2020-सी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

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References

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जीव विज्ञान अंक 173 अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी ऑप्टिकल ट्वीज़र्स तीन-मोती परख आणविक मोटर्स मायोसिन

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Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

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