Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Рассечение механоферментных свойств процессивных миозидов с помощью сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь представлен комплексный протокол для проведения сверхбыстрых экспериментов с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5, который можно легко распространить на изучение других классов процессных двигателей. В протоколе подробно описаны все необходимые этапы, от настройки экспериментального аппарата до пробоподготовки, сбора и анализа данных.

Abstract

Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия (UFFCS) представляет собой одномолекулярную методику, основанную на лазерном пинцете, которая позволяет исследовать хемомеханику как обычных, так и нетрадиционных миозинов под нагрузкой с беспрецедентным временным разрешением. В частности, возможность зондирования миозиновых двигателей под постоянной силой сразу после образования актин-миозиновой связи вместе с высокой скоростью силовой обратной связи (200 кГц) показала, что UFFCS является ценным инструментом для изучения зависимости нагрузки от быстрой динамики, такой как рабочий ход миозина. Кроме того, UFFCS позволяет изучать, как процессивные и непроцессные взаимодействия миозин-актин влияют на интенсивность и направление приложенной силы.

Следуя этому протоколу, можно будет проводить сверхбыстрые эксперименты с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5 и на различных нетрадиционных миозинах. Путем некоторых корректировок протокол также может быть легко распространен на изучение других классов процессивных двигателей, таких как кинезины и динеины. Протокол включает в себя все необходимые этапы, от настройки экспериментального аппарата до пробоподготовки, процедур калибровки, сбора и анализа данных.

Introduction

В последние десятилетия оптический пинцет был ценным инструментом для выяснения механохимии белковых взаимодействий на уровне одной молекулы из-за поразительной возможности одновременных манипуляций и измерения конформационных изменений и ферментативной кинетики 1,2. В частности, способность применять и измерять силы в диапазоне сил, оказываемых молекулярными двигателями в клетке, вместе со способностью измерять субнанометровые конформационные изменения сделали оптический пинцет уникальным одномолекулярным инструментом для разгадки хемомеханических свойств моторных белков и их механической регуляции.

Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия (UFFCS) - это метод одномолекулярной силовой спектроскопии, основанный на оптических пинцетах, разработанный для изучения быстрой кинетики молекулярных двигателей под нагрузкой в трехшаровой геометрии (рисунок 1a)3,4. UFFCS сокращает временной лаг для приложения силы к моторному белку до физического предела оптического пинцета, т. е. времени механической релаксации системы, что позволяет быстро прикладывать силу после начала пробега миозина (несколько десятков микросекунд)3. Эта способность была использована для исследования ранних механических событий в быстрых скелетных 3 и сердечных5 мышцах миозина, чтобы выявить зависимость нагрузки от силового удара, слабых и сильных связывающих состояний, а также порядок биохимических (Pi) и механических (powerstroke) событий.

Геометрия из трех шариков обычно используется для изучения непроцессных двигателей, геометрия одного шарика с силовым зажимом обычно используется для исследования процессных нетрадиционных миозинов, таких как миозин Va6. Тем не менее, есть несколько причин, чтобы предпочесть анализ UFFCS с тремя шариками также для процессивных миозинов. Во-первых, быстрое применение нагрузки сразу после связывания актин-миозин позволяет измерять ранние события в развитии силы, как в непроцессных двигателях. Кроме того, в случае процессивных двигателей это также позволяет точно измерять длину хода двигателя и продолжительность хода при постоянном усилии на протяжении всей их прогрессии (рисунок 1b). Кроме того, из-за высокой скорости силовой обратной связи система может поддерживать постоянную силу во время быстрых изменений положения, таких как рабочий ход миозина, тем самым гарантируя постоянную нагрузку во время шага двигателя. Высокое временное разрешение системы позволяет обнаруживать суб-мс взаимодействия, открывая возможность исследования слабого связывания миозина с актином. Наконец, геометрия анализа гарантирует, что сила приложена вдоль актиновой нити, с незначительными поперечными и вертикальными компонентами силы. Этот момент имеет особое значение, поскольку было показано, что вертикальная силовая составляющая существенно влияет на нагрузочную зависимость кинетики двигателя 7,8. Используя эту технику, мы могли бы применить ряд вспомогательных и резистивных нагрузок к процессивному миозину-5B и непосредственно измерить зависимость нагрузки от его процессивности для широкого диапазона сил4.

