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Immunology and Infection

ज़िका वायरस प्रतिकृति के अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए उच्च थ्रूपुट एंटीवायरल परख

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

इस काम में, हम एक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रारूप में ज़िका वायरस प्रतिकृति के अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए रिप्लिकन आधारित और वायरल एंजाइम आधारित परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

एंटीवायरल दवा की खोज के लिए विश्वसनीय जैव रासायनिक और सेलुलर परख के विकास की आवश्यकता होती है जिसे उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) प्रारूपों में किया जा सकता है। फ्लेविवायरस गैर-संरचनात्मक (एनएस) प्रोटीन को एनोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली पर सह-अनुवादपूर्वक इकट्ठा करने के लिए सोचा जाता है, जिससे प्रतिकृति परिसर (आर सी) बनता है। NS3 और NS5 आर सी के सबसे अधिक अध्ययन एंजाइम हैं और वायरल जीनोम प्रतिकृति में उनकी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण दवा विकास के लिए मुख्य लक्ष्यों का गठन करते हैं । NS3 प्रोटीज डोमेन, जिसके लिए NS2B को अपने कोफैक्टर के रूप में आवश्यक है, परिपक्व एनएस प्रोटीन में अपरिपक्व वायरल पॉलीप्रोटीन के क्लीवेज के लिए जिम्मेदार है, जबकि एनएसए 5 आरडीआरपी डोमेन आरएनए प्रतिकृति के लिए जिम्मेदार है। इसके साथ ही, हम ज़िका वायरस (ZIKV) प्रतिकृति के अवरोधकों के लिए बड़े यौगिक पुस्तकालयों का परीक्षण करने के लिए रिप्लिकन-आधारित स्क्रीनिंग और एंजाइमैटिक परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉलों का विस्तार से वर्णन करते हैं। रिप्लियोन स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की गई उप-प्रतिकृति उप-प्रतिकृति प्रणालियां हैं, जिसमें वायरल संरचनात्मक जीन को रिपोर्टर जीन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। वायरल आरएनए प्रतिकृति पर यौगिकों के निरोधात्मक प्रभावों को रिपोर्टर प्रोटीन गतिविधि में कमी को मापकर आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है। रिप्लिकन आधारित स्क्रीनिंग एक रिपोर्टर जीन के रूप में रेनिला लूसिफ़ेरेस व्यक्त एक BHK-21 ZIKV replicon सेल लाइन का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । पहचाने गए यौगिकों के विशिष्ट लक्ष्यों की विशेषता के लिए, हमने एनएसएस3 प्रोटीज और एनएसए5 आरडीआरपी को फिर से व्यक्त करने के लिए इन-विट्रो फ्लोरेसेंस-आधारित परख की स्थापना की। वायरल प्रोटीज़ की प्रोटियोलिटिक गतिविधि को फ्लोरोजेनिक पेप्टाइड सब्सट्रेट बीजेड-एनकेआरआर-एएमसी का उपयोग करके मापा गया था, जबकि NS5 RdRp विस्तार गतिविधि सीधे आरएनए विस्तार के दौरान SYBR ग्रीन I के फ्लोरोसेंट सिग्नल की वृद्धि से पता चला था, सिंथेटिक बायोटिनाइलेटेड सेल्फ-प्राइमिंग टेम्पलेट 3′यूटीआर-U30 (5'-बायोटिन-U30-ACUGGAGAUCGUUCCAGU-3') का उपयोग करके।

Introduction

जीका वायरस (ZIKV) फ्लाविवायरसजीनस का एक उभरता हुआ आर्थ्रोपोड-जनित वायरस सदस्य है, जिसमें बारीकी से संबंधित डेंगू वायरस (DENV), जापानी इंसेफेलाइटिस वायरस (जेईवी) और येलो फीवर वायरस (वाईएफवी) शामिल हैं, जो सार्वजनिक स्वास्थ्य1के लिए लगातार खतरा पैदा करते हैं । अमेरिका में 2015-16 ZIKV प्रकोप गंभीर तंत्रिका संबंधी विकारों के साथ सहयोग के कारण ब्राजील में अपने उद्भव के बाद वैश्विक ध्यान प्राप्त किया, जैसे जन्मजात ZIKV-नवजात शिशुओं में माइक्रोसेफली से जुड़े2,3 और वयस्कों में Guillain-Barré सिंड्रोम4। हालांकि अगले दो वर्षों में संक्रमण के मामलों की संख्या में गिरावट आई है, लेकिन 2019 में 87 देशों और क्षेत्रों में ZIKV के ऑटोचथनस मच्छर जनित प्रसारण का सत्यापन किया गया था, इसलिए, वायरस की क्षमता को फिर से महामारी5के रूप में उभरने के लिए एविडेंसिंग किया गया था। आज तक, ZIKV संक्रमण के खिलाफ कोई अनुमोदित टीके या प्रभावी दवाएं नहीं हैं।

