Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dissekere mekanoenzymatiske egenskaper av prosessive myosiner med ultrafast kraft-klemmespektroskopi

Published: July 1, 2021 doi: 10.3791/62388
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3, 2,3
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

ERRATUM NOTICE

Summary

Presentert her er en omfattende protokoll for å utføre ultrafast kraftklemmeeksperimenter på prosessive myosin-5-motorer, som lett kan utvides til studiet av andre klasser av prosessive motorer. Protokollen beskriver alle nødvendige trinn, fra oppsett av eksperimentelt apparat til prøvepreparering, datainnsamling og analyse.

Abstract

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) er en enkelt molekylteknikk basert på laserpinsett som gjør det mulig å undersøke kjemomekanikken til både konvensjonelle og ukonvensjonelle myosiner under belastning med enestående tidsoppløsning. Spesielt har muligheten til å undersøke myosinmotorer under konstant kraft rett etter aktin-myosinbindingsdannelsen, sammen med den høye frekvensen av krafttilbakemeldingen (200 kHz), vist at UFFCS er et verdifullt verktøy for å studere belastningsavhengigheten av rask dynamikk som myosin-arbeidsslaget. Videre muliggjør UFFCS studiet av hvordan prosessive og ikke-prosessive myosin-aktin-interaksjoner påvirkes av intensiteten og retningen til den påførte kraften.

Ved å følge denne protokollen vil det være mulig å utføre ultrafast kraftklemmeeksperimenter på prosessive myosin-5-motorer og på en rekke ukonvensjonelle myosiner. Ved noen justeringer kan protokollen også enkelt utvides til studiet av andre klasser av prosessive motorer som kinesiner og dyneiner. Protokollen inneholder alle nødvendige trinn, fra oppsett av eksperimentelt apparat til prøvepreparering, kalibreringsprosedyrer, datainnsamling og analyse.

Introduction

I de siste tiårene har optisk pinsett vært et verdifullt verktøy for å belyse mekanokjemien av proteininteraksjoner på enkeltmolekylnivå, på grunn av den slående muligheten for samtidig manipulering og måling av konformasjonsendringer og enzymatisk kinetikk 1,2. Spesielt evnen til å anvende og måle krefter i området av de som utøves av molekylære motorer i cellen, sammen med kapasiteten til å måle sub-nanometer konformasjonsendringer, gjorde optisk pinsett et unikt enkeltmolekylverktøy for å unraveling de kjemomekaniske egenskapene til motorproteiner og deres mekaniske regulering.

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) er en enkeltmolekylær kraftspektroskopiteknikk basert på optisk pinsett, utviklet for å studere den raske kinetikken til molekylære motorer under belastning i en tre-perle geometri (figur 1a) 3,4. UFFCS reduserer tidsforsinkelsen for kraftpåføring på motorproteinet til den fysiske grensen for optisk pinsett, dvs. den mekaniske relaksasjonstiden til systemet, og tillater dermed påføring av kraften raskt etter begynnelsen av en myosinkjøring (noen få titalls mikrosekunder)3. Denne evnen har blitt utnyttet til å undersøke de tidlige mekaniske hendelsene i rask skjelett 3 oghjerte 5 muskelmyosin for å avsløre belastningsavhengigheten av kraftslaget, de svake og sterke bindingstilstandene, samt rekkefølgen av biokjemiske (Pi) og mekaniske (powerstroke) hendelser.

Treperlegeometrien brukes vanligvis til å studere ikke-prosessive motorer, en enkelt perlegeometri med en kraftklemme har ofte blitt brukt til å undersøke prosessive ikke-konvensjonelle myosiner som myosin Va6. Det er imidlertid flere grunner til å foretrekke en tre-perle UFFCS-analyse også for prosessive myosiner. For det første tillater den raske påføringen av belastning rett etter aktin-myosinbinding måling av de tidlige hendelsene i kraftutvikling som i ikke-prosessive motorer. I tillegg, når det gjelder prosessive motorer, tillater det også en nøyaktig måling av motorens kjørelengder og driftsvarigheter under konstant kraft gjennom hele progresjonen (figur 1b). Videre, på grunn av den høye frekvensen av krafttilbakemeldingen, kan systemet opprettholde kraften konstant under raske endringer i posisjon, for eksempel myosin-arbeidsslaget, og garanterer dermed en konstant belastning under motorsteg. Den høye temporale oppløsningen av systemet tillater deteksjon av sub-ms-interaksjoner, og åpner muligheten for å undersøke svak binding av myosin til aktin. Til slutt garanterer analysegeometrien at kraften påføres langs aktinfilamentet, med ubetydelige tverrgående og vertikale komponenter av kraften. Dette punktet er spesielt relevant siden den vertikale kraftkomponenten har vist seg å påvirke lastavhengigheten av motorens kinetikk 7,8 betydelig. Ved å bruke denne teknikken kunne vi bruke en rekke assistive og resistive belastninger på prosessiv myosin-5B og direkte måle lastavhengigheten av dens prosessivitet for et bredt spekter av krefter4.

Som vist i figur 1a, henger en enkelt aktinfilament i dette systemet mellom to isoporperler fanget i fokus for dobbel optisk pinsett ("manualen"). En ubalansert nettokraft F = F1-F 2 påføres filamentet, gjennom et raskt tilbakemeldingssystem, som gjør at filamentet beveger seg med konstant hastighet i en retning til det når et brukerdefinert inversjonspunkt hvor nettokraften reverseres i motsatt retning. Når det motoriske proteinet ikke interagerer med filamentet, er hantelen fri til å bevege seg frem og tilbake i en trekantet bølgeform (figur 1b, bunnpanel) som spenner over sokkelperlen som et enkelt motorprotein er festet på. Når interaksjonen er etablert, overføres kraften som bæres av hantelen svært raskt til motorproteinet, og motoren begynner å forskyve filamentet ved å gå under kraftintensiteten og retningen som ble påført av tilbakemeldingssystemet på tidspunktet for interaksjonen, til myosin løsner fra aktin. Å være forskyvningen produsert av motorens stepping avhengig av polariteten til det fangede aktinfilamentet, i henhold til retningen av den påførte kraften, kan lasten enten være hjelpemiddel, dvs. skyve i samme retning av motorens forskyvning (trykk i figur 1b øvre panel), eller resistiv, dvs. trekke i motsatt retning med hensyn til motorens forskyvning (trekk i figur 1b øvre panel) som gjør det mulig å studere den kjemomekaniske reguleringen av motorens prosessivitet med både intensiteten og retningen til den påførte lasten.

I de neste avsnittene er alle trinnene for å måle aktin-myosin-5B-interaksjoner under forskjellige belastninger med et ultrafast kraftklemmespektroskopioppsett fullstendig beskrevet, inkludert 1) oppsett av det optiske oppsettet, justering av optiske feller og kalibreringsprosedyrer, 2) forberedelsene til alle komponentene og deres montering i prøvekammeret, 3) måleprosedyren, 4) Representative data og dataanalyse for å trekke ut viktige fysiske parametere, for eksempel kjørelengden, trinnstørrelsen og hastigheten til motorproteinet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optisk oppsett

MERK: Det eksperimentelle oppsettet består av dobbel optisk pinsett med nanometerpunktstabilitet og < 1% laserintensitetsfluktuasjoner. Under disse forholdene er stabiliteten til hantelen på nanometernivå garantert under typisk fellestivhet (0,1 pN / nm) og spenning (1 pN - noen få titalls pN). Figur 2 viser et detaljert skjema for det optiske oppsettet.

