Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

Published: October 30, 2021 doi: 10.3791/62422
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1São Carlos Institute of Physics, University of Sao Paulo

Summary

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

Abstract

גילוי תרופות אנטי ויראליות דורש פיתוח של בדיקות ביוכימיות ותאיות אמינות שניתן לבצע בפורמטים של סינון תפוקה גבוהה (HTS). חלבוני הפלביוירוס הלא מבניים (NS) נחשבים להרכיב באופן תרגום משותף על ממברנות רטיקולום אנדופלסמי (ER), ויוצרים את קומפלקס השכפול (RC). ה- NS3 וה- NS5 הם האנזימים הנחקרים ביותר של ה- RC ומהווים את המטרות העיקריות לפיתוח תרופות בשל תפקידיהם המכריעים בשכפול הגנום הנגיפי. תחום הפרוטאז NS3, הדורש NS2B כגורם המשנה שלו, אחראי על המחשוף של פוליפרוטאין ויראלי לא בוגר לתוך חלבוני NS בוגרים, בעוד NS5 RdRp תחום אחראי על שכפול RNA. להלן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקולים המשמשים בהקרנות מבוססות replicon ובדיקות אנזימטיות לבדיקת ספריות מורכבות גדולות עבור מעכבי וירוס זיקה (ZIKV) שכפול. replicons הם מערכות תת-גנומיות המשכפלות את עצמם המתבטאות בתאי יונקים, שבהן הגנים המבניים הנגיפיים מוחלפים בגן עיתונאי. ההשפעות המעכבות של תרכובות על שכפול RNA ויראלי ניתן להעריך בקלות על ידי מדידת הירידה בפעילות חלבון הכתב. ההקרנות מבוססות השלילה בוצעו באמצעות קו תא BHK-21 ZIKV המבטא את רנילה לוציפראז כגן עיתונאי. כדי לאפיין את המטרות הספציפיות של תרכובות מזוהות, הקמנו בדיקות מבוססות פלואורסצנטיות במבחנה עבור פרוטאז NS3 ו- NS5 RdRp. הפעילות הפרוטאוליטית של הפרוטאז הנגיפי נמדדה באמצעות מצע הפפטיד הפלואורוגני Bz-nKRR-AMC, בעוד שפעילות התארכות NS5 RdRp זוהתה ישירות על ידי הגידול של האות הפלואורסצנטי של SYBR Green I במהלך התארכות RNA, באמצעות תבנית הפרימטינג העצמית הביוטינילית הסינתטית 3′UTR-U30 (5'-ביוטין-U30-ACUGGAGAUCUCUCCAGU-3').

Introduction

נגיף זיקה (ZIKV) הוא חבר וירוס מתפתח המועבר בפרוקי רגליים בסוג Flavivirus, הכולל את נגיף דנגי הקשורים קשר הדוק (DENV), וירוס דלקת המוח היפנית (JEV) ווירוס קדחת צהובה (YFV), המהווים איומים מתמידים על בריאות הציבור1. התפרצות ZIKV 2015-16 באמריקה קיבלה תשומת לב עולמית בעקבות הופעתה בברזיל בשל הקשר עם הפרעות נוירולוגיות חמורות, כגון מיקרוצפליה מולדת הקשורה ל- ZIKV בתינוקות2,3 ותסמונת גיליאן-בארה במבוגרים4. למרות שמספר מקרי ההדבקה ירד במהלך השנתיים הבאות, שידורים אוטוכטוניים המועברים על ידי יתושים של ZIKV אומתו ב -87 מדינות וטריטוריות בשנת 2019, ולכן, מה שמפנה את הפוטנציאל של הנגיף להתגלות מחדש כמגיפה5. עד כה, אין חיסונים מאושרים או תרופות יעילות נגד זיהום ZIKV.

גילוי תרופות אנטי-ויראליות דורש פיתוח של בדיקות תאיות וביוכימיות אמינות שניתן לבצע בפורמטים של סינון תפוקה גבוהה (HTS). הקרנות מבוססות Replicon ובדיקות ויראליות מבוססות אנזימים הן שתי אסטרטגיות חשובות לבדיקת תרכובות מולקולה קטנה עבור מעכבי ZIKV1. חלבוני הפלביוירוס הלא מבניים (NS) נחשבים להרכבה תרגומית משותפת על הממברנות הרטיקולום האנדופלזמי (ER), ויוצרים את קומפלקס השכפול (RC)6. ה- NS3 וה- NS5 הם האנזימים הנחקרים ביותר של ה- RC ומהווים את המטרות העיקריות לפיתוח תרופות בשל תפקידיהם המכריעים בשכפול הגנום הנגיפי. תחום פרוטאז NS3, הדורש NS2B כגורם המשנה שלו, אחראי על המחשוף של פוליפרוטאין ויראלי לא בוגר לתוך חלבוני NS בוגרים, ואילו NS5 RdRp תחום אחראי על שכפול RNA6.

replicons הם מערכות תת-גנומיות המשכפלות את עצמם המתבטאות בתאי יונקים, שבהן הגנים המבניים הנגיפיים מוחלפים בגן עיתונאי. ההשפעות המעכבות של תרכובות על שכפול RNA ויראלי ניתן להעריך בקלות על ידי מדידת הירידה בפעילות חלבון הכתב7. להלן, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים להקרנת מעכבי שכפול ZIKV בתבנית לוחית 96-well. ההסתה המבוססת על replicon בוצעה באמצעות BHK-21 ZIKV Rluc קו תא כי פיתחנו לאחרונה8. כדי לאפיין את המטרות הספציפיות של תרכובות מזוהות, הקמנו בדיקות מבוססות פלואורסצנטיות במבחנה עבור פרוטאז NS3 המובע באופן רקומביננטי באמצעות מצע הפפטיד הפלואורוגניים, Bz-nKRR-AMC, ואילו עבור NS5 RdRp מדדנו את ההארכה של תבנית הפרימה עצמית ביוטינילית סינתטית 3′UTR-U30 (5'-ביוטין-U30-ACUGGAGAUCUCUCUCCAGU-3'), באמצעות צבע intercalating SYBR Green I.

פרוטאז ZIKV (45-96 שאריות של קופקטור NS2B המקושר לשאריות 1-177 של NS3 תחום פרוטאז על ידי מקשר עשיר גליצין [G4SG4]) הושג, כמתואר עבור YFV9, בעוד פולימראז (276-898 שאריות של תחום RdRp) שוכפל ובא לידי ביטוי, כפי שמפורט ב10. שני רצפי האנזים נגזרו מ- GenBank ALU33341.1. כמו הקרנות אנטי ויראליות ראשוניות, תרכובות נבדקים ב 10 μM ואלה המציגים פעילויות ≥ 80% מוערכים לאחר מכן באופן תלוי מינון, וכתוצאה מכך יעיל / עיכוב (EC50 או IC50) ואת ריכוזים ציטוטוקסית (CC50). בהקשר של תוצאות מייצגות, ערכי EC50 ו CC50 של NITD008, מעכב flaviviruses ידוע11, מן הקרנות מבוססות replicon מוצגים. עבור התקפות אנזימטיות, ערכיIC 50 של שתי תרכובות מתיבת התגובה למגיפה MMV / DNDi, ספרייה המורכבת מ -400 מולקולות עם פעילויות אנטיבקטריאליות, אנטי פטרייתיות ואנטי ויראליות, מוצגים. הפרוטוקולים המתוארים בעבודה זו ניתן לשנות כדי לסנן מעכבים של flaviviruses הקשורים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פעילות לוציפראזה

הערה: ודא שכל ההליכים הקשורים לתרבות התאים מתנהלים בברדסים מאושרים של בטיחות ביולוגית (ראה טבלת חומרים).

  1. הכן מדיה צמיחה המורכבת בינונית של נשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 500 מיקרוגרם / מ"ל G418.
  2. הכן פתרון מלאי 10 mM של תרכובות שנבדקו ב- DMSO 100%, ולאחר מכן לדלל אותם ל 1 mM ב 100% DMSO.
  3. תרבות ZIKV Rluc replicon תאים במדיה צמיחה 75 ס"מ2 תרבית בקבוקון ב 37 °C בחממה CO2-לח (ראה טבלה של חומרים)עד שהם מגיעים 70-90% השפעה.
  4. זרוק את המדיום. הוסף 5 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוקון במשך 5 עד 10 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 125 x g במשך 5 דקות.
  5. השלך את supernatant, resuspend התאים ב 5 מ"ל של DMEM 10% FBS ולספור 10 μL של תאים resuspended בהמוציטומטר.
  6. התאים מתאימים ל-2 x 104 תאים/באר ב-DMEM 10% FBS וזרע 100 מיקרו-ל של תאים לבאר בצלחת תרבית תאים של 96-well (ראו טבלת חומרים).
  7. לדגור על הצלחת במשך 16 שעות ב 37 °C בחממה CO2-לח (ראה טבלה של חומרים).
  8. לאחר מכן, להשליך את המדיום עם micropipette רב ערוצי ולהוסיף 100 μL / באר של DMEM 2% FBS לצלחת.
  9. הוסף 1 μL של תרכובות לבאר כדי לגרום לריכוז הסופי של 10 μM 1% DMSO במצב בינוני. בעמודה הראשונה, הוסף רק 1% DMSO כבקרת ללא עיכוב ו- NITD008 בעמודה האחרונה, כשליטה חיובית (100% עיכוב).
  10. לדגור את הצלחת במשך 48 שעות ב 37 °C בחממה CO2-לח (ראה טבלה של חומרים).
  11. להפשיר את ערכת מערכת אסאי רנילה luciferase בטמפרטורת החדר, להכין 1x רניל לוציפראז תמיס חוצץ ונפח מתאים של ריאגנט רנילה לוציפראז (חוצץ אסאי + מצע; 100 μL לבאר), על פי הוראות היצרן.
  12. להשליך את supernatant מן התאים עם micropipette רב ערוצי ולהוסיף 25 μL של 1x רנילה לוציפראז ליסיס חוצץ לבאר.
  13. לדגור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולאחר מכן להעביר 20 μL של lysates התא עם micropipette רב ערוצית לצלחת אטומה לבנה 96-באר (ראה טבלה של חומרים) המכיל 100 μL / באר של רנילה לוציפראז אסאי ריאגנט.
  14. קרא את האותות הזוהרים ב- luminometer או בכל ציוד שיש לו את האפשרות לקרוא זוהר (ראה טבלת חומרים).
  15. עבור כל צלחת, לחשב את ערך גורם Z 12, כדלקמן: Z′ = 1 - ((3SD של מדגם + 3SD של שליטה)/│ממוצע של מדגם - ממוצע שליטה│); SD - סטיית תקן. גורם Z בין 0.5 ל-1.0 פירושו בדיקת אסאי באיכות טובה 12.
  16. כדי לקבוע את ערכי EC50 של תרכובות, המשך כמתואר בשלבים 1.3 עד 1.8 ולאחר מכן הוסף את התרכובות מדוללות באופן סדרתי לתאים , יחד עם הפקדים השליליים (1% DMSO) וחיוביים (NITD008 ב- 10 מיקרומטר). בצע את בדיקת ההסתה פעמיים בכפילויות.
  17. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי EC50.

2. תבחן MTT מבוסס התפשטות תאים

  1. המשך כמתואר בפריט 1 שלבים 1.1 עד 1.8.
  2. הוסף את התרכובות בתחילה ב 10 μM ואת הפקד 1% DMSO לתאים.
  3. הכן פתרון 5 מ"ג/מ"ל MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפניל טטרזוליום ברומיד) בתמיסת תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS - 137 מ"מ NaCl, 2,7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, 1,8 מ"מ KH2PO4; pH 7.4) ומערבולת עד סולוביליזציה מלאה של MTT.
  4. הוסף את פתרון MTT לתאים בעשירית מנפח הבאר (10 μL/well).
  5. לדגור על הצלחת ב 37 °C בחממה CO2לח (ראה טבלה של חומרים)עבור 3-4 שעות.
  6. השלך את supernatant עם micropipette רב ערוצי ולהוסיף 100 μL של DMSO (100%) לכל באר.
  7. Solubilize גבישי formazan על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאחר מכן לקרוא את הספיגה ב 570 ננומטר בספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים).
  8. כדי לקבוע את ערכיCC 50 של תרכובות, המשך כמתואר בפריט 1 שלבים 1.1 עד 1.8 ולאחר מכן הוסף את התרכובות מדוללות באופן סדרתי לתאים, יחד עם הפקד השלילי (1% DMSO). בצע את בדיקת ההסתה פעמיים בכפילויות.
  9. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי CC50.

3. NS2B-NS3 פעילות פרוטאז

  1. להפשיר עלי-קוט חלבונים על קרח.
  2. הגדר את הטמפרטורה של קורא הלוחות(ראה טבלת חומרים ) ל- 37°C.
  3. הכן את הכמות המתאימה של חלבון מדולל ל 80 ננומטר (5 μL / well). ריכוז החלבון הסופי הוא 4 ננומטר.
  4. להפשיר את הכמות המתאימה של מצע Bz-nKRR-AMC על קרח (פתרון מלאי 300 μM מדולל במאגר אסאי, 10 μL / טוב).
  5. בצלחת לבנה 96-well (ראה טבלה של חומרים),לחלק 84 μL של חוצץ אסאי (20 mM טריס pH 8.5, 5% גליסול ו 0.01% טריטון X-100) בכל באר.
  6. כדי להפוך את תגובת השליטה החיובית, לכל באר של העמודה האחרונה לוותר 1 μL של אפרוטינין כדי להשיג ריכוז סופי של 1 μM (פתרון מלאי 100 מיקרומטר מדולל במים)
  7. כדי להפוך את תגובת השליטה השלילית, לעמודה הראשונה לחלק 1 μL של DMSO (ריכוז סופי 1%).
  8. כדי לבצע את ההקרנה המורכבת, לחלק 1 μL של כל תרכובת כדי להשיג ריכוז סופי של 10 μM (1 mM ריכוז מלאי) למעט בארות שליטה חיובית ושלילית.
  9. מחלק 5 μL של פתרון פרוטאז.
  10. לדגור על הצלחת ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
  11. כדי להתחיל את התגובה, לוותר על 10 μL של פתרון מלאי Bz-nKRR-AMC (ריכוז סופי של 30 מיקרומטר).
  12. הגדר את אורך גל העירור ל 380 ננומטר ופליטה ל 460 ננומטר ולקרוא את פלואורסצנטיות במשך 30 דקות כל 1 דקות בקורא מיקרופלסטיק (ראה טבלה של חומרים). בצע את הניסוי כולו ב 37 °C (50 °F).
  13. חשב את הערכים הממוצעים של הפלואורסצנטיות עבור תגובות שליטה חיוביות ושליליות. הגדר כ- 100% מפעילות הפרוטאז את הערך הממוצע של פלואורסצנטיות לתגובות שליטה שליליות שהופחת מהערך הממוצע של שליטה חיובית וחשב את אחוזי הפעילות עבור כל מתחם.
  14. עבור כל צלחת, חשב את ערך גורם Z, כמתואר בשלב 1.15.
  15. המשך עם קביעתIC 50 עבור תרכובות שהפגינו שיעור עיכוב גבוה מ 80%.
  16. בצע את ההסתייגות במשולשים כמתואר בשלבים 3.1-3.13, באמצעות דילול סדרתי של המתחם.
  17. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי IC50.

4. NS5 RdRp הארכה

הערה: כל החומרים המשמשים ב- assay זה הם RNase, DNase ו pyrogenase ללא אישור.

  1. הכן הן את חיץ ה- Assay (50 mM Tris pH 7.0, 2.5 mM MnCl2, 0.01% טריטון X-100) והן את פתרון מלאי ATP 200 mM עם 0.1% מים מטופלים על ידי דיתילפירוקרבונט (DEPC).
  2. אנל 5 μL aliquot של 200 מיקרומטר 3′UTR-U30 (5'-ביוטין-U30-ACUGGAGAUCUCUCCAGU-3') במים שטופלו ב- PCR על ידי דגירה במשך 5 דקות ב 55 °C (55 °F) בתרמוציט.
  3. להפשיר את פתרון המלאי של NS5 RdRp, 200 mM ATP ו x10.000 SYBR ירוק I על קרח.
  4. לדלל את החלבון לריכוז סופי של 250 ננומטר ב 3 מ"ל של חוצץ אסאי.
  5. הכן פתרון מצע על ידי דילול פתרונות המלאי של ATP, 3'UTR-U30 ו SYBR ירוק I ב 3 מ"ל של מאגר בדיקה לריכוז סופי של 1 mM, 300 nM ו 1X, בהתאמה.
  6. בלוח PCR של 96 באר (ראה טבלת חומרים), הוסף 24.5 μL של חלבון מדולל בעמודות 1 עד 11 של כל שורה. הוסף את אותו נפח של מאגר צ'ייד בבארות הנותרות.
  7. לשליטה ולתגובה ריקה, הוסף 0.5 μL של DMSO בעמודות 1 ו- 12. הוסף 0.5 μL של תרכובת מדוללת DMSO לריכוז סופי של פתרון מלאי 1mM 10 μM).
  8. אוטמים את הצלחת בסרט איטום ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  9. התחל את התגובה על ידי הוספת 25 μL של פתרון מצע ולאטום את הצלחת שוב.
  10. דגירה ב 30 °C (50 °C) במערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלה של חומרים)ולנטר את הפלואורסצנטיות במשך שעה אחת, מדידת פלואורסצנטיות כל 30 s עם מסנן FAM (פליטה:494 ננומטר / עירור:521 ננומטר).
  11. עבור כל צלחת, חשב את ערך גורם Z, כמתואר בשלב 1.15.
  12. המשך עם קביעתIC 50 עבור תרכובות שהפגינו שיעור עיכוב גבוה מ 80%, כפי שתואר בשלב 3.15.
  13. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי IC50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן יובשו בלוחות 96-well ומאפשר הערכה של 80 תרכובות לצלחת בהקרנה ראשונית של ריכוז יחיד, כולל הפקדים השליליים והחיוביים שהוצבו בעמודה הראשונה והאחרונה של הלוחות, בהתאמה. ההקרנות מבוססות replicon מיוצגות באיור 1, הכולל את מבנה הרנ"א שפותח כדי להשיג את קו התא BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo (איור 1A),הייצוג הסכמטי של בדיקות(איור 1B)ועקומות תגובת המינון של NITD008 (EC50 של 0.28 μM, CC50 > 10 μM) (איור 1C). ערכי EC50 ו- CC50 של תרכובות פגע נקבעים כמו הריכוזים הנדרשים כדי לעכב 50% של פעילות Rluc ולגרום 50% ציטוטוקסיות, בהתאמה. ביחס לפייסת לוציפראז, DMSO 1% משמש כשליטה ללא מעכבות (0% עיכוב) ו NITD008 משמש כשליטה חיובית (100% עיכוב), כפי שתואר בעבר8.

פעילות הפרוטאז NS2B-NS3 נמדדת על ידי ניטור פלואורסצנטיות של AMC ששוחרר עקב הפעילות הפרוטאוליטית של הפרוטאז (איור 2A). אפרוטינין, חלבון הפועל כמעכב טריפסין וכבר מתואר כמעכב של פרוטאזים flavivirus13,14,15, שימש בדיקה זו כמו שליטה חיובית ניסיונית (IC50 של 0.13 ± 0.02 μM, נתונים לא הראו). איור 2B ממחיש עקומת עיכוב תגובת מינון של מולקולה המתמקדת בפעילות הפרוטאז, ה-MMV1634402 (IC50 של 0.36 ± 0.08 מיקרומטר). פעילות התארכות NS5 RdRp נמדדת בזמן אמת על ידי העלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של SYBR Green I כאשר משולבת עם dsRNA מסונתז (איור 2C). עקומת עיכוב תגובת המינון של מולקולת פגע מיקוד ZIKV RdRp, התרכובת MMV1782220 (IC50 של 1.9 ± 0.8 מיקרומטר), מוצג איור 2D. מאז מעכבים אנלוגיים נוקלאוזיד, כגון NITD008, אינם מתאימים לבדיקות אנזימטיות, כמו פוספטים צריך להיות משולב תאית למולקולה16, לא השתמשנו בכל שליטה חיובית עבור NS5 RdRp התארכות. עם זאת, Clofazimine, אנטיביוטיקה מסחרית, אשר לאחרונה זיהינו כמעכב של פולימראז ויראלי8, יכול לשמש בקרה ניסיונית ב assays הבא.

Figure 1
איור 1: הקרנות מבוססות רפליקון. A) ייצוג סכמטי של מבנה replicon ZIKV המכיל רצף Rluc בטרמינל UTR 5 ' וטוגן בטרמינל UTR 3 ', שפיתחנו כדי להשיג את BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo קו התא 8. B) ייצוג סכמטי של בדיקת פעילות לוציפראז ובדיקת MTT מבוססת התפשטות תאים שבוצעה כדי לסנן מעכבים של שכפול ZIKV. ג) עקומות תגובת המינון (EC50 ו- CC50) של NITD008. ההסתה בוצעה בכפילויות. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תפילת אנזים ויראלית המבוססת על אנזים, א)ייצוג סכמטי של פעילות פרוטאז NS2B-NS3. B) עקומת עיכוב תגובת המינון (IC50) של תרכובת MMV1634402. ג) ייצוג סכמטי של NS5 RdRp RNA RNA פעילות פעילות 2000. D) עקומת עיכוב תגובת המינון (IC50) של תרכובת MMV1782220. ההסתה בוצעה במשולשים. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים כאן יכולים להיות מותאמים בקלות להקרנות בפורמטים של 384 או 1536-well. עבור הקרנות ביוכימיות ו/או מבוססות תאים המבוצעות בתבנית HTS, ערך פקטור Z' , פרמטר סטטיסטי, מחושב עבור כל צלחת כדי להבטיח את הרגישות, הרבייה והדיוק של בדיקותאלה 12. ערך פקטור Z של 0.5 ומעלה צפוי להקרנות מבוססות replicon בעוד ערך של 0.7 ומעלה צפוי לבדיקות הפעילות של NS3 ו- NS5. עבור HTS מבוסס replicon, פיתחנו את BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo תאים, קו תא יציב מחסה replicon ZIKV משוכפל המכיל רצף רנילה לוציפראז(Rluc)באזור 5 'UTR וטובין phosphotransferase (ניאו) מונע על ידי אתר כניסה ריבוזומלי פנימי (IRES) ב 3 'UTR. שמרנו על 38 שאריות של קפסיד ו -30 שאריות של גנים עוטפים הנדרשים לייזום נכון של תרגום ה- RNA, כדי לשמור על רמות שכפול דומות ורגישות לסמים בין מעברי תאים8. בשל היעדר גנים מבניים, replicons אינם מייצרים virions צאצאים, ובכך לחסל את הסיכון של זיהום ויראלי שנרכש במעבדה17.

ההסתה האנטי-ויראלית באמצעות תאי replicon ZIKV מורכבת מפעילות לוציפראז ובדיקות MTT (ציטוקסיות) מבוססות התפשטות תאים המבוצעות במקביל. זה הכרחי כדי לא לכלול להיטים חיוביים כוזבים, הכוללים מולקולות המפריעות ישירות לביטוי ו/או לפעילות של חלבון הכתב ואלה המשפיעים לרעה על בריאות התא7. מערכות Replicon מאפשרות גילוי של מולקולות המעכבות שכפול RNA אך לא אלה הנדרשות לכניסה ויראלית והרכבה / שחרור virion. לחלופין, ניתן לארוז את השרליונים כדי לייצר חלקיקי שאריות וירוסים (VRPs) על ידי אספקת החלבונים המבניים בטראנס17. חלקיקים זיהומיים חד-סיבוביים (SRIPs) המתקבלים הם זיהומיים, אך נגיף צאצאים אינו יכול להתפשט מכיוון שגנום החבילה חסר גנים מבניים. לכן, VRPs יכול לשמש כדי לבדוק מעכבי כניסה / שכפול ויראלי על ידי מדידת רמות חלבון הכתב7.

בנוסף להקרנות המבוססות על replicon, פירטנו גם כאן את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזימים ויראליים עבור פרוטאז NS3 רקומביננטי ו- NS5 RdRp. הפעילות הפרוטאוליטית של הפרוטאז הנגיפי נמדדה באמצעות מצע הפפטיד הפלואורוגני Bz-nKRR-AMC, המכיל את זיהוי הפרוטאז ZIKV ורצף המחשוף בשילוב עם התג הפלואורסצנטי 7-אמין-4-מתילקומוארין (AMC). בשל פעילות הפרוטאז, התג פלואורסצנטי משתחרר וקצב התגובה נמדד ישירות על ידי ניטור הפלואורסצנטיות בספקטרופוטומטר18,19. בדיקה זו היא הגיונית מאוד, זולה יחסית, מהירה ומתאימה להקרנה של ספריות מורכבות גדולות20,21. החיסרון העיקרי הוא מרווה אפשרי בין תרכובות שנבדקו פלואורופור שיכול להוביל להיטים חיוביים כוזבים. עם זאת, בעיה זו יכולה להיות מטופלת על ידי מדידת פלואורסצנטיות נוספת בנוכחות AMC. כמו כן, תרכובות המציגות פליטה או ספיגה באותו אורך גל של הפלואורופור לא ניתן להעריך בשיטה זו18,20.

לגבי NS5 RdRp, פעילות התארכותו מזוהה ישירות על ידי הגידול של האות הפלואורסצנטי של SYBR Green I במהלך התארכות של תבנית 3'UTR-U30. הפרוטוקול הותאם מביזונים עם צבעים משולבים כגון Pico Green ו- SYTO 9 שהיו בשימוש נרחב להערכת תרכובות עבור פולימראזים ויראליים שונים22,23,24,25,26. למרות שהשתמשנו בתבנית ביוטינילית עצמית27 בבחינת, ניתן להשתמש בתבניות אחרות, כגון poliU, גם25. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא המספר הגבוה של להיטים שווא חיוביים אינטראקציה עם הצבע, או על ידי הפרעה פלואורסצנטיות או על ידי הפחתת intercalation dsRNA28. לכן, תרכובות פגע צריך להיות מאומת עם נגד assays כגון שיטות ביופיסיקה או על ידי השוואת SYBR™ ירוק I פלואורסצנטי ב dsRNA עם ובלי המתחם29. עם זאת, היישום הקל, המדידה הישירה והמחיר הזול הם נקודות מפתח לשימוש בשיטות מבוססות פלואורסצנטיות כפלטפורמות HTS, בהשוואה לתווית רדיו או מצמדים שקשה ליישם בקמפיינים בקנה מידה בינוני/גדול27,30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID grant 2013/07600-3 to GO, grant 2018/05130-3 ל- RSF ו- 2016/19712-9 ל- ASG, ו- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (grant 88887.516153/2020-00) ל- ASG. ברצוננו להודות בהכרת תודה לרפואה על מלריה ונצ'רס (MMV, www.mmv.org) וליוזמת התרופות למחלות מוזנחות (DNDi, www.dndi.org) על תמיכתם, עיצוב תיבת התגובה למגיפה ואספקת התרכובות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' Dharmacon - 100 ng
96-well cell culture plates KASVI K12-096
96-well PCR Microplate KASVI K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate Corning 3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin) SIGMA-Aldrich 257370 100 mg
Aprotinin from bovine lung SIGMA-Aldrich A1153 10 mg
ATP JenaBioscience NU-1010-1G 1 g
Bz-nKRR-AMC International Peptides - 5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet ESCO
Diethyl pyrocarbonate SIGMA-Aldrich D5758 25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide) SIGMA-Aldrich 472301 1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GIBCO 3760091
Fetal Bovine Serum GIBCO 12657-029 500 mL
G418 SIGMA-Aldrich A1720 Disulfate salt
Glycerol SIGMA-Aldrich G5516 1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate SIGMA-Aldrich 203734 25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Invitrogen M6494
NITD008 ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich SML2409 5 mg
qPCR system Mx3000P Agilent
Renilla luciferase Assay System PROMEGA E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader Molecular Devices
SYBR Green I Invitrogen S7563 500 µl
Triton X-100 SIGMA-Aldrich X100 500 mL
Trizma base SIGMA-Aldrich T1503 1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X SIGMA-Aldrich 59417-C 100 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  2. Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
  3. de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
  4. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  5. Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
  6. Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
  7. Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
  8. Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
  9. Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
  10. Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
  11. Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
  12. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  13. Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
  14. Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
  15. Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
  16. Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
  17. Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
  18. Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
  19. Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
  20. Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
  21. Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
  22. Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
  23. Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
  24. Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
  25. Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  26. Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
  27. Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
  28. Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
  29. Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
  30. Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
  31. Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 176
בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandes, R. S., Noske, G. D.,… More

Fernandes, R. S., Noske, G. D., Gawriljuk, V. O., de Oliveira, K. I. Z., Godoy, A. S., Mesquita, N. C. M. R., Oliva, G. High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication. J. Vis. Exp. (176), e62422, doi:10.3791/62422 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter