Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tests antiviraux à haut débit pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

Dans ce travail, nous décrivons les protocoles utilisés dans les tests à base de réplicon et à base d’enzymes virales pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika dans un format de dépistage à haut débit.

Abstract

La découverte de médicaments antiviraux nécessite le développement de tests biochimiques et cellulaires fiables qui peuvent être effectués dans des formats de criblage à haut débit (HTS). On pense que les protéines non structurelles (NS) du flavivirus s’assemblent de manière co-translationnelle sur les membranes du réticulum endoplasmique (ER), formant le complexe de réplication (RC). Les NS3 et NS5 sont les enzymes les plus étudiées de la RC et constituent les principales cibles du développement de médicaments en raison de leur rôle crucial dans la réplication du génome viral. Le domaine de la protéase NS3, qui nécessite NS2B comme cofacteur, est responsable du clivage de la polyprotéine virale immature dans les protéines NS matures, tandis que le domaine NS5 RdRp est responsable de la réplication de l’ARN. Ici, nous décrivons en détail les protocoles utilisés dans les dépistages basés sur la réplication et les tests enzymatiques pour tester de grandes bibliothèques de composés pour les inhibiteurs de la réplication du virus Zika (ZIKV). Les replicons sont des systèmes sous-économiques auto-réplicants exprimés dans les cellules de mammifères, dans lesquels les gènes structurels viraux sont remplacés par un gène rapporteur. Les effets inhibiteurs des composés sur la réplication de l’ARN viral peuvent être facilement évalués en mesurant la réduction de l’activité de la protéine rapporteure. Les dépistages basés sur la réplicon ont été effectués à l’aide d’une lignée cellulaire de réplicon BHK-21 ZIKV exprimant la renilla luciférase en tant que gène rapporteur. Pour caractériser les cibles spécifiques des composés identifiés, nous avons établi des essais in vitro basés sur la fluorescence pour la protéase NS3 exprimée par recombinaison et le RdRp NS5. L’activité protéolytique de la protéase virale a été mesurée en utilisant le substrat peptidique fluorogénique Bz-nKRR-AMC, tandis que l’activité d’allongement NS5 RdRp a été directement détectée par l’augmentation du signal fluorescent de SYBR Green I pendant l’allongement de l’ARN, en utilisant le modèle d’auto-amorçage biotinylé synthétique 3′UTR-U30 (5'-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').

Introduction

Le virus Zika (ZIKV) est un nouveau virus transmis par les arthropodes du genre Flavivirus,qui comprend le virus de la dengue (DENV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) et le virus de la fièvre jaune (YFV), qui constituent des menaces constantes pour la santé publique1. L’épidémie de ZIKV de 2015-2016 dans les Amériques a attiré l’attention du monde entier après son émergence au Brésil en raison de l’association avec des troubles neurologiques graves, tels que la microcéphalie congénitale associée au ZIKV chez les nouveau-nés2,3 et le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes4. Bien que le nombre de cas d’infection ait diminué au cours des deux années suivantes, les transmissions autochtones de ZIKV transmises par les moustiques ont été vérifiées dans 87 pays et territoires en 2019, ce qui témoigne du potentiel du virus à réapparaître en tant qu’épidémie5. À ce jour, il n’existe aucun vaccin approuvé ou médicament efficace contre l’infection par le ZIKV.

La découverte de médicaments antiviraux nécessite le développement de tests cellulaires et biochimiques fiables qui peuvent être effectués dans des formats de criblage à haut débit (HTS). Les dépistages à base de réplicon et les tests à base d’enzymes virales sont deux stratégies précieuses pour tester les composés à petites molécules pour les inhibiteurs du ZIKV1. On pense que les protéines non structurelles (NS) du flavivirus s’assemblent de manière co-translationnelle sur les membranes du réticulum endoplasmique (ER), formant le complexe de réplication (RC)6. Les NS3 et NS5 sont les enzymes les plus étudiées de la RC et constituent les principales cibles du développement de médicaments en raison de leur rôle crucial dans la réplication du génome viral. Le domaine de la protéase NS3, qui nécessite NS2B comme cofacteur, est responsable du clivage de la polyprotéine virale immature dans les protéines NS matures, tandis que le domaine NS5 RdRp est responsable de la réplication de l’ARN6.

Les replicons sont des systèmes sous-économiques auto-réplicants exprimés dans les cellules de mammifères, dans lesquels les gènes structurels viraux sont remplacés par un gène rapporteur. Les effets inhibiteurs des composés sur la réplication de l’ARN viral peuvent être facilement évalués en mesurant la réduction de l’activité de la protéinerapporteure 7. Nous décrivons ici les protocoles utilisés pour le dépistage des inhibiteurs de la réplication du ZIKV dans un format de plaque à 96 puits. Les tests à base de réplicon ont été effectués à l’aide d’une lignée cellulaire BHK-21 ZIKV Rluc replicon que nous avons récemment développée8. Pour caractériser les cibles spécifiques des composés identifiés, nous avons établi des tests in vitro basés sur la fluorescence pour la protéase NS3 exprimée par recombinaison en utilisant le substrat peptidique fluorogénique, Bz-nKRR-AMC, tandis que pour NS5 RdRp, nous avons mesuré l’allongement du modèle d’auto-amorçage biotinylé synthétique 3′UTR-U30 (5'-biotine-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), en utilisant le colorant intercalant SYBR Green I.

La protéase ZIKV (45-96 résidus de cofacteur NS2B liés aux résidus 1-177 du domaine protéase NS3 par un liant riche en glycine [G4SG4]) a été obtenue, comme décrit pour YFV9,tandis que la polymérase (276-898 résidus du domaine RdRp) a été clonée et exprimée, comme détaillé dans10. Les deux séquences enzymatiques ont été dérivées de GenBank ALU33341.1. En tant que dépistages antiviraux primaires, les composés sont testés à 10 μM et ceux dont les activités sont ≥ 80% sont ensuite évalués de manière dose-dépendante, ce qui entraîne les concentrations efficaces/inhibition (EC50 ou IC50)et cytotoxiques (CC50). Dans le contexte de résultats représentatifs, les valeurs EC50 et CC50 de NITD008, un inhibiteur connu des flavivirus11, issus de dépistages basés sur la réplicône sont montrées. Pour les tests enzymatiques, les valeurs IC50 de deux composés de la boîte de réponse pandémique MMV/DNDi, une bibliothèque composée de 400 molécules ayant des activités antibactériennes, antifongiques et antivirales, sont présentées. Les protocoles décrits dans ce travail pourraient être modifiés pour dépister les inhibiteurs d’autres flavivirus apparentés.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Test d’activité de la luciférase

REMARQUE : S’assurer que toutes les procédures impliquant la culture cellulaire sont effectuées dans des hottes de biosécurité certifiées (voir tableau des matériaux).

  1. Préparer des milieux de croissance constitués du milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de FBS et 500 μg/mL de G418.
  2. Préparer une solution mère de 10 mM de composés testés dans du DMSO à 100 %, puis les diluer à 1 mM dans du DMSO à 100 %.
  3. Culture ZIKV Rluc replicon cellules dans un milieu de croissance dans une fiole de culture de 75 cm2 à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO2(voir Tableau des matériaux)jusqu’à ce qu’elles atteignent 70-90% de confluence.
  4. Jetez le support. Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA dans la fiole pendant 5 à 10 min, puis centrifuger les cellules à 125 x g pendant 5 min.
  5. Jeter le surnageant, ressuspender les cellules dans 5 mL de DMEM 10% FBS et compter 10 μL de cellules ressuspendées à un hémocytomètre.
  6. Ajuster les cellules à 2 x 104 cellules/puits dans DMEM 10% FBS et ensemencer 100 μL de cellules par puits dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits (voir Tableau des matériaux).
  7. Incuber la plaque pendant 16 h à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO2(voir Tableau des matériaux).
  8. Ensuite, jetez le milieu avec une micropipette multicanal et ajoutez 100 μL / puits de DMEM 2% FBS à la plaque.
  9. Ajouter 1 μL des composés par puits pour donner une concentration finale de 10 μM à 1 % de DMSO dans le milieu d’essai. Dans la première colonne, ajoutez seulement 1% de DMSO comme témoin sans inhibition et NITD008 dans la dernière colonne, comme témoin positif (inhibition de 100%).
  10. Incuber la plaque pendant 48 h à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO2(voir Tableau des matériaux).
  11. Décongeler le kit Renilla luciferase Assay System à température ambiante, préparer une solution de travail 1x Renilla luciferase Lysis Buffer et un volume approprié de réactif Renilla Luciferase (tampon De dosage + substrat; 100 μL par puits), conformément aux instructions du fabricant.
  12. Jetez le surnageant des cellules avec une micropipette multicanal et ajoutez 25 μL de 1x tampon de lyse renilla luciferase par puits.
  13. Incuber la plaque à température ambiante pendant 15 min, puis transférer 20 μL de lysates cellulaires avec une micropipette multicanal sur une plaque blanche opaque de 96 puits (voir Tableau des matériaux)contenant 100 μL/puits de réactif d’essai renilla luciferase.
  14. Lisez les signaux luminescents dans un luminomètre ou dans tout équipement qui a la possibilité de lire la luminescence (voir Tableau des matériaux).
  15. Pour chaque plaque, calculer la valeur du facteur Z 12, comme suit : Z′ = 1 - ((3SD de l’échantillon + 3SD du contrôle)/│Moyenne de l’échantillon - Moyenne du contrôle│); SD - écart type. Un facteur Z compris entre 0,5 et 1,0 signifie un test de bonne qualité 12.
  16. Pour déterminer les valeurs EC50 des composés, procédez comme décrit aux étapes 1.3 à 1.8, puis ajoutez les composés dilués en série aux cellules, ainsi que les témoins négatifs (1% DMSO) et positifs (NITD008 à 10 μM). Effectuez le test deux fois en double.
  17. Tracer les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utiliser un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs EC50.

2. Essai MTT basé sur la prolifération cellulaire

  1. Procédez comme décrit au point 1, étapes 1.1 à 1.8.
  2. Ajouter les composés initialement à 10 μM et le DMSO témoin à 1% dans les cellules.
  3. Préparer une solution de MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromure) à 5 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4; pH 7,4) et vortex jusqu’à la solubilisation complète du MTT.
  4. Ajouter la solution MTT aux cellules à un dixième du volume du puits (10 μL/puits).
  5. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié au CO2(voir tableau des matériaux)pendant 3-4 h.
  6. Jetez le surnageant avec une micropipette multicanal et ajoutez 100 μL de DMSO (100%) à chaque puits.
  7. Solubilisez les cristaux de formazan en pipetant de haut en bas, puis lisez l’absorbance à 570 nm dans un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux).
  8. Pour déterminer les valeurs CC50 des composés, procéder comme décrit au point 1 étapes 1.1 à 1.8, puis ajouter les composés dilués en série aux cellules, ensemble le témoin négatif (1% de DMSO). Effectuez le test deux fois en double.
  9. Tracez les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utilisez un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs CC50.

3. Dosage de l’activité de la protéase NS2B-NS3

  1. Décongeler une aliquote de protéines sur de la glace.
  2. Réglez la température du lecteur de plaques (voir Tableau des matériaux)à 37 °C.
  3. Préparer la quantité appropriée de protéine diluée à 80 nM (5 μL/puits). La concentration finale en protéines est de 4 nM.
  4. Décongeler la quantité appropriée de substrat Bz-nKRR-AMC sur de la glace (solution mère de 300 μM diluée dans un tampon d’essai, 10 μL/puits).
  5. Dans une plaque blanche de 96 puits (voir tableau des matériaux),distribuer 84 μL de tampon d’essai (20 mM Tris pH 8,5, 5% glycérol et 0,01% Triton X-100) dans chaque puits.
  6. Pour faire la réaction témoin positive, à chaque puits de la dernière colonne distribuer 1 μL d’aprotinine pour atteindre une concentration finale de 1 μM (solution mère 100 μM diluée dans l’eau)
  7. Pour faire la réaction témoin négative, à la première colonne distribuer 1 μL de DMSO (concentration finale 1%).
  8. Pour effectuer le criblage des composés, distribuer 1 μL de chaque composé pour atteindre une concentration finale de 10 μM (concentration de 1 mM en stock) à l’exclusion des puits témoins positifs et négatifs.
  9. Distribuer 5 μL de la solution de protéase.
  10. Incuber la plaque à 4 °C pendant 30 minutes.
  11. Pour commencer la réaction, distribuer 10 μL de solution mère Bz-nKRR-AMC (concentration finale de 30 μM).
  12. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 380 nm et l’émission à 460 nm et lisez la fluorescence pendant 30 minutes toutes les 1 minutes dans un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux). Effectuez toute l’expérience à 37 °C.
  13. Calculer les valeurs moyennes de la fluorescence pour les réactions témoins positives et négatives. Définissez à 100 % de l’activité de la protéase la valeur moyenne de la fluorescence pour les réactions de contrôle négatives soustraite de la valeur moyenne du contrôle positif et calculez les pourcentages d’activité pour chaque composé.
  14. Pour chaque plaque, calculez la valeur du facteur Z, comme décrit à l’étape 1.15.
  15. Procéder à la détermination de laCI 50 pour les composés qui présentaient un taux d’inhibition supérieur à 80 %.
  16. Effectuer le dosage en trois exemplaires comme décrit aux étapes 3.1-3.13, en utilisant une dilution en série du composé.
  17. Tracer les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utiliser un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs IC50.

4. Essai d’allongement NS5 RdRp

REMARQUE: Tous les matériaux utilisés dans ce test sont certifiés sans RNase, DNase et pyrogénase.

  1. Préparer à la fois le tampon d’essai (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl2,0,01 % Triton X-100) et la solution mère ATP de 200 mM avec de l’eau traitée à 0,1 % de diéthylpyrocarbonate (DEPC).
  2. Recuit d’une aliquote de 5 μL de 200 μM 3′UTR-U30 (5'-biotine-U 30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') dans de l’eau traitée par PCR en l’incubant pendant 5 minutes à 55 °C dans un thermocycleur.
  3. Décongeler la solution mère de NS5 RdRp, 200 mM ATP et x10.000 SYBR Green I sur glace.
  4. Diluer la protéine à une concentration finale de 250 nM dans 3 mL de tampon d’essai.
  5. Préparer la solution de substrat en diluant les solutions mères de l’ATP, du 3'UTR-U30 et du SYBR Green I dans 3 mL de tampon d’essai jusqu’à une concentration finale de 1 mM, 300 nM et 1X, respectivement.
  6. Dans une plaque de PCR de 96 puits (voir tableau des matériaux),ajouter 24,5 μL de protéine diluée dans les colonnes 1 à 11 de chaque ligne. Ajouter le même volume de tampon d’essai dans les puits restants.
  7. Pour le contrôle et la réaction à blanc, ajouter 0,5 μL de DMSO dans les colonnes 1 et 12. Ajouter 0,5 μL de composé dilué dans du DMSO à une concentration finale de 10 μM 1mM de solution mère).
  8. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité et incubez à température ambiante pendant 15 minutes.
  9. Commencez la réaction en ajoutant 25 μL de solution de substrat et scellez à nouveau la plaque.
  10. Incuber à 30 °C dans un système de PCR en temps réel (voir Tableau des matériaux)et surveiller la fluorescence pendant 1 heure, en mesurant la fluorescence toutes les 30 s avec le filtre FAM (Émission:494 nm/Excitation:521 nm).
  11. Pour chaque plaque, calculez la valeur du facteur Z, comme décrit à l’étape 1.15.
  12. Procéder à la détermination de la CI50 pour les composés qui présentaient un taux d’inhibition supérieur à 80 %, comme décrit à l’étape 3.15.
  13. Tracer les valeurs moyennes des taux d’inhibition par concentration de composé et utiliser un logiciel d’analyse graphique pour effectuer un ajustement sigmoïdal et obtenir les valeurs IC50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tous les protocoles décrits dans le présent document ont été établis dans des plaques de 96 puits et permettent l’évaluation de 80 composés par plaque dans un criblage primaire d’une seule concentration, y compris les témoins négatifs et positifs placés à la première et à la dernière colonne des plaques, respectivement. Les dépistages basés sur la réplicon sont représentés à la figure 1, qui comprend la construction de l’ARN développée pour obtenir la lignée cellulaire BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo (Figure 1A), la représentation schématique des essais (Figure 1B) et les courbes dose-réponse de NITD008 (EC50 de 0,28 μM, CC50 > 10 μM) (Figure 1C). Les valeurs EC50 et CC50 des composés frappés sont déterminées comme les concentrations nécessaires pour inhiber 50% de l’activité Rluc et causer 50% de cytotoxicité, respectivement. En ce qui concerne le test de la luciférase, le DMSO 1% est utilisé comme témoin sans inhibiteur (inhibition de 0%) et NITD008 est utilisé comme témoin positif (inhibition de 100%), comme décrit précédemment8.

L’activité de la protéase NS2B-NS3 est mesurée par surveillance de fluorescence de l’AMC libérée en raison de l’activité protéolytique de la protéase(Figure 2A). L’aprotinine, une protéine qui agit comme inhibiteur de la trypsine et qui est déjà décrite comme un inhibiteur des protéases de flavivirus13,14,15, a été utilisée dans ce test comme témoin positif expérimental (IC50 de 0,13 ± 0,02 μM, données non présentées). La figure 2B illustre une courbe d’inhibition dose-réponse d’une molécule ciblant l’activité de la protéase, le composé MMV1634402 (CI50 de 0,36 ± 0,08 μM). L’activité d’allongement de NS5 RdRp est mesurée en temps réel par l’augmentation de l’intensité de fluorescence de SYBR Green I lorsqu’elle est intercalée avec l’ARNd synthétisé (Figure 2C). La courbe d’inhibition dose-réponse d’une molécule hit ciblant ZIKV RdRp, le composé MMV1782220 (CI50 de 1,9 ± 0,8 μM), est montrée à la figure 2D. Étant donné que les inhibiteurs analogues nucléosidiques, tels que NITD008, ne conviennent pas aux essais enzymatiques, car les phosphates doivent être incorporés intracellulairement à la molécule16,nous n’avons utilisé aucun contrôle positif pour le test d’allongement NS5 RdRp. Cependant, clofazimine, un antibiotique commercial, que nous avons récemment identifié comme un inhibiteur de la polymérasevirale 8,pourrait être utilisé comme contrôle expérimental dans les prochains essais.

Figure 1
Figure 1: Dépistages basés sur replicon. A) Représentation schématique de la construction ZIKV replicon contenant une séquence Rluc à la terminaison UTR 5' et un gène Neo à la terminaison UTR 3', que nous avons développée pour obtenir la lignée cellulaire BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo 8. B)Représentation schématique du test d’activité de la luciférase et du test MTT basé sur la prolifération cellulaire effectué pour dépister les inhibiteurs de la réplication du ZIKV. C) Les courbes dose-réponse (EC50 et CC50)de NITD008. Le test a été effectué en double. Les barres d’erreur représentent les écarts-types. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Essais à base d’enzymes virales. A) Représentation schématique du test d’activité de la protéase NS2B-NS3. B) Courbe d’inhibition dose-réponse (CI50)du composé MMV1634402. C) Représentation schématique du test d’activité de l’ARN polymérase NS5 RdRp. D) Courbe d’inhibition dose-réponse (CI50)du composé MMV1782220. Les tests ont été effectués en trois exemplaires. Les barres d’erreur représentent les écarts-types. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les protocoles décrits ici pourraient être facilement adaptés pour les projections dans un format 384 ou 1536 puits. Pour les criblages biochimiques et/ou cellulaires effectués au format HTS, la valeur du facteur Z', un paramètre statistique, est calculée pour chaque plaque afin d’assurer la sensibilité, la reproductibilité et la précision de ces essais12. Une valeur factorielle Z de 0,5 ou plus est attendue pour les dépistages basés sur la réplicône, tandis qu’une valeur de 0,7 ou plus est attendue pour les tests d’activité NS3 et NS5. Pour le HTS à base de réplicon, nous avons développé les cellules BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo, une lignée cellulaire stable abritant une réplication du ZIKV réplicative contenant une séquence de renilla luciférase(Rluc)dans la région UTR 5' et un gène de néomycine phosphotransférase (Neo) piloté par un site d’entrée ribosomique interne (IRES) au 3'UTR. Nous avons retenu 38 résidus de capside et 30 résidus de gènes d’enveloppe nécessaires à l’initiation correcte de la traduction de l’ARN, afin de maintenir des niveaux de réplication et une sensibilité médicamenteux comparables entre les passages cellulaires8. En raison de l’absence de gènes structurels, les replicons ne produisent pas de virions de descendance, éliminant ainsi le risque d’infection virale acquise en laboratoire17.

Les essais antiviraux utilisant les cellules de réplicon ZIKV consistent en l’activité de la luciférase et les tests MTT (cytotoxicité) basés sur la prolifération cellulaire effectués en parallèle. Ceci est nécessaire pour exclure les résultats faussement positifs, comprenant des molécules qui interfèrent directement avec l’expression et/ou l’activité de la protéine rapporteure et celles qui nuisent à la santé cellulaire7. Les systèmes Replicon permettent la découverte de molécules qui inhibent la réplication de l’ARN, mais pas celles nécessaires à l’entrée virale et à l’assemblage/libération de virions. Alternativement, les répliquants peuvent être emballés pour produire des particules de réplicon de virus (VRP) en fournissant les protéines structurelles dans trans17. Les particules infectieuses mono-rondes (SRIP) qui en résultent sont infectieuses, mais le virus de descendance ne peut pas se propager car le génome de l’emballage manque de gènes structurels. Par conséquent, les VRP pourraient être utilisés pour tester les inhibiteurs de l’entrée/réplication virale en mesurant les niveaux de la protéinerapporteure 7.

En plus des dépistages à base de réplicon, nous avons également détaillé ici les protocoles utilisés dans les tests à base d’enzymes virales pour la protéase recombinante NS3 et NS5 RdRp. L’activité protéolytique de la protéase virale a été mesurée à l’aide du substrat peptidique fluorogénique Bz-nKRR-AMC, qui contient la séquence de reconnaissance et de clivage de la protéase ZIKV couplée à la balise fluorescente 7-amine-4-méthylcoumarine (AMC). En raison de l’activité de la protéase, l’étiquette fluorescente est libérée et la vitesse de réaction est directement mesurée en surveillant la fluorescence dans un spectrophotomètre18,19. Ce test est très judicieux, relativement bon marché, rapide et adapté au criblage de grandes bibliothèques de composés20,21. L’inconvénient majeur est la trempe possible entre les composés testés et le fluorophore qui peut conduire à des résultats faussement positifs. Cependant, ce problème pourrait être résolu par une mesure de fluorescence supplémentaire en présence d’AMC. En outre, les composés présentant une émission ou une absorption dans la même longueur d’onde du fluorophore ne peuvent pas être évalués par cette méthode18,20.

En ce qui concerne le NS5 RdRp, son activité d’allongement est directement détectée par l’augmentation du signal fluorescent de SYBR Green I lors de l’allongement d’un gabarit auto-amorçant 3'UTR-U30. Le protocole a été adapté à partir de tests avec des colorants intercalants tels que Pico Green et SYTO 9 qui ont été largement utilisés pour évaluer les composés pour différentes polymérases virales22,23,24,25,26. Même si nous avons utilisé un modèle biotinylé auto-amorçant27 dans le test, d’autres modèles, tels que poliU, peuvent également être utilisés25. Le principal inconvénient de cette méthode est le nombre élevé de résultats faussement positifs qui interagissent avec le colorant, soit en interférant avec la fluorescence, soit en diminuant l’intercalation de l’ARNd28. Par conséquent, les composés frappés doivent être validés avec des contre-essais tels que les méthodes de biophysique ou en comparant la fluorescence SYBR™ Green I dans l’ARNds avec et sans le composé29. Néanmoins, la facilité de mise en œuvre, la mesure directe et l’abordabilité sont des points clés pour l’utilisation de méthodes basées sur la fluorescence en tant que plates-formes HTS, par rapport aux tests radio-marqués ou couplés qui sont difficiles à mettre en œuvre dans les campagnes à moyenne / grande échelle27,30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), la subvention CEPID 2013/07600-3 à GO, la subvention 2018/05130-3 à RSF et 2016/19712-9 à ASG, et la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (subvention 88887.516153/2020-00) à ASG. Nous tenons à remercier l’initiative Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) et Drugs for Neglected Diseases (DNDi, www.dndi.org) pour leur soutien, la conception de la boîte d’intervention en cas de pandémie et la fourniture des composés.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  2. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  3. de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
  4. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  5. Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
  6. Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
  7. Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
  8. Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
  9. Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
  10. Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
  11. Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
  12. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  13. Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
  14. Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
  15. Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
  16. Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
  17. Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
  18. Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
  19. Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
  20. Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
  21. Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
  22. Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
  23. Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
  24. Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
  25. Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  26. Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
  27. Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
  28. Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
  29. Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
  30. Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
  31. Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).

Tags

Immunologie et infection numéro 176
Tests antiviraux à haut débit pour dépister les inhibiteurs de la réplication du virus Zika
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, R. S., Noske, G. D.,… More

Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter