Summary
I dette arbejde beskriver vi de protokoller, der anvendes i repliconbaserede og virale enzymbaserede assays til at screene for hæmmere af zikavirusreplikation i et screeningsformat med høj overførselshastighed.
Abstract
Antiviral lægemiddelopdagelse kræver udvikling af pålidelige biokemiske og cellulære analyser, der kan udføres i højgennemsigtstvisningsformater (HTS). Flavivirus ikke-strukturelle (NS) proteiner menes at co-translationelt samle på endoplasmic reticulum (ER) membraner, der danner replikation kompleks (RC). NS3 og NS5 er de mest studerede enzymer i RC og udgør de vigtigste mål for lægemiddeludvikling på grund af deres afgørende roller i viral genom replikation. NS3 protease domæne, som kræver NS2B som sin cofaktor, er ansvarlig for kavalergang af den umodne viral polyprotein i de modne NS proteiner, mens NS5 RdRp domæne er ansvarlig for RNA replikation. Heri beskriver vi i detaljer de protokoller, der anvendes i repliconbaserede screeninger og enzymatiske analyser til at teste store sammensatte biblioteker for hæmmere af Zika-virus (ZIKV) replikation. Replikoner er selvreplikerende subgenomiske systemer udtrykt i pattedyrceller, hvor de virale strukturelle gener erstattes af et reporter-gen. De hæmmende virkninger af forbindelser på viral RNA replikation kan let vurderes ved at måle reduktionen i reporter protein aktivitet. De replicon-baserede screeninger blev udført ved hjælp af en BHK-21 ZIKV replicon celle linje udtrykker Renilla luciferase som en reporter gen. For at karakterisere de specifikke mål for identificerede forbindelser etablerede vi in vitro fluorescensbaserede analyser til rekombinant udtrykt NS3 protease og NS5 RdRp. Den virale proteases proteolytiske aktivitet blev målt ved hjælp af det fluorogene peptidsubstrat Bz-nKRR-AMC, mens NS5 RdRp-forlængelsesaktiviteten blev direkte opdaget ved stigningen i det fluorescerende signal fra SYBR Green I under RNA-forlængelse ved hjælp af den syntetiske biotinylerede selvansugende skabelon 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3').
Introduction
Zikavirus (ZIKV) er et spirende leddyrbårent virusmedlem af slægten Flavivirus, som omfatter den nært beslægtede Dengue virus (DENV), japansk encephalitisvirus (JEV) og Yellow Fever-virus (YFV), der udgør konstante trusler mod folkesundheden1. Zikv-udbruddet i 2015-16 i Amerika fik global opmærksomhed efter dets fremkomst i Brasilien på grund af sammenhængen med alvorlige neurologiske lidelser, såsom medfødt ZIKV-associeret mikrocefali hos nyfødte2,3 og Guillain-Barré syndrom hos voksne4. Selv om antallet af smittetilfælde faldt i løbet af de næste to år, blev autoktone myggebårne transmissioner af ZIKV verificeret i 87 lande og territorier i 2019, hvilket viser virussens potentiale til at genopstå som enepidemi 5. Til dato er der ingen godkendte vacciner eller effektive lægemidler mod ZIKV-infektion.
Antiviral lægemiddelopdagelse kræver udvikling af pålidelige cellulære og biokemiske analyser, der kan udføres i HTS-formater (high-throughput screening). Repliconbaserede screeninger og virale enzymbaserede analyser er to værdifulde strategier til at teste småmolekyleforbindelser til hæmmere af ZIKV1. Flavivirus ikke-strukturelle (NS) proteiner menes at co-translationelt samle på endoplasmaiske reticulum (ER) membraner, der danner replikation kompleks (RC)6. NS3 og NS5 er de mest studerede enzymer i RC og udgør de vigtigste mål for lægemiddeludvikling på grund af deres afgørende roller i viral genom replikation. NS3 protease domæne, som kræver NS2B som sin cofaktor, er ansvarlig for kavalergang af den umodne viral polyprotein i de modne NS proteiner, mens NS5 RdRp domæne er ansvarlig for RNA replikation6.
Replikoner er selvreplikerende subgenomiske systemer udtrykt i pattedyrceller, hvor de virale strukturelle gener erstattes af et reporter-gen. De hæmmende virkninger af forbindelser på viral RNA-replikation kan let vurderes ved at måle reduktionen i reporterproteinaktiviteten7. Heri beskriver vi de protokoller, der anvendes til screeningshæmmere af ZIKV-replikationen i et 96-brønds pladeformat. De replicon-baserede assays blev udført ved hjælp af en BHK-21 ZIKV Rluc replicon celle linje, som vi for nylig har udviklet8. For at karakterisere de specifikke mål for identificerede forbindelser etablerede vi in vitro fluorescensbaserede analyser til rekombinant udtrykt NS3 protease ved hjælp af det fluorogene peptidsubstrat, Bz-nKRR-AMC, mens vi for NS5 RdRp målte forlængelsen af den syntetiske biotinylerede selvansende skabelon 3'UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3'), ved hjælp af det interkalerende farvestof SYBR Green I.
Zikv protease (45-96 restkoncentrationer af NS2B-cofaktor, der er knyttet til restkoncentrationer 1-177 af NS3-proteasedomænet af en glycinrig linker [G4SG4]) blev fremstillet som beskrevet for YFV9, mens polymerase (276-898 rester af RdRp-domæne) blev klonet og udtrykt som beskrevet i10. Begge enzymsekvenser er afledt af GenBank ALU33341.1. Som primære antivirale screeninger testes forbindelser ved 10 μM, og dem, der viser aktiviteter ≥ 80 %, vurderes derefter på en dosisafhængig måde, hvilket resulterer i en effektiv/hæmning (EF50 eller IC50) og koncentrationerne af cytotoksisk (CC50). I forbindelse med repræsentative resultater vises EF50- og CC50-værdierne af NITD008, en kendt flavivirushæmmer11, fra repliconbaserede screeninger. For de enzymatiske analyser vises IC50-værdierne af to forbindelser fra MMV/DNDi Pandemic Response Box, et bibliotek bestående af 400 molekyler med antibakterielle, svampedræbende og antivirale aktiviteter. De protokoller, der er beskrevet i dette arbejde, kan ændres til at screene for hæmmere af andre relaterede flavivirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Luciferase aktivitet assay
BEMÆRK: Sørg for, at alle procedurer, der involverer cellekultur, udføres i certificerede biosikre emhætter (se Materialetabel).
- Forbered vækstmedier bestående af Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 500 μg/mL G418.
- Forbered en 10 mM lageropløsning af testede forbindelser i 100% DMSO, og fortynd dem derefter til 1 mM i 100% DMSO.
- Kultur ZIKV Rluc repliconceller i vækstmedier i en 75 cm2-kulturkolbe ved 37 °C i en CO2-befugtetinkubator (se Materialetabel),indtil de når 70-90% sammenløb.
- Kassér mediet. Tilsæt 5 mL trypsin-EDTA til kolben i 5 til 10 min og derefter centrifuge cellerne ved 125 x g i 5 min.
- Kassér supernatanten, brug cellerne i 5 mL AF DMEM 10% FBS og tæl 10 μL af ophængte celler ved et hæmocytometer.
- Juster cellerne til 2 x 104 celler/brønd i DMEM 10% FBS og frø 100 μL celler pr. brønd i en 96-brønds cellekulturplade (se Materialetabel).
- Pladen inkuberes i 16 timer ved 37 °C i en CO2-befugtetinkubator (se Materialetabel).
- Kassér derefter mediet med en multikanalmikropipette, og der tilsættes 100 μL/brønd af DMEM 2% FBS til pladen.
- Der tilsættes 1 μL af forbindelserne pr. brønd for at resultere i en endelig koncentration på 10 μM 1% DMSO i analysemedium. I den første kolonne tilsættes kun 1% DMSO som en no hæmningskontrol og NITD008 i den sidste kolonne som en positiv kontrol (100% hæmning).
- Pladen inkuberes i 48 timer ved 37 °C i en CO2-befugtetinkubator (se Materialetabel).
- Optø Renilla luciferase Assay System kit ved stuetemperatur, forberede en 1x Renilla luciferase Lysis Buffer arbejdsløsning og en passende mængde Renilla Luciferase reagens (Assay buffer + substrat; 100 μL per brønd), i henhold til producentens anvisninger.
- Kassér supernatanten fra cellerne med en multikanalmikropipette, og tilsæt 25 μL 1x Renilla luciferase Lysis Buffer pr. Brønd.
- Pladen inkuberes ved stuetemperatur i 15 min og overføres derefter 20 μL cellelytter med en multikanalmikropipette til en hvid uigennemsigtig 96-brøndsplade (se Materialetabel),der indeholder 100 μL/brønd af Renilla luciferase Assay Reagent.
- Læs selvlysende signaler i et luminometer eller i udstyr, der har mulighed for at læse luminescens (se Materialetabel).
- For hver plade beregnes Z-faktorværdien 12på følgende måde: Z' = 1 - ((3SD af prøve + 3SD kontrol)/│Prøveværdi - Gennemsnit af kontrol│); SD - standardafvigelse. En Z-faktor mellem 0,5 og 1,0 betyder en analyse af god kvalitet 12.
- For at bestemme EC50-værdierne af forbindelser skal du fortsætte som beskrevet i trin 1.3 til 1.8 og derefter tilføje de forbindelser, der er serielt fortyndet til cellerne , sammen med de negative (1% DMSO) og positive (NITD008 ved 10 μM) kontroller. Udfør analysen to gange i dubletter.
- Plot gennemsnitsværdierne for hæmningsrater pr. sammensat koncentration, og brug en grafanalysesoftware til at udføre en sigmoidal montering og opnå EC50-værdierne.
2. Cellespredningsbaseret MTT-analyse
- Fortsæt som beskrevet i punkt 1 trin 1.1 til 1.8.
- Tilsættes i første omgang forbindelserne ved 10 μM og kontrol 1% DMSO til cellerne.
- Der fremstilles en opløsning på 5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromid) i fosfatbufferet saltvand (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4; pH 7,4) og vortex indtil fuldstændig solubilisering af MTT.
- Tilsættes MTT-opløsningen til cellerne ved en tiendedel af brøndvolumenet (10 μL/brønd).
- Pladen inkuberes ved 37 °C i en CO2-befugtetinkubator (se Materialetabel)i 3-4 timer.
- Kassér supernatanten med en multikanalmikropipette, og tilsæt 100 μL DMSO (100%) til hver brønd.
- Opløse formazankrystallerne ved at pipetter op og ned og derefter aflæse absorbansen ved 570 nm i et spektrofotometer (se Materialetabel).
- For at bestemme CC50-værdierne af forbindelser skal du fortsætte som beskrevet i punkt 1 trin 1.1 til 1.8 og derefter tilføje de forbindelser, der er serielt fortyndet til cellerne, sammen den negative (1% DMSO) kontrol. Udfør analysen to gange i dubletter.
- Plot de gennemsnitlige værdier af hæmning satser pr sammensatte koncentration og bruge en graf analyse software til at udføre en sigmoidal montering og opnå CC50 værdier.
3. NS2B-NS3 protease aktivitet assay
- Optø en protein aliquot på is.
- Indstil pladelæseren (se materialetabellen)temperatur til 37 °C.
- Den tilsatte mængde protein fortyndet til 80 nM (5 μL/brønd). Den endelige proteinkoncentration er 4 nM.
- Optø den passende mængde Bz-nKRR-AMC-substrat på is (300 μM lageropløsning fortyndet i analysebuffer, 10 μL/brønd).
- I en 96-brønd hvid plade (se Materialetabel),dispensere 84 μL af assay buffer (20 mM Tris pH 8,5, 5% glycerol og 0,01% Triton X-100) i hver brønd.
- For at gøre den positive kontrolreaktion, til hver brønd i den sidste kolonne dispensere 1 μL af Aprotinin at opnå endelig koncentration af 1 μM (lageropløsning 100 μM fortyndet i vand)
- For at foretage den negative kontrolreaktion skal der til den første kolonne dispenseres 1 μL DMSO (endelig koncentration 1%).
- For at udføre den sammensatte screening skal der dispenseres 1 μL af hver forbindelse for at opnå den endelige koncentration på 10 μM (1 mM lagerkoncentration) eksklusive positive og negative kontroltjælde.
- Dispenser 5 μL af proteaseopløsningen.
- Inkuberes pladen ved 4 °C i 30 minutter.
- For at starte reaktionen skal der dispenseres 10 μL Bz-nKRR-AMC-lageropløsning (endelig koncentration på 30 μM).
- Indstil excitationsbølgelængden til 380 nm og emissionen til 460 nm, og læs fluorescensen i 30 min hvert 1. minut i en mikropladelæser (se Materialetabel). Udfør hele eksperimentet ved 37 °C.
- Beregn de gennemsnitlige værdier af fluorescens for positive og negative kontrolreaktioner. Set som 100% af proteaseaktiviteten den gennemsnitlige værdi af fluorescens for negative kontrolreaktioner fratrukket af den gennemsnitlige værdi af positiv kontrol og beregne aktivitetsprocenterne for hver forbindelse.
- For hver plade beregnes Z-faktorværdien som beskrevet i trin 1.15.
- Fortsæt med IC50 bestemmelse for forbindelser, der udviste en hæmning sats højere end 80%.
- Analysen udføres i triplikater som beskrevet i trin 3.1-3.13 ved hjælp af en seriel fortynding af forbindelsen.
- Plot de gennemsnitlige værdier af hæmning satser pr sammensatte koncentration og bruge en graf analyse software til at udføre en sigmoidal montering og opnå IC50 værdier.
4. NS5 RdRp forlængelse assay
BEMÆRK: Alle materialer, der anvendes i denne analyse, er RNase, DNase og pyrogenasefri certificeret.
- Tilbered både analysebufferen (50 mM Tris pH 7,0, 2,5 mM MnCl2, 0,01% Triton X-100) og 200 mM ATP-lageropløsningen med 0,1% diethylpyrocarbonat (DEPC) behandlet vand.
- Anneal a 5 μL aliquot af 200 μM 3′UTR-U30 (5'-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCCAGU-3') i PCR-behandlet vand ved at inkubere det i 5 minutter ved 55 °C i en termocykel.
- Optø lageropløsningen af NS5 RdRp, 200 mM ATP og x10.000 SYBR Green I på is.
- Proteinet fortyndes til en endelig koncentration på 250 nM i 3 mL analysebuffer.
- Klargør substratopløsning ved at fortynde lageropløsningerne i ATP, 3'UTR-U30 og SYBR Green I i 3 mL analysebuffer til en endelig koncentration på henholdsvis 1 mM, 300 nM og 1X.
- I en 96-brønd PCR-plade (se Materialetabel) tilsættes 24,5 μL fortyndet protein i kolonne 1 til 11 i hver række. Tilføj den samme mængde assay buffer i de resterende brønde.
- Ved kontrol og tom reaktion tilsættes 0,5 μL DMSO i kolonne 1 og 12. Der tilsættes 0,5 μL forbindelse fortyndet i DMSO til en endelig koncentration på 10 μM 1mM lageropløsning).
- Forsegl pladen med en forseglingsfilm og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Start reaktionen ved at tilsætte 25 μL substratopløsning og forsegle pladen igen.
- Inkuberes ved 30 °C i et PCR-system i realtid (se Materialetabel)og overvåg fluorescensen i 1 time og måler fluorescensen hver 30'er med FAM-filteret (Emission:494 nm/Excitation:521 nm).
- For hver plade beregnes Z-faktorværdien som beskrevet i trin 1.15.
- Fortsæt med IC50 bestemmelse for forbindelser, der udviste en hæmning sats højere end 80%, som beskrevet i trin 3.15.
- Plot de gennemsnitlige værdier af hæmning satser pr sammensatte koncentration og bruge en graf analyse software til at udføre en sigmoidal montering og opnå IC50 værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle de protokoller, der er beskrevet heri, blev stukket i 96-brøndsplader og gør det muligt at vurdere 80 forbindelser pr. plade i en primær screening af en enkelt koncentration, herunder de negative og positive kontroller, der blev placeret ved henholdsvis første og sidste kolonne af pladerne. De repliconbaserede screeninger er repræsenteret i figur 1, som omfatter RNA-konstruktionen, der er udviklet til at opnå BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo-cellelinjen (figur 1A),den skematiske gengivelse af analyser (figur 1B) og dosisresponskurverne på NITD008 (EF50 af 0,28 μM, CC50 > 10 μM) (figur 1C). EC50- og CC50-værdierne af hitforbindelser bestemmes som de koncentrationer, der er nødvendige for at hæmme henholdsvis 50 % af Rluc-aktiviteten og forårsage 50 % cytotoksicitet. Med hensyn til luciferase assay, DMSO 1% anvendes som en no inhibitor kontrol (0% hæmning) og NITD008 bruges som en positiv kontrol (100% hæmning), som tidligere beskrevet8.
NS2B-NS3 proteaseaktiviteten måles ved fluorescensovervågning af AMC, der frigives på grund af proteolytisk aktivitet af protease (figur 2A). Aprotinin, et protein, der virker som trypsinhæmmer og allerede beskrives som en hæmmer af flavivirusproceaser13,14,15, blev brugt i denne analyse som en eksperimentel positiv kontrol (IC50 af 0,13 ± 0,02 μM, data, der ikke er vist). Figur 2B illustrerer en dosis-respons hæmning kurve af et molekyle rettet mod protease aktivitet, forbindelsen MMV1634402 (IC50 af 0,36 ± 0,08 μM). Den forlængelse aktivitet NS5 RdRp måles i realtid ved stigningen i fluorescens intensiteten af SYBR Green I, når intercalated med syntetiseret dsRNA (Figur 2C). Dosis-respons hæmning kurve af et hit molekyle rettet mod ZIKV RdRp, den sammensatte MMV1782220 (IC50 af 1,9 ± 0,8 μM), er vist i figur 2D. Da nukleoside analoge hæmmere, såsom NITD008, ikke er egnede til enzymatiske assays, da fosfater skal indarbejdes intracellulært tilmolekylet 16, brugte vi ikke nogen positiv kontrol til NS5 RdRp forlængelse assay. Men, Clofazimin, et kommercielt antibiotikum, som vi for nylig identificeret som en hæmmer af viral polymerase8, kunne bruges som en eksperimentel kontrol i næste assays.
Figur 1: Repliconbaserede screeninger. A) Skematisk repræsentation af ZIKV replicon konstruktion, der indeholder en Rluc sekvens på 5 'UTR endestation og en Neo gen på 3 'UTR endestation, at vi har udviklet til at opnå BHK-21-RepZIKV-IRES_Neo celle linje 8. B) Skematisk repræsentation af luciferaseaktivitetsanalysen og cellespredningsbaseret MTT-analyse, der udføres for at screene for hæmmere af ZIKV-replikation. C) Dosisresponskurverne (EF50 og CC50) i NITD008. Analysen blev udført i dubletter. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Virale enzymbaserede analyser. A) Skematisk repræsentation af NS2B-NS3 proteaseaktivitetsanalyse. B) Dosis-respons hæmning kurve (IC50) af sammensatte MMV1634402. C) Skematisk repræsentation af NS5 RdRp RNA polymerase aktivitet assay. D) Dosis-respons hæmning kurve (IC50)af sammensatte MMV1782220. Analyserne blev udført i triplikater. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoller, der er beskrevet heri, kunne let tilpasses til screeninger i et 384 eller 1536-brønd-format. For biokemiske og/eller cellebaserede screeninger, der udføres i HTS-format, beregnes Z's faktorværdi, en statistisk parameter, for hver plade for at sikre følsomheden, reproducerbarheden og nøjagtigheden af disse analyser12. Der forventes en Z'-faktorværdi på 0,5 eller derover for repliconbaserede screeninger, mens der forventes en værdi på 0,7 eller derover for NS3- og NS5-aktivitetsanalyserne. For replicon-baserede HTS, har vi udviklet BHK-21-RepZIKV_IRES-Neo celler, en stabil celle linje huser en replikativ ZIKV replicon, der indeholder en Renilla luciferase (Rluc)sekvens på 5 'UTR regionen og en neomycin fosfotransferase (Neo) gen drevet af en intern ribosomal entry site (IRES) på 3'UTR. Vi beholdt 38 rester af capsid og 30 rester af omsluttige gener, der er nødvendige for korrekt indledning af RNA-oversættelsen, for at opretholde sammenlignelige replikationsniveauer og lægemiddelfølsomhed mellem cellepassager8. På grund af manglen på strukturelle gener producerer replikoner ikke afkomvirioner, hvilket eliminerer risikoen for laboratorieerhvervet virusinfektion17.
De antivirale analyser ved hjælp af ZIKV repliconcellerne består i luciferaseaktiviteten og de cellespredningsbaserede MTT-analyser (cytotoksicitets), der udføres parallelt. Dette er nødvendigt for at udelukke falsk-positive hits, der omfatter molekyler, der forstyrrer direkte med reporterproteinudtrykket og / eller aktiviteten og dem, der påvirker cellesundhedennegativt 7. Replicon systemer gør det muligt at finde molekyler, der hæmmer RNA replikation, men ikke dem, der kræves for viral indrejse og virion samling / frigivelse. Alternativt kan repliconer emballeres til fremstilling af virus repliconpartikler (VRPs) ved at levere de strukturelle proteiner i trans17. De resulterende enkeltrundede infektiøse partikler (SRIPs) er smitsomme, men afkomvirus kan ikke formere sig, da pakkegenomet mangler strukturelle gener. Derfor kan VRP'er bruges til at teste for hæmmere af viral indrejse / replikation ved at måle niveauet af reporterproteinet7.
Ud over de repliconbaserede screeninger beskrev vi også heri de protokoller, der anvendes i virale enzymbaserede assays til rekombinant NS3 protease og NS5 RdRp. Den virale proteases proteolytiske aktivitet blev målt ved hjælp af det fluorogene peptidsubstrat Bz-nKRR-AMC, som indeholder ZIKV proteasegenkendelses- og kavalergangssekvensen kombineret med fluorescerende tag 7-amine-4-methylcoumarin (AMC). På grund af proteaseaktiviteten frigives fluorescerende tag, og reaktionshastigheden måles direkte ved at overvåge fluorescensen i et spektrofotometer18,19. Denne analyse er meget fornuftig, relativt billig, hurtig og velegnet til screening af store sammensatte biblioteker20,21. Den største ulempe er den mulige slukning mellem testede forbindelser og fluorophor, der kan føre til falsk-positive hits. Dette problem kan imidlertid løses ved hjælp af en yderligere fluorescensmåling i nærværelse af AMC. Forbindelser, der viser emission eller absorption i samme bølgelængde af fluorophoren, kan heller ikke vurderes ved denne metode18,20.
Med hensyn til NS5 RdRp, dens forlængelse aktivitet er direkte opdaget af stigningen i fluorescerende signal af SYBR Green I under forlængelsen af en selvansugende 3'UTR-U30 skabelon. Protokollen blev tilpasset fra assays med intercalating farvestoffer såsom Pico Green og SYTO 9, der har været meget udbredt til at evaluere forbindelser til forskellige virale polymeraser22,23,24,25,26. Selvom vi har brugt en selvansugende biotinyleret skabelon27 i analysen, kan andre skabeloner, såsom poliU, også bruges25. Den største ulempe ved denne metode er det høje antal falsk-positive hits, der interagerer med farvestoffet, enten ved at forstyrre fluorescensen eller ved at reducere dsRNA intercalation28. Derfor skal hitforbindelser valideres med modanalyser som biofysikmetoder eller ved at sammenligne SYBR™ Grøn I fluorescens i dsRNA med og uden forbindelsen29. Ikke desto mindre er den nemme implementering, direkte måling og overkommelige priser centrale punkter i brugen af fluorescensbaserede metoder som HTS-platforme sammenlignet med radiomærkede eller koblede analyser , der er vanskelige at gennemføre i mellemstore /store kampagner27,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), CEPID tilskud 2013/07600-3 til GO, tilskud 2018/05130-3 til RSF og 2016/19712-9 til ASG og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (tilskud 88887.516153/2020-00) til ASG. Vi vil gerne takke Medicine for Malaria Ventures (MMV, www.mmv.org) og initiativet Lægemidler mod oversete sygdomme (DNDi, www.dndi.org) for deres støtte, design af Pandemic Response Box og levering af forbindelserne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3' | Dharmacon | - | 100 ng |
| 96-well cell culture plates | KASVI | K12-096 | |
| 96-well PCR Microplate | KASVI | K4-9610 | |
| 96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate | Corning | 3922 | |
| AMC (7-amine-4-methylcoumarin) | SIGMA-Aldrich | 257370 | 100 mg |
| Aprotinin from bovine lung | SIGMA-Aldrich | A1153 | 10 mg |
| ATP | JenaBioscience | NU-1010-1G | 1 g |
| Bz-nKRR-AMC | International Peptides | - | 5 mg |
| Class II Biohazard Safety Cabinet | ESCO | ||
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA-Aldrich | D5758 | 25 mL |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | SIGMA-Aldrich | 472301 | 1 L |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | GIBCO | 3760091 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12657-029 | 500 mL |
| G418 | SIGMA-Aldrich | A1720 | Disulfate salt |
| Glycerol | SIGMA-Aldrich | G5516 | 1 L |
| HERACELL VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MnCl2 tetrahydrate | SIGMA-Aldrich | 203734 | 25 g |
| MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) | Invitrogen | M6494 | |
| NITD008 ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | SML2409 | 5 mg |
| qPCR system Mx3000P | Agilent | ||
| Renilla luciferase Assay System | PROMEGA | E2810 | |
| SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader | Molecular Devices | ||
| SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | ||
| SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | 500 µl |
| Triton X-100 | SIGMA-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Trizma base | SIGMA-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Trypsin-EDTA Solution 1X | SIGMA-Aldrich | 59417-C | 100 mL |
References
- Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. 534 (7606), 267-271 (2016).
- de Araújo, T. V. B., et al. Association between microcephaly, Zika virus infection, and other risk factors in Brazil: Final report of a case-control study. The Lancet Infectious Diseases. 18 (3), 328-336 (2018).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Pielnaa, P., et al. Zika virus-spread, epidemiology, genome, transmission cycle, clinical manifestation, associated challenges, vaccine and antiviral drug development. Virology. 543, 34-42 (2020).
- Bollati, M., et al. Structure and functionality in flavivirus NS-proteins: Perspectives for drug design Flaviviral NS3 protein Flaviviral NS5 protein Protease Helicase Polymerase Methyltransferase Flavivirus protein structure Antivirals VIZIER Consortium. Antiviral Research. 87, 125-148 (2010).
- Fernandes, R. S., et al. Reporter replicons for antiviral drug discovery against positive single-stranded RNA viruses. Viruses. 12 (6), (2020).
- Fernandes, R. S., et al. Discovery of an imidazonaphthyridine and a riminophenazine as potent anti-Zika virus agents through a replicon-based high-throughput screening. Virus Research. 299, 198388 (2021).
- Noske, G. D., et al. Structural characterization and polymorphism analysis of the NS2B-NS3 protease from the 2017 Brazilian circulating strain of Yellow Fever virus. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1864 (4), 129521 (2020).
- Godoy, A. S., et al. Crystal structure of Zika virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. Nature Communications. 8, 14764 (2017).
- Yin, Z., et al. An adenosine nucleoside inhibitor of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (48), 20435-20439 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Brecher, M., Zhang, J., Li, H. The flavivirus protease as a target for drug discovery. Virologica Sinica. 28 (6), 326-336 (2013).
- Noble, C. G., Seh, C. C., Chao, A. T., Shi, P. Y. Ligand-bound structures of the dengue virus protease reveal the active conformation. Journal of Virology. 86 (1), 438-446 (2012).
- Chen, X., et al. Mechanisms of activation and inhibition of Zika virus NS2B-NS3 protease. Cell Research. 26 (11), 1260-1263 (2016).
- Eyer, L., Nencka, R., de Clercq, E., Seley-Radtke, K., Růžek, D. Nucleoside analogs as a rich source of antiviral agents active against arthropod-borne flaviviruses. Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 26, (2018).
- Xie, X., et al. Zika Virus Replicons for Drug Discovery. EBioMedicine. 12, 156-160 (2016).
- Pan, K. L., Lee, J. C., Sung, H. W., Chang, T. Y., Hsu, J. T. A. Development of NS3/4A protease-based reporter assay suitable for efficiently assessing hepatitis C virus infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4825-4834 (2009).
- Khumthong, R., Angsuthanasombat, C., Panyim, S., Katzenmeier, G. In Vitro Determination of Dengue Virus Type 2 NS2B-NS3 Protease Activity with Fluorescent Peptide Substrates. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35 (2), (2002).
- Ulanday, G. E. L., Okamoto, K., Morita, K. Development and utility of an in vitro, fluorescence-based assay for the discovery of novel compounds against dengue 2 viral protease. Tropical Medicine and Health. 44 (1), 1-10 (2016).
- Ong, I. L. H., Yang, K. L. Recent developments in protease activity assays and sensors. Analyst. 142 (11), 1867-1881 (2017).
- Eltahla, A. A., Lackovic, K., Marquis, C., Eden, J. S., White, P. A. A fluorescence-based high-throughput screen to identify small compound inhibitors of the genotype 3a hepatitis c virus RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 18 (9), 1027-1034 (2013).
- Eydoux, C., et al. A fluorescence-based high throughput-screening assay for the SARS-CoV RNA synthesis complex. Journal of Virological Methods. 288, 114013 (2021).
- Shimizu, H., et al. Discovery of a small molecule inhibitor targeting dengue virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (11), 1-21 (2019).
- Sáez-Álvarez, Y., Arias, A., del Águila, C., Agudo, R. Development of a fluorescence-based method for the rapid determination of Zika virus polymerase activity and the screening of antiviral drugs. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Kocabas, F., Turan, R. D., Aslan, G. S. Fluorometric RdRp assay with self-priming RNA. Virus Genes. 50 (3), 498-504 (2015).
- Niyomrattanakit, P., et al. A fluorescence-based alkaline phosphatase-coupled polymerase assay for identification of inhibitors of dengue virus RNA-Dependent RNA polymerase. Journal of Biomolecular Screening. 16 (2), 201-210 (2011).
- Simeonov, A., Davis, M. I. Interference with Fluorescence and Absorbance Flow Chart Fluorescence Interferences. (Md). , 1-8 (2016).
- Genick, C. C., et al. Applications of biophysics in high- Throughput screening hit validation. Journal of Biomolecular Screening. 19 (5), 707-714 (2014).
- Smith, T. M., et al. Identifying initiation and elongation inhibitors of dengue virus RNA polymerase in a high-throughput lead-finding campaign. Journal of Biomolecular Screening. 20 (1), 153-163 (2015).
- Porecha, R., Herschlag, D. RNA radiolabeling. Methods in enzymology. 530, 255-279 (2013).
