Summary
介绍了通过 MRGPRX2 受体生成短肽库以激活桅杆细胞的技术。相关技术简单、便宜，可扩展到其他细胞受体。
Abstract
识别特定于具有治疗意义的细胞受体的配体对于许多应用至关重要，包括设计和开发新的治疗方法。与Mas相关的G蛋白受体-X2（MRGPRX2）是调节乳腺细胞活化的重要受体，因此指导一般免疫反应。已确定MGPRX2的众多配体，包括PAMP、防御素、LL-37和其他蛋白质片段（即降解白蛋白）等内源性肽。进一步鉴定MGPRX2特定配体需要筛选大量的肽（即肽库）;然而，桅杆细胞很难和昂贵的体 外 维持，因此，不经济地用于筛选大量的分子。本文演示了使用 MRGPRX2 表达 HEK 细胞设计、开发和筛选小肽分子库的方法。这种细胞系相对容易和便宜的维护，可用于 体外 高通量分析。一种对钙敏感的Fura-2荧光染料，用于监测活化后细胞内钙通量。Fura-2 的荧光强度在 510 nm 时与激发波长 340 和 380 nm 的比例用于计算钙浓度。用于验证该系统的肽库基于内源性前列腺素 N-终端 12 （PAMP-12） 秘密，已知该秘密库将 MRGPRX2 与高特异性和亲和力结合。随后的肽通过氨基酸截断和应用于PAMP-12的阿兰宁扫描技术产生。此处描述的方法简单且价格低廉，但坚固耐用，用于筛选大量化合物库，以识别在受体激活中发挥重要作用的结合域和其他重要参数。
Introduction
乳腺细胞是免疫系统不可分割的一部分，在先天和自适应免疫反应中起着至关重要的作用。乳腺细胞主要通过抗原与免疫球蛋白E（IgE）-FcéRI受体复合物结合，或者通过最近发现的与男性相关的G-蛋白受体X2（MRGPRX2）1激活。MRGPRX2激活与多种免疫和炎症性疾病有关，因此，了解受体与其配体2的结合机制非常重要。为此，开发并筛选了一个小型肽分子库，对在 HEK 细胞中过度表达的 MRGPRX2 受体进行筛选。在这项研究中，肽库是使用简单多才多艺的阿兰宁扫描和氨基酸截断技术构建的。阿兰宁扫描涉及用阿兰宁残留物取代特定的氨基酸。Alanine 是小而中性的，剥离了被替换残留物赋予的特定特性的肽，并连续突出了氨基酸在受体相互作用中各自的物理化学特性的重要性。相反，在氨基酸截断中，肽序列的设计使其缺少来自N终端、C终端或两者兼有的一个或多个氨基酸残留物。这组肽用于识别对 MRGPRX2 结合至关重要的氨基酸序列。
人类桅杆细胞系（LAD-2）的经验表明，这些细胞很难 在体外培养和维持：两周的加倍时间，昂贵的中等补充剂，以及通过3期间需要的直接注意。这些属性使细胞不适合大规模筛选潜在的配体。在这里，稳定地转染的 HEK 细胞表示 MRGPRX2 受体 （HEK-X2） 用于筛选肽库1。HEK-293细胞由于其高转化效率、较快的翻倍率以及需要在实验室4中培养非昂贵的中等补充剂，被广泛用于表面受体的异质表达。转染 HEK-293 细胞线的方案已经得到证明，并且已经建立了5。HEK-293细胞稳定地表达MRGPRX2受体（通道13-19）被激活与肽通过N截断，C-截断，N+C截断，和丙氨酸扫描1产生。野生型 HEK 细胞 （HEK-WT） （通道 16-21） 用作控制。激活后监测细胞内钙释放，以研究基于MGPRX2的活化。
MRGPRX2 的细胞激活后，细胞溶胶钙动员。乳腺细胞中这种受调节的细胞内钙释放由存储操作的钙进入 （SOCE） 调节，由频闪相互作用分子 1 （STIM1） 协调：并且是免疫反应级联6，7的核心。各种方法已用于检测细胞内钙浓度，包括贴片夹和荧光染料8。在现有的所有技术中，氟钙染料与各种检测技术结合，正在被广泛使用。获得兴趣的两种氟染料是：单波长染料（如 Fluo-4）和双波长比例染料（如印度 -1 和 Fura-2）。双波长比度染料带来单波长染料的优势在于，双波长比度染料纠正了染料加载、照片漂白和聚焦10、11等实验错误。
Fura-2 乙酰酯（Fura-2 AM）是一种细胞渗透的绿色荧光染料，其激发在钙结合后会转移到较低的波长。实验中，Fura-2 的兴奋度为 340 和 380 nm，而排放记录为 510 nm。钙结合后，340纳米的荧光强度增加，而380纳米的荧光强度降低，如图 1所示。数据表示为 340 nm （F340） 激发后的荧光强度与 380 nm （F380） 即 F340/F380 激发后的荧光强度比率。F340/F380的比例是成正比的细胞内钙，其价值可以通过格林凯维奇方程12计算。由于荧光信号来自两波长（340 nm 和 380 nm）的染料激发，荧光信号的比例对染料加载、染料泄漏、光出血和细胞密度等实验因素进行了修正。
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Protocol
1. 肽库的设计与开发
- 要根据已知的配体即 PAMP-1213来识别桅杆细胞 MRGPRX2 受体的配体，请按照以下步骤操作。
- 通过连续通过固相肽合成（SPPS）截断配体的N端氨基酸残留物，生成N截断肽库。
- 通过截断已知配体的 C 端氨基酸残留物，由 SPPS 连续截断 C 截断肽库。"
- 根据 1.1.1 和 1.1.2 的结果，分别通过截断 N 和 C 端所需的残留物，使用 SPPS 生成 N+C 截断肽库。
- 使用固相肽合成合成肽13。
- 将 N 端修改为乙酰 （Ac） 组，将 C 端修改为阿米德组。
- 使用高压液相色谱仪 （HPLC） 和使用质谱光度计的质量来描述肽的纯度。
- 要研究父PAMP-12分子中特定氨基酸的重要性，请遵循以下步骤。
- 通过用丙氨酸取代肽分子中各自的氨基酸残留物，生成阿兰宁扫描肽库，一次使用 SPPS。将 N 端修改为乙酰 （Ac） 组，将 C 端修改为阿米德组。
- 使用高压液相色谱仪 （HPLC） 和使用质谱光度计的质量来描述肽的纯度。
注意：确保合成肽的纯度高。使用质谱学和 HPLC 来描述肽的特征。
2.体外 细胞培养
- 通过以下步骤培养 HEK-X2 和 HEK-WT 细胞。
- 通过补充高葡萄糖DMEM与10%胎儿牛血清（FBS），2mM L-麸质胺，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素补充培养介质。
- 通过组织培养（TC）处理T-75培养瓶的细胞，在含有5%CO2的37°C的孵化器中生长，直到它们达到75-80%的汇合。
- 一旦75%的汇流，洗细胞，并添加2-3mL的试丁鱼2-3分钟。在 37 °C、5% CO2 孵化器中孵育，分离细胞。
- 一旦细胞分离，收集细胞在试金。加入6-9兆L的新鲜介质。
- 以 1620 x g 离心细胞 3-5 分钟。
- 离心后，丢弃超高纳特收集颗粒。将细胞重新用新鲜培养培养物中恢复。根据所需的浓度稀释细胞。
注意：HEK细胞是快速生长的细胞，因此优化细胞介质补充剂。HEK细胞是粘附细胞;通过他们在TC处理的文化烧瓶，以支持粘附。
- 为实验准备一个 96 井测定板。
- 在每口井中加入200微升的细胞悬浮，浓度为200，000细胞/mL，以播种40，000个细胞/井。
- 在 37 °C、5% CO 2 孵化器中将细胞培养24 小时。
注：根据板大小和细胞应变类型优化每口井的细胞密度。在黑色 TC 处理的 96 井板中用平透明底部进行三重切片实验。
3. Fura-2 上午钙检测
- 按照下面的步骤准备染料。
- 使用 Fura-2 AM 染料进行实验。
- 准备 HEPES-Tyrode 的缓冲区 （HTB） 缓冲器，其中包含 25 m HEPES 缓冲器、120 mM NaCl、5 mM KCl、1 毫克/mL 葡萄糖、1 毫克/mL 牛血清白蛋白 （BSA）以及新鲜添加的 1.8 mM CaCl2 在高压灭菌水中。
- 在 50 μg Fura-2 AM 小瓶中加入 50 μL 的 DMSO，以准备 1 mM 库存解决方案的 Fura-2 AM 染料。每 ML 新鲜介质添加 1 μL 1 m Fura-2 AM 染料，以准备具有 1 μM 染料浓度的染料加载介质。
- 从孵化器中取出 96 井板并丢弃介质。用新鲜的染料加载介质替换介质。在每口井中加入 200 μL 的染料装载介质。在37°C、5%CO2孵化器中孵育细胞30-40分钟。
- 孵化40分钟后，取出介质。用 HTB 缓冲器清洗细胞。添加 100 μL 的 HTB 缓冲器，用于荧光读取。拿盘子读荧光。
注：优化染料加载介质中染料的浓度。染料泄漏和光出血可能是与染料相关的问题。将新鲜加入的 CaCl2 添加到 HTB 缓冲器中以避免降水。
4. 细胞激活和荧光读数
注：带自动管道系统的荧光板读卡器允许化合物从复合源自动转移到检测板，而无需将板从板读取器中取出。
- 当细胞被孵育时，设置 板读取器。
- 将 温度 设置为 37 °C。
- 在 设置中，选择 Flex。
- 将 阅读模式 设置为 荧光 和 底部读取。
- 在 波长中， 将 波长 数设置为 2。将 激发设置 为 340 nm 和 380 nm。将 排放 设置为 510 nm。
- 将 敏感度 保留为 默认值。
- 在 时间，将 间隔 设置为3.9s。将 运行时间 设置为 94s 以获得 25 读取。
- 接下来，选择 检测板类型。
- 接下来，选择 威尔斯阅读。
- 在 复合转移中，将 转移 设置为 1， 初始卷 设置为 100 μL。 将 派佩特高度 设置为 100 μL， 将音量 设置为 50 μL， 将时间点 设置为 36 s，以便在第 10 读取时添加化合物。
- 接下来，选择 复合源 板类型。
- 离开三叶草不使用。
- 选择 派佩特提示布局中的提示。
- 对于 复合柱和尖端柱，确保要转移的化合物位于复合板的第 1 列中。将 提示列 设置为 1， 将复合列 设置为 1。
- 离开 自动校准 作为 打开。
- 单击 "确定"。
- 当温度达到 37 °C 时，将板加载到 板读取器中。
- 按 阅读室 ，将 检测板 放入荧光 板读卡器中。
- 按 源 放置 复合板。通过添加 200 μL 的各自肽、离子霉素和乙二醇乙二醇（β-氨基乙醚）-N、N、N+、N+-四乙酸 （EGTA）-Triton X-100 溶液，准备 复合板 。
- 按 下提示机架 以放置 提示框。使用黑色尖端以避免尖端自动荧光。
- 加载板后，请查看软件的设置并按 "阅读"。
5. 数据分析
- 通过格林凯维奇方程从荧光比中确定钙浓度 -
其中，Kd 是 Fura-2 AM 的分离常数，R 是激发后的排放比，分别在 340 nm 和 380 nm （F340/F380） 上， Rmax 是通过添加 50 μL 的 30 μM 离子霉素来观察到的最大荧光比，R分钟 是通过添加 50 μL 的 100 m M EGTA/2.5%Triton X-100 来观察到的最小荧光， 和F380分钟 和F380最大 是Fura-2AM的绝对荧光强度在无钙和绑定状态，分别。
注：机器会以一定的力量分配液体。不要将肽分配高度设置得离板底太近：它可以分离细胞。使用黑色移液器提示，以避免自发光。阅读每个实验中每个板的最大荧光和最小荧光。
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Representative Results
表1包含通过末期氨基酸截断和丙氨酸扫描产生的肽序列。如表1所示，肽序列RKKWNKWALSR缺乏N终端苯丙氨酸（F）的母体PAMP-12，因此是N截断库中具有代表性的肽。同样，在FRKKWNKWALS中，PAMP-12 C终端血清已被移除，代表从PAMP-12衍生的C-截断肽库。在N+C截断肽库中，从N和C终端中去除氨基酸。从N终端截断4个氨基酸，从PAMP-12的C终端截断1个残留物，在WNKWALS中产生。从丙氨酸扫描中提取的肽库有一种氨基酸被阿兰宁取代，就像ARKWNKWALSR一样，N终端苯丙氨酸被阿兰宁取代。Fura-2 AM染料用于研究多肽对MRGPRX2变异的赫克细胞1的活化潜力。数据记录在荧光板读取器上。如果肽配体激活细胞，以 340 nm （F340） 抽出的荧光会增加，而 380 nm 波长 （F380） （图 1a）的荧光度也会增加。然而，对于空白（或为该事项非激活肽或 HEK-WT 控制），相对增加和减少将分别较低，如图 2a 所示。然而，钙浓度由F340/F380的比例表示，如图1b，2b所示。 F340/F380的比例可以在格林凯维奇方程中进一步替代，以便使用原位校准获得钙浓度（图3）。表1所列肽的特点是质谱（图4a）和HPPC（图4b），发现纯度高。
| 肽技术 | 佩普蒂德代表 |
| 父母肽 | 阿克 - 弗克温克瓦尔斯尔 - 阿米德 |
| N-截断 | 阿克 - 克温克瓦尔斯 - 阿米德 |
| C-截断 | 阿克 - 弗克温克瓦尔斯 - 阿米德 |
| N+C-截断 | 阿克 - 温克瓦尔斯 - 阿米德 |
| 阿兰宁扫描 | 阿克 - 阿克温克瓦尔斯 - 阿米德 |
表1：N、C 和 N+C - 截断和丙氨酸扫描后产生的代表性肽序列。肽的N终端被乙酰修改，而C终端包含一个中间体组。
图1：激活肽的代表性数据。 （a） 激活肽的荧光信号。所代表的数据对应于 PAMP-12（FRKKWNKWALSR）。肽是在生成 10 个读取周期（36s）的基线后添加的，箭头如图所示。（b） 激发后的荧光排放比为340纳米（F340），激发后荧光排放的比例为380纳米（F380）（F340/F380）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：空白代表数据。 （a） 空白的荧光信号。HTB 是在生成 10 个读取周期 （36s） 的基线后添加的，如箭头所示。（b） 激发后的荧光排放比为340纳米（F340），激发后荧光排放的比例为380纳米（F380）（F340/F380）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：染料校准标准的代表数据。（a） 离子霉素被添加在第10读数，如箭头所示，以获得最大荧光在Ca+2绑定状态。EGTA-Triton X-100 是在箭头显示的 20 个读数后添加的，以获得最小信号。（b） 激发后的荧光排放比为340纳米（F340），激发后荧光排放的比例为380纳米（F380）（F340/F380）。这些值被进一步放在格林凯维奇方程中，以获得细胞内钙的浓度。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：具有代表性肽的特征，以确认序列和纯度。（a） 具有代表性的肽序列WNKWAL的理论质量为857.90 Da，质谱学中的m/z比显示。（b） 肽的纯度为 99%，经 HPLC 确认。这种肽属于N+C截断肽库。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
钙信号是乳腺细胞脱粒的核心，已广泛应用于受体-配体相互作用、配体鉴定和药物发现等研究。MRGPRX2是最近发现的乳腺细胞受体，被发现在许多炎症性疾病，如痒，哮喘，和特异性皮炎，除其他2。此外，一些经批准的药物已被证明通过MRGPRX2受体15引起炎症反应。因此，研究配体-受体相互作用、识别新的配体并了解激活机制势在必行。这项研究显示了在设计肽库（表1）和研究基于MGPRX2的桅杆细胞活化时使用常见的肽技术。基础钙动员被用作乳腺细胞激活的指标。
Fura-2 是一种钙敏感染料，用于测量细胞内钙浓度。乙酰酯变异（Fura-2 AM）可提高细胞膜的渗透性，从而产生一种量化细胞质钙释放的简单方法。染料经常用于各种特征技术，如流细胞仪，显微镜和荧光仪9，16，17。虽然广泛使用，但染料存在一些挑战，需要加以解决，才能有效地加以利用。细胞内钙结合依赖于染料的去酯化，这在很大程度上取决于染料的加载条件、细胞系统和细胞培养类型。部分去酯化会导致荧光信号不足。此外，不完全的去酯化还会导致染料本地化到细胞细胞器中，从而导致数据不准确。脱酯染料从细胞泄漏是Fura-210，11面临的另一个问题。
除染料装载外，检测技术的运用也发挥着重要作用。流细胞仪无法使用紫外激光器操作，因此对染料9不利。同样，荧光成像技术也需要显微镜操作方面的高级培训。配体激活后钙释放的瞬态性质要求在波长变化中快速反应，从而加快显微镜的快门速度。此外，使用专门的细胞成像室，使用覆盖唇和恒定的图像对焦，使其成为大规模筛选16的繁琐技术。
在方法优化方面投入了大量时间。Cuvette 基于荧光仪，其中细胞在脱离培养瓶后，在黑暗中用染料加载介质孵育，然后在 HTB 缓冲器中清洗和重新悬浮用于研究。悬浮在HTB缓冲器中的细胞被取在一个幼崽中，并使用基于光倍增器的荧光仪进行读取。检测系统一次只能容纳少量（2-4）幼崽，因此不适合大规模筛选多肽。此外，HEK细胞是附体细胞，细胞悬浮读数在实验中显示个体重复的巨大变化。因此，使用了荧光成像技术，这再次被证明是乏味和缓慢的。对具有快速波长变化能力、显微镜特定细胞室和卓越成像技能的先进显微镜的需求阻碍了研究。此外， 原位 肽模拟时间广泛，导致重要数据丢失。效率低下的细胞处理技术导致读数过程中细胞浮选，使其难以集中注意力，结果不一致。
研究使用了荧光板读取器系统，该系统带有自动管道系统，可以在实验期间分配化合物。事实上，许多样品在96井板中连续快速阅读，是这项技术的一个补充优势。结果表明，与悬浮相比，当细胞连接时，读数更一致。在 TC 处理的 96 井板中，细胞计数为 40，000 个细胞/井，生长一天，效果最佳。在 37 °C 孵化器上，染料孵化时间为 30-40 分钟，是最佳的。然而，当实验用实验重复完成时，观察到不同柱子的相应井的变化。为了克服这一点，使用了正 （PAMP-12） 和负控制 （空白） 的板的每个列。这提供了更一致和可重复的数据。此处描述的方法是一种简单多才多艺的方法，可有效地用于大规模钙基筛查。但是，有几个因素决定了数据的质量，因此该方法需要针对给定的细胞仪器系统进行优化。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
SR 和 LDU 希望感谢艾伯塔省创新战略研究项目、NRC 和 NSERC-发现项目赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
