Summary
I dette arbeidet beskriver vi protokollene som brukes i replikonbaserte og virale enzymbaserte analyser for å screene for hemmere av Zika-virusreplikasjon i et screeningformat med høy gjennomstrømning.
Abstract
Antiviral legemiddeloppdagelse krever utvikling av pålitelige biokjemiske og cellulære analyser som kan utføres i HTS-formater (high-throughput screening). Flavivirus ikke-strukturelle (NS) proteiner antas å samoversettelse montere på endoplasmic retikulum (ER) membraner, danner replikasjonskomplekset (RC). NS3 og NS5 er de mest studerte enzymene i RC og utgjør hovedmålene for narkotikautvikling på grunn av deres avgjørende roller i viral genomreplikasjon. NS3 protease domene, som krever NS2B som sin kofaktor, er ansvarlig for spaltingen av det umodne virale polyproteinet i de modne NS-proteinene, mens NS5 RdRp-domenet er ansvarlig for RNA-replikering. Heri beskriver vi i detalj protokollene som brukes i replikonbaserte screeninger og enzymatiske analyser for å teste store sammensatte biblioteker for hemmere av Zika-viruset (ZIKV) replikering. Replicons er selvreplikerende subgenomiske systemer uttrykt i pattedyrceller, der de virale strukturelle genene erstattes av et reportergen. De hemmende effektene av forbindelser på viral RNA-replikasjon kan enkelt evalueres ved å måle reduksjonen i reporterproteinaktiviteten. De replikonbaserte visningene ble utført ved hjelp av en BHK-21 ZIKV-replikoncellelinje som uttrykte Renilla luciferase som et reportergen. For å karakterisere de spesifikke målene for identifiserte forbindelser etablerte vi in-vitro fluorescensbaserte analyser for rekombinant uttrykt NS3-protease og NS5 RdRp. Den proteolytiske aktiviteten til den virale protease ble målt ved hjelp av det fluorogene peptidsubstratet Bz-nKRR-AMC, mens NS5 RdRp forlengelse aktivitet ble direkte oppdaget av økningen av fluorescerende signalet av SYBR Green I under RNA forlengelse, ved hjelp av syntetisk biotinylated selvpriming mal 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').
Introduction
Zika-viruset (ZIKV) er et fremvoksende leddyrbåren virusmedlem av slekten Flavivirus, som inkluderer det nært beslektede Dengue-viruset (DENV), japansk encefalittvirus (JEV) og Yellow Fever virus (YFV), som utgjør konstante trusler motfolkehelsen 1. 2015-16 ZIKV-utbruddet i Amerika fikk global oppmerksomhet etter fremveksten i Brasil på grunn av foreningen med alvorlige nevrologiske lidelser, som medfødt ZIKV-assosiert mikrocephaly hos nyfødte2,3 og Guillain-Barré syndrom hos voksne4. Selv om antall infeksjonssaker gikk ned i løpet av de neste to årene, ble autochthonous myggbårne overføringer av ZIKV verifisert i 87 land og territorier i 2019, og derfor evidencing virusets potensial til å dukke opp igjen som enepidemi 5. Til dags dato er det ingen godkjente vaksiner eller effektive legemidler mot ZIKV-infeksjon.
Antiviral legemiddeloppdagelse krever utvikling av pålitelige cellulære og biokjemiske analyser som kan utføres i HTS-formater (high-throughput screening). Replikonbaserte screeninger og virale enzymbaserte analyser er to verdifulle strategier for å teste småmolekylforbindelser for hemmere av ZIKV1. Flavivirus ikke-strukturelle (NS) proteiner antas å samoversettelse montere på endoplasmic retikulum (ER) membraner, danner replikasjonskomplekset (RC)6. NS3 og NS5 er de mest studerte enzymene i RC og utgjør hovedmålene for narkotikautvikling på grunn av deres avgjørende roller i viral genomreplikasjon. NS3 protease domene, som krever NS2B som sin kofaktor, er ansvarlig for spaltingen av det umodne virale polyproteinet i de modne NS-proteinene, mens NS5 RdRp-domenet er ansvarlig for RNA-replikering6.
Replicons er selvreplikerende subgenomiske systemer uttrykt i pattedyrceller, der de virale strukturelle genene erstattes av et reportergen. De hemmende effektene av forbindelser på viral RNA-replikasjon kan enkelt evalueres ved å måle reduksjonen i reporterproteinaktiviteten7. Her beskriver vi protokollene som brukes for screeninghemmere av ZIKV-replikasjonen i et 96-brønns plateformat. De replikonbaserte analysene ble utført ved hjelp av en BHK-21 ZIKV Rluc replicon-cellelinje som vi nylig har utviklet8. For å karakterisere de spesifikke målene for identifiserte forbindelser etablerte vi in vitro fluorescensbaserte analyser for rekombinant uttrykt NS3-protease ved hjelp av det fluorogene peptidsubstratet, Bz-nKRR-AMC, mens for NS5 RdRp målte vi forlengelsen av den syntetiske biotinylerte selvprimende malen 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), ved hjelp av det interkalerende fargestoffet SYBR Green I.
ZIKV-protease (45-96 rester av NS2B-kofaktor knyttet til rester 1-177 av NS3-proteasedomene av en glycin rik linker [G4SG4]) ble oppnådd, som beskrevet for YFV9, mens polymerasen (276-898 rester av RdRp-domene) ble klonet og uttrykt, som beskrevet i10. Begge enzymsekvensene ble avledet fra GenBank ALU33341.1. Som primære antivirale screeninger testes forbindelser ved 10 μM, og de som viser aktiviteter ≥ 80% blir deretter evaluert på en doseavhengig måte, noe som resulterer i effektiv / inhibering (EC50 eller IC50) og cytotoksiske (CC50) konsentrasjoner. I forbindelse med representative resultater vises EC50- og CC50-verdiene til NITD008, en kjent flavivirushemmer11, fra replikonbaserte screeninger. For de enzymatiske analysene vises IC50-verdiene til to forbindelser fra MMV/ DNDi Pandemic Response Box, et bibliotek bestående av 400 molekyler med antibakterielle, antifungale og antivirale aktiviteter. Protokollene beskrevet i dette arbeidet kan endres for å screene for hemmere av andre relaterte flavivirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Luciferase aktivitetsanalyse
MERK: Påse at alle prosedyrer som involverer cellekultur utføres i sertifiserte biosikkerhetshetter (se Materialfortegnelse).
- Forbered vekstmedier som består av Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) supplert med 10% FBS og 500 μg/ml G418.
- Forbered en 10 mM lagerløsning av testede forbindelser i 100% DMSO, og fortynn dem deretter til 1 mM i 100% DMSO.
- Kultur ZIKV Rluc replikonceller i vekstmedier i en 75 cm2 kulturflaske ved 37 °C i en CO2-fuktetinkubator (se Materialtabell) til de når 70-90 % samløp.
- Kast mediet. Tilsett 5 ml trypsin-EDTA i kolben i 5 til 10 min og sentrifuger deretter cellene ved 125 x g i 5 minutter.
- Kast supernatanten, resuspend cellene i 5 ml DMEM 10% FBS og telle 10 μL resuspended celler på et hemocytometer.
- Juster cellene til 2 x 104 celler/brønn i DMEM 10% FBS og frø 100 μL celler per brønn i en 96-brønns cellekulturplate (se Materialtabell).
- Inkuber platen i 16 timer ved 37 °C i en CO2-fuktetinkubator (se Materialtabell).
- Kast deretter mediet med en flerkanals mikropipette og tilsett 100 μL / brønn DMEM 2% FBS til platen.
- Tilsett 1 μL av forbindelsene per brønn for å resultere i en endelig konsentrasjon på 10 μM 1% DMSO i analysemedium. I den første kolonnen legger du bare til 1 % DMSO som en ingen-hemmingskontroll og NITD008 i den siste kolonnen, som en positiv kontroll (100 % hemming).
- Inkuber platen i 48 timer ved 37 °C i en CO2-fuktetinkubator (se Materialliste).
- Tine Renilla luciferase Assay System kit ved romtemperatur, lag en 1x Renilla luciferase Lysis Buffer arbeidsløsning og et passende volum av Renilla Luciferase reagens (Analysebuffer + substrat; 100 μL per brønn), i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kast supernatanten fra cellene med en flerkanals mikropipette og tilsett 25 μL 1x Renilla luciferase Lysis Buffer per brønn.
- Inkuber platen ved romtemperatur i 15 minutter og overfør deretter 20 μL cellelysater med en flerkanals mikropipette til en hvit ugjennomsiktig 96-brønnsplate (se Materialtabell) som inneholder 100 μL/brønn av Renilla luciferase Assay Reagens.
- Les lystetthetssignalene i et luminometer eller i utstyr som har mulighet til å lese luminescens (se Materialfortegnelse).
- For hver plate beregner du Z-faktorverdien 12, som følger: Z′ = 1 - ((3SD av prøve + 3SD kontroll)/│Mean av prøve - Gjennomsnitt av kontroll│); SD - standardavvik. En Z-faktor mellom 0,5 og 1,0 betyr en analyse av god kvalitet 12.
- For å bestemme EC50-verdiene for forbindelser, fortsett som beskrevet i trinn 1,3 til 1,8 og legg deretter til forbindelsene som serielt fortynnes til cellene , sammen med de negative (1% DMSO) og positive (NITD008 ved 10 μM) kontroller. Utfør analysen to ganger i duplikater.
- Plott gjennomsnittsverdiene for hemmingshastigheter per sammensatt konsentrasjon og bruk en grafanalyseprogramvare for å utføre en sigmoidal tilpasning og oppnå EC50-verdiene.
2. Celleproliferasjonsbasert MTT-analyse
- Fortsett som beskrevet i punkt 1 trinn 1.1 til 1.8.
- Tilsett forbindelsene i utgangspunktet ved 10 μM og kontrollen 1% DMSO i cellene.
- Forbered en 5 mg/ml MTT (3-(4,5-dimetythiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) oppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4; pH 7.4) og virvel til fullstendig oppløsning av MTT.
- Tilsett MTT-løsningen i cellene på en tiendedel av brønnvolumet (10 μL/brønn).
- Inkuber platen ved 37 °C i en CO2-fuktetinkubator (se materialtabellen) i 3-4 timer.
- Kast supernatanten med en flerkanals mikropipette og tilsett 100 μL DMSO (100%) til hver brønn.
- Solubiliser formazankrystallene ved å pipettere opp og ned og les deretter absorbansen ved 570 nm i et spektrofotometer (se Materialtabell).
- For å bestemme CC50-verdiene for forbindelser, fortsett som beskrevet i punkt 1 trinn 1.1 til 1.8 og legg deretter forbindelsene serielt fortynnet til cellene, sammen den negative (1% DMSO) kontrollen. Utfør analysen to ganger i duplikater.
- Plott gjennomsnittsverdiene for hemmingshastigheter per sammensatt konsentrasjon og bruk en grafanalyseprogramvare for å utføre en sigmoidal tilpasning og oppnå CC50-verdiene.
3. NS2B-NS3 protease aktivitetsanalyse
- Tin en protein aliquot på is.
- Still inn plateleseren (se Materialtabell)temperatur til 37°C.
- Forbered den passende mengden protein fortynnet til 80 nM (5 μL / brønn). Endelig proteinkonsentrasjon er 4 nM.
- Tine riktig mengde Bz-nKRR-AMC-substrat på is (300 μM lagerløsning fortynnet i analysebuffer, 10 μL/brønn).
- I en 96-brønns hvit plate (se Materialtabell), dispenser 84 μL analysebuffer (20 mM Tris pH 8,5, 5% glyserol og 0,01% Triton X-100) i hver brønn.
- For å gjøre den positive kontrollreaksjonen, dispenserer hver brønn av den siste kolonnen 1 μL Aprotinin for å oppnå endelig konsentrasjon på 1 μM (lagerløsning 100 μM fortynnet i vann)
- For å gjøre den negative kontrollreaksjonen, dispenserer du 1 μL DMSO (endelig konsentrasjon 1%).
- For å utføre den sammensatte screeningen, dispenser 1 μL av hver forbindelse for å oppnå endelig konsentrasjon på 10 μM (1 mM lagerkonsentrasjon) unntatt positive og negative kontrollbrønner.
- Dispenser 5 μL av proteaseoppløsningen.
- Inkuber platen ved 4 °C i 30 minutter.
- For å starte reaksjonen, dispenser 10 μL Bz-nKRR-AMC lagerløsning (sluttkonsentrasjon på 30 μM).
- Sett eksitasjonsbølgelengden til 380 nm og utslipp til 460 nm og les fluorescensen i 30 min hvert 1 minutt i en mikroplateleser (se Materialtabell). Utfør hele eksperimentet ved 37 °C.
- Beregn gjennomsnittsverdiene til fluorescensen for positive og negative kontrollreaksjoner. Sett som 100% av langvarig aktivitet gjennomsnittsverdien av fluorescens for negative kontrollreaksjoner trukket fra gjennomsnittsverdien av positiv kontroll og beregne prosentandelen av aktivitet for hver forbindelse.
- For hver plate beregner du Z-faktorverdien, som beskrevet i trinn 1.15.
- Fortsett med IC50-bestemmelse for forbindelser som viste en hemmingshastighet høyere enn 80%.
- Utfør analysen i triplikater som beskrevet i trinn 3.1-3.13, ved hjelp av en seriell fortynning av forbindelsen.
- Plott gjennomsnittsverdiene for hemmingshastigheter per sammensatt konsentrasjon og bruk en grafanalyseprogramvare for å utføre en sigmoidal montering og oppnå IC50-verdiene.
4. NS5 RdRp forlengelsesanalyse
MERK: Alle materialer som brukes i denne analysen er RNase, DNase og pyrogenasefri sertifisert.
- Forbered både analysebufferen (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl2,0,01% Triton X-100) og den 200 mM ATP lagerløsningen med 0,1% dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlet vann.
- Anneal en 5 μL aliquot av 200 μM 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') i PCR behandlet vann ved å inkubere det i 5 minutter ved 55 °C i en termosykler.
- Tine lagerløsningen til NS5 RdRp, 200 mM ATP og x10.000 SYBR Green I på is.
- Fortynn proteinet til en endelig konsentrasjon på 250 nM i 3 ml analysebuffer.
- Forbered substratløsning ved å fortynne lagerløsningene til ATP, 3'UTR-U30 og SYBR Green I i 3 ml analysebuffer til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 1 mM, 300 nM og 1X.
- I en 96-brønns PCR-plate (se Materialtabell), tilsett 24,5 μL fortynnet protein i kolonne 1 til 11 i hver rad. Tilsett samme volum analysebuffer i de resterende brønnene.
- For kontroll og blank reaksjon legger du til 0,5 μL DMSO i kolonne 1 og 12. Tilsett 0,5 μL sammensatt fortynnet i DMSO til en endelig konsentrasjon på 10 μM 1mM lagerløsning).
- Forsegle platen med en tetningsfilm og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
- Start reaksjonen ved å tilsette 25 μL substratløsning og forsegle platen igjen.
- Inkuber ved 30 °C i et PCR-system i sanntid (se Materialtabell) og overvåk fluorescensen i 1 time, og mål fluorescensen hver 30.
- For hver plate beregner du Z-faktorverdien, som beskrevet i trinn 1.15.
- Fortsett med IC50-bestemmelse for forbindelser som viste en hemmingshastighet høyere enn 80%, som beskrevet i trinn 3.15.
- Plott gjennomsnittsverdiene for hemmingshastigheter per sammensatt konsentrasjon og bruk en grafanalyseprogramvare for å utføre en sigmoidal montering og oppnå IC50-verdiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle protokollene som er beskrevet her, ble stablished i 96-brønnsplater og tillater evaluering av 80 forbindelser per plate i en primær screening av en enkelt konsentrasjon, inkludert de negative og positive kontrollene plassert i henholdsvis første og siste kolonne av platene. De replikonbaserte visningene er representert i figur 1, som inkluderer RNA-konstruksjonen som er utviklet for å oppnå BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-cellelinjen (figur 1A), analysene skjematisk representasjon (figur 1B) og doseresponskurvene til NITD008 (EF50 av 0,28 μM, CC50 > 10 μM) (Figur 1C). EC50- og CC50-verdiene til treffforbindelser bestemmes da konsentrasjonene som kreves for å hemme 50% av Rluc-aktiviteten og forårsake henholdsvis 50% cytotoksisitet. Når det gjelder luciferaseanalysen, brukes DMSO 1% som en ingen hemmerkontroll (0% hemming) og NITD008 brukes som en positiv kontroll (100% hemming), som tidligere beskrevet8.
NS2B-NS3-proteaseaktiviteten måles ved fluorescensovervåking av AMC som frigjøres på grunn av proteolytisk aktivitet av proteasen (figur 2A). Aprotinin, et protein som fungerer som trypsinhemmer og allerede er beskrevet som en hemmer av flavivirusproteaser13,14,15, ble brukt i denne analysen som en eksperimentell positiv kontroll (IC50 av 0,13 ± 0,02 μM, data ikke vist). Figur 2B illustrerer en doseresponshemmingskurve av et molekyl rettet mot proteaseaktiviteten, forbindelsen MMV1634402 (IC50 av 0,36 ± 0,08 μM). Forlengelsesaktiviteten til NS5 RdRp måles i sanntid av økningen i fluorescensintensiteten til SYBR Green I når den interkaleres med syntetisert dsRNA (Figur 2C). Doseresponshemmingskurven til et treffmolekyl rettet mot ZIKV RdRp, forbindelsen MMV1782220 (IC50 av 1,9 ± 0,8 μM), vises i figur 2D. Siden nukleoside analoge hemmere, som NITD008, ikke er egnet for enzymatiske analyser, da fosfater må innlemmes intracellulært tilmolekylet 16, brukte vi ingen positiv kontroll for NS5 RdRp forlengelsesanalyse. Imidlertid kan Clofazimine, et kommersielt antibiotika, som vi nylig identifiserte som en hemmer av viral polymerase8, brukes som en eksperimentell kontroll i neste analyser.
Figur 1: Replicon-baserte screeninger. A) Skjematisk representasjon av ZIKV-replikonkonstruksjonen som inneholder en Rluc-sekvens ved 5' UTR terminus og et neogen ved 3' UTR terminus, som vi har utviklet for å oppnå BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo cellelinje 8. B) Skjematisk representasjon av luciferase aktivitetsanalyse og celleproliferasjonsbasert MTT-analyse utført for å screene for hemmere av ZIKV-replikering. C) Doseresponskurvene (EC50 og CC50) i NITD008. Analysen ble utført i duplikater. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Virale enzymbaserte analyser. A) Skjematisk representasjon av NS2B-NS3-proteaseaktivitetsanalyse. B) Doseresponsinhiberingskurven (IC50) for sammensatt MMV1634402. C) Skjematisk representasjon av NS5 RdRp RNA polymerase aktivitetsanalyse. D) Doseresponsinhiberingskurven (IC50) av sammensatt MMV1782220. Analysene ble utført i triplikater. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene som er beskrevet her, kan lett tilpasses for visninger i et 384 eller 1536-brønns format. For biokjemiske og/eller cellebaserte screeninger utført i HTS-format, beregnes Z's faktorverdi, en statistisk parameter, for hver plate for å sikre følsomhet, reproduserbarhet og nøyaktighet av disse analysene12. En Z'-faktorverdi på 0,5 eller høyere forventes for replikonbaserte screeninger, mens en verdi på 0,7 eller høyere forventes for aktivitetsanalysene NS3 og NS5. For den replikosebaserte HTS har vi utviklet BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-cellene, en stabil cellelinje som inneholder en replikerende ZIKV-repliktur som inneholder en Renilla luciferase (Rluc) sekvens på 5' UTR-regionen og en neomycinfotransferase (Neo) gen drevet av et internt ribosomalt inngangssted (IRES) ved 3'UTR. Vi beholdt 38 rester av capsid og 30 rester av envelopgener som kreves for riktig initiering av RNA-oversettelsen, for å opprettholde sammenlignbare replikeringsnivåer og legemiddelfølsomhet mellom cellepassasjer8. På grunn av mangel på strukturelle gener produserer ikke replikoner avkomvisjoner, og eliminerer dermed risikoen for laboratorieoppkjøpt virusinfeksjon17.
De antivirale analysene ved hjelp av ZIKV-replikoncellene består i luciferaseaktiviteten og celleproliferasjonsbaserte MTT-analyser (cytotoksisitet) utført parallelt. Dette er nødvendig for å utelukke falske positive treff, bestående av molekyler som forstyrrer direkte reporterproteinuttrykket og / eller aktiviteten og de som påvirkercellehelsen 7negativt . Replicon-systemer tillater oppdagelsen av molekyler som hemmer RNA-replikasjon, men ikke de som kreves for viral oppføring og virionmontering / frigjøring. Alternativt kan replikoner pakkes for å produsere virus replicon partikler (VRPer) ved å gi strukturelle proteiner i trans17. De resulterende enkeltrunde smittsomme partiklene (SRIP-er) er smittsomme, men avkomvirus kan ikke forplante seg da pakkegenomet mangler strukturelle gener. Derfor kan VRPer brukes til å teste for hemmere av viral oppføring / replikering ved å måle nivåene avreporterproteinet 7.
I tillegg til de replikonbaserte screeningene, detaljerte vi også her i protokollene som brukes i virale enzymbaserte analyser for den rekombinante NS3-protease og NS5 RdRp. Den proteolytiske aktiviteten til den virale protease ble målt ved hjelp av det fluorogene peptidsubstratet Bz-nKRR-AMC, som inneholder ZIKV-proteasegjenkjenning og spaltingssekvens kombinert med fluorescerende tag 7-amine-4-metylcoumarin (AMC). På grunn av proteaseaktiviteten frigjøres fluorescerende taggen og reaksjonshastigheten måles direkte ved å overvåke fluorescensen i et spektrofotometer18,19. Denne analysen er svært fornuftig, relativt billig, rask og egnet for screening av store sammensatte biblioteker20,21. Den største ulempen er mulig slukking mellom testede forbindelser og fluoroforen som kan føre til falske positive treff. Dette problemet kan imidlertid løses ved en ekstra fluorescensmåling i nærvær av AMC. Også forbindelser som viser utslipp eller absorpsjon i samme bølgelengde av fluoroforen kan ikke evalueres ved denne metoden18,20.
Når det gjelder NS5 RdRp, oppdages forlengelsesaktiviteten direkte ved økningen av det fluorescerende signalet til SYBR Green I under forlengelsen av en selvprimende 3'UTR-U30 mal. Protokollen ble tilpasset fra analyser med interkalerende fargestoffer som Pico Green og SYTO 9 som har blitt mye brukt til å evaluere forbindelser for forskjellige virale polymeraser22,23,24,25,26. Selv om vi har brukt en selvprimende biotinylert mal27 i analysen, kan andre maler, for eksempel poliU, også brukes25. Den største ulempen ved denne metoden er det høye antallet falske positive treff som samhandler med fargestoffet, enten ved å forstyrre fluorescensen eller ved å redusere dsRNA-interskaleringen28. Derfor må hitforbindelser valideres med motanalyser som biofysikkmetoder eller ved å sammenligne SYBR™ Green I fluorescens i dsRNA med og uten forbindelsen29. Likevel er enkel implementering, direkte måling og overkommelig pris viktige punkter for bruk av fluorescensbaserte metoder som HTS-plattformer, sammenlignet med radiomerkede eller koblede analyser som er vanskelige å implementere i mellomstore / store kampanjer27,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID grant 2013/07600-3 to GO, tilskudd 2018/05130-3 til RSF og 2016/19712-9 til ASG, og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (tilskudd 88887.516153/2020-00) til ASG. Vi vil takknemlig takke Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) og Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi, www.dndi.org) for deres støtte, design av Pandemic Response Box og levering av forbindelsene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | - | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarin) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | - | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D.
