Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عالية الإنتاجية المضادة للفيروسات المقايسات لفحص لمثبطات تكرار فيروس زيكا

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

في هذا العمل، نصف البروتوكولات المستخدمة في المقايسات القائمة على الإنزيمات القائمة على replicon والفيروسية لفحص مثبطات تكرار فيروس زيكا في شكل فحص عالي الإنتاجية.

Abstract

يتطلب اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات تطوير فحوصات بيوكيميائية وخليوية موثوقة يمكن إجراؤها في أشكال الفحص عالي الإنتاجية (HTS). ويعتقد أن البروتينات غير الهيكلية (NS) من الفيروسات الفلافية تتجمع بشكل مشترك على أغشية الشبكية الانتوبلازمية (ER)، مما يشكل مجمع النسخ المتماثل (RC). وNS3 و NS5 هي الإنزيمات الأكثر دراسة من RC وتشكل الأهداف الرئيسية لتطوير المخدرات بسبب أدوارها الحاسمة في تكرار الجينوم الفيروسي. NS3 protease المجال، الذي يتطلب NS2B كمتبرع لها، هي المسؤولة عن انشقاق البوليبروتين الفيروسية غير ناضجة في البروتينات NS ناضجة، في حين أن المجال NS5 RdRp هو المسؤول عن النسخ المتماثل الحمض النووي الريبي. هنا، نصف بالتفصيل البروتوكولات المستخدمة في الفحوصات المستندة إلى الرد والمقايسات الأنزيمية لاختبار المكتبات المركبة الكبيرة لمثبطات تكرار فيروس زيكا (ZIKV). Replicons هي النظم الفرعية ذاتية التكرار التي يتم التعبير عنها في خلايا الثدييات ، والتي يتم فيها استبدال الجينات الهيكلية الفيروسية بجين مراسل. الآثار المثبطة للمركبات على تكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي يمكن تقييمها بسهولة عن طريق قياس الانخفاض في نشاط البروتين مراسل. تم إجراء العروض المستندة إلى الرد باستخدام خط خلية BHK-21 ZIKV الذي يعبر عن رينيلا لوسيفيراز كجين مراسل. لتوصيف الأهداف المحددة للمركبات المحددة، أنشأنا المقايسات القائمة على الفلورسينس في المختبر لإعادة دمج protease NS3 و NS5 RdRp. تم قياس النشاط البروتيوليكي للبروتيز الفيروسي باستخدام ركيزة الببتيد الفلورية Bz-nKRR-AMC، في حين تم الكشف عن نشاط استطالة NS5 RdRp مباشرة من خلال زيادة إشارة الفلورسنت من SYBR الأخضر I أثناء استطالة الحمض النووي الريبي ، وذلك باستخدام قالب فتيلة ذاتية التركيب الاصطناعية 3′UTR-U30 (5'biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').

Introduction

فيروس زيكا (ZIKV) هو عضو فيروس ناشئ ينتقل عن طريق المفصليات من جنس فيروس فلافي، والذي يتضمن فيروس حمى الضنك (DENV) المرتبط ارتباطا وثيقا ، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) وفيروس الحمى الصفراء (YFV) ، والتي تشكل تهديدات مستمرة للصحة العامة1. حظيت فاشية ZIKV 2015-16 في الأمريكتين باهتمام عالمي بعد ظهورها في البرازيل بسبب ارتباطها باضطرابات عصبية حادة ، مثل صغر الرأس الخلقي المرتبط ب ZIKV عند حديثي الولادة2و3 ومتلازمة غيلان باريه في البالغين4. وعلى الرغم من انخفاض عدد حالات العدوى خلال العامين المقبلين، فقد تم التحقق من انتقال فيروس ZIKV المنقول بالبعوض في 87 بلدا وإقليما في عام 2019، مما يدل على احتمال ية ظهور الفيروس مرة أخرى كجائحة5. حتى الآن، لا توجد لقاحات معتمدة أو أدوية فعالة ضد عدوى ZIKV.