  1. Optisk pinsett design og konstruksjon 9,10,11.
    1. Plasser alle komponentene i oppsettet på et optisk bord i henhold til skjemaet i figur 2. Merk at den optiske tabellen inneholder aktive isolatorer for å minimere mekaniske vibrasjoner. I tillegg er mikroskopstrukturen montert på elastomere isolatorer for å absorbere akustisk støy og mekaniske resonanser.
    2. Sett inn en optisk isolator nær laserkilden ("OI" i figur 2) for å unngå tilfeldige amplitudefluktuasjoner på grunn av optisk tilbakemelding.
    3. Forsegle hele banen i en lukket boks for å redusere luftstrøm og turbulenser som kan påvirke laserpekestabiliteten.
    4. Lag den doble optiske pinsetten ved å dele hovedlaserkilden (Nd: YAG-laser, 1,064 nm bølgelengde i figur 2) i to grener med ortogonale polarisasjoner ved bruk av polariserende strålesplittere (PBS). Tidsdelte feller bør unngås fordi de induserer svingning av hantelen under spenning12.
    5. Bruk to akustooptiske deflektorer (AODer i figur 2) drevet av Direct Digital Synthesizers (DDS) for å tillate fine og raske bevegelser av de to fellene og presis regulering av aktinspenningen ved å kjøre DDS-ene direkte gjennom de digitale utgangene fra det feltprogrammerbare gate array-FPGA-kortet (se figur 2).
      MERK: Den totale responstiden for tilbakemelding må være <10 μs for raskt å korrigere og opprettholde konstant kraft på begge fellene under målinger, inkludert ubundet tilstand, myosininteraksjon og bevegelse. For dette formål må posisjonsdetektorer ha en >= 100 kHz båndbredde og data må anskaffes ved >= 200 kHz samplingsfrekvens. For hvert datapunkt som samles inn (5 μs innsamlingstid), beregnes proporsjonale korreksjoner for de to fellene av FPGA og sendes til de to DDS-ene som driver AOD-ene. AOD-responstiden må være under 5 μs for å tilfredsstille den nødvendige responstiden for tilbakemelding.
    6. For nm-deteksjon av den fangede perleposisjonen, sett to kvadrantfotodiodedetektorer (QPDer i figur 2) i kondensatorens bakre fokalplan. Nøyaktig justering av QPDene i et plan konjugert til kondensatorens bakre fokalplan, samt AOD-ene i et plan konjugert til det bakre fokalplanet til objektivet, vil sikre at QPD-signaler vil være uavhengige av AOD-frekvensen.
    7. Monter AOD på en lineær oversetter med mikrometerdrift og forskyv den til krystallkanten kommer nær laserstrålen. Deretter erstatter du målet med en iris, sentrert på det gjengede objektivhuset, og regulerer blenderåpningen for å passe til objektivets bakblenderåpning.
    8. Flytt oversetteren mot laserstrålen til den delen av strålen som er blokkert av piezokrystallet er synlig etter iris, vri oversetteren litt bakover for å få strålen til å fylle irisåpningen helt igjen.
    9. Gjenta trinn 1.1.7-1.1.8 for den andre AOD. Kontroller responstiden til tilbakemeldingssløyfen ved å måle tidsforsinkelsen fra QPD-ene mens du raskt beveger en stråle på en perle som sitter fast på overflaten av dekselet13.
      MERK: Ovennevnte tre trinn (1.1.7-1-1-9) fører til forsiktig justering av AOD-krystaller. Disse trinnene er viktige for å optimalisere tidsresponsen til både stråleavbøyningen og tilbakemeldingen13.
  2. Ved hjelp av en fotodiode måles intensitetssvingningene til fangstlaseren ved mikroskopinngangen, som må være under 1%. Merk at fotodiodens båndbredde må være større enn bildefrekvensen.
  3. Kontroller pekestabiliteten til begge overlappingene.
    1. Forbered silikaperler i fosfatbuffer (PB) ved å fortynne 20 μL silikaperler (1,2 μm, 10% faste stoffer) i 1 ml aceton, sonikat i 30 s, hvirvel kort og sentrifuge i 2 minutter ved 19.000 x g.
    2. Fjern supernatanten, resuspender i 1 ml aceton og gjenta vasken. Svev igjen i 1 ml 50 mM PB, vask 2 ganger. Til slutt, resuspender i 100 μL av 50 mM PB.
    3. Utfør optisk pinsett kalibrering med silika perler ved å stikke en coverslip på et mikroskop lysbilde med en dobbeltsidig tape (ca. 60 μm tykk) for å bygge en flyt kammer. Fyll kammeret med en 1 mg/ml BSA (Bovine Serum Albumin protein) og vent i 3 min.
    4. Flow en 1:1000 fortynning av silika perler i PB inn i kammeret. Bruk en sprøyte fylt med silisiumfett for å forsegle kammeret forsiktig. Fang en enkelt perle i hver felle og bruk effektspektrummetoden14 for å kalibrere dem.
    5. Forbered silikaperler i pentylacetat (ved romtemperatur) ved å oppløse 20 μL silikaperler (1,2 μm diameter, 10% fast) i 1-1,5 ml aceton, hvirvel og sonikat i 30 s.
    6. Sentrifuge ved 18 500 x g i 2 min. Kast supernatanten og resuspender i 1 ml aceton, og gjenta deretter vasken. Resuspender i 1 ml pentylacetat og gjenta vask (sentrifuge og resuspensjon) i pentylacetat 2 ganger. Resuspender pelleten i 100 μL nitrocellulose 1% og 900 μL pentylacetat. Oppbevares ved 4 °C i 2 måneder.
    7. Ta et 24 x 24 mm glassdeksel og rengjør det forsiktig med papir dynket med ren etanol. Deretter, mens du holder den med ren pinsett, skyll den en gang til ved å vaske direkte med ren etanol. La det tørke under en mild strøm av nitrogen. Gjenta om nødvendig denne operasjonen for å fjerne alle synlige rester på glassoverflaten.
    8. Ta silikaperlene lager, virvel den og sonicate den kort for ~ 30 s.
    9. Etter rengjøring av et andre deksel (24 x 60 mm), bruk det til å smøre 2 μL silikaperleløsning på den ene overflaten av dekselet, og vent til det tørker.
    10. Rengjør forsiktig et mikroskopglass (26 x 76 mm) som skal brukes til å lage strømningskammeret.
    11. Klipp to linjer med dobbel klebrig tape (~ 3 mm stor, 60-100 μm tykk) og fest dem på den ene siden av mikroskoplysbildet, som vist i figur 3.
    12. Ved å bruke ren pinsett, lukk kammeret (ca. 20 μL sluttvolum) ved å sette det belagte dekselet (1.3.9) i kontakt med de klebrige tapelinjene, med nitrocellulosen + perlelaget mot innsiden av kammeret, som vist i figur 3a. Fyll strømningskammeret med 50 mM fosfatbuffer og forsegl det med silisiumfett.
    13. Avbilde en enkelt silikaperle i lysfeltmikroskopi ved >200x forstørrelse ved hjelp av et CCD-kamera (Charge-Coupled Device) eller komplementært CMOS-kamera (Metal-Oxide-Semiconductor) med >1,4 megapiksler. Bruk en tilbakemeldingsprogramvare for å flytte piezotrinnet (med nanometernøyaktighet eller bedre) for å kompensere for termiske drifter10.
    14. Overlapp midten av venstre felle med midten av perlen (x-y signalnivåer fra QPD skal samsvare med de fra kalibreringen). Mål deretter posisjonsstøyen og standardavviket til posisjonssignalene for denne fellen.
    15. Gjenta forrige trinn for høyre felle15.
  4. Kalibrering av overlappingsposisjon: MHz til nm
    1. Forbered et strømningskammer med silikaperler festet på dekkoverflaten (1.3.5-1.3.12) og flytende polystyrenperler (bruk α-aktininkonjugerte perler tilberedt som i følgende avsnitt 2.1).
    2. Fokuser en silikaperle på dekkflaten litt desentrert (~ 5 μm) fra midten av synsfeltet (FOV) og skaff deg et bilde av FOV. Flytt perlen med 10 μm mot FOV-senteret ved hjelp av piezo-trinnet og skaff deg et andre bilde. Beregn midten av perlen i de to bildene ved hjelp av en sentroidalgoritme eller lignende, og beregne avstanden i piksel mellom de to perlene for å oppnå nm / pikselkalibrering av brightfield-kameraet.
    3. Fang en enkelt flytende partikkel i en felle. Deretter flytter du fellen ved hjelp av AOD i små trinn (0,2 MHz) og tar et bilde av partikkelen og den tilsvarende frekvensen til AOD for hvert trinn. Beregn posisjonen til partikkelen i FOV ved å bruke sentroidalgoritmen som før og konverter den i nm ved å bruke nm / pikselkalibreringen oppnådd i forrige trinn.
    4. Utfør en lineær tilpasning til frekvensposisjonsdataene og beregne kalibreringskonstanten i nm / MHz.
    5. Gjenta kalibreringen for den andre fellen
  5. Fellekraft og stivhetskalibrering (MHz vs W), QPD (MHz vs pN / nm)
    1. Forbered et strømningskammer med silikaperler festet på dekkoverflaten (1.3.5-1.3.12) og flytende polystyrenperler (bruk α-aktininkonjugerte perler fremstilt som i følgende avsnitt 2.1) og fang en enkelt partikkel i en felle. Deretter forskyver du begge fellene gjennom AOD-er i små trinn (0,2 MHz) og registrerer en brownsk bevegelse av partikkelen i begge fellene med QPD og den tilsvarende frekvensen til AOD-ene.
    2. Beregn en gjennomsnittlig effekt på detektorene i hver posisjon og oppnå fellestivhet og QPD-kalibreringskonstant beta ved å tilpasse en Lorentzian-funksjon til et effektspekter av den registrerte brownske bevegelsen13.

2. Forberedelse av prøve

  1. Forbered α-aktinin konjugerte fluorescerende perler
    1. Utfør konjugering16: Ta aminofunksjonaliserte polystyrenperler (1 μm diameter, 2,5% faste stoffer), vask dem to ganger i 500 μL destillert vann og resuspendert i 500 μL PBS (pH 7,0). Tilsett 1 mM HaloTag succinimidylesterO2 ligand og inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask tre ganger med 500 μL PBS og resuspendert med 100-200 μM HaloTag α-aktinin. Inkuber i 1 time ved 37 °C og vask tre ganger i 500 μL PBS (bruk perler innen 1,5 uker eller flashfryst i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C).
    2. Merking: Inkuber 200 μL perleoppløsning med Rhodamine-BSA ved 5 μg / ml endelig konsentrasjon i 10 minutter. Vask med 50 mM PB tre ganger og resuspender i 500 μL PB 50 mM. Dette kan oppbevares i alikoter ved -80 °C i månedsvis).
  2. Uttrykke og rense biotinylert Myosin-5B som beskrevet tidligere 4,17.
  3. Polymeriser og merk F-aktin13:
    1. F-aktinpolymerisasjon: Bland 69 μL ultrarent vann, 10 μL aktinpolymerisasjonsbuffer 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidinkarbonat pH 7,5), 20 μL G-aktin 10 mg / ml og 1 μL DL -Dithiothreitol (DTT) 1 M. La det ligge på is i mer enn 1 time.
    2. F-aktinmerking med rhodamin (Ex/Em: 546/575 nm): Ta 25 μL polymerisert F-aktin og tilsett 19,5 μL ultrarent vann, 2,5 μL aktinpolymerisasjonsbuffer 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl 2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM guanidinkarbonat pH 7,5), 1 μL 1 M DTT og2 μL 250 μM rhodaminfalloidin. La den ligge på is over natten. For fangstforsøk kan rhodamine F-aktin lagres på is og brukes innen en uke.
  4. Prøvemontering
    1. Ta strømningskammeret (1.3.5-1.3.12) og inkuber 1 mg/ml biotinylert BSA i 5 minutter. Etter vask med AB-buffer (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH7,2) inkuberes 1 mg/ml streptavidin i 5 minutter og vask igjen med AB-buffer. Inkuber biotinylert myosin-5B tung meromyosin ved 3 nM konsentrasjon i M5B buffer (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3) med 2 μM Calmodulin (CaM) i 5 minutter. Vask med tre volumer biotinylert BSA på 1 mg/ml supplert med 2 μM CaM i AB og inkuber i 3 minutter.
    2. Under inkubering forbereder reaksjonsblandingen (RM): 0,005 % α-aktininfunksjonaliserte perler (pkt. 2.1), 1 nM rhodamin F-aktin (pkt. 2.3) i bildebuffer (IB: AB-buffer med 1,2 μM glukoseoksidase, 0,2 μM katalase, 17 mM glukose, 20 mM DTT, 2 μM CaM og ATP ved konsentrasjonen som trengs for forsøket).
    3. Vask med RM og forsegl kammeret med silikonfett. Prøven er nå klar til å bli overvåket under mikroskopet.

