Summary
Vengono descritte le tecniche per generare una libreria di peptidi corti in grado di attivare i mastociti tramite il recettore MRGPRX2. Le tecniche associate sono facili, poco costose e possono essere estese ad altri recettori cellulari.
Abstract
Identificare i ligandi specifici per i recettori cellulari terapeuticamente significativi è fondamentale per molte applicazioni, tra cui la progettazione e lo sviluppo di nuove terapie. Il recettore della proteina G correlato a Mas X2 (MRGPRX2) è un importante recettore che regola l'attivazione dei mastociti e, quindi, dirige la risposta immunitaria generale. Sono stati identificati numerosi ligandi per MRGPRX2 e includono peptidi endogeni come PAMP, defensine, LL-37 e altri frammenti proteici (cioè albumina degradata). Un'ulteriore identificazione di ligandi specifici di MRGPRX2 richiede lo screening di un gran numero di peptidi (cioè la libreria peptidica); tuttavia, i mastociti sono difficili e costosi da mantenere in vitro e, quindi, non economici da utilizzare per lo screening di un gran numero di molecole. Il presente documento dimostra un metodo per progettare, sviluppare e vacalare una libreria di piccole molecole peptidiche utilizzando MRGPRX2 che esprimono cellule HEK. Questa linea cellulare è relativamente facile e poco costosa da mantenere e può essere utilizzata per l'analisi in vitro ad alto rendimento. Un colorante fluorescente Fura-2 sensibile al calcio per marcare il flusso di calcio intracellulare all'attivazione è stato utilizzato per monitorare l'attivazione. Il rapporto tra l'intensità di fluorescenza di Fura-2 a 510 nm contro lunghezze d'onda di eccitazione di 340 e 380 nm è stato utilizzato per calcolare la concentrazione di calcio. La libreria peptidica utilizzata per verificare questo sistema era basata sul secretagogo endogeno proadrenomedullina N-terminale 12 (PAMP-12), che è noto per legare MRGPRX2 con elevata specificità e affinità. I peptidi successivi sono stati generati attraverso il troncamento degli aminoacidi e le tecniche di scansione dell'alanina applicate a PAMP-12. Il metodo qui descritto è semplice e poco costoso ma robusto per lo screening di una vasta libreria di composti per identificare domini di legame e altri parametri importanti che svolgono un ruolo importante nell'attivazione del recettore.
Introduction
I mastociti sono parte integrante del sistema immunitario e svolgono un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie sia innate che adattative. I mastociti sono attivati principalmente dal legame di un antigene al complesso immunoglobulina E (IgE) - recettore FcεRI, o dal recettore della proteina G correlato a mas recentemente scoperto-X2 (MRGPRX2)1. L'attivazione di MRGPRX2 è stata collegata a diverse malattie immunitarie e infiammatorie e, quindi, è importante comprendere il meccanismo di legame del recettore ai suoi ligandi2. Per fare ciò, è stata sviluppata una libreria di piccole molecole peptidiche e sottoposte a screening contro i recettori MRGPRX2 che sono stati sovraespressi nelle cellule HEK. Nello studio, la libreria peptidica è stata costruita utilizzando le tecniche semplici e versatili della scansione dell'alanina e del troncamento degli amminoacidi. La scansione dell'alanina comporta la sostituzione di aminoacidi specifici con un residuo di alanina. Essendo l'alanina piccola e neutra, spoglia il peptide delle proprietà specifiche conferite dal residuo sostituito ed evidenzia consecutivamente il significato delle rispettive proprietà fisiochimiche dell'amminoacido nelle interazioni recettoriali. Al contrario, nel troncamento degli amminoacidi, le sequenze peptidiche sono progettate in modo tale da mancare uno o più residui di amminoacidi dal terminale N, dal terminale C o da entrambi. Questo insieme di peptidi è stato utilizzato per identificare le sequenze di aminoacidi cruciali per il legame con MRGPRX2.