يتطلب اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات تطوير فحوصات خلوية وبيوكيميا حيوية موثوقة يمكن إجراؤها في أشكال فحص عالية الإنتاجية (HTS). تعتبر الفحوصات المستندة إلى Replicon والمقايسات الفيروسية القائمة على الإنزيم استراتيجيتين قيمتين لاختبار مركبات الجزيئات الصغيرة لمثبطات ZIKV1. ويعتقد أن البروتينات غير الهيكلية (NS) الفيروس flavivirus لتجميع ترجمة مشتركة على أغشية الشبكية الانتوبلازمية (ER) ، وتشكيل مجمع النسخ المتماثل (RC)6. وNS3 و NS5 هي الإنزيمات الأكثر دراسة من RC وتشكل الأهداف الرئيسية لتطوير المخدرات بسبب أدوارها الحاسمة في تكرار الجينوم الفيروسي. NS3 protease المجال، الذي يتطلب NS2B كمحترف لها، هي المسؤولة عن انشقاق من البوليبروتين الفيروسية غير ناضجة في البروتينات NS ناضجة، في حين أن المجال NS5 RdRp هو المسؤول عن النسخ المتماثل RNA6.

Replicons هي النظم الفرعية ذاتية التكرار التي يتم التعبير عنها في خلايا الثدييات ، والتي يتم فيها استبدال الجينات الهيكلية الفيروسية بجين مراسل. الآثار المثبطة للمركبات على تكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي يمكن تقييمها بسهولة عن طريق قياس الانخفاض في نشاط البروتين مراسل7. هنا ، نصف البروتوكولات المستخدمة لفحص مثبطات تكرار ZIKV في شكل لوحة 96 جيدا. تم إجراء المقايسات المستندة إلى replicon باستخدام خط خلية RLUC ZIKV RLUC BHK-21 الذي قمنا بتطويره مؤخرا8. لتوصيف الأهداف المحددة للمركبات المحددة ، أنشأنا في المختبر المقايسات القائمة على الفلورسينس للتعبير عن NS3 protease باستخدام ركيزة الببتيد الفلورية ، Bz-nKRR-AMC، في حين أننا بالنسبة ل NS5 RdRp قمنا بقياس استطالة القالب الذاتي البدائية الحيوية الاصطناعية 3'UTR-U30 (5'biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3')، وذلك باستخدام الصبغة المتشابكة SYBR Green I.

تم الحصول على بروتياز ZIKV (45-96 بقايا عامل مساعد NS2B مرتبطة المخلفات 1-177 من مجال بروتياز NS3 بواسطة وصلة غنية بالجليسين [G4SG4]) ، كما هو موضح لYFV9، في حين تم استنساخ البوليمرات (276-898 بقايا مجال RdRp) وأعرب عنها ، كما هو مفصل في10. تم اشتقاق كلا التسلسلين الإنزيمي من GenBank ALU3341.1. كما الفحوص المضادة للفيروسات الأولية, يتم اختبار المركبات في 10 ميكرومتر وتلك التي تظهر الأنشطة ≥ 80٪ ثم يتم تقييم بطريقة تعتمد على الجرعة, مما أدى إلى فعالة / تثبيط (EC50 أو IC50) وتركيزات السامة للخلايا (CC50). في سياق النتائج التمثيلية ، يتم عرض قيم EC50 و CC50 من NITD008 ، وهو مثبط معروف للفيروسات الفلافية11، من الفحوصات المستندة إلى replicon. بالنسبة للمقايسات الأنزيمية، تظهر قيم IC50 لمركبين من صندوق الاستجابة لجائحة MMV/DNDi، وهي مكتبة تتكون من 400 جزيء مع أنشطة مضادة للبكتيريا ومضادة للفطريات ومضادة للفيروسات. يمكن تعديل البروتوكولات الموصوفة في هذا العمل لفحص مثبطات الفيروسات الفلافية الأخرى ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Luciferase نشاط المقايسة

ملاحظة: تأكد من أن جميع الإجراءات التي تنطوي على ثقافة الخلية تتم في أغطية السلامة البيولوجية المعتمدة (انظر جدول المواد).

