Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

L. Gardini; A. V. Kashchuk; F. S. Pavone; M. Capitanio

doi:10.3791/62388

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

1.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/62388

⸱

1. Juli 2021

L. Gardini¹^,² , A. V. Kashchuk²^,³ , F. S. Pavone¹^,²^,³ , M. Capitanio²^,³

¹National Institute of Optics, National Research Council, ²LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, ³Physics Department, University of Florence

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung von ultraschnellen Kraftklemmexperimenten an prozessiven Myosin-5-Motoren vorgestellt, das leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von prozessiven Motoren ausgeweitet werden könnte. Das Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, von der Einrichtung der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zur Datenerfassung und Analyse.

Zusammenfassung

Die Ultrakurzzeit-Kraftklemmenspektroskopie (UFFCS) ist eine auf einer Laserpinzette basierende Einzelmolekültechnik, die es ermöglicht, die Chemomechanik sowohl konventioneller als auch unkonventioneller Myosine unter Last mit bisher unerreichter Zeitauflösung zu untersuchen. Insbesondere die Möglichkeit, Myosinmotoren direkt nach der Aktin-Myosin-Bindungsbildung unter konstanter Kraft zu untersuchen, hat zusammen mit der hohen Rate der Kraftrückkopplung (200 kHz) gezeigt, dass UFFCS ein wertvolles Werkzeug ist, um die Lastabhängigkeit schneller Dynamiken wie des Myosin-Arbeitsschlags zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht UFFCS die Untersuchung, wie prozessive und nicht-prozessive Myosin-Aktin-Wechselwirkungen durch die Intensität und Richtung der angewendeten Kraft beeinflusst werden.

Durch die Befolgung dieses Protokolls wird es möglich sein, ultraschnelle Kraftklemmexperimente an prozessiven Myosin-5-Motoren und an einer Vielzahl von unkonventionellen Myosinen durchzuführen. Durch einige Anpassungen konnte das Protokoll auch leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von Prozessmotoren wie Kinesine und Dyneine ausgedehnt werden. Das Protokoll umfasst alle notwendigen Schritte, vom Aufbau der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zu Kalibrierverfahren, Datenerfassung und Analyse.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten waren optische Pinzetten ein wertvolles Werkzeug, um die Mechanochemie von Proteininteraktionen auf Einzelmolekülebene aufzuklären, da sie die Möglichkeit der gleichzeitigen Manipulation und Messung von Konformationsänderungen und enzymatischer Kinetik ^{auffallen lassen} ^1,2. Insbesondere die Fähigkeit, Kräfte im Bereich molekularer Motoren in der Zelle aufzubringen und zu messen, sowie die Fähigkeit, Konformationsänderungen im Sub-Nanometer-Bereich zu messen, machten optische Pinzetten zu einem einzigartigen Einzelmolekülwerkzeug, um die chemomechanischen Eigenschaften von Motorprotei....