L'esperienza con le linee di mastociti umani (LAD-2) ha dimostrato che queste cellule sono difficili da coltura e mantenere in vitro:un tempo di raddoppio di due settimane, costosi integratori medi e attenzione diretta richiesta durante il passaggio3. Questi attributi rendono le cellule inadatte per lo screening su larga scala di potenziali ligandi. Qui, le cellule HEK stabilmente trasfettate che esprimono il recettore MRGPRX2 (HEK-X2) sono state utilizzate per lo screening della libreria peptidica1. Le cellule HEK-293 sono ampiamente utilizzate e studiate per l'espressione eterologa dei recettori di superficie grazie alla loro elevata efficienza di trasfezione, al tasso di raddoppio più veloce e alla necessità di integratori medi non costosi da colturare in laboratorio4. Il protocollo per trasfezionare la linea cellulare HEK-293 è stato dimostrato ed è ben consolidato5. Le cellule HEK-293 che esprimono stabilmente il recettore MRGPRX2 (passaggio 13-19) sono state attivate con i peptidi generati attraverso N-troncamento, C-troncamento, N + C-troncamento e scansione alanina1. Le celle HEK di tipo selvaggio (HEK-WT) (passaggio 16-21) sono state utilizzate come controllo. Il rilascio intracellulare di calcio al momento dell'attivazione è stato monitorato per studiare l'attivazione basata su MRGPRX2.
L'attivazione cellulare da parte di MRGPRX2 è seguita da una mobilizzazione citosolica del calcio. Questo rilascio intracellulare regolato di calcio nei mastociti è regolato dall'ingresso di calcio gestito dal deposito (SOCE), coordinato dalla molecola di interazione stromale 1 (STIM1); ed è centrale per la cascata di risposta immunitaria6,7. Sono stati utilizzati vari metodi per rilevare la concentrazione intracellulare di calcio, tra cui patch-clamp e coloranti fluorescenti8. Di tutte le tecniche disponibili, i coloranti fluorometrici di calcio in coniugazione con varie tecniche di rilevamento vengono ampiamente utilizzati9. Due tipi di coloranti fluorometrici che hanno guadagnato interesse sono vale a dire, coloranti a singola lunghezza d'onda come Fluo-4 e coloranti ratiometrici a doppia lunghezza d'onda come Indo -1 e Fura-2. Il vantaggio che i coloranti ratiometrici a doppia lunghezza d'onda portano rispetto ai coloranti a singola lunghezza d'onda è che i coloranti ratiometrici correggono errori sperimentali come il caricamento del colorante, lo sbiancamento fotografico e la messa a fuoco10,11.
L'estere acetossimetilico fura-2 (Fura-2 AM) è un colorante permeante cellulare, verde-fluorescente la cui eccitazione si sposta su una lunghezza d'onda inferiore dopo il legame con il calcio. Sperimentalmente, Fura-2 è eccitato a 340 e 380 nm, mentre l'emissione è registrata a 510 nm. Al momento del legame con il calcio, l'intensità fluorescente a 340 nm aumenta mentre quella di 380 nm diminuisce, come mostrato nella Figura 1. I dati sono rappresentati come un rapporto tra l'intensità di fluorescenza dopo l'eccitazione a 340 nm (F340) e quella dell'intensità dopo l'eccitazione a 380 nm (F380), cioè F340 / F380. Il rapporto F340/F380 è proporzionale al calcio intracellulare, il cui valore può essere calcolato dall'equazione di Grynkiewicz12. Poiché il segnale di fluorescenza è ottenuto dall'eccitazione del colorante a due lunghezze d'onda (340 nm e 380 nm), il rapporto dei segnali di fluorescenza corregge fattori sperimentali come il carico del colorante, la perdita di colorante, il fotosciviazione e le densità cellulari.
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Protocol
1. Progettazione e sviluppo di librerie peptidiche
- Per identificare i ligandi del recettore MRGPRX2 dei mastociti sulla base di un ligando noto, ad esempio PAMP-1213, seguire i passaggi seguenti.
- Generare una libreria peptidica N-troncata troncando i residui di amminoacidi N-terminali del ligando, in successione, mediante sintesi peptidica in fase solida (SPPS).
- Generare una libreria peptidica C-troncata troncando i residui di amminoacidi C-terminali del ligando noto, in successione, mediante SPPS.
- Sulla base dei risultati di 1.1.1 e 1.1.2, generare una libreria peptidica troncata N + C utilizzando SPPS troncando i residui desiderati dal terminale N e C, rispettivamente.
- Utilizzare la sintesi peptidica in fase solida per sintetizzare i peptidi13.
- Modificare il N-terminale in gruppo acetilico (Ac) e C-terminale in gruppo ammide.
- Caratterizzare il peptide per la sua purezza utilizzando la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e per la massa utilizzando uno spettrofotometro di massa.
- Per studiare il significato di aminoacidi specifici all'interno della molecola madre PAMP-12, seguire i passaggi seguenti.
- Generare una libreria peptidica a scansione di alanina sostituendo i rispettivi residui di amminoacidi nella molecola peptidica con alanina, uno alla volta utilizzando SPPS. Modificare il N-terminale in gruppo acetilico (Ac) e C-terminale in gruppo ammide.
- Caratterizzare il peptide per la sua purezza utilizzando la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e per la massa utilizzando uno spettrofotometro di massa.
NOTA: Assicurarsi che i peptidi sintetizzati siano di elevata purezza. Caratterizzare i peptidi utilizzando la spettroscopia di massa e l'HPLC.
2. Coltura cellulare in vitro
- Colturare le celle HEK-X2 e HEK-WT seguendo i passaggi seguenti.
- Preparare il terreno di coltura integrando DMEM ad alto contenuto di glucosio con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM di L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
- Passare le cellule in palloni di coltura tissutale (TC) trattati con T-75 e crescere in un incubatore a 37 °C contenente il 5% di CO2,fino a quando non sono confluenti al 75-80%.
- Una volta confluente al 75%, lavare le cellule e aggiungere 2-3 ml di tripsina per 2 - 3 min. Incubare in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per staccare le cellule.
- Una volta che le cellule si sono staccate, raccogliere le cellule in tripsina. Aggiungere 6-9 ml di mezzo fresco.
- Centrifugare le celle a 1620 x g per 3-5 min.
- Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante per raccogliere il pellet. Risuspendare le cellule in un terreno di coltura fresco. Diluire le cellule secondo la concentrazione desiderata.
NOTA: le cellule HEK sono cellule a crescita rapida e quindi ottimizzano gli integratori del mezzo cellulare. Le cellule HEK sono cellule aderenti; farli passare in palloni di coltura trattati con TC per supportare l'adesione.
- Preparare una piastra di dosaggio da 96 pozzetti per l'esperimento.
- Aggiungere 200 μL di sospensione cellulare in ogni pozzetaggio, con una concentrazione di 200.000 cellule/ml, per seminare 40.000 cellule/pozzede.
- Far crescere le cellule per 24 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: ottimizzare la densità della cella per pozzo in base alle dimensioni della piastra e al tipo di deformazione della cella. Condurre l'esperimento in triplicati in una piastra nera a 96 pozzetti trattata tc con fondo piatto trasparente.
3. Saggio del calcio Fura-2 AM
- Preparare il colorante seguendo i passaggi seguenti.
- Usa il colorante Fura-2 AM per l'esperimento.
- Preparare il tampone HEPES-Tyrode (HTB) contenente 25 mM di hepes buffer, 120 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 1 mg/mL di glucosio, 1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) e 1,8 mM di CaCl2 appena aggiunti in acqua sterilizzata in autoclave.
- Aggiungere 50 μL di DMSO in un flaconcino di Fura-2 AM da 50 μg per preparare 1 mM di soluzione stock di colorante Fura-2 AM. Aggiungere 1 μL di colorante Fura-2 AM da 1 mM per mL di mezzo fresco per preparare il mezzo di carico del colorante con concentrazione di colorante di 1 μM.
- Rimuovere la piastra del pozzo 96 dall'incubatore e scartare il mezzo. Sostituire il mezzo con un mezzo di caricamento del colorante fresco. Aggiungere 200 μL di mezzo di carico del colorante in ogni pozzo. Incubare le cellule per 30-40 minuti in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
- Dopo 40 minuti di incubazione, rimuovere il mezzo. Lavare le celle con il tampone HTB. Aggiungere 100 μL di tampone HTB per la lettura della fluorescenza. Prendi la piastra per la lettura della fluorescenza.
NOTA: Ottimizzare la concentrazione di colorante nel mezzo di carico del colorante. La perdita di colorante e il fotosciviazione sono possibili preoccupazioni associate al colorante. Aggiungere CaCl2 fresco nel buffer HTB per evitare precipitazioni.
4. Attivazione cellulare e lettura fluorescente
NOTA: il lettore di piastre a fluorescenza con un sistema di pipettaggio automatizzato consente il trasferimento automatico di composti da una sorgente composta alla piastra di analisi senza estrarre la piastra dal lettore di piastre.
- Mentre le cellule vengono incubate, impostare il lettore di piastre.
- Impostare la temperatura su 37 °C.
- In Impostazioni, selezionare Flex.
- Impostare la modalità di lettura su Fluorescenza e Lettura inferiore.
- In Lunghezze d'onda impostare il numero di lunghezze d'onda su 2. Impostare l'eccitazione su 340 nm e 380 nm. Impostare l'emissione su 510 nm.
- Lasciate la sensibilità a Default.
- In Timing, impostare l'intervallo su 3.9 s. Imposta il tempo di esecuzione su 94 s per ottenere 25 letture.
- Quindi, selezionare il Tipo di piastra di analisi.
- Quindi, selezionare Wells da leggere.
- In Trasferimento composto (Compound Transfer), impostare Trasferimenti su 1 e Volume iniziale su 100 μL. Impostare Altezza pipetta su 100 μL, Volume su 50 μL e Punto temporale su 36 s, per aggiungere il composto alla 10a lettura.
- Quindi, selezionare il tipo di piastra Sorgente composta.
- Lasciare Triturate su Non usato.
- Selezionate le punte nel layout Delle punte pipetta.
- Per le colonne composte ea punta, assicurarsi che i composti da trasferire si trovino nella colonna 1 della piastra composta. Impostate colonna punta su 1 e colonna composta su 1.
- Lasciare il file Autocalibrate come ON.
- Fare clic su OK.
- Quando la temperatura ha raggiunto i 37 °C, caricare le piastre nel lettore di piastre.
- Premere la camera di lettura per inserire la piastra di analisi nel lettoredi piastre di fluorescenza .
- Premere il tasto Sorgente per inserire la piastra composta. Preparare la piastra composta aggiungendo 200 μL dei rispettivi peptidi, ionomicina e glicole etilenico-bis (β-aminoetiletere)-N,N,N′,N′-soluzioni di acido tetraacetico (EGTA)-Triton X-100.
- Premere tip rack per inserire la casella tip. Utilizzare una punta nera per evitare l'autofluorescenza della punta.
- Una volta caricate le piastre, rivedere le impostazioni del software e premere Leggi.
5. Analisi dei dati
- Determinare la concentrazione di calcio dal rapporto di fluorescenza mediante l'equazione di Grynkiewicz -
dove Kd è la costante di dissociazione di Fura-2 AM, R è il rapporto di emissione dopo eccitazione a 340 nm e 380 nm (F340/F380) per i rispettivi peptidi, Rmax è il rapporto di fluorescenza massimo osservato con l'aggiunta di 50 μL di ionomicina 30 μM, Rmin è la fluorescenza minima osservata con l'aggiunta di 50 μL di 100 mM EGTA/2,5%Triton X-100, e F380min e F380max sono l'intensità assoluta di fluorescenza di Fura-2 AM rispettivamente allo stato libero e legato al calcio.
NOTA: La macchina eroga il liquido con una certa forza. Non impostare l'altezza di erogazione del peptide troppo vicino al fondo della piastra; può staccare le cellule. Utilizzare punte di pipette nere per evitare l'autofluorescenza. Leggi la fluorescenza massima e la fluorescenza minima per ogni piastra per ogni esperimento.
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Representative Results
La Tabella 1 contiene le sequenze peptidiche generate attraverso il troncamento degli amminoacidi terminali e la scansione dell'alanina. Come mostrato nella Tabella 1,la sequenza peptidica RKKWNKWALSR manca di fenilalanina N-terminale (F) rispetto al suo genitore PAMP-12 e quindi è un peptide rappresentativo nella libreria N-troncata. Allo stesso modo, in FRKKWNKWALS, la serina C-terminale PAMP-12 è stata rimossa, rappresentando una libreria peptidica C-troncata derivata da PAMP-12. Nella libreria peptidica N+C-troncata, l'amminoacido sia da N che da C-terminale viene rimosso. Il troncamento di 4 amminoacidi da N-terminale e 1 residuo da C-terminale di PAMP-12 si traduce in WNKWALS. La libreria peptidica derivata dalla scansione dell'alanina ha un amminoacido sostituito con l'alanina, come con ARKKWNKWALSR, dove la fenilalanina N-terminale viene sostituita con l'alanina. Il colorante Fura-2 AM è stato utilizzato per studiare il potenziale di attivazione dei peptidi contro le cellule HEK trasfettate MRGPRX21. I dati sono stati registrati su un lettore di lastre a fluorescenza. Se il ligando peptidico attiva la cellula, la fluorescenza pompata a 340 nm (F340) aumenta, mentre la stessa diminuisce per la lunghezza d'onda di 380 nm (F380) (Figura 1a). Per un bianco (o per quella materia un peptide non attivante o un controllo HEK-WT) tuttavia, l'aumento e la diminuzione relativi sarebbero rispettivamente bassi, come mostrato nella Figura 2a. La concentrazione di calcio è, tuttavia, rappresentata dal rapporto F340/F380 come mostrato nella Figura 1b,2b. Il rapporto F340/F380 può essere ulteriormente sostituito nell'equazione di Grynkiewicz per ottenere la concentrazione di calcio utilizzando calibrazioni in situ (Figura 3). I peptidi elencati nella Tabella 1 sono stati caratterizzati da spettroscopia di massa (Figura 4a) e HPLC (Figura 4b) e sono risultati di elevata purezza.
| Tecnica peptidica | Peptide rappresentativo |
| Peptide genitore | Ac-FRKKWNKWALSR-Ammide |
| N-Troncamento | Ac-RKKWNKWALSR-Ammide |
| C-Troncamento | Ac-FRKKWNKWALS-Ammide |
| N+C-Troncamento | Ac-WNKWALS-Ammide |
| Scansione di alanina | Ac-ARKKWNKWALSR-Ammide |
Tabella 1: Sequenze peptidiche rappresentative generate dopo N, C e N + C - troncamento e scansione dell'alanina. L'N-terminale dei peptidi era acetil modificato mentre il C-Terminale conteneva un gruppo ammido.
Figura 1: Dati rappresentativi per un peptide attivante. ( a ) I segnalidifluorescenza per un peptide attivante. I dati rappresentati corrispondono a PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Il peptide è stato aggiunto dopo aver generato una linea di base per 10 cicli di lettura (36 s), come mostrato dalla freccia. b) Il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 340 nm (F340) e quella di emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 380 nm (F380) (F340/F380). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dati rappresentativi per lo spazio vuoto. (a) I segnali di fluorescenza per il Blank. HTB è stato aggiunto dopo aver generato una linea di base per 10 cicli di lettura (36 s), come mostrato dalla freccia. b) Il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 340 nm (F340) e quella di emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 380 nm (F380) (F340/F380). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dati rappresentativi per gli standard per la taratura del colorante. (a) La ionomicina è stata aggiunta alla 10a lettura, come mostrato dalla freccia, per ottenere la massima fluorescenza nello stato legato Ca+ 2. EGTA-Triton X-100 è stato aggiunto dopo 20 letture, come mostrato dalla freccia, per ottenere un segnale minimo. b) Il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 340 nm (F340) e quella di emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 380 nm (F380) (F340/F380). Questi valori sono ulteriormente inseriti nell'equazione di Grynkiewicz per ottenere la concentrazione intracellulare di calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Caratterizzazione di un peptide rappresentativo per confermare la sequenza e la purezza. (a) La massa teorica della sequenza peptidica rappresentativa WNKWAL era 857,90 Da, che è stata mostrata dal rapporto m/z nella spettroscopia di massa. b)Purezza del peptide del 99% come confermato dall'HPLC. Questo peptide appartiene alla libreria peptidica N+C-troncata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La segnalazione del calcio è fondamentale per la degranulazione dei mastociti ed è stata ampiamente utilizzata nello studio delle interazioni recettore-ligando, dell'identificazione del ligando e della scoperta di farmaci14. MRGPRX2 è un recettore dei mastociti scoperto di recente che è stato trovato per svolgere un ruolo chiave in molte malattie infiammatorie come prurito, asma e dermatite atopica, tra gli altri2. Inoltre, diversi farmaci approvati hanno dimostrato di suscitare una risposta infiammatoria attraverso il recettore MRGPRX215. È quindi imperativo studiare l'interazione ligando-recettore, identificare nuovi ligandi e comprendere il meccanismo di attivazione. Questo studio mostra l'uso di tecniche peptidiche comuni nella progettazione di una libreria peptidica (Tabella 1) e nello studio dell'attivazione dei mastociti basata su MRGPRX2. La mobilizzazione del calcio sottostante è stata impiegata come indicatore dell'attivazione dei mastociti.
Fura-2 è un colorante sensibile al calcio utilizzato per misurare la concentrazione intracellulare di calcio. La variante acetoximetil estere (Fura-2 AM) aumenta la permeabilità della membrana cellulare producendo un metodo semplice per quantificare i rilasci di calcio citoplasmatico. Il colorante è stato frequentemente utilizzato con varie tecniche di caratterizzazione come citometro a flusso, microscopia e fluorimetri9,16,17. Sebbene ampiamente utilizzato, ci sono sfide associate al colorante, che devono essere affrontate prima che queste possano essere impiegate in modo efficiente. Il legame intracellulare del calcio si basa sulla de-esterificazione del colorante, che dipende in gran parte dalle condizioni di carico del colorante, dal sistema cellulare e dai tipi di coltura cellulare. La de-esterificazione parziale si traduce in segnali di fluorescenza inadeguati. Inoltre, la de-esterificazione incompleta provoca anche la localizzazione del colorante negli organelli cellulari con conseguente dati imprecisi. La fuoriuscita di colorante de-esterificato dalla cellula è un altro problema affrontato con Fura-210,11.
Oltre al caricamento del colorante, anche l'uso della tecnica di rilevamento gioca un ruolo importante. L'incapacità dei citometri a flusso di funzionare con i laser UV li rende sfavorevoli per il colorante9. Allo stesso modo, le tecniche di imaging fluorescente richiedono una formazione avanzata nel funzionamento al microscopio. La natura transitoria del rilascio di calcio all'attivazione del ligando richiede una risposta rapida nel cambiamento delle lunghezze d'onda e quindi una maggiore velocità dell'otturatore del microscopio. Inoltre, l'uso di camere di imaging cellulare specializzate, l'uso di coverslip e la messa a fuoco costante dell'immagine lo rendono una tecnica ingombrante per lo screening su larga scala16.
Una notevole quantità di tempo è stata investita nell'ottimizzazione del metodo. Fluorometro a base di cuvette, in cui le cellule dopo essersi staccate dal pallone di coltura, sono state incubate con il mezzo caricato con colorante al buio e poi sono state lavate e risospendite nel tampone HTB per lo studio. Le cellule sospese nel tampone HTB sono state prelevate in una cuvetta e sono state lette utilizzando un fluorometro a base di fotomoltiplicatore. I sistemi di rilevamento potevano contenere solo poche (2-4) cuvette alla volta e quindi non erano adatti per lo screening su larga scala dei peptidi. Inoltre, essendo cellule HEK cellule aderenti, la lettura della sospensione cellulare ha mostrato grandi variazioni all'interno delle singole ripetizioni all'interno di un esperimento. Di conseguenza, è stata utilizzata la tecnica di imaging fluorescente, che ancora una volta si è rivelata noiosa e lenta. La necessità di un microscopio avanzato con capacità di variazione rapida della lunghezza d'onda, camere cellulari specifiche per microscopio e eccellenti capacità di imaging ha impedito lo studio. Inoltre, la simulazione peptidica in situ è stata estesa nel tempo e ha comportato la perdita di dati importanti. Una tecnica di elaborazione cellulare inefficiente ha portato a flottazioni cellulari durante le letture che hanno reso difficile la messa a fuoco e hanno dato risultati incoerenti.
Per lo studio è stato utilizzato un sistema di lettura a piastre di fluorescenza con un sistema di pipettaggio automatizzato in grado di erogare composti durante gli esperimenti. Il fatto che molti campioni vengano letti in rapida successione in una piastra a 96 pozzetti è un ulteriore vantaggio di questa tecnica. I risultati hanno mostrato che le letture erano più coerenti quando le cellule erano attaccate rispetto alla sospensione. La conta cellulare di 40.000 cellule / pozzetto in una piastra di 96 pozzi trattati con TC coltivata per un giorno ha dato i migliori risultati. Un tempo di incubazione del colorante di 30-40 minuti a 37 °C dell'incubatrice è stato ottimale. Tuttavia, quando gli esperimenti sono stati fatti con ripetizioni sperimentali, sono state osservate variazioni nei corrispondenti pozzi di diverse colonne. Per ovviare a questo, è stato utilizzato un controllo positivo (PAMP-12) e un controllo negativo (Blank) per ogni colonna della piastra. Ciò ha fornito dati più coerenti e riproducibili. Il metodo qui descritto è un metodo facile e versatile, che può essere impiegato in modo efficiente per lo screening a base di calcio su larga scala. Tuttavia, ci sono diversi fattori che determinano la qualità dei dati e quindi il metodo deve essere ottimizzato per un determinato sistema di cellule-strumento.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
SR e LDU vorrebbero riconoscere Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC e NSERC-Discovery grant per questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
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