Как показано на фиг.1а, в этой системе одна актиновая нить подвешена между двумя полистирольными шариками, захваченными в фокусе двойного оптического пинцета («гантели»). Несбалансированная чистая сила F= F1-F 2 накладывается на нить через систему быстрой обратной связи, которая заставляет нить накала двигаться с постоянной скоростью в одном направлении, пока она не достигнет определенной пользователем точки инверсии, где чистая сила обращена в противоположном направлении. Когда моторный белок не взаимодействует с нитью, гантель может свободно перемещаться вперед и назад в форме треугольной волны (рисунок 1b, нижняя панель), охватывающей бусину пьедестала, на которой прикреплен один двигательный белок. Как только взаимодействие установлено, сила, переносимая гантелью, очень быстро передается моторному белку, и двигатель начинает вытеснять нить накала, наступая под интенсивность и направление силы, которые были приложены системой обратной связи во время взаимодействия, пока миозин не отделяется от актина. Поскольку смещение, создаваемое шагом двигателя, зависит от полярности захваченной актиновой нити накала, в зависимости от направления приложенной силы нагрузка может быть либо вспомогательной, т.е. толкающей в том же направлении двигатель смещения (толчок на фиг.1b верхней панели), либо резистивной, т.е. тягой в противоположном направлении по отношению к смещению двигателя (тяга на фиг.1b) верхняя панель), позволяющая изучать хемомеханическую регуляцию двигательной процессности как по интенсивности, так и по направленности приложенной нагрузки.

В следующих разделах полностью описаны все этапы измерения взаимодействий актин-миозин-5В при различных нагрузках с установкой сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии, в том числе 1) настройка оптической установки, выравнивание оптических ловушек и процедуры калибровки, 2) подготовка всех компонентов и их сборка в камере для образцов, 3) процедура измерения, 4) репрезентативные данные и анализ данных для извлечения важных физических параметров, таких как длина пробега, размер шага и скорость моторного белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Оптическая настройка

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная установка состоит из двойного оптического пинцета с нанометровой стабильностью и < колебаниями интенсивности лазера 1%. В этих условиях стабильность гантели на нанометровом уровне гарантируется при типичной жесткости ловушки (0,1 пН/нм) и натяжении (1 пН – несколько десятков пН). На рисунке 2 показана подробная схема оптической установки.