एंटीवायरल दवा खोज के लिए विश्वसनीय सेलुलर और जैव रासायनिक परख के विकास की आवश्यकता होती है जिसे उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) प्रारूपों में किया जा सकता है। रिप्लिकन आधारित स्क्रीनिंग और वायरल एंजाइम आधारित परख ZIKV1के अवरोधकों के लिए छोटे अणु यौगिकों का परीक्षण करने के लिए दो मूल्यवान रणनीतियां हैं । फ्लेविवायरस गैर-संरचनात्मक (एनएस) प्रोटीन को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली पर सह-अनुवादपूर्वक इकट्ठा करने के लिए सोचा जाता है, जो प्रतिकृति परिसर (आर सी) 6 कागठनकरता है। NS3 और NS5 आर सी के सबसे अधिक अध्ययन एंजाइम हैं और वायरल जीनोम प्रतिकृति में उनकी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के कारण दवा विकास के लिए मुख्य लक्ष्यों का गठन करते हैं । NS3 प्रोटीज डोमेन, जिसके लिए NS2B को अपने कोफैक्टर के रूप में आवश्यक है, परिपक्व एनएस प्रोटीन में अपरिपक्व वायरल पॉलीप्रोटीन के दरार के लिए जिम्मेदार है, जबकि एनएसए 5 आरडीआरपी डोमेन आरएनए प्रतिकृति6के लिए जिम्मेदार है।

रिप्लियोन स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की गई उप-प्रतिकृति उप-प्रतिकृति प्रणालियां हैं, जिसमें वायरल संरचनात्मक जीन को रिपोर्टर जीन द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। वायरल आरएनए प्रतिकृति पर यौगिकों के निरोधात्मक प्रभावों का मूल्यांकन रिपोर्टर प्रोटीनगतिविधिमें कमी को मापकर आसानी से किया जा सकता है । इसके साथ ही, हम 96-वेल प्लेट प्रारूप में ज़िकवी प्रतिकृति के अवरोधकों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। रिप्लिकन-आधारित परख बीएचके-21 ज़िकेवी आरएलयूसीप्राइसन सेल लाइन का उपयोग करके किया गया था जिसे हमने हाल ही में8विकसित किया है। पहचाने गए यौगिकों के विशिष्ट लक्ष्यों की विशेषता के लिए, हमने फ्लोरोजेनिक पेप्टाइड सब्सट्रेट का उपयोग करके एनएस 3 प्रोटीज़ को फिर से जोड़ने के लिए विट्रो फ्लोरेसेंस-आधारित परख में स्थापित किया, Bz-nKRR-एएमसी, जबकि NS5 RdRp के लिए हमने इंटरकैलिंग डाई सिबीआर ग्रीन I का उपयोग करके सिंथेटिक बायोटिनाइलेटेड सेल्फ-प्राइमिंग टेम्पलेट 3′यूटीआर-यू30 (5'-बायोटिन-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3') के विस्तार को मापा।

एक ग्लाइसिन रिच लिंकर [जी 4 एसजी 4]) द्वारा NS3 प्रोटीज डोमेन के अवशेषों 1-177 से जुड़े NS2B कोफेसर के ZIKV प्रोटीज(45-96अवशेष प्राप्त किए गए थे, जैसा कि वाईएफवी9के लिए वर्णित है, जबकि पॉलीमरेज (आरडीआरपी डोमेन के 276-898 अवशेष) का क्लोन और व्यक्त किया गया था, जैसा कि10में विस्तृत है। दोनों एंजाइम दृश्य जेनबैंक ALU33341.1 से प्राप्त किए गए थे। प्राथमिक एंटीवायरल स्क्रीनिंग के रूप में, यौगिकों का परीक्षण 10 माइक्रोन पर किया जाता है और 80% ≥ गतिविधियों को दिखाने वालों का मूल्यांकन खुराक-निर्भर तरीके से किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रभावी/अवरोध (ईसी50 या आईसी50)और साइटोटॉक्सिक (सीसी50)सांद्रता होती है। प्रतिनिधि परिणामों के संदर्भ में, ईसी50 और सीसी50 मूल्य NITD008, एक ज्ञात फ्लेविवायरस अवरोधक11,रिप्लिकन-आधारित स्क्रीनिंग से दिखाए जाते हैं। एंजाइमेटिक परख के लिए, एमएमवी/डीएनडीआई महामारी रिस्पांस बॉक्स से दो यौगिकों केआईसी ५० मूल्यों को दिखाया गया है, जो जीवाणुरोधी, एंटीफंगल और एंटीवायरल गतिविधियों के साथ ४०० अणुओं से बना पुस्तकालय है । इस कार्य में वर्णित प्रोटोकॉल को अन्य संबंधित फ्लेविवायरस के अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

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Protocol

1. लूसिफ़ेरेस गतिविधि परख

नोट: सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं प्रमाणित जैवसेफता हुड (सामग्री की तालिकादेखें) में आयोजित की जाती हैं।

  1. 10% एफबीएस और 500 माइक्रोग्राम/एमएल G418 के साथ पूरक Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में शामिल विकास मीडिया तैयार करें।
  2. 100% DMSO में परीक्षण यौगिकों का 10 mm स्टॉक समाधान तैयार करें, और फिर उन्हें 100% DMSO में 1 mm तक पतला करें।
  3. एक सीओ2-आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर (सामग्री की तालिकादेखें) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 75 सेमी 2 संस्कृति फ्लास्क में विकास मीडिया में संस्कृति ZIKV Rluc replicon कोशिकाओं जब तक वे 70-90% योग्यता तक पहुंचने।
  4. माध्यम को त्याग दें। 5 से 10 मिनट के लिए फ्लास्क में ट्रिपसिन-ईडीटीए के 5 एमएल जोड़ें और फिर 5 मिनट के लिए 125 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
  5. सुपरनैंट को त्यागें, डीएमईएम 10% एफबीएस के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और हीमोसाइटोमीटर पर पुनर्नोकेड कोशिकाओं के 10 माइक्रोन की गणना करें।
  6. कोशिकाओं को 2 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से डीएमईएम 10% एफबीएस और बीज 100 माइक्रोन कोशिकाओं में अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) में समायोजित करें।
  7. सीओ 2-आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर (सामग्री की तालिकादेखें) में 37 डिग्री सेल्सियस पर16घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  8. इसके बाद, एक मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट के साथ माध्यम को त्यागें और प्लेट में डीएमईएम 2% एफबीएस के 100 μL/well जोड़ें।
  9. परख माध्यम में 10 माइक्रोन 1% DMSO की अंतिम एकाग्रता में परिणाम के लिए अच्छी तरह से प्रति यौगिकों के 1 μL जोड़ें । पहले कॉलम में, सकारात्मक नियंत्रण (100% अवरोध) के रूप में अंतिम कॉलम में नो अवरोध नियंत्रण और एनआईटीडी008 के रूप में केवल 1% डीएमएसओ जोड़ें।
  10. सीओ 2-आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर (सामग्री की तालिकादेखें) में 37 डिग्री सेल्सियस पर48घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  11. कमरे के तापमान पर रेनिला लूसिफ़ेरेस परख प्रणाली किट गल, एक 1x रेनिला लूसिफ़ेरेस Lysis बफर काम कर रहे समाधान और रेनिला लूसिफ़ेरेस रिएजेंट (परख बफर + सब्सट्रेट; १०० μL प्रति अच्छी तरह से) की एक उपयुक्त मात्रा तैयार करते हैं, निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
  12. एक मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट के साथ कोशिकाओं से सुपरनेट को त्यागें और प्रति अच्छी तरह से 1x रेनिला लूसिफ़ेरेस लाइसिस बफर के 25 माइक्रोल जोड़ें।
  13. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें और फिर एक मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट के साथ सेल लिस्लेट के 20 माइक्रोल को एक सफेद अपारदर्शी 96-वेल प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) में स्थानांतरित करें जिसमें 100 माइक्रोल/
  14. ल्यूमिनेसेंट संकेतों को एक ल्यूमिनोमीटर में या किसी भी उपकरण में पढ़ें जिसमें ल्यूमिनेसेंस (सामग्री की तालिकादेखें) को पढ़ने का विकल्प है।
  15. प्रत्येक प्लेट के लिए, जेड-फैक्टर मूल्य 12की गणना करें, इस प्रकार: जेड = 1 - ((3SD का नमूना + 3SD नियंत्रण) / │ नमूना का ईआन - नियंत्रण का मतलब│); एसडी - मानक विचलन। 0.5 और 1.0 के बीच एक जेड-कारक का अर्थ है एक अच्छी गुणवत्ता परख 12।
  16. यौगिकों के चुनाव आयोग50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए, चरण 1.3 से 1.8 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें और फिर कोशिकाओं में क्रमिक रूप से पतला यौगिकों को जोड़ें, नकारात्मक (1% डीएमएसओ) और सकारात्मक (10 माइक्रोन पर एनआईटीडी08) नियंत्रण के साथ। डुप्लिकेट में दो बार परख करें।
  17. यौगिक एकाग्रता प्रति निषेध दरों के औसत मूल्यों को प्लॉट करें और एक सिग्माइडल फिटिंग करने और ईसी50 मूल्यों को प्राप्त करने के लिए ग्राफ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

2. सेल प्रसार आधारित MTT परख

  1. आइटम 1 चरण 1.1 से 1.8 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।
  2. कोशिकाओं में शुरू में 10 माइक्रोन और नियंत्रण 1% DMSO पर यौगिकों जोड़ें ।
  3. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस - 137 एमएमएम एनएसीएल, में 5 मिलीग्राम/एमएल एमटीटी (3-(4,5-डाइमेथाइलथियाजोल-2-आईएल) - 2,5 डिफेनिल टेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड) समाधान तैयार करें एमटीटी के पूर्ण घुलनशीलीकरण तक 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8mM KH2PO 4, पीएच 7.4) और भंवर।
  4. अच्छी मात्रा (10 μL/well) के एक दसवें हिस्से में कोशिकाओं के लिए MTT समाधान जोड़ें ।
  5. 3-4 घंटे के लिए सीओ2-आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर (सामग्री की तालिकादेखें) में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  6. सुपरनेट को मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट के साथ त्यागें और प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ (100%) के 100 माइक्रोल जोड़ें।
  7. ऊपर और नीचे पाइपिंग करके formazan क्रिस्टल को सोलुबिलाइज करें और फिर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री की तालिकादेखें) में 570 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
  8. यौगिकों के सीसी50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए, आइटम 1 चरण 1.1 से 1.8 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें और फिर कोशिकाओं में क्रमिक रूप से पतला यौगिकों को जोड़ें, एक साथ नकारात्मक (1% डीएमएसओ) नियंत्रण। डुप्लिकेट में दो बार परख करें।
  9. यौगिक एकाग्रता प्रति निषेध दरों के औसत मूल्यों को प्लॉट करें और एक सिग्माइडल फिटिंग करने और सीसी50 मूल्यों को प्राप्त करने के लिए ग्राफ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

3. NS2B-NS3 प्रोटीज गतिविधि परख

  1. बर्फ पर एक प्रोटीन एलिकोट गल।
  2. प्लेट रीडर सेट करें (सामग्री की तालिकादेखें) तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  3. 80 एनएम (5 μL/well) को पतला प्रोटीन की विनियोजित मात्रा तैयार करें। अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 4 एनएम है।
  4. बर्फ पर Bz-nKRR-एएमसी सब्सट्रेट की उचित राशि गल (३०० μM स्टॉक समाधान परख बफर में पतला, 10 μL/अच्छी तरह से) ।
  5. एक 96-अच्छी तरह से सफेद प्लेट में (सामग्री की तालिकादेखें), प्रत्येक कुएं में परख बफर (20 एमएम ट्रिस पीएच 8.5, 5% ग्लिसरोल और 0.01% ट्राइटन एक्स-100) के 84 माइक्रोन वितरित करें।
  6. सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया बनाने के लिए, अंतिम कॉलम के प्रत्येक कुएं में 1 माइक्रोनिन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एप्रोटिनिन के 1 माइक्रोन को वितरित करें (स्टॉक समाधान 100 माइक्रोन पानी में पतला)
  7. नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया बनाने के लिए, पहले कॉलम में डीएमएसओ (अंतिम एकाग्रता 1%) के 1 माइक्रोन को वितरित किया जाता है।
  8. यौगिक स्क्रीनिंग करने के लिए, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं को छोड़कर 10 माइक्रोन (1 mm स्टॉक एकाग्रता) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक यौगिक के 1 μL बांटना।
  9. प्रोटीज समाधान के 5 माइक्रोन वितरित करें।
  10. प्लेट को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  11. प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, Bz-nKRR-एएमसी स्टॉक समाधान (30 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता) के 10 माइक्रोन बांटना।
  12. 460 एनएम के लिए उत्साह तरंगदैर्ध्य और उत्सर्जन सेट करें और एक माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिकादेखें) में हर 1 मिनट में 30 मिनट के लिए फ्लोरेसेंस पढ़ें। पूरे प्रयोग को 37 डिग्री सेल्सियस पर करें।
  13. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए फ्लोरेसेंस के मतलब मूल्यों की गणना करें। प्रोटीज़ गतिविधि के 100% के रूप में सेट करें नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए फ्लोरेसेंस का मतलब मूल्य सकारात्मक नियंत्रण के औसत मूल्य को घटाया जाता है और प्रत्येक यौगिक के लिए गतिविधि के प्रतिशत की गणना करता है।
  14. प्रत्येक प्लेट के लिए, जेड-फैक्टर मूल्य की गणना करें, जैसा कि चरण 1.15 में वर्णित है।
  15. आईसी50 यौगिकों के लिए दृढ़ संकल्प के साथ आगे बढ़ें जिन्होंने 80% से अधिक अवरोध दर का प्रदर्शन किया।
  16. यौगिक के धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करके, चरण 3.1-3.13 में वर्णित ट्रिप्लिकेट में परख करें।
  17. यौगिक एकाग्रता प्रति निषेध दरों के औसत मूल्यों को प्लॉट करें और एक सिग्माइडल फिटिंग करने और आईसी50 मूल्यों को प्राप्त करने के लिए ग्राफ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

4. NS5 RdRp विस्तार परख

नोट: इस परख में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री RNase, DNase और pyrogenase मुक्त प्रमाणित कर रहे हैं ।

  1. परख बफर (50 एमएम ट्रिस पीएच 7.0, 2.5 एमएम एमएनएल2,0.01% ट्राइटन एक्स-100) और 200 एमएम एटीपी स्टॉक सॉल्यूशन के साथ 0.1% डिथाइलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) ट्रीटेड पानी दोनों तैयार करें।
  2. एनील एक 5 माइक्रोन एलिकोट 200 माइक्रोन 3'यूटीआर-यू30 (5'-बायोटिन-यू30-ACUGGAGAUCUCUCCAGU-3') में एक थर्मोसाइकिलर में 5 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करके पानी का इलाज किया।
  3. बर्फ पर NS5 RdRp, 200 mm एटीपी और x10.000 SYBR ग्रीन I के शेयर समाधान गल।
  4. परख बफर के 3 एमएल में 250 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन को पतला करें।
  5. एटीपी, 3'यूटीआर-यू 30 और एसवाईबीआर ग्रीन आई के स्टॉक समाधानों को क्रमशः 1 mM,300 एनएम और 1X की अंतिम एकाग्रता के लिए परख बफर के 3 एमएल में कमजोर करके सब्सट्रेट समाधान तैयार करें।
  6. एक 96-अच्छी पीसीआर प्लेट में (सामग्री की तालिकादेखें), प्रत्येक पंक्ति के कॉलम 1 से 11 में पतला प्रोटीन का 24.5 माइक्रोन जोड़ें। शेष कुओं में परख बफर की एक ही मात्रा जोड़ें।
  7. नियंत्रण और खाली प्रतिक्रिया के लिए, कॉलम 1 और 12 में DMSO के 0.5 माइक्रोन जोड़ें। 10 μM 1mM स्टॉक समाधान की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएमएसओ में पतला यौगिक के 0.5 माइक्रोन जोड़ें।) ।
  8. एक सीलिंग फिल्म के साथ थाली सील और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  9. सब्सट्रेट समाधान के 25 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया शुरू करें और प्लेट को फिर से सील करें।
  10. एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट (सामग्री की तालिकादेखें) और 1 घंटे के लिए फ्लोरेसेंस की निगरानी, FAM फिल्टर के साथ हर 30 एस फ्लोरेसेंस को मापने (उत्सर्जन: 494 एनएम/उत्तेजन: 521 एनएम)।
  11. प्रत्येक प्लेट के लिए, जेड-फैक्टर मूल्य की गणना करें, जैसा कि चरण 1.15 में वर्णित है।
  12. आईसी50 यौगिकों के लिए दृढ़ संकल्प के साथ आगे बढ़ें जिन्होंने 80% से अधिक अवरोध दर का प्रदर्शन किया, जैसा कि चरण 3.15 में वर्णित है।
  13. यौगिक एकाग्रता प्रति निषेध दरों के औसत मूल्यों को प्लॉट करें और एक सिग्माइडल फिटिंग करने और आईसी50 मूल्यों को प्राप्त करने के लिए ग्राफ विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

यहां वर्णित सभी प्रोटोकॉल ९६-अच्छी प्लेटों में स्थिर थे और प्लेटों के पहले और अंतिम कॉलम में रखे गए नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रणों सहित एक ही एकाग्रता की प्राथमिक स्क्रीनिंग में प्रति प्लेट ८० यौगिकों के मूल्यांकन की अनुमति देता है । रिप्लिकन-आधारित स्क्रीनिंग का प्रतिनिधित्व चित्रा 1में किया जाता है, जिसमें बीएचके-21-RepZIKV_IRES-नियो सेल लाइन(चित्रा 1 ए),परख योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व(चित्रा 1 बी)और NITD008 (ईसी50 ऑफ 0.28 एम) प्राप्त करने के लिए विकसित आरएनए निर्माण शामिल है। सीसी50 > 10 माइक्रोन)(चित्रा 1C)। हिट यौगिकों के ईसी50 और सीसी50 मूल्यों को आरएलयूसी गतिविधि के 50% को बाधित करने और क्रमशः 50% साइटोटॉक्सिकिटी का कारण बनने के लिए आवश्यक सांद्रता के रूप में निर्धारित किया जाता है। लूसिफ़ेरेस परख के संबंध में, डीएमएसओ 1% का उपयोग नो इनरेटर कंट्रोल (0% अवरोध) के रूप में किया जाता है और NITD008 का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण (100% अवरोध) के रूप में किया जाता है, जैसा कि पहले8वर्णित है।

एनएसए 2बी-एनएसए 3 प्रोटीज गतिविधि को प्रोटीज(चित्रा 2 ए)की प्रोटियोलिटिक गतिविधि के कारण जारी एएमसी की फ्लोरेसेंस मॉनिटरिंग द्वारा मापा जाता है। एप्रोटिनिन, एक प्रोटीन जो ट्राइपसिन अवरोधक के रूप में कार्य करता है और पहले से ही फ्लेविवायरसप्रोटीज13, 14,15के अवरोधक के रूप में वर्णित है, इस परख में एक प्रायोगिक सकारात्मक नियंत्रण(0.13 ± 0.02 माइक्रोन, डेटा नहीं दिखाया गया) के रूप में इस परख में उपयोग किया गया था। चित्रा 2B प्रोटीज गतिविधि को लक्षित करने वाले अणु की खुराक-प्रतिक्रिया अवरोध वक्र को दिखाता है, यौगिक MMV1634402(आईसी 50 के 0.36 ± 0.08 माइक्रोन)। NS5 RdRp की विस्तार गतिविधि को वास्तविक समय में सियबीआर ग्रीन I की फ्लोरेसेंस तीव्रता में वृद्धि से मापा जाता है जब संश्लेषित डीएसआरएनए(चित्रा 2सी)के साथ इंटरकैलेटेड होता है। ZIKV RdRp को लक्षित करने वाले एक हिट अणु की खुराक-प्रतिक्रिया अवरोध वक्र, यौगिक MMV1782220(आईसी 50 के 1.9 ± 0.8 माइक्रोनएम), चित्रा 2Dमें दिखाया गया है। चूंकि NITD008 जैसे न्यूकोसाइड एनालॉग अवरोधक एंजाइमेटिक परख के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि फॉस्फेट को अणु16में अंतरकोशिकीय रूप से शामिल करने की आवश्यकता है, हमने NS5 RdRp विस्तार परख के लिए किसी भी सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग नहीं किया। हालांकि, क्लोफैज़माइन, एक वाणिज्यिक एंटीबायोटिक, जिसे हमने हाल ही में वायरल पॉलीमरेज8के अवरोधक के रूप में पहचाना है, को अगले परख में एक प्रयोगात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:रिप्लिकन-आधारित स्क्रीनिंग। A)ZIKV रिप्लिकन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 5 ' यूटीआर टर्मिनस में एक आरएलयूसी अनुक्रम और 3 ' यूटीआर टर्मिनस में एक नव जीन युक्त है, जिसे हमने बीएचके-21-RepZIKV-IRES_Neo सेल लाइन 8प्राप्त करने के लिए विकसित किया है । B)लूसिफ़ेरेस गतिविधि परख और सेल प्रसार आधारित एमटीटी परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ZIKV प्रतिकृति के अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया। C)एनआईटीडी008 की डोज-रिस्पांस वक्र्स (ईसी50और सीसी 50) । परख डुप्लीकेट में की गई। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:वायरल एंजाइम आधारित परख। A)NS2B-NS3 प्रोटीज गतिविधि परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। B)यौगिक MMV1634402 की खुराक-प्रतिक्रिया अवरोध वक्र(आईसी 50)। C)NS5 RdRp आरएनए पॉलीमरेज गतिविधि परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। D)यौगिक MMV1782220 की खुराक-प्रतिक्रिया अवरोध वक्र(आईसी 50)। परखों को त्रिपालियों में अंजाम दिया गया। त्रुटि सलाखों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से एक ३८४ या १५३६-अच्छी तरह से प्रारूपों में स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एचटीएस प्रारूप में किए गए जैव रासायनिक और/या सेल-आधारित स्क्रीनिंग के लिए, जेड ' फैक्टर वैल्यू, एक सांख्यिकीय पैरामीटर, प्रत्येक प्लेट के लिए गणना की जाती है ताकि उन परख की संवेदनशीलता, प्रजनन क्षमता और सटीकता सुनिश्चित की जा सके12। 0.5 या उससे अधिक के जेड कारक मूल्य को रिप्लिकन-आधारित स्क्रीनिंग के लिए अपेक्षित है जबकि एनएसए3 और एनएसए 5 गतिविधि परख के लिए 0.7 या उससे अधिक का मूल्य अपेक्षित है। रिप्लिकन-आधारित एचटीएस के लिए, हमने बीएचके-21-RepZIKV_IRES-नियो कोशिकाओं को विकसित किया है, एक स्थिर सेल लाइन जो 5 'यूटीआर क्षेत्र में रेनिला लूसिफ़ेरेस(आरएलयूसी)अनुक्रम युक्त एक प्रतिकृति ज़िकेवी रिप्लिकन को आश्रय देती है और एक नियोमाइसिन फॉस्फोट्रांजेक्शन (नियो) जीन 3'यूटीआर में एक आंतरिक रिबोसोमल एंट्री साइट (IRES) द्वारा संचालित है। हमने कैप्सिड के 38 अवशेषों और आवरण जीन के 30 अवशेषों को बनाए रखा जो आरएनए अनुवाद की सही शुरुआत के लिए आवश्यक हैं, ताकि कोशिका मार्ग8के बीच तुलनीय प्रतिकृति स्तर और नशीली दवाओं की संवेदनशीलता को बनाए रखा जा सके। संरचनात्मक जीन की कमी के कारण, रिप्लिकन संतान के विरनों का उत्पादन नहीं करते हैं, इस प्रकार प्रयोगशाला-अधिग्रहीत वायरल संक्रमण17के जोखिम को नष्ट करते हैं।

ज़िकव रिप्लिकन कोशिकाओं का उपयोग करने वाले एंटीवायरल परख में लूसिफ़ेरेस गतिविधि और सेल प्रसार-आधारित एमटीटी (साइटोटॉक्सिकिटी) परख समानांतर में प्रदर्शन किया जाता है। यह झूठी सकारात्मक हिट को बाहर करने के लिए आवश्यक है, जिसमें अणु शामिल हैं जो सीधे रिपोर्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति और/या गतिविधि के साथ हस्तक्षेप करते हैं और जो सेल स्वास्थ्य7को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करते हैं । रिप्लिकन सिस्टम अणुओं की खोज की अनुमति देता है जो आरएनए प्रतिकृति को रोकते हैं लेकिन वायरल प्रवेश और उग्र असेंबली/रिलीज के लिए आवश्यक नहीं हैं। वैकल्पिक रूप से, ट्रांस17 मेंसंरचनात्मक प्रोटीन प्रदान करके वायरस रिप्लीकॉन कणों (वीआरपी) का उत्पादन करने के लिए रिप्लिकन पैक किया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप एकल दौर संक्रामक कणों (SRIPs) संक्रामक हैं, लेकिन संतान वायरस के रूप में पैकेज जीनोम संरचनात्मक जीन का अभाव प्रचार नहीं कर सकते । इसलिए, वीआरपी का उपयोग रिपोर्टर प्रोटीन7के स्तर को मापकर वायरल प्रविष्टि/प्रतिकृति के अवरोधकों के लिए परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है ।

रिप्लिकन-आधारित स्क्रीनिंग के अलावा, हमने इसके साथ-साथ रीकॉम्बिनेंट एनएसए 3 प्रोटीज और एनएसए 5 आरडीआरपी के लिए वायरल एंजाइम-आधारित परख में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल में भी विस्तृत रूप से विस्तृत किया है। वायरल प्रोटेस की प्रोटाइलिटिक गतिविधि को फ्लोरोजेनिक पेप्टाइड सब्स-एनकेआरआर-एएमसी का उपयोग करके मापा गया था, जिसमें ज़िकव प्रोटेज़ रिकग्निशन और क्लीवेज सीक्वेंस शामिल हैं, जिसमें फ्लोरोसेंट टैग 7-अमीन-4-मिथाइलकोमरीन (एएमसी) के साथ मिलकर किया गया है । प्रोटीज गतिविधि के कारण, फ्लोरोसेंट टैग जारी किया जाता है और प्रतिक्रिया दर सीधे एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर18, 19में फ्लोरेसेंस की निगरानी करके मापीजातीहै। यह परख अत्यधिक समझदार, अपेक्षाकृत सस्ते, त्वरित और बड़े यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है20,21। प्रमुख दोष परीक्षण यौगिकों और फ्लोरोफोर के बीच संभावित शमन है जो झूठी-सकारात्मक हिट का कारण बन सकता है। हालांकि, इस मुद्दे को एएमसी की उपस्थिति में एक अतिरिक्त फ्लोरेसेंस माप द्वारा संबोधित किया जा सकता है । इसके अलावा फ्लोरोफोर की एक ही तरंगदैर्ध्य में उत्सर्जन या अवशोषण दिखाने वाले यौगिकों का मूल्यांकन इस विधि18,20द्वारा नहीं किया जा सकता .

NS5 RdRp के बारे में, इसकी विस्तार गतिविधि सीधे एक आत्म भड़काना 3'UTR-U30 टेम्पलेट के विस्तार के दौरान SYBR ग्रीन I के फ्लोरोसेंट संकेत की वृद्धि से पता चला है । इस प्रोटोकॉल को पिको ग्रीन और एसवाईटीओ 9 जैसे इंटरकैलिंग रंगों से अनुकूलित किया गया था, जिनका व्यापक रूप से विभिन्न वायरल बहुलकों22 , 23 , 24,25,26केलिए यौगिकों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया है । भले ही हमने परख में एक सेल्फ-प्राइमिंग बायोटिनाइलेटेड टेम्पलेट27 का इस्तेमाल किया है, लेकिन पोलियू जैसे अन्य टेम्पलेट्स का उपयोग25के साथ किया जा सकता है। इस विधि का मुख्य नुकसान झूठी-सकारात्मक हिट की उच्च संख्या है जो डाई के साथ बातचीत करती है, या तो फ्लोरेसेंस के साथ हस्तक्षेप करके या डीएसआरएनए इंटरकैलेशन28को कम करके। इसलिए, हिट यौगिकों को काउंटर-परख जैसे बायोफिजिक्स विधियों के साथ या एसवाईबीआर की तुलना करके मान्य करने की आवश्यकता है™ डीस् आरएनए में ग्रीन आई फ्लोरेसेंस के साथ और यौगिक29के बिना। फिर भी, आसान कार्यान्वयन, प्रत्यक्ष माप और सामर्थ्य रेडियो-लेबल या युग्मित परख की तुलना में एचटीएस प्लेटफार्मों के रूप में फ्लोरेसेंस-आधारित तरीकों के उपयोग के प्रमुख बिंदु हैं, जिन्हें मध्यम/बड़े पैमाने पर अभियानों27,30,31में लागू करना मुश्किल है।

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Disclosures

लेखक हितों का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को फंडाकाओ डी एम्पारो à पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईपी), सीईपीआईडी ग्रांट 2013/07600-3 टू गो द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान 2018/05130-3 RSF और 2016/19712-9 ASG के लिए, और Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível सुपीरियर (अनुदान 88887.516153/2020-00) ASG के लिए । हम मलेरिया वेंचर्स (एमएमवी, www.mmv.org) और उपेक्षित रोगों की पहल (डीएनडीआई, www.dndi.org) के लिए दवाओं को उनके समर्थन, महामारी प्रतिक्रिया बॉक्स के डिजाइन और यौगिकों की आपूर्ति के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 176
ज़िका वायरस प्रतिकृति के अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए उच्च थ्रूपुट एंटीवायरल परख
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