3. Måling

  1. Monter manualen.
    1. Se etter de flytende α-aktininkulene ved å flytte prøven ved hjelp av langdistanseoversettere, slå på en felle og fell en perle.
    2. Når den første fellen er opptatt, flytter du oversetteren for å plassere den fangede perlen nær dekkslipoverflaten for å unngå at flere perler overlappes, og fanger en annen perle i den andre fellen.
    3. Juster de to overlappingene til lik stivhet ved å justere kraften til AODs akustiske bølger. Stivhet er vanligvis satt mellom 0,03 og 0,14 pN / nm. Jo mindre stivheten er, desto mindre er kraftstøyen, spesielt ved lave krefter.
    4. Vend deretter det motoriserte speilet M (figur 2) for å bytte til fluorescensmikroskopi, og se etter et aktinfilament som flyter i oppløsning ved å forskyve prøven gjennom langdistanseoversettere13. Foretrekker lange filamenter (>5 μm) siden den prosessive myosinen vil forskyve den og flytte den i noen mikrometer før den løsner.
    5. Flytt prøven for å la en av de fangede perlene nærme seg den ene enden av filamentet til de fester seg til hverandre. Deretter justerer du perleavstanden til den omtrentlige filamentlengden og skaper en flyt i retning av den ubundne andre perlen ved å flytte scenen i retningen. Filamentet vil bli strukket av strømmen, og det vil til slutt binde seg til det13. Perle-aktin-perlekomplekset kalles "dumbbell".
  2. Opprett aktin-myosinkontakt.
    1. Skill forsiktig de to fellene langt fra hverandre for å forspenne filamentet opp til ca. 3 pN og undersøk stivheten til hantelen ved å få en felle til å svinge i en trekantbølge ved å endre frekvensen til en av de to AOD-ene og verifisere den påfølgende overføringen av bevegelsen til den etterfølgende perlen gjennom posisjonssignalet.
    2. Flytt scenen for å sette hantelen i nærheten av en sokkel silikaperle og la kontakten mellom filamentet og proteinet festet på perleoverflaten ved å justere høyden på de fangede perlesentrene litt under silikaperlediameteren. Plasser deretter midten av silikaperlen mellom de fangede perlene.
  3. Force clamp og nm stabilisering tilbakemelding:
    1. Slå på den ultrasnelle kraftklemmen med 2-3 pN-kraft og 200 nm svingning og skann sokkelperlen i diskrete trinn på ca. 20-30 nm i retning vinkelrett på aktinfilamentet. Vent til interaksjoner skjer i hver posisjon (få sekunder), og gå deretter videre hvis ingen interaksjon observeres. Når proteinfilamentinteraksjonen er etablert, se etter posisjonen der interaksjoner er hyppigere.
    2. Sørg for at når den prosessive myosinen beveger seg mot den ene enden av aktinfilamentet (vanligvis +-enden), beveger den fangede perlen festet til +-enden seg mot silikaperlen. Flytt scenen mot enden av filamentet slik at silikaperlen ligger så nær den fangede perlen festet til -enden av filamentet når myosin ikke er bundet, og start nanometerstabiliseringstilbakemeldingen. Ved å gjøre dette minimeres sannsynligheten for at den fangede perlen festet til +enden av filamentet krasjer inn i silikaperlen.
  4. Registrer data.

4. Dataanalyse4

MERK: Analysemetoden som beskrives tillater deteksjon og måling av prosessive kjøringer og raske steppinghendelser basert på endringer i hantelhastigheten, som forårsaket av myosintrinn. Analyse av prosessive kjøringer utføres basert på en dataanalysemetode for ikke-prosessive motorer beskrevet i referanser 3,4,13.