  1. Проектирование и конструирование оптических пинцетов 9,10,11.
    1. Поместите все компоненты установки на оптический стол согласно схеме, показанной на рисунке 2. Обратите внимание, что оптическая таблица включает активные изоляторы для минимизации механических колебаний. Кроме того, структура микроскопа установлена на эластомерных изоляторах для поглощения акустического шума и механических резонансов.
    2. Вставьте оптический изолятор рядом с источником лазера («OI» на рисунке 2), чтобы избежать случайных колебаний амплитуды из-за оптической обратной связи.
    3. Закройте весь путь в закрытой коробке, чтобы уменьшить воздушный ток и турбулентность, которые могут повлиять на стабильность лазерного наведения.
    4. Создайте двойной оптический пинцет, разделив основной лазерный источник (лазер Nd:YAG, длина волны 1064 нм на рисунке 2) на две ветви с ортогональными поляризациями с помощью поляризационных делителей пучка (PBS). Следует избегать ловушек с разделением времени, поскольку они вызывают колебания гантели при натяжении12.
    5. Используйте два акустооптических дефлектора (AOD на рисунке 2), приводимые в действие прямыми цифровыми синтезаторами (DDS), чтобы обеспечить тонкое и быстрое движение двух ловушек и точное регулирование натяжения актина путем непосредственного управления DDS через цифровые выходы с программируемой вентильной решетки FPGA платы (см. Рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время отклика обратной связи должно составлять <10 мкс для быстрой коррекции и поддержания постоянной силы на обеих ловушках во время измерений, включая несвязанное состояние, взаимодействие миозина и движение. С этой целью детекторы положения должны иметь полосу пропускания > = 100 кГц, а данные должны получаться с частотой дискретизации > = 200 кГц. Для каждой полученной точки данных (время сбора 5 мкс) пропорциональные поправки для двух ловушек рассчитываются FPGA и отправляются в два DDS, приводящие в движение AOD. Время отклика AOD должно быть ниже 5 мкс для удовлетворения требуемого времени отклика обратной связи.
    6. Для обнаружения положения захваченных шариков поместите два квадрантных фотодиодных детектора (QPD на рисунке 2) в заднюю фокальную плоскость конденсатора. Точное выравнивание QPD в плоскости, сопряженной с задней фокальной плоскостью конденсатора, а также AOD в плоскости, сопряженной с задней фокальной плоскостью объектива, гарантирует, что сигналы QPD будут независимы от частоты AOD.
    7. Установите AOD на линейный транслятор с микрометровым приводом и смещайте его до тех пор, пока край кристалла не приблизится к лазерному лучу. Затем замените объектив на диафрагму, центрированную на резьбовом корпусе объектива, и отрегулируйте его диафрагму, чтобы соответствовать размеру задней диафрагмы объектива.
    8. Переместите транслятор в сторону лазерного луча до тех пор, пока часть луча, заблокированная пьезокристаллом, не будет видна после диафрагмы, поверните транслятор немного назад, чтобы луч снова полностью заполнил диафрагму диафрагмы.
    9. Повторите шаги 1.1.7-1.1.8 для второго AOD. Проверьте время отклика петли обратной связи, измерив временной лаг от QPD при быстром перемещении луча на бусине, застрявшей на поверхности крышки13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные три этапа (1.1.7-1-1-9) приводят к тщательному выравниванию кристаллов AOD. Эти шаги важны для оптимизации временной реакции как отклонения луча, так и обратной связи13.
  2. С помощью фотодиода измерьте интенсивность колебаний улавливающего лазера на входе в микроскоп, которая должна быть ниже 1%. Обратите внимание, что пропускная способность фотодиода должна быть больше, чем скорость изображения.
  3. Проверьте устойчивость наведения обеих ловушек.
    1. Готовят шарики кремнезема в фосфатном буфере (ПБ), разбавляя 20 мкл шариков кремнезема (1,2 мкм, 10% твердых веществ) в 1 мл ацетона, ультраниката в течение 30 с, кратковременного вихря и центрифуги в течение 2 мин при 19 000 х г.
    2. Удалите супернатант, повторно суспендируйте в 1 мл ацетона и повторите промывку. Повторно суспендировать в 1 мл 50 мМ ПБ, промыть 2 раза. Наконец, повторное суспендирование в 100 мкл 50 мМ ПБ.
    3. Выполните калибровку оптического пинцета с помощью кварцевых шариков, наклеив крышку на предметное стекло микроскопа с помощью двусторонней ленты (толщиной около 60 мкм) для создания проточной камеры. Заполните камеру 1 мг/мл BSA (белок бычьего сывороточного альбумина) и подождите 3 мин.
    4. Поместите в камеру разбавление диоксида кремнезема в ПБ в соотношении 1:1000. Используйте шприц, наполненный силиконовой смазкой, чтобы тщательно запечатать камеру. Задерните одну бусину в каждой ловушке и примените метод14 спектра мощности для их калибровки.
    5. Готовят шарики кремнезема в пентилацетате (при комнатной температуре) путем растворения 20 мкл кварцевого шарика (диаметр 1,2 мкм, 10% твердого вещества) в 1-1,5 мл ацетона, вихря и ультразвука в течение 30 с.
    6. Центрифуга при 18 500 х г в течение 2 мин. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте в 1 мл ацетона, затем повторите промывку. Повторное суспендирование в 1 мл пентилацетата и повторная промывка (центрифуга и ресуспенсация) в пентилацетате 2 раза. Повторно суспендировать гранулу в 100 мкл нитроцеллюлозы 1% и 900 мкл пентилацетата. Хранить при температуре 4 °C в течение 2 месяцев.
    7. Возьмите стеклянную крышку размером 24 x 24 мм и тщательно очистите ее бумагой, пропитанной чистым этанолом. Затем, удерживая его чистым пинцетом, промойте его второй раз, промыв непосредственно чистым этанолом. Дайте ему высохнуть под мягким потоком азота. При необходимости повторите эту операцию, чтобы удалить все видимые остатки на поверхности стекла.
    8. Возьмите кварцевые шарики, вихрьте их и ненадолго обработайте ультразвуком в течение ~ 30 с.
    9. После очистки второго чехла (24 х 60 мм) используйте его, чтобы намазать 2 мкл раствора кварцевых шариков на одну поверхность крышки и подождать, пока он высохнет.
    10. Тщательно очистите предметное стекло микроскопа (26 x 76 мм), которое будет использоваться для создания проточной камеры.
    11. Вырежьте две линии двойной липкой ленты (~3 мм в большую длину, толщиной 60-100 мкм) и прикрепите их на одной стороне слайда микроскопа, как показано на рисунке 3.
    12. Используя чистый пинцет, закройте камеру (конечный объем около 20 мкл), поместив покрытую крышку (1.3.9) в контакт с липкими линиями ленты, при этом слой нитроцеллюлозы + шариков обращен внутрь камеры, как показано на рисунке 3a. Заполните проточную камеру фосфатным буфером 50 мМ и запечатайте ее силиконовой смазкой.
    13. Изобразите один шарик кремнезема в яркой микроскопии при увеличении >200x с помощью устройства с зарядовой связью (CCD) или комплементарной камеры металл-оксид-полупроводник (CMOS) с >1,4 мегапикселя. Используйте программное обеспечение обратной связи для перемещения пьезоступенчатой ступени (с нанометровой точностью или выше), чтобы компенсировать тепловые дрейфы10.
    14. Перекрытие центра левой ловушки с центром шарика (уровни сигнала x-y от QPD должны совпадать с уровнями от калибровки). Затем измерьте шум положения и стандартное отклонение сигналов положения для этой ловушки.
    15. Повторите предыдущий шаг для правой ловушки15.
  4. Калибровка положения ловушки: МГц к нм
    1. Подготовьте проточную камеру с кварцевыми шариками, прикрепленными к поверхности крышки (1.3.5-1.3.12) и плавающими полистирольными шариками (используйте α-актининовые конъюгированные бусины, приготовленные, как в следующем разделе 2.1).
    2. Сфокусируйте диоксид кремния на поверхности крышки, слегка опущенной (~5 мкм) от центра поля зрения (FOV) и получите изображение FOV. Переместите шарик на 10 мкм к центру FOV с помощью пьезо-стадии и получите второе изображение. Рассчитайте центр бусины на двух изображениях с помощью центроидного алгоритма или аналогичного алгоритма и рассчитайте расстояние в пикселях между двумя бусинами, чтобы получить нм/пиксельную калибровку камеры яркого поля.
    3. Поймайте одну плавающую частицу в одну ловушку. Затем перемещайте ловушку с помощью AOD небольшими шагами (0,2 МГц) и получайте изображение частицы и соответствующую частоту AOD для каждого шага. Вычислите положение частицы в FOV с помощью центроидного алгоритма, как и раньше, и преобразуйте ее в нм с помощью калибровки нм/пиксель, полученной на предыдущем шаге.
    4. Выполните линейную подгонку к данным о положении частоты и рассчитайте калибровочную постоянную в нм/МГц.
    5. Повторная калибровка для второй ловушки
  5. Калибровка мощности и жесткости ловушек (МГц против Вт), QPD (МГц против пН/нм)
    1. Подготовьте проточную камеру с шариками кремнезема, прикрепленными к поверхности крышки (1.3.5-1.3.12) и плавающими полистирольными шариками (используйте α-актининовые конъюгированные шарики, приготовленные, как в следующем разделе 2.1), и задерните одну частицу в одной ловушке. Затем вытесняют обе ловушки через AOD небольшими шагами (0,2 МГц) и регистрируют броуновское движение частицы в обеих ловушках с помощью QPD и соответствующей частоты AOD.
    2. Рассчитайте среднюю мощность на детекторах в каждом положении и получите жесткость ловушки и калибровочную константу QPD beta, установив функцию Лоренца в спектр мощности зарегистрированного броуновского движения13.

2. Пробоподготовка

  1. Приготовление α-актининовых конъюгированных флуоресцентных шариков
    1. Выполните сопряжение16: Возьмите аминофункционализированные полистирольные шарики (диаметр 1 мкм, 2,5% твердых веществ), дважды промыть их в дистиллированной воде по 500 мкл и повторно суспендировать в 500 мкл PBS (рН 7,0). Добавляют 1 мМ HaloTag сукцинимидиловый эфир O2 лиганда и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Промыть три раза 500 мкл PBS и повторно суспендировать 100-200 мкМ HaloTag α-актинина. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и промыть три раза в 500 мкл PBS (использовать бусины в течение 1,5 недель или замороженные во вспышке в жидком азоте и хранить при −80 °C).
    2. Маркировка: Инкубировать 200 мкл раствора шариков с родамином-BSA в конечной концентрации 5 мкг/мл в течение 10 мин. Промыть с 50 мМ ПБ три раза и повторно суспендировать в 500 мкл ПБ 50 мМ. Это может храниться в аликвотах при -80 °C в течение нескольких месяцев).
  2. Экспрессируют и очищают биотинилированный миозин-5В, как описано ранее 4,17.
  3. Полимеризация и маркировка F-актина13:
    1. F-актиновая полимеризация: Смешайте 69 мкл сверхчистой воды, 10 мкл буфера полимеризации актина 10x (100 мМ Tris HCl, 20 мМ MgCl2, 500 мМ KCl, 10 мМ АТФ, 50 мМ гуанидина карбоната рН 7,5), 20 мкл G-актина 10 мг/мл и 1 мкл DL-дитиотрейтола (DTT) 1 М. Оставьте его на льду более чем на 1 ч.
    2. Маркировка F-актина родамином (Ex/Em: 546/575 нм): Возьмите 25 мкл полимеризованного F-актина и добавьте 19,5 мкл сверхчистой воды, 2,5 мкл буфера полимеризации актина 10x (100 мМ Tris HCl, 20 мМ MgCl2, 500 мМ KCl, 10 мМ АТФ, 50 мМ гуанидина карбоната рН 7,5), 1 мкл 1 М DTT и 2 мкл 250 мкМ родамин фаллоидина. Оставьте его на льду на ночь. Для экспериментов по улавливанию родамин F-актин можно хранить на льду и использовать в течение недели.
  4. Образец сборки
    1. Возьмите проточную камеру (1.3.5-1.3.12) и инкубируйте 1 мг/мл биотинилированного BSA в течение 5 мин. После промывки AB-буфером (25 мМ MOPS, 25 мМ KCl, 4mM MgCl2, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, рН 7,2) инкубируют 1 мг/мл стрептавидина в течение 5 мин и снова промывают AB-буфером. Инкубировать биотинилированный миозин-5В тяжелый меромиозин при концентрации 3 нМ в буфере M5B (10 мМ MOPS pH 7,3, 0,5 М NaCl, 0,1 мМ EGTA, 3 мМ NaN3) с 2 мкМ Калмодулина (CaM) в течение 5 мин. Промыть тремя объемами 1 мг/мл биотинилированного BSA с добавлением 2 мкМ CaM в AB и инкубировать в течение 3 мин.
    2. При инкубации готовят реакционную смесь (RM): 0,005% α-актинин функционализированных шариков (раздел 2.1), 1 нМ родамин F-актина (раздел 2.3) в буфере визуализации (IB: БУФЕР AB с 1,2 мкМ глюкозо-оксидазы, 0,2 мкМ каталазы, 17 мМ глюкозы, 20 мМ DTT, 2 мкМ CaM и АТФ при концентрации, необходимой для эксперимента).
    3. Промыть с помощью RM и запечатать камеру силиконовой смазкой. Теперь образец готов к просмотру под микроскопом.

3. Измерение

  1. Соберите гантель.
    1. Ищите плавающие бусины α-актинина, перемещая образец с помощью дальнобойных трансляторов, включите одну ловушку и поймайте одну бусину.
    2. Как только первая ловушка занята, переместите переводчик, чтобы расположить захваченную бусину близко к поверхности крышки, чтобы избежать захвата нескольких бусин, и поймайте еще одну бусину во второй ловушке.
    3. Отрегулируйте две ловушки до одинаковой жесткости, регулируя мощность акустических волн AOD. Жесткость обычно устанавливается между 0,03 и 0,14 пН/нм. Чем меньше жесткость, тем меньше силовой шум, в частности при низких силах.
    4. Затем переверните моторизованное зеркало M (фиг.2), чтобы переключиться на флуоресцентную микроскопию, и найдите актиновую нить, плавающую в растворе, вытеснив образец через дальнобойные трансляторы13. Предпочитайте длинные нити (>5 мкм), так как процессивный миозин вытеснит его и переместит на несколько микрон перед отсоединением.
    5. Переместите образец, чтобы одна из захваченных бусин приблизилась к одному концу нити, пока они не прикрепятся друг к другу. Затем отрегулируйте расстояние бусин на приблизительную длину нити и создайте поток в направлении несвязанной второй бусины, переместив ступень в ее направлении. Нить будет растягиваться потоком, и она в конечном итоге свяжется с ней13. Комплекс бисероплетение-актин-бисероплетение называется «гантели».
  2. Установить контакт актин-миозин.
    1. Осторожно разделите две ловушки далеко друг от друга, чтобы предварительно натянуть нить накала примерно до 3 пН и прощупайте жесткость гантели, заставив одну ловушку колебаться в треугольной волне, изменяя частоту одного из двух AOD и проверяя последующую передачу движения на заднюю бусину через ее сигнал положения.
    2. Переместите сцену, чтобы поместить гантель в непосредственной близости от пьедестала кварцевой бусины и разрешить контакт между нитью и белком, прикрепленным к поверхности бусины, регулируя высоту захваченных центров бусин немного ниже диаметра кварцевой бусины. Затем расположите центр кварцевой бусины между захваченными бусинами.
  3. Усилие зажима и обратная связь стабилизации нм:
    1. Включите сверхбыстрый силовой зажим с силой 2-3 пН и колебаниями 200 нм и просканируйте бусину пьедестала дискретными шагами около 20-30 нм в направлении, перпендикулярном актиновой нити. Подождите, пока взаимодействия произойдут в каждой позиции (несколько секунд), а затем сделайте шаг вперед, если взаимодействие не наблюдается. По мере установления взаимодействия белка с нитью найдите положение, в котором взаимодействия происходят чаще.
    2. Убедитесь, что когда процессивный миозин движется к одному концу актиновой нити (обычно к концу +), захваченная шарик, прикрепленная к концу +, движется к кварцевому шарику. Переместите стадию к концу нити накаливания так, чтобы шарик кремнезема лежал как можно ближе к захваченному шарику, прикрепленному к -концу нити, когда миозин не связан, и запустите нанометровую стабилизационную обратную связь. При этом вероятность того, что захваченная бусина, прикрепленная к +концу нити накала, врезается в кварцевый шарик, сводится к минимуму.
  4. Запись данных.

4. Анализ данных4

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный метод анализа позволяет обнаруживать и измерять процессивные пробежки и события быстрого шага на основе изменений скорости гантелей, вызванных шагом миозина. Анализ технологических прогонов выполняется на основе метода анализа данных для непроцессных двигателей, описанного в ссылках 3,4,13.

  1. Установите пороговое значение для изменения скорости, чтобы обеспечить обнаружение событий шага. Поскольку в этом случае ожидаются как прямые, так и обратные шаги, пересечение порога принимается в обе стороны.
  2. Назначьте каждый шаг соответствующему прогону: если временной интервал между двумя последующими шагами короче 3 мс, а амплитуда шагов < 90 нм, шаги назначаются одному и тому же прогону, в противном случае шаги назначаются разным прогонам4.
  3. Правильная длина пробега для вспомогательных сил4.
    1. Корректируйте длины пробега при вспомогательных силах, вычисляя реальное значение длины пробега RL из измеренного среднего значения длины пробега <RLm> из следующего уравнения, где D — диапазон колебаний:
      Equation 1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о выводе этого уравнения можно найти в ссылке4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные данные состоят из записей позиций с течением времени, как показано на рисунке 4. В позиционной записи видны два вида смещения. Во-первых, когда миозиновый двигатель не взаимодействует с актиновой нитью, захваченные шарики движутся с постоянной скоростью против вязкой силы сопротивления раствора, показывая линейное смещение, колеблющееся в диапазоне колебаний, заданном оператором в треугольной волне3 (не видно на рисунке 4 из-за длинной временной шкалы). Во-вторых, как только миозиновый двигатель взаимодействует с нитью, сила, переносимая движущейся нитью, очень быстро передается белку, скорость системы падает до нуля (красные линии на рисунке 4), и события шага происходят при постоянной силе до конца пробега. Как показано на рисунке 5, сила переключается с положительного на отрицательное направление (и наоборот) системой обратной связи, которая переключает направление силы, когда шарик достигает края диапазона колебаний, заданного пользователем. В некоторых случаях может случиться так, что, когда миозин связывает и смещает нить накала в положительном направлении, он толкает шарик к (верхнему) краю диапазона колебаний. Если это происходит при вспомогательной силе (т.е. направленной на положительное смещение, толчок, на рисунке 5), то прогон миозина будет прерван инверсией направления силы на краю колебания (стрелки на рисунке 5), тем самым ограничивая длину пробега амплитудой колебаний гантели D. Это требует коррекции длины пробега в случае вспомогательной силы (4.3.1).

Figure 1
Рисунок 1: Схема UFFCS, нанесенного на процессивный двигатель миозина-5B. (a) Одна молекула миозина-5B прикреплена к стеклянному бусиновому пьедесталу через связь стрептавидин-биотин. Одна актиновая нить захватывается путем подвешивания ее между бусинами, покрытыми α актинином (так называемая геометрия «трех бусин»). Черные стрелки представляют силу, зажатую на правой (F1) и левой бусине (F2), красная стрелка представляет чистую силу (F) на гантели. F чередуется взад и вперед, чтобы поддерживать гантель в ограниченном диапазоне колебаний, когда миозин не связан с актином. b) пример трассировки, показывающий смещение и силу во время соответствующих фаз колебаний гантелей, прикрепления миозина-5В и процессивных пробежек при вспомогательных (толкающих) и резистивных (тянущих) нагрузках. Эта цифра была изменена с4. Необработанные данные, полученные при частоте дискретизации 200 кГц, строятся на график. Std. Dev. силы составляет около 0,27 пН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Оптическая схема экспериментальной установки. Оптический микроскоп состоит из: галогенной лампы (H), конденсатора (C), образца (S), пьезотрансляторов (x-y и z), объектива (O), камеры с низким увеличением (CCD 200X) и камеры с высоким увеличением (CCD 2000X), используемой для обратной связи стабилизации нм. Двойной оптический пинцет вставляется и извлекается из оптической оси микроскопа через дихроичные зеркала (D2 и D3) и включает в себя: лазер Nd:YAG (1064 нм), оптический изолятор (OI), волновые пластины λ/2, кубы поляризационного делителя пучка (PBS), акустооптические дефлекторы (AOD), интерферентные фильтры 1064 нм (F1 и F2), квадрантные детекторные фотодиоды (QDP). Сигналы от QDP были разработаны с помощью FPGA, отправленной на два специально построенных прямых цифровых синтезатора (DDS), приводящих в движение AOD (силовая обратная связь). Флуоресцентное возбуждение обеспечивалось дублированным лазером Nd:YAG (532 нм) и изображением, проецируемым на электронно-умноженную камеру (EMCCD). M - подвижное зеркало, F3 - эмиссионный фильтр. Эта цифра была изменена с 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Сборка проточной камеры. (a) Подготовка камеры. Стеклянная крышка, смазанная шариками кремнезема, прикреплена к слайду микроскопа через двойные липкие ленточные полосы, чтобы сформировать проточную ячейку объемом около 20 мкл. б) Вид сверху проточной ячейки. Растворы летят с одной стороны камеры пипеткой и всасывают с другой стороны через фильтровальную бумагу, чтобы создать поток вдоль направления стрелки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Регистрация репрезентативной позиции. Запись положения, показывающая процессные прогоны миозина-5B и алгоритм обнаружения шага и запуска. Обнаруженные начало и конец каждого прогона обозначены зелеными и голубыми вертикальными линиями соответственно. Красными горизонтальными линиями обозначены обнаруженные шаги. Эта цифра была изменена с4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Инверсия силы во время прогонов миозина. Когда миозин связывается и перемещает нить в положительном направлении под действием вспомогательной силы (толчка), может случиться так, что она достигает края диапазона колебаний, где сила обращена вспять (обозначена стрелками), так что бег миозина под вспомогательной силой прерывается. Напротив, при резистивной силе (тяге) процессивное ступенчатое действие миозина не позволяет гантели достичь точки инверсии силы. Поэтому в последнем случае длины пробега не ограничиваются диапазоном колебаний для резистивных сил. Эта цифра была изменена с4. Необработанные данные, полученные при частоте дискретизации 200 кГц, строятся на график. Std. Dev. силы составляет около 0,27 пН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя методы с одной молекулой, такие как трехшарновый анализ, технически сложны и имеют низкую пропускную способность, UFFCS улучшает обнаружение молекулярных взаимодействий благодаря высокому соотношению сигнал/шум данных. UFFCS позволяет изучать нагрузочно-зависимость моторных белков, с основными преимуществами очень быстрого приложения силы при связывании двигателя с нитью накала для зондирования ранних и очень быстрых событий в производстве силы и слабых состояний связывания при контролируемой силе; поддержание постоянного усилия на протяжении всего пробега и зондирование зависимости двигателя с полным контролем направленности силы. Что касается последнего пункта, геометрия трех шариков, которую мы используем здесь, очень эффективна в применении и измерении сил вдоль направления нити накала, сводя к минимуму вклад поперечных или вертикальных компонентов. Однако, когда ожидается, что двигательный белок будет активно производить поперечные или вертикальные силы или даже крутящие моменты, другие конфигурации, такие как геометрия одного шарика, более уместны 2,7,18. Кроме того, благодаря своему пространственному и временному разрешению, UFFCS представляет собой уникальный инструмент для понимания основ молекулярных взаимодействий, которые в противном случае были бы затруднены обычными одномолекулярными методами. Фактически, UFFCS позволил исследовать, как ассистивные и резистивные силы регулируют механическую реакцию миозина-5B, тем самым давая новое представление о его коллективном поведении в актиновой сетке в клетке4.

Однако успех этих экспериментов зависит от выполнения некоторых важных требований, которые должны быть выполнены очень тщательно, следуя всем инструкциям, содержащимся в этом протоколе: точное выравнивание и изоляция оптической установки имеет основополагающее значение для достижения оптимального пространственного разрешения; тщательная калибровка оптической системы необходима для определения значений приложенных сил с высокой точностью; настройка системы быстрой обратной связи необходима для достижения высокого временного разрешения; наконец, все компоненты, собранные в камере для отбора проб, должны быть подготовлены в контролируемой среде, сохраняя их как можно более стерильными, поскольку любая примесь в камере для отбора проб может поставить под угрозу эксперимент, и все указания на их оптимальное хранение и обработку должны строго соблюдаться для успеха экспериментального протокола. Важно отметить, что анализ данных должен быть тщательно адаптирован к различным видам взаимодействия двигателя и нити накала, чтобы правильно интерпретировать результаты и избегать артефактов.

В этот протокол включены все этапы для выполнения сверхбыстрых экспериментов с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5, от настройки экспериментального аппарата до подготовки образцов, измерения и анализа данных, которые могут быть удобно адаптированы для изучения различных нетрадиционных миозинов и других классов процессивных двигателей, таких как кинезины и динеины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках Грантового соглашения No 871124 Laserlab-Europe, Министерством университетов и исследований Италии (грант FIRB «Futuro in Ricerca» 2013 года No RBFR13V4M2) и Ente Cassa di Risparmio di Firenze. А.В. Кащук получил поддержку междисциплинарной стипендии Human Frontier Science Program Lt008/2020-C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Tags

Биология выпуск 173 сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия оптический пинцет трехшариковый анализ молекулярные двигатели миозин

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Рассечение механоферментных свойств процессивных миозидов с помощью сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter