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Biology

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Abstract

La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza (UFFCS) es una técnica de molécula única basada en pinzas láser que permite la investigación de la quimiomecánica de miosinas convencionales y no convencionales bajo carga con una resolución de tiempo sin precedentes. En particular, la posibilidad de sondear motores de miosina bajo fuerza constante justo después de la formación del enlace actina-miosina, junto con la alta tasa de retroalimentación de fuerza (200 kHz), ha demostrado que UFFCS es una herramienta valiosa para estudiar la dependencia de la carga de dinámicas rápidas como la carrera de trabajo de la miosina. Además, UFFCS permite el estudio de cómo las interacciones miosina-actina procesivas y no procesivas están influenciadas por la intensidad y la dirección de la fuerza aplicada.

Siguiendo este protocolo, será posible realizar experimentos ultrarrápidos de fuerza-pinza en motores de miosina 5 procesiva y en una variedad de miosinas no convencionales. Mediante algunos ajustes, el protocolo también podría extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso como quinesinas y dineínas. El protocolo incluye todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, procedimientos de calibración, adquisición de datos y análisis.

Introduction

En las últimas décadas, las pinzas ópticas han sido una herramienta valiosa para dilucidar la mecanoquímica de las interacciones de proteínas a nivel de molécula única, debido a la sorprendente posibilidad de manipulación concurrente y medición de cambios conformacionales y cinética enzimática 1,2. En particular, la capacidad de aplicar y medir fuerzas en el rango de las ejercidas por los motores moleculares en la célula, junto con la capacidad de medir cambios conformacionales subnanométricos, hicieron de las pinzas ópticas una herramienta única de una sola molécula para desentrañar las propiedades quimiomecánicas de las proteínas motoras y su regulación mecánica.

La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza (UFFCS) es una técnica de espectroscopia de fuerza de molécula única basada en pinzas ópticas, desarrollada para estudiar la cinética rápida de motores moleculares bajo carga en una geometría de tres perlas (Figura 1a)3,4. UFFCS reduce el tiempo de aplicación de fuerza a la proteína motora hasta el límite físico de las pinzas ópticas, es decir, el tiempo de relajación mecánica del sistema, permitiendo así la aplicación de la fuerza rápidamente después del comienzo de una carrera de miosina (pocas decenas de microsegundos)3. Esta capacidad se ha explotado para investigar los eventos mecánicos tempranos en la miosina del músculo esquelético 3 rápido y elmúsculo 5 cardíaco para revelar la dependencia de la carga de la carrera de potencia, los estados de unión débil y fuerte, así como el orden de los eventos bioquímicos (Pi) y mecánicos (carrera de potencia).

La geometría de tres perlas se emplea generalmente para estudiar motores no procesivos, una geometría de una sola perla con una abrazadera de fuerza se ha utilizado comúnmente para investigar miosinas procesivas no convencionales como la miosina Va6. Sin embargo, hay varias razones para preferir un ensayo UFFCS de tres perlas también para miosinas procesivas. En primer lugar, la rápida aplicación de la carga justo después de la unión actina-miosina permite la medición de los primeros eventos en el desarrollo de la fuerza como en los motores no procesivos. Además, en el caso de los motores de proceso, también permite una medición precisa de las longitudes de funcionamiento del motor y las duraciones de funcionamiento bajo fuerza constante a lo largo de su progresión (Figura 1b). Además, debido a la alta tasa de retroalimentación de fuerza, el sistema puede mantener la fuerza constante durante los cambios rápidos de posición, como la carrera de trabajo de la miosina, garantizando así una carga constante durante el paso del motor. La alta resolución temporal del sistema permite la detección de interacciones sub-ms, abriendo la posibilidad de investigar la unión débil de la miosina a la actina. Finalmente, la geometría del ensayo garantiza que la fuerza se aplique a lo largo del filamento de actina, con componentes transversales y verticales insignificantes de la fuerza. Este punto es de particular relevancia ya que se ha demostrado que el componente de fuerza vertical influye significativamente en la dependencia de la carga de la cinética del motor 7,8. Mediante el uso de esta técnica, podríamos aplicar un rango de cargas asistenciales y resistivas a la miosina-5B procesiva y medir directamente la dependencia de la carga de su procesividad para un amplio rango de fuerzas4.

Como se muestra en la Figura 1a, en este sistema un solo filamento de actina está suspendido entre dos perlas de poliestireno atrapadas en el foco de pinzas ópticas dobles (la "mancuerna"). Una fuerza neta desequilibrada F = F1-F 2 se impone sobre el filamento, a través de un sistema de retroalimentación rápida, que hace que el filamento se mueva a velocidad constante en una dirección hasta que alcanza un punto de inversión definido por el usuario donde la fuerza neta se invierte en la dirección opuesta. Cuando la proteína motora no está interactuando con el filamento, la mancuerna es libre de moverse hacia adelante y hacia atrás en forma de onda triangular (Figura 1b, panel inferior) que abarca el cordón del pedestal en el que se une una sola proteína motora. Una vez que se establece la interacción, la fuerza transportada por la mancuerna se transfiere muy rápidamente a la proteína motora y el motor comienza a desplazar el filamento al paso por debajo de la intensidad de fuerza y la dirección que aplicó el sistema de retroalimentación en el momento de la interacción, hasta que la miosina se separa de la actina. Dado que el desplazamiento producido por el paso del motor depende de la polaridad del filamento de actina atrapado, según la dirección de la fuerza aplicada, la carga puede ser asistencial, es decir, empujando en la misma dirección del desplazamiento del motor (empuje en el panel superior de la Figura 1b), o resistiva, es decir, tirando en la dirección opuesta con respecto al desplazamiento del motor (tire en la Figura 1b panel superior) que permite estudiar la regulación quimiomecánica de la procesividad del motor tanto por la intensidad como por la direccionalidad de la carga aplicada.

En las siguientes secciones se describen completamente todos los pasos para medir las interacciones actina-miosina-5B bajo diferentes cargas con una configuración de espectroscopia de fuerza-abrazadera ultrarrápida, incluyendo 1) la configuración de la configuración óptica, la alineación de trampas ópticas y los procedimientos de calibración, 2) las preparaciones de todos los componentes y su ensamblaje en la cámara de muestra, 3) el procedimiento de medición, 4) Datos representativos y análisis de datos para extraer parámetros físicos importantes, como la longitud de la carrera, el tamaño del paso y la velocidad de la proteína motora.

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Protocol

1. Configuración óptica

NOTA: La configuración experimental se compone de pinzas ópticas dobles con estabilidad de apuntamiento nanométrico y < fluctuaciones de intensidad láser del 1%. En estas condiciones, la estabilidad de la mancuerna a nivel nanométrico está garantizada bajo la rigidez típica de la trampa (0,1 pN/nm) y la tensión (1 pN - pocas decenas de pN). La figura 2 muestra un esquema detallado de la configuración óptica.

  1. Diseño y construcción de pinzas ópticas 9,10,11.
    1. Coloque todos los componentes de la configuración en una tabla óptica de acuerdo con el esquema de la Figura 2. Tenga en cuenta que la mesa óptica incluye aisladores activos para minimizar las vibraciones mecánicas. Además, la estructura del microscopio está montada en aisladores elastoméricos para absorber el ruido acústico y las resonancias mecánicas.
    2. Inserte un aislador óptico cerca de la fuente láser ("OI" en la Figura 2), para evitar fluctuaciones de amplitud aleatorias debido a la retroalimentación óptica.
    3. Selle toda la trayectoria en una caja cerrada para reducir la corriente de aire y las turbulencias que podrían afectar la estabilidad del apuntamiento del láser.
    4. Cree las pinzas ópticas dobles dividiendo la fuente láser principal (láser Nd: YAG, longitud de onda de 1,064 nm en la Figura 2) en dos ramas con polarizaciones ortogonales mediante el uso de divisores de haz polarizador (PBS). Las trampas de tiempo compartido deben evitarse porque inducen la oscilación de la mancuerna bajo tensión12.
    5. Utilice dos deflectores acústico-ópticos (AOD en la Figura 2) accionados por sintetizadores digitales directos (DDS) para permitir movimientos finos y rápidos de las dos trampas y una regulación precisa de la tensión de actina al conducir directamente los DDS a través de las salidas digitales de la placa FPGA de matriz de puertas programable en campo (consulte la Figura 2).
      NOTA: El tiempo de respuesta de retroalimentación general debe ser de <10 μs para corregir rápidamente y mantener una fuerza constante en ambas trampas durante las mediciones, incluido el estado no unido, la interacción con la miosina y el movimiento. Para ello, los detectores de posición deberán tener una anchura de banda >= 100 kHz y los datos deberán adquirirse a una frecuencia de muestreo de >= 200 kHz. Para cada punto de datos adquirido (tiempo de adquisición de 5 μs), las correcciones proporcionales para las dos trampas son calculadas por el FPGA y enviadas a los dos DDS que impulsan los AOD. El tiempo de respuesta AOD debe ser inferior a 5 μs para satisfacer el tiempo de respuesta de retroalimentación requerido.
    6. Para la detección nm de la posición de las perlas atrapadas, coloque dos detectores de fotodiodos del cuadrante (QPD en la Figura 2) en el plano focal posterior del condensador. La alineación precisa de los QPD en un plano conjugado con el plano focal posterior del condensador, así como los AOD en un plano conjugado con el plano focal posterior del objetivo, asegurará que las señales de QPD sean independientes de la frecuencia de los AOD.
    7. Monte el AOD en un traductor lineal con accionamiento micrométrico y desplácelo hasta que el borde del cristal se acerque al rayo láser. Luego, reemplace el objetivo con un iris, centrado en la carcasa del objetivo roscada, y regule su apertura para que se ajuste al tamaño de la apertura posterior del objetivo.
    8. Mueva el traductor hacia el rayo láser hasta que la porción del haz bloqueada por el cristal piezoeléctrico sea visible después del iris, gire el traductor ligeramente hacia atrás para que el rayo vuelva a llenar completamente la abertura del iris.
    9. Repita los pasos 1.1.7-1.1.8 para el segundo AOD. Compruebe el tiempo de respuesta del bucle de retroalimentación midiendo el retraso de tiempo de los QPD mientras mueve rápidamente una viga en un cordón atascado en la superficie del cubreobjetos13.
      NOTA: Los tres pasos anteriores (1.1.7-1-1-9) conducen a la alineación cuidadosa de los cristales de AOD. Estos pasos son importantes para optimizar el tiempo de respuesta tanto de la deflexión del haz como de la retroalimentación13.
  2. Por medio de un fotodiodo medir las fluctuaciones de intensidad del láser de captura en la entrada del microscopio que debe ser inferior al 1%. Tenga en cuenta que el ancho de banda del fotodiodo debe ser mayor que la velocidad de imagen.
  3. Compruebe la estabilidad de apuntamiento de ambas trampas.
    1. Preparar perlas de sílice en tampón fosfato (PB) diluyendo 20 μL de perlas de sílice (1,2 μm, 10% de sólidos) en 1 ml de acetona, sonicado durante 30 s, vórtice brevemente y centrifugación durante 2 min a 19.000 x g.
    2. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender en 1 ml de acetona y repita el lavado. Resuspender en 1 mL de 50 mM PB, lavar 2 veces. Finalmente, resuspender en 100 μL de 50 mM PB.
    3. Realice la calibración de pinzas ópticas con perlas de sílice pegando un cubreobjetos en un portaobjetos de microscopio con una cinta de doble cara (aproximadamente 60 μm de espesor) para construir una cámara de flujo. Llene la cámara con una BSA (proteína de albúmina sérica bovina) de 1 mg / ml y espere 3 minutos.
    4. Fluya una dilución 1:1000 de perlas de sílice en PB en la cámara. Use una jeringa llena de grasa de silicona para sellar cuidadosamente la cámara. Atrape una sola cuenta en cada trampa y aplique el método de espectro de potencia14 para calibrarlas.
    5. Preparar perlas de sílice en acetato de pentilo (a temperatura ambiente) disolviendo 20 μL de perlas de sílice (1,2 μm de diámetro, 10% sólidas) en 1-1,5 ml de acetona, vórtice y sonicado durante 30 s.
    6. Centrifugadora a 18.500 x g durante 2 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 ml de acetona, luego repita el lavado. Resuspender en 1 ml de acetato de pentilo y repetir el lavado (centrífuga y resuspensión) en acetato de pentilo 2 veces. Resuspender el pellet en 100 μL de nitrocelulosa al 1% y 900 μL de acetato de pentilo. Conservar a 4 °C durante 2 meses.
    7. Tome un cubreobjetos de vidrio de 24 x 24 mm y límpielo cuidadosamente con papel empapado con etanol puro. Luego, mientras lo sostiene con pinzas limpias, enjuáguelo por segunda vez lavándolo directamente con etanol puro. Dejar secar bajo un suave flujo de nitrógeno. Si es necesario, repita esta operación para eliminar todos los residuos visibles en la superficie del vidrio.
    8. Tome el stock de perlas de sílice, vórtice y sonicarlo brevemente durante ~ 30 s.
    9. Después de limpiar un segundo cubreobjetos (24 x 60 mm), úselo para untar 2 μL de solución de perlas de sílice en una superficie del cubreobjetos y espere a que se seque.
    10. Limpie cuidadosamente un portaobjetos de microscopio (26 x 76 mm) que se utilizará para crear la cámara de flujo.
    11. Corte dos líneas de cinta adhesiva doble (~3 mm de largo, 60-100 μm de grosor) y colóquelas en un lado del portaobjetos del microscopio, como se muestra en la Figura 3.
    12. Mediante el uso de pinzas limpias, cerrar la cámara (aproximadamente 20 μL de volumen final) poniendo el cubreobjetos recubierto (1.3.9) en contacto con las líneas adhesivas de la cinta, con la capa de nitrocelulosa + perlas hacia el interior de la cámara, como se muestra en la figura 3a. Llene la cámara de flujo con tampón de fosfato de 50 mM y séllela con grasa de silicona.
    13. Imagine una sola perla de sílice en microscopía de campo claro con un aumento de >200x utilizando un dispositivo de carga acoplada (CCD) o una cámara complementaria de semiconductor de óxido metálico (CMOS) con >1.4 megapíxeles. Utilice un software de retroalimentación para mover la etapa piezoeléctrica (con precisión nanométrica o mejor) para compensar las derivas térmicas10.
    14. Superponga el centro de la trampa izquierda con el centro del talón (los niveles de señal x-y del QPD deben coincidir con los de la calibración). Luego mida el ruido de posición y la desviación estándar de las señales de posición para esta trampa.
    15. Repita el paso anterior para la trampa derecha15.
  4. Calibración de la posición de la trampa: MHz a nm
    1. Preparar una cámara de flujo con perlas de sílice adheridas a la superficie del cubreobjetos (1.3.5-1.3.12) y perlas flotantes de poliestireno (utilizar perlas conjugadas α-actinina preparadas como en el siguiente punto 2.1).
    2. Enfoque una cuenta de sílice en la superficie del cubreobjetos ligeramente descentrada (~ 5 μm) del centro del campo de visión (FOV) y adquiera una imagen del FOV. Mueva la cuenta 10 μm hacia el centro FOV utilizando la etapa piezoeléctrica y adquiera una segunda imagen. Calcule el centro de la cuenta en las dos imágenes utilizando un algoritmo centroide o similar y calcule la distancia en píxeles entre las dos cuentas para obtener la calibración nm/píxel de la cámara de campo claro.
    3. Atrapa una sola partícula flotante en una trampa. Luego, mueva la trampa usando AOD en pequeños pasos (0.2 MHz) y adquiera una imagen de la partícula y la frecuencia correspondiente de la AOD para cada paso. Calcule la posición de la partícula en el campo de visión utilizando el algoritmo centroide como antes y conviértala en nm utilizando la calibración nm/píxel obtenida en el paso anterior.
    4. Realice un ajuste lineal a los datos de posición de frecuencia y calcule la constante de calibración en nm/MHz.
    5. Repita la calibración para la segunda trampa
  5. Calibración de potencia y rigidez de trampa (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
    1. Preparar una cámara de flujo con perlas de sílice fijadas en la superficie del cubreobjetos (1.3.5-1.3.12) y perlas flotantes de poliestireno (utilizar perlas conjugadas α-actinina preparadas como en el punto 2.1 siguiente) y atrapar una sola partícula en una trampa. Luego desplace ambas trampas a través de AOD en pequeños pasos (0.2 MHz) y registre un movimiento browniano de la partícula en ambas trampas con QPD y la frecuencia correspondiente de los AOD.
    2. Calcule una potencia promedio en los detectores en cada posición y obtenga la rigidez de la trampa y la constante beta constante de calibración QPD ajustando una función lorentziana a un espectro de potencia del movimiento browniano registrado13.

2. Preparación de la muestra

  1. Preparar perlas fluorescentes conjugadas con α-actinina
    1. Realizar conjugación16: Tomar perlas de poliestireno aminofuncionalizadas (1 μm de diámetro, 2,5% sólidos), lavarlas dos veces en 500 μL de agua destilada y resuspenderlas en 500 μL de PBS (pH 7.0). Añadir 1 mM HaloTag succinimidyl ester O2 ligando e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar tres veces con 500 μL de PBS y resuspender con 100-200 μM HaloTag α-actinina. Incubar durante 1 h a 37 °C y lavar tres veces en 500 μL de PBS (usar perlas en un plazo de 1,5 semanas o congelarlas rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C).
    2. Etiquetado: Incubar 200 μL de solución de perlas con rodamina-BSA a una concentración final de 5 μg/ml durante 10 min. Lavar con 50 mM de PB tres veces y volver a suspender en 500 μL de PB 50 mM. Esto se puede almacenar en alícuotas a - 80 °C durante meses).
  2. Expresar y purificar la miosina-5B biotinilada como se describió anteriormente 4,17.
  3. Polimerizar y etiquetar F-actina13:
    1. Polimerización de actina F: Mezclar 69 μL de agua ultrapura, 10 μL de tampón de polimerización de actina 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM carbonato de guanidina pH 7.5), 20 μL de G-actina 10 mg/mL y 1 μL de DL-Ditiotreitol (DTT) 1 M. Dejar en hielo durante más de 1 h.
    2. Marcado de F-actina con rodamina (Ej/Em: 546/575 nm): Tome 25 μL de F-actina polimerizada y agregue 19.5 μL de agua ultrapura, 2.5 μL de tampón de polimerización de actina 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM carbonato de guanidina pH 7.5), 1 μL de 1 M DTT y2 μL de 250 μM de faloidina rodamina. Déjalo en hielo durante la noche. Para los experimentos de captura, la rodamina F-actina puede almacenarse en hielo y usarse dentro de una semana.
  4. Montaje de muestras
    1. Tomar la cámara de flujo (1.3.5-1.3.12) e incubar 1 mg/ml de BSA biotinilada durante 5 min. Después del lavado con tampón AB (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH7.2) incubar 1 mg/mL de estreptavidina durante 5 min y lavar de nuevo con tampón AB. Incubar la miosina pesada biotinilada-5B meromiosina a una concentración de 3 nM en tampón M5B (10 mM MOPS pH 7.3, 0.5 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3) con 2 μM Calmodulina (CaM) durante 5 min. Lavar con tres volúmenes de BSA biotinilada de 1 mg/ml suplementado con CaM de 2 μM en AB e incubar durante 3 min.
    2. Durante la incubación preparar la mezcla de reacción (RM): 0,005% de perlas funcionalizadas de α-actinina (sección 2.1), 1 nM de rodamina F-Actina (sección 2.3) en tampón de imagen (IB: tampón AB con 1,2 μM de glucosa-oxidasa, 0,2 μM catalasa, 17 mM de glucosa, 20 mM DTT, 2 μM CaM y ATP a la concentración necesaria para el experimento).
    3. Lavar con RM y sellar la cámara con grasa de silicona. La muestra ahora está lista para ser observada bajo el microscopio.

3. Medición

  1. Monta la mancuerna.
    1. Busque las perlas flotantes de α-actinina moviendo la muestra con traductores de largo alcance, encienda una trampa y atrape una cuenta.
    2. Una vez que la primera trampa esté ocupada, mueva el traductor para colocar la cuenta atrapada cerca de la superficie del cubreobjetos para evitar atrapar múltiples cuentas, y atrape otra cuenta en la segunda trampa.
    3. Ajuste las dos trampas a rigideces iguales ajustando la potencia de las ondas acústicas AOD. Las rigideces generalmente se establecen entre 0.03 y 0.14 pN / nm. Cuanto menor es la rigidez, menor es el ruido de fuerza, en particular a bajas fuerzas.
    4. Luego voltee el espejo motorizado M (Figura 2) para cambiar a microscopía de fluorescencia, y busque un filamento de actina flotando en solución desplazando la muestra a través de traductores de largo alcance13. Prefiera filamentos largos (>5 μm) ya que la miosina procesiva lo desplazará y lo moverá durante unas micras antes de desprenderse.
    5. Mueva la muestra para dejar que una de las perlas atrapadas se acerque a un extremo del filamento hasta que se unan entre sí. Luego, ajuste la distancia de las perlas a la longitud aproximada del filamento y cree un flujo en la dirección de la segunda cuenta sin unir moviendo el escenario en su dirección. El filamento será estirado por el flujo y eventualmente se unirá a él13. El complejo cuenta-actina-perla se llama "mancuerna".
  2. Establecer contacto actina-miosina.
    1. Separe suavemente las dos trampas muy separadas para pretensar el filamento hasta aproximadamente 3 pN y pruebe la rigidez de la mancuerna haciendo que una trampa oscile en una onda triangular cambiando la frecuencia de uno de los dos AOD y verificando la consiguiente transmisión del movimiento a la cuenta de arrastre a través de su señal de posición.
    2. Mueva la platina para colocar la mancuerna cerca de una cuenta de sílice de pedestal y permita el contacto entre el filamento y la proteína unida a la superficie de la cuenta ajustando la altura de los centros de perlas atrapadas ligeramente por debajo del diámetro de la perla de sílice. Luego coloque el centro de la cuenta de sílice entre las perlas atrapadas.
  3. Clamp de fuerza y retroalimentación de estabilización nm:
    1. Encienda la abrazadera de fuerza ultrarrápida con una fuerza de 2-3 pN y una oscilación de 200 nm y escanee el cordón del pedestal en pasos discretos de aproximadamente 20-30 nm en la dirección perpendicular al filamento de actina. Espere a que ocurran interacciones en cada posición (pocos segundos), luego avance si no se observa ninguna interacción. A medida que se establece la interacción proteína-filamento, busque la posición donde las interacciones son más frecuentes.
    2. Asegúrese de que cuando la miosina procesiva se mueva hacia un extremo del filamento de actina (generalmente el extremo +), la cuenta atrapada unida al extremo + se mueva hacia la cuenta de sílice. Mueva la etapa hacia el extremo del filamento para que la perla de sílice se encuentre lo más cerca posible de la cuenta atrapada unida al extremo del filamento cuando la miosina no esté unida y comience la retroalimentación de estabilización nanométrica. Al hacerlo, se minimiza la probabilidad de que la cuenta atrapada unida al extremo + del filamento se estrelle contra la cuenta de sílice.
  4. Registrar datos.

4. Análisis de datos4

NOTA: El método de análisis que se describe permite la detección y medición de carreras procesivas y eventos de paso rápido basados en cambios en la velocidad de la mancuerna, como los causados por el paso de miosina. El análisis de los tramos de proceso se realiza sobre la base de un método de análisis de datos para motores no procesales descrito en las referencias 3,4,13.

  1. Establezca un umbral para los cambios de velocidad para permitir la detección de eventos de versión. Dado que en este caso se esperan pasos hacia adelante y hacia atrás, se acepta el cruce del umbral en ambas direcciones.
  2. Asigne cada paso a la ejecución correspondiente: si el intervalo de tiempo entre dos pasos consecuentes es inferior a 3 ms y la amplitud de los pasos es < 90 nm, los pasos se asignan a la misma ejecución, de lo contrario los pasos se asignan a diferentes ejecuciones4.
  3. Longitud de carrera correcta para las fuerzas de asistencia4.
    1. Corrija las longitudes de carrera bajo fuerzas auxiliares calculando el valor real de longitud de carrera RL a partir del valor de longitud de carrera promedio medido <RLm> de la siguiente ecuación, donde D es el rango de oscilación:
      Equation 1
      NOTA: Los detalles sobre la derivación de esta ecuación se pueden encontrar en la referencia4.

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Representative Results

Los datos representativos consisten en registros de posición a lo largo del tiempo, como se muestra en la Figura 4. En el registro de posición son visibles dos tipos de desplazamiento. En primer lugar, cuando el motor de miosina no está interactuando con el filamento de actina, las perlas atrapadas se mueven a velocidad constante contra la fuerza de arrastre viscosa de la solución que muestra un desplazamiento lineal oscilando dentro del rango de oscilación establecido por el operador en una onda triangular3 (no visible en la Figura 4 debido a la larga escala temporal). En segundo lugar, una vez que el motor de miosina interactúa con el filamento, la fuerza transportada por el filamento en movimiento se transfiere muy rápidamente a la proteína, la velocidad del sistema cae a cero (líneas rojas en la Figura 4) y los eventos de paso ocurren bajo fuerza constante hasta el final de la carrera. Como se muestra en la Figura 5, la fuerza se cambia de la dirección positiva a la negativa (y viceversa) mediante el sistema de retroalimentación, que cambia la dirección de la fuerza cuando el talón alcanza el borde del rango de oscilación establecido por el usuario. En algunos casos, puede suceder que, cuando la miosina se une y desplaza el filamento hacia la dirección positiva, empuja la cuenta hacia el borde (superior) del rango de oscilación. Si esto sucede bajo fuerza de asistencia (es decir, dirigida hacia el desplazamiento positivo, empuje, en la Figura 5), la carrera de la miosina será interrumpida por la inversión de la dirección de la fuerza en el borde de oscilación (flechas en la Figura 5), limitando así la longitud de la carrera a la amplitud de la oscilación de la mancuerna D. Esto requiere una corrección de la longitud de la carrera en caso de fuerza de asistencia (4.3.1).

Figure 1
Figura 1: Esquema de UFFCS aplicado a un motor procesivo de miosina-5B. (a) Una sola molécula de miosina-5B está unida a un pedestal de perla de vidrio a través de un enlace estreptavidina-biotina. Un solo filamento de actina queda atrapado suspendiéndolo entre perlas recubiertas de α-actinina (la llamada geometría de "tres cuentas"). Las flechas negras representan la fuerza sujeta a la derecha (F1) y la cuenta izquierda (F2), la flecha roja representa la fuerza neta (F) en la mancuerna. F se alterna hacia adelante y hacia atrás para mantener la mancuerna dentro de un rango de oscilación limitado cuando la miosina no está unida a la actina. (b) Ejemplo de traza que muestre el desplazamiento y la fuerza durante las fases correspondientes de oscilación con mancuernas, fijación de miosina-5B y corridas procesivas bajo cargas de asistencia (empuje) y resistivas (tracción). Esta cifra se ha modificado de4. Se representan gráficos los datos brutos adquiridos a una frecuencia de muestreo de 200 kHz. Std. Dev. de fuerza es de aproximadamente 0.27 pN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema óptico de la configuración experimental. El microscopio óptico consta de: lámpara halógena (H), condensador (C), muestra (S), traductores piezoeléctricos (x-y y z), objetivo (O), una cámara de bajo aumento (CCD 200X) y una cámara de gran aumento (CCD 2000X) utilizada para la retroalimentación de estabilización nm. Las pinzas ópticas dobles se insertan y extraen del eje óptico del microscopio a través de espejos dicroicos (D2 y D3) y comprenden: láser Nd:YAG (1064 nm), aislador óptico (OI), placas de onda λ/2, cubos divisores de haz polarizador (PBS), deflectores acústico-ópticos (AOD), filtros interferenciales de 1064 nm (F1 y F2), fotodiodos detectores de cuadrante (QDP). Las señales de los QDP se elaboraron con un FPGA, enviado a dos sintetizadores digitales directos (DDS) personalizados que impulsan los AOD (retroalimentación de fuerza). La excitación de fluorescencia fue proporcionada por un láser Nd: YAG duplicado (532 nm) y la imagen proyectada en una cámara multiplicada por electrones (EMCCD). M es un espejo móvil, F3 un filtro de emisión. Esta cifra se ha modificado de 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Montaje de la cámara de flujo. a) Preparación de la cámara. Un cubreobjetos de vidrio, manchado con perlas de sílice, se une a un portaobjetos de microscopio a través de tiras de cinta adhesiva dobles para formar una celda de flujo de aproximadamente 20 μL de volumen. b) Vista superior de la celda de flujo. Las soluciones se vuelan desde un lado de la cámara con una pipeta y se aspiran desde el otro lado a través de un papel de filtro para crear un flujo a lo largo de la dirección de la flecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Registro de posiciones representativas. Registro de posición que muestra las ejecuciones procesivas de miosina-5B y el algoritmo de detección de paso y ejecución. El principio y el final detectados de cada ejecución se indican mediante líneas verticales verde y cian, respectivamente. Las líneas horizontales rojas indican los pasos detectados. Esta cifra se ha modificado de4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Inversión de fuerza durante las corridas de miosina. Cuando la miosina se une y mueve el filamento en la dirección positiva bajo fuerza de asistencia (empuje), puede suceder que alcance el borde del rango de oscilación donde la fuerza se invierte (indicada por las flechas), de modo que la miosina corre bajo fuerza de asistencia se interrumpe. Por el contrario, bajo fuerza resistiva (pull), el paso procesivo de miosina evita que la mancuerna alcance el punto de inversión de fuerza. Por lo tanto, en este último caso, las longitudes de ejecución no están limitadas por el rango de oscilación para las fuerzas resistivas. Esta cifra se ha modificado de4. Se representan gráficos los datos brutos adquiridos a una frecuencia de muestreo de 200 kHz. Std. Dev. de fuerza es de aproximadamente 0.27 pN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aunque las técnicas de molécula única, como el ensayo de tres perlas, son técnicamente desafiantes y de bajo rendimiento, UFFCS mejora la detección de interacciones moleculares gracias a la alta relación señal-ruido de los datos. UFFCS permite el estudio de la dependencia de la carga de las proteínas motoras, con las principales ventajas de aplicar la fuerza muy rápidamente al unirse el motor al filamento para sondear eventos tempranos y muy rápidos en la producción de fuerza y estados de unión débiles bajo fuerza controlada; Mantener la fuerza constante durante toda la carrera y sondear la dependencia motora con control total de la direccionalidad de la fuerza. En cuanto al último punto, la geometría de tres perlas que utilizamos aquí es muy eficiente para aplicar y medir fuerzas a lo largo de la dirección del filamento, minimizando las contribuciones de los componentes transversales o verticales. Sin embargo, cuando se espera que la proteína motora produzca activamente fuerzas transversales o verticales, o incluso torques, otras configuraciones como la geometría de una sola cuenta son más apropiadas 2,7,18. Además, gracias a su resolución espacial y temporal, UFFCS representa una herramienta única para la comprensión de los conceptos básicos de las interacciones moleculares que de otro modo se verían obstaculizadas con las técnicas convencionales de molécula única. De hecho, la UFFCS permitió investigar cómo las fuerzas asistenciales y resistivas regulan la respuesta mecánica de la miosina-5B, dando así una nueva visión de su comportamiento colectivo dentro de la malla de actina en la célula4.

Sin embargo, el éxito de estos experimentos depende del cumplimiento de algunos requisitos importantes que deben abordarse con mucho cuidado siguiendo todas las instrucciones que se encuentran en este protocolo: la alineación y el aislamiento precisos de la configuración óptica son fundamentales para alcanzar una resolución espacial óptima; es necesaria una calibración cuidadosa del sistema óptico para determinar los valores de las fuerzas aplicadas con alta precisión; el establecimiento de un sistema de retroalimentación rápida es necesario para alcanzar la alta resolución temporal; Finalmente, todos los componentes que se ensamblan en la cámara de muestra deben prepararse en un ambiente controlado, manteniéndolos lo más estériles posible, ya que cualquier impureza en la cámara de muestra podría comprometer el experimento, y todas las indicaciones sobre su almacenamiento y manejo óptimos deben respetarse estrictamente para el éxito del protocolo experimental. Es importante destacar que el análisis de datos debe adaptarse cuidadosamente a los diferentes tipos de interacciones motor-filamento para interpretar adecuadamente los resultados y evitar artefactos.

En este protocolo se incluyen todos los pasos para realizar experimentos ultrarrápidos de fuerza-pinza en motores procesales de miosina-5, desde la configuración de aparatos experimentales hasta la preparación de muestras, medición y análisis de datos, que podrían adaptarse convenientemente para estudiar una variedad de miosinas no convencionales y otras clases de motores procesivos como quinesinas y dineínas.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No. 871124 Laserlab-Europe, por el Ministerio de Universidad e Investigación de Italia (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2), y por Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk recibió el apoyo de la beca interdisciplinaria LT008/2020-C del Programa de Ciencias de la Frontera Humana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

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References

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Biología Número 173 espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza pinzas ópticas ensayo de tres cuentas motores moleculares miosina

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Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza
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Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

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