  1. Angi en terskel for hastighetsendringer for å tillate trinnvis hendelsesdeteksjon. Siden det i dette tilfellet forventes både fremover og bakovertrinn, aksepteres kryssingen av terskelen i begge retninger.
  2. Tilordne hvert trinn til det tilsvarende løpet: Hvis tidsintervallet mellom to påfølgende trinn er kortere enn 3 ms og amplituden til trinnene er < 90 nm, tilordnes trinn til samme kjøring, ellers tilordnes trinn til forskjellige løp4.
  3. Riktig løpslengde for hjelpestyrker4.
    1. Korriger kjørelengder under hjelpende krefter ved å beregne den reelle driftslengdeverdien RL fra den målte gjennomsnittlige kjørelengdeverdien <RLm> fra følgende ligning, der D er svingningsområdet:
      Equation 1
      MERK: Detaljer om utledningen av denne ligningen finnes i referanse4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative data består av posisjonsposter over tid som vist i figur 4. I posisjonsposten er to typer forskyvning synlige. For det første, når myosinmotoren ikke interagerer med aktinfilamentet, beveger de fangede perlene seg med konstant hastighet mot løsningens viskøse dragkraft, og viser en lineær forskyvning som svinger innenfor oscillasjonsområdet satt av operatøren i en trekantet bølge3 (ikke synlig i figur 4 på grunn av den lange temporale skalaen). For det andre, når myosinmotoren interagerer med filamentet, overføres kraften som bæres av det bevegelige filamentet veldig raskt til proteinet, systemhastigheten faller til null (røde linjer i figur 4) og trinnhendelser forekommer under konstant kraft til slutten av løpet. Som vist i figur 5 byttes kraften fra positiv til negativ retning (og omvendt) av tilbakemeldingssystemet, som bytter kraftretning når perlen når kanten av oscillasjonsområdet som er satt av brukeren. I noen tilfeller kan det skje at når myosinet binder og forskyver filamentet mot den positive retningen, skyver den perlen mot (øvre) kanten av svingningsområdet. Hvis dette skjer under hjelpekraft (dvs. rettet mot positiv forskyvning, skyv, i figur 5), vil myosinets løp bli avbrutt av kraftretningsinversjonen ved oscillasjonskanten (piler i figur 5), og dermed begrense løpets lengde til amplituden til hanteloscillasjonen D. Dette krever en korreksjon av løpslengden ved hjelpekraft (4.3.1).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av UFFCS anvendt på en prosessiv myosin-5B-motor . (a) Et enkelt myosin-5B-molekyl er festet til en glassperlesokkel gjennom en streptapavidin-biotin-lenke. En enkelt aktinfilament fanges ved å suspendere den mellom α-aktininbelagte perler (den såkalte "tre-perle" geometrien). Svarte piler representerer kraften klemmet til høyre (F1) og venstre perle (F2), rød pil representerer nettokraften (F) på manualen. F veksles frem og tilbake for å holde manualen innenfor et begrenset svingningsområde når myosin ikke er bundet til aktin. (b) Eksempelspor som viser forskyvning og kraft i de tilsvarende fasene av hanteloscillasjon, myosin-5B-vedlegg og prosessive løp under assisterende (skyv) og resistive (trekk) belastninger. Dette tallet er endret fra4. Rådata innhentet ved 200 kHz samplingsfrekvens plottes. Std. Dev. av kraft er ca. 0,27 pN. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Optisk skjema for eksperimentelt oppsett. Det optiske mikroskopet består av: halogenlampe (H), kondensator (C), prøve (S), piezooversettere (x-y og z), objektiv (O), et kamera med lav forstørrelse (CCD 200X) og et kamera med høy forstørrelse (CCD 2000X) som brukes til nm-stabiliseringstilbakemelding. Dobbel optisk pinsett settes inn og ekstraheres fra mikroskopets optiske akse gjennom dikroiske speil (D2 og D3) og omfatter: Nd: YAG-laser (1064 nm), optisk isolator (OI), λ / 2 bølgeplater, polariserende strålesplitterkuber (PBS), akustooptiske deflektorer (AOD), 1064 nm interferentialfiltre (F1 og F2), kvadrant detektor fotodioder (QDP). Signaler fra QDP-er ble utarbeidet med en FPGA, sendt til to spesialbygde direkte digitale synthesizere (DDS) som driver AOD-ene (force feedback). Fluorescenseksitasjon ble gitt av en duplisert Nd: YAG-laser (532 nm) og bildet projisert på et elektronmultiplisert kamera (EMCCD). M er et bevegelig speil, F3 et utslippsfilter. Dette tallet er endret fra 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Montering av strømningskammer . (a) Kammerforberedelse. Et glassdeksel, smurt med silikaperler, er festet på et mikroskopglass gjennom doble klebrige tapestriper for å danne en strømningscelle på ca. 20 μL volum. b) Sett ovenfra av flytcellen. Løsninger flys fra den ene siden av kammeret med en pipette og suges fra den andre siden gjennom et filterpapir for å skape en strøm langs pilretningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Registrering av representativ posisjon. Posisjonsopptak som viser myosin-5B prosessive kjøringer og trinn- og kjøredeteksjonsalgoritmen. Oppdaget begynnelse og slutt av hver kjøring er indikert med henholdsvis grønne og cyan vertikale linjer. Røde horisontale linjer indikerer de oppdagede trinnene. Dette tallet er endret fra4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Kraftinversjon under myosinkjøringer. Når myosin binder og beveger filamentet i positiv retning under hjelpekraft (push), kan det skje at det når kanten av oscillasjonsområdet der kraften reverseres (indikert med pilene), slik at myosinet som kjøres under hjelpekraft, avbrytes. I motsetning til, under resistiv kraft (trekk), forhindrer myosin prosessiv stepping hantelen i å nå kraftinversjonspunktet. Derfor, i sistnevnte tilfelle, er kjørelengder ikke begrenset av svingningsområdet for resistive krefter. Dette tallet er endret fra4. Rådata innhentet ved 200 kHz samplingsfrekvens plottes. Std. Dev. av kraft er ca. 0,27 pN. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om enkeltmolekylteknikker, som tredråpeanalysen, er teknisk utfordrende og lav gjennomstrømning, forbedrer UFFCS deteksjonen av molekylære interaksjoner takket være det høye signal-støy-forholdet mellom dataene. UFFCS tillater studier av belastningsavhengigheten av motorproteiner, med de viktigste fordelene ved å påføre kraften veldig raskt ved binding av motoren til filamentet for å undersøke tidlige og svært raske hendelser i kraftproduksjon og svake bindingstilstander under kontrollert kraft; opprettholde kraften konstant gjennom hele løpet og sondere motoravhengigheten med full kontroll på kraftretningen. Når det gjelder det siste punktet, er treperlegeometrien som vi bruker her svært effektiv til å påføre og måle krefter langs filamentretningen, og minimere bidrag fra tverrgående eller vertikale komponenter. Men når motorproteinet forventes å aktivt produsere tverrgående eller vertikale krefter, eller til og med dreiemomenter, er andre konfigurasjoner som enkeltdråpegeometrien mer passende 2,7,18. Dessuten, takket være sin romlige og tidsmessige oppløsning, representerer UFFCS et unikt verktøy for forståelsen av grunnleggende molekylære interaksjoner som ellers ville bli hindret med konvensjonelle enkeltmolekylteknikker. Faktisk gjorde UFFCS det mulig å undersøke hvordan hjelpemidler og resistive krefter regulerer den mekaniske responsen til myosin-5B, og dermed gi ny innsikt i dens kollektive oppførsel i aktinnettet i cellen4.

Suksessen til disse eksperimentene er imidlertid avhengig av oppfyllelsen av noen viktige krav som må tas opp svært nøye ved å følge alle instruksjonene som finnes i denne protokollen: Den nøyaktige justeringen og isoleringen av det optiske oppsettet er grunnleggende for å oppnå en optimal romlig oppløsning; nøye kalibrering av det optiske systemet er nødvendig for å bestemme verdiene til de påførte kreftene med høy presisjon; innstillingen av et raskt tilbakemeldingssystem er nødvendig for å nå den høye temporale oppløsningen; Til slutt må alle komponentene som er montert i prøvekammeret fremstilles i et kontrollert miljø, og holde dem så sterile som mulig, siden enhver urenhet i prøvekammeret kan kompromittere eksperimentet, og alle indikasjoner på optimal lagring og håndtering bør respekteres strengt for suksessen til den eksperimentelle protokollen. Det er viktig at dataanalysen tilpasses nøye til de forskjellige typene motorfilamentinteraksjoner for å tolke resultatene riktig og unngå artefakter.

I denne protokollen er inkludert alle trinnene for å utføre ultrafast kraftklemmeeksperimenter på prosessive myosin-5-motorer, fra oppsett av eksperimentelt apparat til prøvepreparering, måling og dataanalyse, som enkelt kan tilpasses for å studere en rekke ukonvensjonelle myosiner og andre klasser av prosessive motorer som kinesiner og dyneiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale nr. 871124 Laserlab-Europe, av det italienske departementet for universitet og forskning (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2), og av Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk ble støttet av Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Tags

Biologi utgave 173 ultrafast kraft-klemme spektroskopi optisk pinsett tre-perle analyse molekylære motorer myosin

Erratum

Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 08/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Dissekere mekanoenzymatiske egenskaper av prosessive myosiner med ultrafast kraft-klemmespektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardini, L., Kashchuk, A. V.,… More

Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter