Summary
MRGPRX2 수용체를 통해 비만 세포를 활성화할 수 있는 짧은 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 기술이 기재되어 있다. 관련 기술은 쉽고 저렴하며 다른 세포 수용체로 확장 될 수 있습니다.
Abstract
치료적으로 중요한 세포 수용체에 특정 한 리간드를 식별하는 것은 많은 응용 프로그램에 대 한 중요 한, 설계 및 새로운 치료의 개발을 포함 하 여. Mas 관련 G-단백질 수용체-X2 (MRGPRX2)는 마스트 세포 활성화를 조절하고, 따라서, 일반적인 면역 반응을 지시하는 중요한 수용체이다. MRGPRX2에 대한 수많은 리간드가 확인되었으며 PAMPs, 디펜신, LL-37 및 기타 단백질 단편(즉, 저하된 알부민)과 같은 내인성 펩티드를 포함한다. MRGPRX2 특이적 리간드의 추가 식별은 많은 수의 펩타이드(즉, 펩티드 라이브러리)의 스크리닝을 필요로 합니다. 그러나, 비만 세포는 시험관 내에서 유지하기 어렵고 비싸고, 따라서, 분자의 큰 숫자를 선별하기 위해 사용하는 경제적이지. 본 논문은 HEK 세포를 발현하는 MRGPRX2를 사용하여 소형 펩티드 분자 라이브러리를 설계, 개발 및 선별하는 방법을 시연한다. 이 세포주 유지 보수가 비교적 쉽고 저렴하며 체외 고처리량 분석에 사용할 수 있습니다. 활성화 시 세포내 칼슘 플럭스를 표시하는 황라-2 형광염염색제가 활성화를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 340 nm와 380 nm의 난사 파장에 대해 510 nm에서 후라-2의 형광 강도의 비율이 칼슘 농도를 계산하는 데 사용되었습니다. 이 시스템을 검증하는 데 사용되는 펩티드 라이브러리는 MRGPRX2를 높은 특이성과 친화성으로 결합하는 것으로 알려진 내인성 proadrenomedullin N 단자 12 (PAMP-12) 분비학을 기반으로하였다. 후속 펩타이드는 PAMP-12에 적용된 아미노산 잘림질 및 알라닌 스캐닝 기술을 통해 생성되었다. 여기서 설명된 방법은 수용체 활성화에 중요한 역할을 하는 결합 도메인 및 기타 중요한 매개 변수를 식별하기 위해 대규모 화합물 라이브러리를 선별하기 위한 간단하고 저렴하면서도 견고합니다.
Introduction
비만 세포는 면역 계통의 필수적인 부분이고 선천적이고 적응적인 면역 반응 둘 다에 있는 중요한 역할을 합니다. 마스트 세포는 주로 면역글로불린 E(IgE)에 항원의 결합에 의해 활성화- FcθRI 수용체 복합체, 또는 최근에 발견된 Mas 관련 G 단백질 수용체-X2(MRGPRX2)1. MRGPRX2 활성화는 몇몇 면역 및 선동적인 질병에 연결되고, 따라서, 그것의 리간드2에수용체의 결합 기계장치를 이해하는 것이 중요합니다. 이를 위해, 작은 펩티드 분자의 라이브러리가 개발되었고 HEK 세포에서 과발현된 MRGPRX2 수용체에 대하여 선별되었다. 연구에서 펩티드 라이브러리는 알라닌 스캐닝 및 아미노산 잘림의 간단하고 다재다능한 기술을 사용하여 구성되었다. Alanine 스캐닝은 특정 아미노산을 알라닌 잔류물로 대체하는 것을 포함합니다. 알라닌은 작고 중성인, 대체된 잔류물로 부여되는 특정 성질의 펩티드를 제거하고 연속적으로 수용체 상호작용에서 아미노산의 각각의 생리학적 특성의 중요성을 강조한다. 반대로, 아미노산 잘림착에서 펩티드 서열은 N단, C 단자 또는 둘 다로부터 하나 이상의 아미노산 잔류물이 부족하도록 설계된다. 펩티드의이 세트는 MRGPRX2 결합에 중요한 아미노산 서열을 식별하는 데 사용되었다.
인간 비만 세포 라인 (LAD-2)을 경험하는 것은 이 세포가 시험관 내에서배양하고 유지하기 어렵다는 것을 보여주었습니다 : 2 주, 비싼 중간 보충제 및 통과 시 필요한 직접주의3. 이러한 특성은 세포를 잠재적 인 리간드의 대규모 스크리닝에 적합하지 않게합니다. 본명, MRGPRX2 수용체(HEK-X2)를 발현하는 안정적으로 전염된 HEK 세포가 펩티드 라이브러리1을스크리닝하는 데 사용되었다. HEK-293 세포는 높은 경질 효율, 빠른 이중 속도 및 실험실4에서배양되는 비고가가치 중형 보충제의 필요성으로 인해 표면 수용체의 이종 발현을 위해 널리 사용되고 연구된다. HEK-293 세포주 에 대한 프로토콜이 입증되었으며 잘 확립되어있다 5. HEK-293 세포는 MRGPRX2 수용체(passage 13-19)를 안정적으로 발현하여 N-잘림, C-잘림, N+C-잘림, 알라닌 스캐닝1을통해 생성된 펩티드로 활성화되었다. 야생형 HEK 세포(HEK-WT) (16-21통로)가 대조군으로 사용되었다. 활성화 시 세포 내 칼슘 방출은 MRGPRX2 기반 활성화를 연구하기 위해 모니터링되었다.
MRGPRX2에 의한 세포 활성화는 세포성 칼슘 동원에 선행된다. 비만 세포에서 이러한 조절된 세포내 칼슘 방출은 저장조작 칼슘 항목(SOCE)에 의해 조절되며, 기질 상호작용 분자 1(STIM1)에 의해 조정됨; 면역 반응 의 중심6,7. 패치 클램프 및 형광염료8을포함한 세포내 칼슘 농도를 검출하기 위해 다양한 방법이 사용되어 왔다. 사용 가능한 모든 기술 중, 다양한 검출 기술과 결합에서 형광 칼슘 염료가 널리 사용되고 있다9. 관심을 얻은 두 가지 유형의 불소 염료는 플루오-4와 같은 단일 파장 염료와 인도 -1 및 후라-2와 같은 이중 파장 염료입니다. 이중 파장 염료가 단일 파장 염료를 통해 가져오는 장점은 염료 하중, 사진 표백 및 초점10,11과같은 실험 적 오류에 대한 비율 측정 염료가 정확하다는 것입니다.
후라-2 아세톡시메틸 에스테르(Fura-2 AM)는 칼슘 결합 시 발근이 낮은 파장으로 이동하는 세포 침투, 녹색 형광염입니다. 실험적으로, Fura-2는 340 및 380 nm에서 흥분하고, 방출은 510 nm에서 기록됩니다. 칼슘 결합시, 340 nm의 형광 강도는 380 nm의 감소하는 동안 증가, 도 1에도시된 바와 같이. 데이터는 340nm(F340)에서 380nm(F380) 즉, F340/F380에서 발아 후 강도의 비율로 표현된다. F340/F380 비율은 세포내 칼슘에 비례하며, 그값은 그린키에비츠방정식(12)에의해 계산될 수 있다. 형광 신호는 두 파장 (340 nm 및 380 nm)에서 염료의 외리로부터 수득되기 때문에 형광 신호의 비율은 염료 하중, 염료 누설, 광표백 및 세포 밀도와 같은 실험 적 인 인자를 교정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 펩티드 라이브러리의 설계 및 개발
- 알려진 리간드 즉, PAMP-1213에기초하여 마스트 세포 MRGPRX2 수용체의 리간드를 식별하려면, 아래 단계를 따른다.
- 리간드의 N단 말단 아미노산 잔류물을 연속적으로 고체 상 펩타이드 합성(SPPS)에 의해 절단하여 N-잘린 펩티드 라이브러리를 생성한다.
- SPPS에 의해 알려진 리간드의 C-말단 아미노산 잔류물을 연속적으로 절단하여 C-잘린 펩티드 라이브러리를 생성한다.
- 1.1.1 및 1.1.2의 결과에 기초하여, N 및 C 단말에서 원하는 잔류물을 각각 절단하여 SPPS를 사용하여 N+C 잘린 펩티드 라이브러리를 생성한다.
- 고형 펩티드 합성을 사용하여펩타이드(13)를합성한다.
- N 단자만을 아세틸(Ac) 그룹 및 C단으로 수정하여 아마데 그룹으로 수정합니다.
- 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 순도에 대한 펩티드를 특성화하고 질량 분광계를 사용하여 질량을 위해.
- 부모 PAMP-12 분자 내에서 특정 아미노산의 중요성을 연구하려면 아래 단계를 따르십시오.
- 펩타이드 분자의 각각 아미노산 잔류물을 알라닌으로 대체하여 알라닌 스캐닝 펩티드 라이브러리를 생성하며, SPPS를 사용하여 한 번에 하나씩 섭취한다. N 단자만을 아세틸(Ac) 그룹 및 C단으로 수정하여 아마데 그룹으로 수정합니다.
- 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 순도에 대한 펩티드를 특성화하고 질량 분광계를 사용하여 질량을 위해.
참고: 합성된 펩타이드가 순도가 높은지 확인하십시오. 질량 분광법과 HPLC를 사용하여 펩티드를 특성화합니다.
2. 체외 세포 배양
- 배양 HEK-X2 및 HEK-WT 셀은 아래 단계를 수행하여.
- 고혈당 DMEM을 10% 태아소 혈청(FBS), 2m L-글루타민, 페니실린 100Μg/mL, 연쇄상 구균100 μg/mL로 보충하여 배양 배지를 준비한다.
- 조직 배양(TC)에서 세포를 통과시키는 T-75 배양 플라스크를 처리하고 37°C에서 인큐베이터에서 성장하여 5%CO2를함유하고, 75-80% 컨실수까지.
- 한 번 75% 컨서블, 세포를 세척하고 2 - 3 분 동안 트립신의 2-3 mL을 추가합니다. 세포를 분리하기 위해 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한다.
- 세포가 분리되면 트립신에서 세포를 수집합니다. 신선한 매체의 6-9mL를 추가합니다.
- 3-5 분 동안 1620 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
- 원심 분리 후, 펠릿을 수집하기 위해 상체를 폐기하십시오. 신선한 배양 배지에서 세포를 다시 중단합니다. 원하는 농도에 따라 세포를 희석시.
참고: HEK 세포는 빠르게 성장하는 세포이므로 세포 중간 보충제를 최적화합니다. HEK 세포는 부착 세포; TC 처리 문화 플라스크에서 그들을 통과 접착을 지원하기 위해 플라스크.
- 실험을 위해 96 개의 잘 된 분석 플레이트를 준비하십시오.
- 각 우물에 세포 현탁액의 200 μL을 추가하여 200,000개의 세포/mL 농도를 사용하여 40,000개의 세포/웰을 시드합니다.
- 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 성장시한다.
참고: 플레이트 크기와 세포 균주 유형에 따라 우물당 세포 밀도를 최적화합니다. 평평한 투명 바닥이 있는 블랙 TC 처리 96 웰 플레이트에서 트리클리세이트에서 실험을 수행한다.
3. 후라-2 AM 칼슘 분석
- 아래 단계에 따라 염료를 준비하십시오.
- 실험을 위해 후라-2 AM 염료를 사용합니다.
- HEPES-Tyrode의 버퍼(HTB) 버퍼는 25m HEPES 버퍼, 120mM NaCl, 5mM KCl, 1 mg/mL 포도당, 1 mg/mL 소 세럼 알부민(BSA) 및 오토클레이브 멸균 수에 1.8mMCaCl2를 새로 추가했습니다.
- 50 μg Fura-2 AM 바이알에 DMSO 50 μL을 추가하여 Fura-2 AM 염료의 1mM 스톡 용액을 준비합니다. 1 μM 염료 농도를 갖는 염료 적재 매체를 준비하는 신선한 매체의 mL 당 1 mM Fura-2 AM 염료 1 μL을 추가합니다.
- 인큐베이터에서 96 개의 웰 플레이트를 제거하고 매체를 폐기하십시오. 매체를 신선한 염색 하중 매체로 교체합니다. 각 우물에 200 μL의 염료 로딩 매체를 추가합니다. 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 30-40분 동안 세포를배양한다.
- 40분 동안 인큐베이션을 한 후 배지를 제거합니다. HTB 버퍼로 셀을 세척합니다. 형광 판독을 위해 HTB 버퍼 100 μL을 추가합니다. 형광 판독을 위해 접시를 가져 가라.
참고: 염료 로딩 매체에서 염료 농도를 최적화합니다. 염료 누설 및 광표백은 염료와 관련된 우려가 가능하다. 강수량을 피하기 위해 HTB 버퍼에 CaCl2를 새로 추가합니다.
4. 세포 활성화 및 형광 판독
참고: 자동 파이펫팅 시스템을 갖춘 형광판 판독기는 플레이트 판독기에서 플레이트를 꺼내지 않고 화합물 소스에서 분석 플레이트로 화합물을 자동으로 전송할 수 있습니다.
- 세포가 배양되는 동안 플레이트 리더를 설정합니다.
- 온도를 37°C로 설정합니다.
- 설정에서 플렉스를 선택합니다.
- 읽기 모드를 형광및 하단 읽기로 설정합니다.
- 파장에서 파장의 수를 2로 설정합니다. 340 nm와 380 nm로 흥분을 설정합니다. 배출량을 510 nm로 설정합니다.
- 기본값에 대한 감도를 둡니다.
- 타이밍에서 간격을 3.9로 설정합니다. 런 타임을 94로 설정하여 25개의 읽기를 가져옵니다.
- 다음으로 분석 플레이트 유형을 선택합니다.
- 다음으로 읽을 우물을 선택합니다.
- 복합 전달에서,100 μL로 1 및 초기 부피로 전송을 설정합니다. 파이펫 높이를 100 μL로 설정하고, 부피는 50 μL로, 시간점을 36초로 설정하여 10번째 판독값에서 화합물을 추가한다.
- 다음으로, 컴파운드 소스 플레이트 유형을 선택한다.
- 삼중되지 않은상태로 둡니다.
- 파이펫 팁 레이아웃에서 팁을 선택합니다.
- 화합물 및 팁 컬럼의경우, 전송되는 화합물이 복합 플레이트의 열 1에 있는지 확인합니다. 팁 열을 1로 설정하고 복합 열을 1로 설정합니다.
- 자동 보정을 ON으로둡니다.
- 확인을 클릭합니다.
- 온도가 37 °C에 도달하면 플레이트 리더에 플레이트를 로드합니다.
- 독서 챔버를 눌러 형광 판 리더에 분석 판을 넣습니다.
- 소스를 눌러 복합 플레이트를넣습니다. 각각의 펩티드, 이오노마이신 및 에틸렌 글리콜 비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N,N,N',N',N-테트라아세틱산(EGTA)-트리톤 X-100 용액의 200 μL을 추가하여 화합물 플레이트를 준비한다.
- 팁 랙을 눌러 팁 박스를 넣습니다. 팁 자동 형광을 피하기 위해 검은 색 팁을 사용합니다.
- 플레이트가 로드되면 소프트웨어 설정을 검토하고 읽기를누릅니다.
5. 데이터 분석
- 그린키에비츠 방정식에 의한 형광비로부터의 칼슘 농도를 결정합니다.
여기서,Kd는 후라-2 AM의 해리상수이며, R은 각 펩티드에 대해 340nm 및 380 nm(F340/F380)에서 발아 후 배출비이며, Rmax는 30 μM ionomycin의 50 μL을 첨가하여 관찰된 최대 형광 비이며, Rmin은 100mEGTA/2.5%트리톤 X-100의 50 μL을 첨가하여 관찰된 최소 형광이며, F380분 및 F380최대칼슘 무료 및 바운드 상태에서 후라-2 AM의 절대 형광 강도입니다.
참고: 기계는 액체를 일부 힘으로 분배합니다. 펩티드 디스펜싱 높이를 플레이트 바닥에 너무 가깝게 설정하지 마십시오. 세포를 분리할 수 있다. 검은 색 파이펫 팁을 사용하여 자동 불발성을 방지하십시오. 각 실험에 대해 각 플레이트에 대한 최대 형광 및 최소 형광을 읽어보십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
표 1에는 말단 아미노산 잘림질 및 알라닌 스캐닝을 통해 생성된 펩티드 서열을 포함합니다. 표 1에도시된 바와 같이, 펩티드 서열 RKKWNKWALSR은 모모 PAMP-12에 대하여 N단 페닐알라닌(F)이 부족하므로 N-잘린 라이브러리의 대표적인 펩타이드이다. 유사하게, FRKKWNKWALS에서 PAMP-12 C 단말 세린이 제거되어 PAMP-12로부터 유래된 C-잘린 펩티드 라이브러리를 나타낸다. N+C-잘린 펩티드 라이브러리에서는 N 및 C 단자 모두에서 아미노산이 제거됩니다. N단말로부터 4개의 아미노산과 PAMP-12의 C단자로부터 의 잔류물 1개로 잘림하면 WNKWALS가 생성됩니다. 알라닌 스캐닝에서 파생된 펩타이드 라이브러리는 알란으로 대체된 아미노산 1개가 있으며, N단 페닐알라닌이 알라닌으로 대체되는 ARKKWNKWALSR과 마찬가지로. 후라-2 AM 염료는 MRGPRX2 에 대한 펩티드의 활성화 잠재력을 연구하는 데 사용되었다1. 데이터는 형광판 판독기에 기록되었다. 펩타이드 리간드가 세포를 활성화하면 340nm(F340)에서 펌핑된 형광이 증가하고, 380nm 파장(F380)에 대해 동일한감소(도 1a)가증가한다. 공백(또는 그 물질의 경우 펩티드 또는 HEK-WT 제어를 활성화하지 않음)의 경우, 도 2a에도시된 바와 같이 상대적 증가 및 감소는 각각 낮을 것이다. 칼슘 농도는, 그러나, 도1b,2b에도시된 바와 같이 F340/F380 비율로 표현된다. 비율 F340/F380은 Situ교정(그림 3)에서칼슘 농도를 얻기 위해 Grynkiewicz 방정식에서 추가로 대체될 수 있다. 표 1에 나열된 펩티드는 질량 분광법(도4a)및 HPLC(도4b)를특징으로 하고 고순도인 것으로 나타났다.
| 펩타이드 기술 | 대표 펩타이드 |
| 부모 펩타이드 | Ac-FRKKWNKWALSR-아미드 |
| N-트렁케이션 | Ac-RKKWNKWALSR-아미드 |
| C-트런케이션 | Ac-FRKKWNKWALS-아미드 |
| N+C-트런케이션 | Ac-WNKWALS-아미드 |
| 알라닌 스캐닝 | Ac-아크크킨크왈스르-아미드 |
표 1: N, C 및 N+C 후 생성된 대표적인 펩타이드 서열 - 잘림, 알라닌 스캐닝. 펩티드의 N 단말은 아세틸을 변형했고 C-단말은 아마드 군을 함유했다.
도 1: 펩티드 활성화를 위한 대표적인 데이터. (a)펩티드 활성화를 위한 형광 신호. 대표 데이터는 PAMP-12(FRKKWNKWALSR)에 해당합니다. 펩타이드는 화살표에 의해 도시된 바와 같이 10개의 판독 주기(36s)에 대한 기준선을 생성한 후 첨가되었다. (b)340nm(F340)에서 발아 후 형광 방출의 비율은 380nm(F380)(F340/F380)에서 발아 후 발광하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 빈 칸에 대한 대표 데이터. (a)블랭크에 대한 형광 신호. HTB는 화살표에 의해 표시된 바와 같이 10 개의 판독 주기 (36 s)에 대한 기준선을 생성 한 후 추가되었습니다. (b)340nm(F340)에서 발아 후 형광 방출의 비율은 380nm(F380)(F340/F380)에서 발아 후 발광하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 염료 교정 표준에 대한 대표 데이터. (a)이오노마이신은 화살에 의해 도시된 바와 같이10번째 판독값에 첨가되어 Ca+2 바운드 상태에서 최대 형광을 하였다. EGTA-트리톤 X-100은 화살표에 표시된 대로 20개의 판독 값을 추가하여 최소 신호를 얻었습니다. (b)340nm(F340)에서 발아 후 형광 방출의 비율은 380nm(F380)(F340/F380)에서 발아 후 발광하였다. 이러한 값은 세포내 칼슘 농도를 얻기 위해 Grynkiewicz 방정식에 더 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 서열 및 순도를 확인하기 위해 대표적인 펩타이드의 특성화. (a)대표적인 펩티드 서열 WNKWAL의 이론질량은 857.90 Da였으며, 이는 질량 분광법에서 m/z 비에 의해 나타났다. (b)HPLC에 의해 확인된 99%의 펩티드순도. 이 펩티드는 N+C-잘린 펩티드 라이브러리에 속한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
칼슘 신호는 비만 세포 탈과화의 중심이며 수용체 리간드 상호 작용, 리간드 식별 및 약물 발견14의연구에 널리 사용되어 왔다. MRGPRX2는 최근에 발견된 비만 세포 수용체로 가려움증, 천식 및 아토피성 피부염과 같은 많은 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 그중에서도 2. 더욱이, 몇몇 승인된 약은 MRGPRX2 수용체 를 통해 선동적인 반응을 유도하기 위하여 표시되었습니다15. 따라서 리간드 수용체 상호 작용을 연구하고, 새로운 리간드를 식별하고, 활성화 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다. 본 연구는 펩티드라이브러리(표 1)를설계하고 MRGPRX2 기반 마스트 세포 활성화를 연구하는 데 공통 펩티드 기술의 사용을 보여줍니다. 근본적인 칼슘 동원은 비만 세포 활성화의 지표로 사용되었습니다.
후라-2는 세포내 칼슘 농도를 측정하는 데 사용되는 칼슘 에 민감한 염료입니다. 아세톡시메틸 에스테르 변이체(Fura-2 AM)는 세포막의 투과성을 증가시키고 세포질 칼슘 방출을 정량화하는 쉬운 방법을 산출한다. 염료는 유동 세포계, 현미경 검사법 및 불소계9,16,17과같은 다양한 특성화 기술과 자주 사용되어 왔다. 널리 사용되지만 염료와 관련된 문제가 있으며, 이를 효율적으로 고용하기 전에 해결해야 합니다. 세포내 칼슘 결합은 염료 하중 조건, 세포 시스템 및 세포 배양 유형에 크게 의존하는 염료의 탈 에스테르화에 의존합니다. 부분 적 발상 화 는 부적당 한 형광 신호 결과. 또한 불완전한 비에스테르화는 또한 염료를 세포 세포기관으로 국소화하여 부정확한 데이터를 생성합니다. 세포로부터 탈염염료의 누설은 후라-210,11에직면한 또 다른 문제점이다.
염료 하중 외에도 검출 기술의 사용도 중요한 역할을 합니다. UV 레이저로 작동 하는 흐름 사이토미터의 무능력 은 염료 에 대 한 불리 한만들기 9. 마찬가지로 형광 화상 진찰 기술은 현미경 수술에서 고급 교육을 필요로합니다. 리간드 활성화 시 칼슘 방출의 일시적인 특성은 파장의 변화에 대한 신속한 반응을 필요로 하므로 현미경의 빠른 셔터 속도를 필요로 합니다. 또한, 특수 세포 이미징 챔버의 사용, 커버립 및 상수 이미지 초점의 사용은 대규모스크리닝(16)에번거로운 기술이다.
방법 최적화에 상당한 시간이 투자되었습니다. 큐벳 기반 불소계는 배양 플라스크에서 분리한 후 세포가 어두운 곳에서 염료로 적재된 배지로 배양한 다음 연구를 위해 HTB 버퍼에서 세척 및 재중단되었다. HTB 버퍼에서 중단된 세포는 큐벳에서 촬영되었으며 광증 계형 형광계를 사용하여 판독하였다. 검출 시스템은 한 번에 몇 개의 (2-4) 큐벳만 보유할 수 있었기 때문에 펩타이드의 대규모 스크리닝에는 적합하지 않았다. 또한, HEK 세포는 부착된 세포, 세포 현탁액 판독은 실험 내의 개별 반복 내에서 큰 변화를 보였다. 결과적으로 형광 화상 진찰 기술이 사용되었으며 다시 지루하고 느린 것으로 판명되었습니다. 빠른 파장 변화 기능, 현미경 특정 세포 챔버 및 우수한 이미징 기술을 가진 고급 현미경에 대한 요구 사항은 연구를 방해했습니다. 또한, 시투 펩티드 시뮬레이션은 시간이 광범위하고 중요한 데이터의 손실을 초래했다. 비효율적인 세포 처리 기술은 판독 중에 세포 부양을 초래하여 집중하기가 어려웠고 일관되지 않은 결과를 주었습니다.
실험 중에 화합물을 분배할 수 있는 자동화된 파이펫팅 시스템을 갖춘 형광 플레이트 판독기 시스템이 연구에 사용되었습니다. 많은 샘플이 96 웰 플레이트에서 빠른 연속으로 읽히는다는 사실은이 기술의 추가 이점입니다. 결과는 세포가 현탁액에 비교된 때 판독값이 더 일관되다는 것을 보여주었습니다. TC 처리 96 웰 플레이트에서 40,000 개의 세포 / 우물의 세포 수는 최상의 결과를 주었다. 37°C 인큐베이터에서 30-40분의 염료 인큐베이션 시간이 최적하였다. 그러나 실험반복으로 실험이 수행되었을 때, 상이한 컬럼의 해당 우물의 변형이 관찰되었다. 이를 극복하기 위해 플레이트의 각 열에 대한 양수(PAMP-12) 및 음수 제어(Blank)가 사용되었습니다. 이를 통해 보다 일관되고 재현 가능한 데이터가 제공되었습니다. 여기에 설명된 방법은 대규모 칼슘 기반 스크리닝에 효율적으로 사용할 수 있는 쉽고 다재다능한 방법입니다. 그러나 데이터의 품질을 결정하는 몇 가지 요인이 있으므로 주어진 셀 계측기 시스템에 최적화되어야 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁적인 이해관계를 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
SR과 LDU는 이 프로젝트에 대한 알버타 혁신 전략 연구 프로젝트, NRC 및 NSERC-Discovery 보조금을 인정하고자 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