  1. إعداد وسائل الإعلام النمو تتكون في دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) تكمل مع 10٪ FBS و 500 ميكروغرام / مل G418.
  2. إعداد 10 MM الأسهم حل المركبات المختبرة في 100٪ DMSO، ومن ثم تمييعها إلى 1 mM في DMSO 100٪.
  3. ثقافة ZIKV Rluc replicon الخلايا في وسائل الإعلام النمو في قارورة الثقافة 75 سم2 في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2-humidified (انظر جدول المواد) حتى تصل إلى التقاء 70-90٪.
  4. تجاهل الوسيطة. إضافة 5 مل من تريبسين-EDTA إلى القارورة لمدة 5 إلى 10 دقائق ثم الطرد المركزي الخلايا في 125 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل supernatant، resuspend الخلايا في 5 مل من DMEM 10٪ FBS والعد 10 ميكرولتر من الخلايا التي أعيد إنفاقها في مقياس الدم.
  6. ضبط الخلايا إلى 2 × 104 خلايا / جيدا في DMEM 10٪ FBS والبذور 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في لوحة ثقافة الخلية 96 جيدا (انظر جدول المواد).
  7. احتضان اللوحة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2-humidified (انظر جدول المواد).
  8. بعد ذلك، تجاهل المتوسطة مع micropipette متعدد القنوات وإضافة 100 ميكرولتر / بئر من DMEM 2٪ FBS إلى لوحة.
  9. إضافة 1 ميكرولتر من المركبات لكل بئر ليؤدي إلى تركيز نهائي من 10 ميكرومتر 1٪ DMSO في المتوسط المقايسة. في العمود الأول، إضافة DMSO 1٪ فقط كعنصر تحكم تثبيط لا وNITD008 في العمود الأخير، كعنصر تحكم إيجابي (تثبيط 100٪).
  10. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2-humidified (انظر جدول المواد).
  11. إذابة طقم نظام Renilla luciferase Assay في درجة حرارة الغرفة ، وإعداد محلول عمل 1x Renilla luciferase Lysis Buffer وحجم مناسب من كاشف Renilla Luciferase (حاجز Assay + الركيزة ؛ 100 ميكرولتر لكل بئر) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  12. تجاهل supernatant من الخلايا مع micropipette متعددة القنوات وإضافة 25 ميكرولتر من 1x رينيلا لوسيفيراز ليسيس العازلة لكل بئر.
  13. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ومن ثم نقل 20 ميكرولتر من lysates الخلية مع micropipette متعدد القنوات إلى لوحة بيضاء مبهمة 96 جيدا (انظر جدول المواد)تحتوي على 100 ميكرولتر / بئر من رينيلا لوسيفراز اسساي كاشف.
  14. اقرأ الإشارات الإنارة في مقياس الإنارة أو في أي معدات لديها خيار قراءة التلألؤ (انظر جدول المواد).
  15. لكل لوحة، حساب قيمة عامل Z 12، على النحو التالي: Z′ = 1 - ((3SD من عينة + 3SD من السيطرة)/العوز المتوسط للعينة - متوسط control العوز); SD - الانحراف المعياري. عامل Z بين 0.5 و 1.0 يعني فحص ذات نوعية جيدة 12.
  16. لتحديد قيم EC50 من المركبات، انتقل كما هو موضح في الخطوات 1.3 إلى 1.8 ثم قم بإضافة المركبات المخففة بشكل متسلسل إلى الخلايا، جنبا إلى جنب مع السلبية (1٪ DMSO) وإيجابية (NITD008 في 10 ميكرومتر) الضوابط. إجراء المقايسة مرتين في التكرارات.
  17. رسم متوسط قيم معدلات التثبيط لكل تركيز مركب واستخدام برنامج تحليل الرسم البياني لإجراء تركيب sigmoidal والحصول على قيم EC50.

2. فحص MTT القائم على انتشار الخلايا

  1. 1 - المضي قدما كما هو موضح في البند 1 من الخطوات 1-1 إلى 1-8.
  2. إضافة المركبات في البداية في 10 ميكرومتر والتحكم 1٪ DMSO إلى الخلايا.
  3. إعداد 5 ملغم/مل MTT (3-(4,5-ثنائي ميثيلثيازول-2-yl)-2,5-ديفينيل رباعي البروميد) محلول في الفوسفات المالحة المخزنة (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4; درجة الحموضة 7.4) ودوامة حتى التشحيم الكامل ل MTT.
  4. إضافة محلول MTT إلى الخلايا في عشر حجم البئر (10 ميكرولتر/بئر).
  5. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2-humidified (انظر جدول المواد)لمدة 3-4 ساعة.
  6. تجاهل supernatant مع micropipette متعدد القنوات وإضافة 100 ميكروغرام من DMSO (100٪) إلى كل بئر.
  7. Solubilize بلورات formazan عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ومن ثم قراءة امتصاص في 570 نانومتر في مطياف (انظر جدول المواد).
  8. لتحديد قيم CC50 من المركبات، انتقل كما هو موضح في البند 1 الخطوات 1.1 إلى 1.8 ومن ثم إضافة المركبات المخففة تسلسليا إلى الخلايا، معا السلبية (1٪ DMSO) السيطرة. إجراء المقايسة مرتين في التكرارات.
  9. رسم متوسط قيم معدلات التثبيط لكل تركيز مركب واستخدام برنامج تحليل الرسم البياني لإجراء تركيب sigmoidal والحصول على قيم CC50.

3. NS2B-NS3 protease نشاط المقايسة

  1. إذابة البروتين aliquot على الجليد.
  2. تعيين قارئ لوحة (انظر جدول المواد)درجة الحرارة إلى 37°C.
  3. إعداد الكمية المخصصة من البروتين المخفف إلى 80 nM (5 ميكرولتر / جيد). تركيز البروتين النهائي هو 4 nM.
  4. إذابة الكمية المناسبة من ركيزة Bz-nKRR-AMC على الجليد (محلول مخزون 300 ميكرومتر مخفف في المخزن المؤقت للمقايسة، 10 ميكرولتر/بئر).
  5. في لوحة بيضاء 96 جيدا (انظر جدول المواد)،والاستغناء عن 84 ميكرولتر من المخزن المؤقت المقايسة (20 mM تريس درجة الحموضة 8.5، 5٪ الجلسرين و 0.01٪ تريتون X-100) في كل بئر.
  6. لجعل رد فعل التحكم الإيجابي، لكل بئر من العمود الأخير الاستغناء 1 ميكرولتر من Aprotinin لتحقيق تركيز النهائي من 1 ميكرومتر (محلول المخزون 100 ميكرومتر المخفف في الماء)
  7. لجعل رد فعل السيطرة السلبية، إلى العمود الأول الاستغناء 1 ميكرولتر من DMSO (التركيز النهائي 1٪).
  8. لإجراء الفحص المركب، استغن عن 1 ميكرولتر من كل مركب لتحقيق تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر (تركيز مخزون 1 متر) باستثناء آبار التحكم الإيجابية والسلبية.
  9. الاستغناء عن 5 ميكرولتر من محلول بروتياز.
  10. احتضان لوحة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. لبدء رد الفعل، والاستغناء عن 10 ميكرولتر من Bz-nKRR-AMC حل الأسهم (التركيز النهائي من 30 ميكرومتر).
  12. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 380 نانومتر والانبعاثات إلى 460 نانومتر وقراءة مضان لمدة 30 دقيقة كل 1 دقيقة في قارئ لوحة صغيرة(انظر جدول المواد ). قم بإجراء التجربة بأكملها عند 37 درجة مئوية.
  13. حساب القيم المتوسطة للفلورسينس لتفاعلات التحكم الإيجابية والسلبية. تعيين 100٪ من نشاط بروتياز متوسط قيمة مضان لتفاعلات التحكم السلبية طرح من متوسط قيمة السيطرة الإيجابية وحساب النسب المئوية للنشاط لكل مركب.
  14. لكل لوحة، حساب قيمة عامل Z، كما هو موضح في الخطوة 1.15.
  15. المضي قدما في تحديد IC50 للمركبات التي أظهرت معدل تثبيط أعلى من 80٪.
  16. إجراء المقايسة في ثلاثية كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.13، وذلك باستخدام تخفيف المسلسل من المجمع.
  17. رسم متوسط قيم معدلات التثبيط لكل تركيز مركب واستخدام برنامج تحليل الرسم البياني لإجراء تركيب sigmoidal والحصول على قيم IC50.

4. NS5 RdRp استطالة المقايسة

ملاحظة: جميع المواد المستخدمة في هذا الفحص هي RNase و DNase و pyrogenase معتمدة مجانا.

  1. إعداد كل من المخزن المؤقت المقايسة (50 mM تريس درجة الحموضة 7.0, 2.5 mM MnCl2, 0.01٪ تريتون X-100) و200 mM ATP الأسهم الحل مع 0.1٪ ديتيلبيروكربونات (DEPC) المياه المعالجة.
  2. أنال a 5 ميكرولتر aliquot من 200 ميكرومتر 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') في PCR المياه المعالجة عن طريق احتضان لمدة 5 دقائق في 55 درجة مئوية في دراجة حرارية.
  3. إذابة حل الأسهم من NS5 RdRp، 200 MM ATP و x10.000 SYBR الأخضر الأول على الجليد.
  4. تمييع البروتين إلى تركيز نهائي قدره 250 nM في 3 مل من المخزن المؤقت للآساء.
  5. إعداد حل الركيزة عن طريق تخفيف حلول الأسهم من ATP، 3'UTR-U30 و SYBR الأخضر الأول في 3 مل من المخزن المؤقت للتقييس إلى تركيز نهائي من 1 mM، 300 nM و 1X، على التوالي.
  6. في لوحة PCR 96-well (انظر جدول المواد)،أضف 24.5 ميكرولتر من البروتين المخفف في الأعمدة من 1 إلى 11 من كل صف. إضافة نفس وحدة التخزين المؤقت المقايسة في الآبار المتبقية.
  7. للتحكم ورد الفعل الفارغ، أضف 0.5 ميكرولتر من DMSO في العمودين 1 و12. إضافة 0.5 ميكرولتر من مركب مخفف في DMSO إلى تركيز النهائي من محلول المخزون 1mM 10 ميكرومتر).
  8. ختم لوحة مع فيلم الختم واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  9. بدء رد الفعل عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من محلول الركيزة وختم لوحة مرة أخرى.
  10. احتضان في 30 درجة مئوية في نظام PCR في الوقت الحقيقي (انظر جدول المواد)ورصد مضان لمدة 1 ساعة، وقياس مضان كل 30 ثانية مع فلتر FAM (الانبعاثات: 494 نانومتر / الإثارة: 521 نانومتر).
  11. لكل لوحة، حساب قيمة عامل Z، كما هو موضح في الخطوة 1.15.
  12. المضي قدما في تحديد IC50 للمركبات التي أظهرت معدل تثبيط أعلى من 80٪، كما هو موضح في الخطوة 3.15.
  13. رسم متوسط قيم معدلات التثبيط لكل تركيز مركب واستخدام برنامج تحليل الرسم البياني لإجراء تركيب sigmoidal والحصول على قيم IC50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم طعن جميع البروتوكولات الموصوفة هنا في لوحات 96 بئرا وتسمح بتقييم 80 مركبا لكل لوحة في فحص أولي لتركيز واحد ، بما في ذلك الضوابط السلبية والإيجابية الموضوعة في العمود الأول والأخير من اللوحات ، على التوالي. يتم تمثيل العروض المستندة إلى replicon في الشكل 1، والذي يتضمن بناء الجيش الملكي النيبالي الذي تم تطويره للحصول على خط الخلية BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo (الشكل 1A)، والتمثيل التخطيطي للمقاسات (الشكل 1B) ومنحنيات الاستجابة للجرعة من NITD008 (EC50 من 0.28 ميكرومتر ، CC50 > 10 ميكرومتر) (الشكل 1C). يتم تحديد قيم EC50 وCC50 من المركبات المصابة كتركيزات مطلوبة لمنع 50٪ من نشاط Rluc وتسبب سمية خلوية بنسبة 50٪ على التوالي. فيما يتعلق المقايسة لوسيفيراز, يستخدم DMSO 1٪ كرقابة المانع لا (0٪ تثبيط) ويستخدم NITD008 كتحكم إيجابي (100٪ تثبيط), كما وصف سابقا8.

يتم قياس نشاط بروتياز NS2B-NS3 من خلال رصد مضان AMC صدر بسبب النشاط البروتيوليك من بروتياز(الشكل 2A). Aprotinin, البروتين الذي يعمل كمثبط تريبسين ويوصف بالفعل بأنه مثبط proteases الفيروسات الفلافية13,14,15, وقد استخدمت في هذا المقايسة كسيطرة إيجابية تجريبية (IC50 من 0.13 ± 0.02 ميكرومتر, البيانات غير مبين). يوضح الشكل 2B منحنى تثبيط الاستجابة للجرعة من جزيء يستهدف نشاط البروتيز ، مركب MMV1634402 (IC50 من 0.36 ± 0.08 ميكرومتر). يتم قياس نشاط استطالة NS5 RdRp في الوقت الحقيقي من خلال زيادة كثافة الفلورية من SYBR الأخضر الأول عندما تتشابك مع dsRNA توليفها (الشكل 2C). يظهر منحنى تثبيط الجرعة والاستجابة لجزيء ضرب يستهدف ZIKV RdRp ، مركب MMV1782220 (IC50 من 1.9 ± 0.8 ميكرومتر) ، في الشكل 2D. منذ مثبطات التناظرية نيوكليوسيد، مثل NITD008، ليست مناسبة للالمقايسات الأنزيمية، كما الفوسفات يحتاج إلى دمجها داخل الخلايا إلى جزيء16،ونحن لم تستخدم أي سيطرة إيجابية لNS5 RdRp استطالة المقايسة. ومع ذلك ، يمكن استخدام Clofazimine ، وهو مضاد حيوي تجاري ، والذي حددناه مؤخرا كمثبط للبوليميراز الفيروسي8، كتحكم تجريبي في المقايسات التالية.

Figure 1
الشكل 1: العروض المستندة إلى Replicon. أ)التمثيل التخطيطي للبناء REPLICON ZIKV تحتوي على تسلسل Rluc في 5 'UTR terminus وجين جديد في 3' UTR terminus, التي قمنا بتطويرها للحصول على BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo خط الخلية 8. ب)التمثيل التخطيطي للفحص نشاط لوسيفيراز والخلايا القائم على MTT المقايسة التي أجريت لفحص لمثبطات تكرار ZIKV. ج)منحنيات الجرعة والاستجابة (EC50 وCC50)من NITD008. تم إجراء الفحص في التكرارات. تمثل أشرطة الخطأ انحرافات معيارية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الفيروسية القائمة على الانزيم المقايسات. أ)تمثيل تخطيطي من NS2B-NS3 protease نشاط المقايسة. ب)منحنى تثبيط الجرعة استجابة (IC50)من مركب MMV1634402. ج)التمثيل التخطيطي للNS5 RdRp RNA البوليمرات نشاط المقايسة. د)منحنى تثبيط الجرعة استجابة (IC50)من مركب MMV1782220. تم إجراء المقايسات في ثلاث نسخ. تمثل أشرطة الخطأ انحرافات معيارية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن تكييف البروتوكولات الموصوفة هنا بسهولة للعروض في أشكال 384 أو 1536 بئرا. بالنسبة للفحوصات الكيميائية الحيوية و/ أو المستندة إلى الخلايا التي يتم إجراؤها في تنسيق HTS ، يتم حساب قيمة عامل Z ، وهي معلمة إحصائية ، لكل لوحة لضمان حساسية واستنساخ ودقة تلك المقايسات12. ومن المتوقع أن تكون قيمة عامل Z 0.5 أو أكثر للعروض المستندة إلى الرد بينما من المتوقع أن تكون القيمة 0.7 أو أكثر لمقاايسات نشاط NS3 و NS5. لHTS المستندة إلى replicon، قمنا بتطوير BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo الخلايا، وهو خط خلية مستقرة تؤوي replicon ZIKV النسخة المتماثلة التي تحتوي على تسلسل رينيلا لوسيفيراز(Rluc)في منطقة UTR 5 وفوسفوترانسيفراز النيوميسين (نيو) التي يقودها موقع دخول ريبوسومي داخلي (IRES) في 3'UTR. احتفظنا 38 بقايا capsid و 30 بقايا الجينات المغلفة التي هي مطلوبة للبدء الصحيح للترجمة الجيش الملكي النيبالي، للحفاظ على مستويات مماثلة من النسخ المتماثل وحساسية المخدرات بين الممرات الخلية8. بسبب عدم وجود الجينات الهيكلية، replicons لا تنتج virions ذرية، وبالتالي القضاء على خطر العدوى الفيروسية المكتسبة مختبريا17.

وتتكون المقايسات المضادة للفيروسات باستخدام خلايا سيليفيكون ZIKV في نشاط لوسيفيراز ومضادات الخلايا MTT (السمية الخلوية) التي أجريت بالتوازي. وهذا ضروري لاستبعاد الزيارات الإيجابية الكاذبة ، والتي تضم الجزيئات التي تتداخل مباشرة مع التعبير عن البروتين المراسل و / أو النشاط وتلك التي تؤثر سلبا على صحة الخلية7. نظم Replicon يسمح اكتشاف الجزيئات التي تمنع تكرار الحمض النووي الريبي ولكن ليس تلك المطلوبة لدخول الفيروسية والتجميع virion / الافراج عنهم. بدلا من ذلك، يمكن تعبئتها replicons لإنتاج جزيئات الفيروس replicon (VRPs) عن طريق توفير البروتينات الهيكلية في17 عبر. والجسيمات المعدية ذات الجولة الواحدة الناتجة عن ذلك معدية، ولكن فيروس ذري لا يمكن أن ينتشر لأن جينوم الحزمة يفتقر إلى جينات هيكلية. لذلك ، يمكن استخدام VRPs لاختبار مثبطات الدخول الفيروسي / النسخ المتماثل عن طريق قياس مستويات بروتين المراسل7.

بالإضافة إلى الفحوصات المستندة إلى replicon ، قمنا أيضا بتفصيل البروتوكولات المستخدمة في المقايسات الفيروسية القائمة على الإنزيم لبروتيز NS3 المؤتلف وNS5 RdRp. تم قياس النشاط البروتيوليكي للبروتيز الفيروسي باستخدام ركيزة الببتيد الفلورية Bz-nKRR-AMC ، والتي تحتوي على التعرف على زيتيز ZIKV وتسلسل الانقسام إلى جانب العلامة الفلورية 7-amine-4-methylcoumarin (AMC). بسبب نشاط البروتيز ، يتم تحرير علامة الفلورسنت ويتم قياس معدل التفاعل مباشرة من خلال مراقبة الفلورسينس في مطياف18،19. هذا المقايسة معقولة للغاية ورخيصة نسبيا وسريعة ومناسبة لفحص المكتبات المركبة الكبيرة20،21. العيب الرئيسي هو الإرواء المحتمل بين المركبات المختبرة والفلوروفور الذي يمكن أن يؤدي إلى إصابات إيجابية كاذبة. ومع ذلك، يمكن معالجة هذه المسألة عن طريق قياس مضان إضافي في وجود AMC. أيضا، لا يمكن تقييم المركبات التي تظهر الانبعاثات أو الامتصاص في نفس الطول الموجي للفلوروفور بهذه الطريقة18،20.

فيما يتعلق ب NS5 RdRp ، يتم اكتشاف نشاط الاستطالة مباشرة من خلال زيادة إشارة الفلورسنت من SYBR Green I أثناء استطالة قالب 3'UTR-U30 ذاتي الفتيل. تم تكييف البروتوكول من المقايسات مع الأصباغ المتشابكة مثل بيكو غرين و SYTO 9 التي استخدمت على نطاق واسع لتقييم مركبات البوليمرات الفيروسية المختلفة22،23،24،25،26. على الرغم من أننا قد استخدمت الذاتي فتيلة القالب البيوتينيلات27 في المقايسة، قوالب أخرى، مثل poliU، يمكن استخدامها كذلك25. العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو العدد الكبير من الزيارات الإيجابية الكاذبة التي تتفاعل مع الصبغة ، إما عن طريق التداخل مع الفلورسينس أو عن طريق تقليل التداخل dsRNA28. لذلك، المركبات ضرب تحتاج إلى التحقق من صحتها مع المقايسات المضادة مثل أساليب الفيزياء الحيوية أو عن طريق مقارنة SYBR™ الأخضر أنا مضان في dsRNA مع وبدون مجمع29. ومع ذلك، فإن التنفيذ السهل والقياس المباشر والقدرة على تحمل التكاليف هي نقاط رئيسية لاستخدام الأساليب القائمة على الفلورسينس كمنصات HTS، بالمقارنة مع المقايسات ذات العلامات الراديوية أو المقترنة التي يصعب تنفيذها في الحملات المتوسطة / الكبيرة27و30و31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل صندوق أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)، منحة CEPID 2013/07600-3 للذهاب، منحة 2018/05130-3 إلى RSF و2016/19712-9 إلى ASG، وCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (منحة 88887.516153/2020-00) إلى ASG. ونود أن نشكر بامتنان مشروعي الطب من أجل الملاريا (MMV، www.mmv.org) ومبادرة أدوية الأمراض المهملة (DNDi، www.dndi.org) على دعمهما وتصميم صندوق الاستجابة للجائحة وتوريد المركبات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  2. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  3. de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
  4. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  5. Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
  6. Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
  7. Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
  8. Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
  9. Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
  10. Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
  11. Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
  12. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  13. Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
  14. Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
  15. Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
  16. Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
  17. Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
  18. Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
  19. Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
  20. Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
  21. Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
  22. Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
  23. Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
  24. Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
  25. Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  26. Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
  27. Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
  28. Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
  29. Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
  30. Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
  31. Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 176،
عالية الإنتاجية المضادة للفيروسات المقايسات لفحص لمثبطات تكرار فيروس زيكا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, R. S., Noske, G. D.,… More

Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter