Summary
MRGPRX2 reseptörü ile mast hücrelerini aktive edebilecek kısa peptitlerden oluşan bir kütüphane oluşturma teknikleri açıklanmıştır. İlişkili teknikler kolay, ucuzdur ve diğer hücre reseptörlerine genişletilebilir.
Abstract
Terapötik olarak önemli hücre reseptörlerine özgü ligandların tanımlanması, yeni terapötiklerin tasarımı ve geliştirilmesi de dahil olmak üzere birçok uygulama için çok önemlidir. Mas ile ilişkili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2), mast hücre aktivasyonunu düzenleyen ve böylece genel immün yanıtı yönlendiren önemli bir reseptördür. MRGPRX2 için çok sayıda ligand tanımlanmıştır ve PAMP'ler, defensinler, LL-37 ve diğer protein parçaları (yani bozulmuş albümin) gibi endojen peptitleri içerir. MRGPRX2 spesifik ligandların daha fazla tanımlanması, çok sayıda peptitin (yani peptit kütüphanesinin) taranmışlığını gerektirir; bununla birlikte, mast hücrelerinin in vitro olarak tutulması zor ve pahalıdır ve bu nedenle çok sayıda molekülün taranması için kullanılması ekonomik değildir. Bu makale, HEK hücrelerini ifade eden MRGPRX2 kullanarak küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane tasarlamak, geliştirmek ve taramak için bir yöntem göstermektedir. Bu hücre hattının bakımı nispeten kolay ve ucuzdur ve in vitro yüksek verim analizi için kullanılabilir. Aktivasyonu izlemek için aktivasyon üzerine hücre içi kalsiyum akısını işaretlemek için kalsiyuma duyarlı fura-2 floresan boya kullanıldı. Kalsiyum konsantrasyonunu hesaplamak için 510 nm'de Fura-2'nin floresan yoğunluğunun 340 ve 380 nm'lik ekscitasyon dalga boylarına karşı oranı kullanılmıştır. Bu sistemi doğrulamak için kullanılan peptit kütüphanesi, MRGPRX2'yi yüksek özgüllük ve benzeşim ile bağladığı bilinen endojen proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) salgıya dayanıyordu. Pamp-12'ye uygulanan amino asit kesilmesi ve alanin tarama teknikleri ile sonraki peptitler üretildi. Burada açıklanan yöntem, bağlayıcı etki alanlarını ve reseptör aktivasyonunda önemli rol oynayan diğer önemli parametreleri tanımlamak için büyük bir bileşikler kitaplığını taramak için basit ve ucuz ancak sağlamdır.
Introduction
Mast hücreleri bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçasıdır ve hem doğuştan gelen hem de adaptif immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynar. Mast hücreleri öncelikle bir antijenin immünoglobulin E (IgE) - FcφRI reseptör kompleksine bağlanması veya yakın zamanda keşfedilen mas ile ilgili G-protein reseptörü-X2 (MRGPRX2)1ile aktive edilir. MRGPRX2 aktivasyonu birkaç bağışıklık ve enflamatuar hastalığa bağlanmıştır ve bu nedenle reseptörün ligandlarına bağlanma mekanizmasını anlamak önemlidir2. Bunun için, HEK hücrelerinde aşırı ifade edilen MRGPRX2 reseptörlerine karşı küçük peptit moleküllerinden oluşan bir kütüphane geliştirildi ve tarandı. Çalışmada peptit kütüphanesi alanin taraması ve amino asit kesilmesinin basit ve çok yönlü teknikleri kullanılarak inşa edilmiştir. Alanin taraması, spesifik amino asitlerin alanin kalıntısı ile değiştirilmesini içerir. Alanin küçük ve nötr olmak, değiştirilen kalıntı tarafından verilen belirli özelliklerin peptidini sıyırır ve reseptör etkileşimlerinde amino asidin ilgili fizyokimyasal özelliklerinin önemini ardışık olarak vurgular. Aksine, amino asit kesilmesinde, peptit dizileri N terminali, C terminali veya her ikisinden bir veya daha fazla amino asit kalıntısından yoksun olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu peptit seti MRGPRX2 bağlanması için çok önemli olan amino asit dizilerini tanımlamak için kullanıldı.
İnsan mast hücreleri hatları (LAD-2) ile deneyim, bu hücrelerin in vitrokültür ve bakımının zor olduğunu göstermiştir: iki haftalık bir iki katlama süresi, pahalı orta takviyeler ve geçiş sırasında doğrudan dikkat3. Bu özellikler, hücreleri potansiyel ligandların büyük ölçekli taraması için uygun hale getirir. Burada, peptit kütüphanesini taramak için MRGPRX2 reseptörü (HEK-X2) ifade eden stably transfected HEK hücreleri kullanılmıştır1. HEK-293 hücreleri, yüksek transeksiyon verimliliği, daha hızlı iki katına çıkma oranı ve pahalı olmayan orta takviyelerin laboratuvarda kültüre edilmesi ihtiyacı nedeniyle yüzey reseptörlerinin heterolog ifadesi için yaygın olarak kullanılır ve çalışılmıştır4. HEK-293 hücre hattının transfect protokolü gösterilmiştir ve iyi kurulmuştur5. MRGPRX2 reseptörü (pasaj 13-19) saplı olarak ifade eden HEK-293 hücreleri, N-truncation, C-truncation, N+C-truncation ve alanine scanning1yoluyla oluşturulan peptitlerle aktive edildi. Kontrol olarak yabani tip HEK hücreleri (HEK-WT) (pasaj 16-21) kullanılmıştır. MRGPRX2 bazlı aktivasyonu incelemek için aktivasyon üzerine hücre içi kalsiyum salınımı izlendi.
MRGPRX2 ile hücre aktivasyonunu sitozolitik kalsiyum mobilizasyon takip edilir. Mast hücrelerindeki bu düzenlenmiş hücre içi kalsiyum salınımı, stromal etkileşim molekülü 1 (STIM1) tarafından koordine edilen depo tarafından işletilen kalsiyum girişi (SOCE) tarafından düzenlenir; ve immün yanıt basamak6,7merkezidir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu tespit etmek için yama kelepçeleri ve floresan boyalar8dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Mevcut tüm teknikler arasında, çeşitli algılama teknikleri ile konjugasyonda florometrik kalsiyum boyaları yaygın olarak kullanılmaktadır9. İlgi gören iki tip florometrik boya, yani Fluo-4 gibi tek dalga boyu boyaları ve Hint -1 ve Fura-2 gibi çift dalga boyu oranmetrik boyalarıdır. Çift dalga boyu oransal boyaların tek dalga boyu boyaları üzerine getirdiği avantaj, oranmetrik boyaların boya yükleme, fotoğraf ağartma ve odaklama10,11gibi deneysel hatalar için doğru olmasıdır.
Fura-2 asetoksimetil ester (Fura-2 AM), kalsiyum bağlayıcılığı üzerine eksitasyonu daha düşük bir dalga boylarına kayan, yeşil floresan bir hücredir. Deneysel olarak, Fura-2 340 ve 380 nm'de heyecanlanırken, emisyon 510 nm'de kaydedilir. Kalsiyum bağlanması üzerine, Şekil 1'degösterildiği gibi, 340 nm'deki floresan yoğunluğu artarken, 380 nm azalır. Veriler, 340 nm'de (F340) heyecanlandıktan sonra floresan yoğunluğunun 380 nm'de (F380) yani F340/F380'de heyecanlandıktan sonraki yoğunluğa oranı olarak temsil edilir. F340/F380 oranı, değeri Grynkiewicz denklemi12ile hesaplanabilen hücre içi kalsiyum ile orantılıdır. Floresan sinyali boyanın iki dalga boyunda (340 nm ve 380 nm) çıkarılmasından elde edildiğinden, floresan sinyallerinin oranı boya yükleme, boya kaçağı, fotobleaching ve hücre yoğunlukları gibi deneysel faktörler için düzeltir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peptit kütüphanesinin tasarımı ve geliştirilmesi
- Bilinen bir ligand yani PAMP-1213'edayanan mast hücresi MRGPRX2 reseptörün ligandlarını tanımlamak için aşağıdaki adımları izleyin.
- Ligandın N-terminal amino asit kalıntılarını art arda katı fazlı peptit sentezi (SPPS) ile keserek N kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.
- Bilinen ligandın C-terminal amino asit kalıntılarını art arda SPPS ile keserek C kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.
- 1.1.1 ve 1.1.2 sonuçlarına dayanarak, sırasıyla N ve C terminalinden istenen kalıntıları keserek SPPS kullanarak bir N + C kesilmiş peptit kütüphanesi oluşturun.
- Peptitleri sentezlemek için katı fazlı peptit sentezi kullanın13.
- N-terminalini asetil (Ac) grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin.
- Peptidi, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanarak saflığı ve kütle spektrofotometresi kullanarak kütle için karakterize edin.
- Ana PAMP-12 molekülü içindeki spesifik amino asitlerin önemini incelemek için aşağıdaki adımları izleyin.
- Peptit molekülündeki ilgili amino asit kalıntılarını SPPS kullanarak teker teker alanin ile değiştirerek bir alanin tarama peptit kütüphanesi oluşturun. N-terminalini asetil (Ac) grubuna ve C-terminalini amid grubuna değiştirin.
- Peptidi, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanarak saflığı ve kütle spektrofotometresi kullanarak kütle için karakterize edin.
NOT: Sentezlenen peptitlerin yüksek saflıkta olduğundan emin olun. Kitle spektroskopisi ve HPLC kullanarak peptitleri karakterize edin.
2. Tüp bebek kültürü
- Aşağıdaki adımları izleyerek KÜLTÜR HEK-X2 ve HEK-WT hücreleri.
- Yüksek glikoz DMEM'i %10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisan ile destekleyerek kültür ortamını hazırlayın.
- Doku kültüründeki (TC) hücrelerin T-75 kültür şişelerini tedavi etti ve% 75-80 birleştiğinde% 5 CO2içeren 37 ° C'de bir inkübatörde büyür.
- % 75 birleştiğinde, hücreleri yıkayın ve 2 - 3 dakika boyunca 2-3 mL tripsin ekleyin. Hücreleri ayırmak için 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- Hücreler ayrıldıktan sonra, hücreleri tripsin içinde toplayın. 6-9 mL taze orta ekleyin.
- Hücreleri 3-5 dakika boyunca 1620 x g'da santrifüj edin.
- Santrifüjlemeden sonra, peletin toplanması için süpernatantı atın. Hücreleri taze bir kültür ortamında yeniden biriktirin. Hücreleri istenen konsantrasyona göre seyreltin.
NOT: HEK hücreleri hızlı büyüyen hücrelerdir ve bu nedenle hücre ortamı takviyelerini optimize eder. HEK hücreleri yapışan hücrelerdir; yapıştırma desteklemek için TC ile işlenmiş kültür şişelerine geçiş.
- Deney için 96'lık iyi bir test plakası hazırlayın.
- 40.000 hücre/kuyu tohumuna 200.000 hücre/mL konsantrasyonda, her kuyuya 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
- Hücreleri 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde24 saat büyütün.
NOT: Plaka boyutuna ve hücre gerinim tipine bağlı olarak hücre yoğunluğunu kuyu başına optimize edin. Deneyi, düz şeffaf tabanlı siyah TC ile işlenmiş 96 kuyu plakasında triplicates olarak gerçekleştirin.
3. Fura-2 kalsiyum tahlil
- Aşağıdaki adımları izleyerek boya hazırlayın.
- Deney için Fura-2 boyasını kullanın.
- HEPES-Tyrode'un 25 mM HEPES tamponu, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/mL glikoz, 1 mg/mL sığır serum albümin (BSA) içeren tampon (HTB) tamponu hazırlayın ve otoklav sterilize suya 1,8 mM CaCl2 taze eklendi.
- Fura-2 boyasının 1 mM stok çözeltisini hazırlamak için 50 μg Fura-2 şişesine 50 μL DMSO ekleyin. 1 μM boya konsantrasyonuna sahip boya yükleme ortamını hazırlamak için taze ortamın mL'si başına 1 μL 1 mM Fura-2 boya ekleyin.
- 96 kuyu plakasını inkübatörden çıkarın ve ortamı atın. Ortamı taze bir boya yükleme ortamıyla değiştirin. Her kuyuya 200 μL boya yükleme ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 inkübatörde 30-40 dakika kuluçkayayatırın.
- 40 dakikalık inkübasyondan sonra ortamı çıkarın. Hücreleri HTB arabelleğiyle yıkayın. Floresan okuma için 100 μL HTB tampon ekleyin. Floresan okuma için tabağı alın.
NOT: Boya yükleme ortamındaki boya konsantrasyonu optimize edin. Boya sızıntısı ve fotobleaching, boya ile ilişkili olası endişelerdir. Yağıştan kaçınmak için CACL2'yi HTB tamponuna yeni ekleyin.
4. Hücre aktivasyonu ve floresan okuma
NOT: Otomatik pipetleme sistemine sahip floresan plaka okuyucu, plakayı plaka okuyucudan çıkarmadan bileşiklerin bileşik bir kaynaktan test plakasına otomatik olarak aktarılmasını sağlar.
- Hücreler inkübe edilirken, Plaka Okuyucu'sunu ayarlayın.
- Sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın.
- Ayarlar'da Flex 'iseçin.
- Okuma Modunu Floresan ve Alt okuma olarak ayarlayın.
- Dalga Boyları'nda Dalga Boylarının sayısını 2 olarak ayarlayın. Heyecanlandırmayı 340 nm ve 380 nm olarak ayarlayın. Emisyonu 510 nm olarak ayarlayın.
- Duyarlılığı Varsayılanolarak bırakın.
- Zamanlama'da Aralık 'ı 3,9 s olarak ayarlayın. 25 okuma almak için Çalışma Süresi'yi 94 s olarak ayarlayın.
- Ardından, Tahlil Plaka Türü 'nüseçin.
- Ardından, Okunacak Kuyular 'ıseçin.
- Bileşik Aktarımda, Aktarımları 1'e ve İlk Hacmi 100 μL'ye ayarlayın.
- Ardından, Bileşik Kaynak plaka türünü seçin.
- Triturate'i Kullanılmayanolarak bırakın.
- Pipet İpuçları Düzeni'ndeki ipuçlarını seçin.
- Bileşik ve Uç Sütunlarıiçin, aktarılacak bileşiklerin bileşik plakanın sütun 1'inde olduğundan emin olun. İpucu Sütununu 1'e ve Bileşik Sütunu 1'e ayarlayın.
- Otomatik Hesapla'ı AÇıKolarak bırakın.
- Tamam 'ıtıklatın.
- Sıcaklık 37 °C'ye ulaştığında, plakaları Plaka Okuyucuyayükleyin.
- Tahlil Plakasını floresan Plaka Okuyucusunakoymak için Okuma Odasına basın.
- Bileşik Plaka koymak için Kaynağa basın. İlgili peptitler, iyonomisin ve etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N,N′, N′-tetraasetik asit (EGTA)-Triton X-100 çözeltileri ekleyerek Bileşik Plakayı hazırlayın.
- İpucu Kutusunukoymak için Uç Rafı'na basın. Uç otofluoresansını önlemek için siyah bir uç kullanın.
- Plakalar yüklendikten sonra, yazılımın ayarlarını gözden geçirin ve Oku 'yabasın.
5. Veri analizi
- Grynkiewicz denklemi ile floresan oranından kalsiyum konsantrasyonu belirleyin -
burada, Kd Fura-2 AM'nin ayrışma sabitidir, R, ilgili peptitler için 340 nm ve 380 nm'de (F340 / F380) uyarılma sonrası emisyon oranıdır, Rmax, 30 μM iyonomisin 50 μL ilavesi ile gözlenen maksimum floresan oranıdır, Rmin 100 mM EGTA / 2.5% Triton X-100'ün 50 μL eklenmesiyle gözlenen minimum floresandır, ve F380dk ve F380max, fura-2 AM'nin kalsiyumsuz ve bağlı durumdaki mutlak floresan yoğunluğudur.
NOT: Makine sıvıyı bir miktar kuvvetle dağıtır. Peptit dağıtım yüksekliğini plakanın altına çok yakın ayarlamayın; hücreleri ayırabilir. Otofluoresansı önlemek için siyah pipet uçlarını kullanın. Her deney için her plaka için maksimum floresan ve minimum floresan okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 1, terminal amino asit kesilmesi ve alanin taraması yoluyla oluşturulan peptit dizilerini içerir. Tablo 1'degösterildiği gibi, peptit dizisi RKKWNKWALSR, ana PAMP-12 ile ilgili olarak N-terminal fenilalaninden (F) yoksundur ve bu nedenle N kesilmiş kütüphanede temsili bir peptittir. Benzer şekilde, FRKKWNKWALS'da PAMP-12'den türetilen C kesilmiş peptit kütüphanesini temsil eden PAMP-12 C-terminal serini kaldırılmıştır. N+C kesilmiş peptit kütüphanesinde hem N hem de C-terminalinden amino asit çıkarılır. N-terminalinden 4 amino asit ve PAMP-12 C terminalinden 1 kalıntının kesilmesi WNKWALS ile sonuçlanır. Alanin taramasından elde edilen peptit kütüphanesi, N-terminal fenilalanin alanin ile değiştirildiği ARKKWNKWALSR'da olduğu gibi alanin ile değiştirilen bir amino aside sahiptir. Fura-2 boyası, PEPTİDLerİN MRGPRX2 transfected HEK hücrelerine karşı aktivasyon potansiyelini incelemek için kullanılmıştır1. Veriler floresan plaka okuyucusunda kaydedildi. Peptid ligand hücreyi aktive ettiyse, floresan 340 nm 'de (F340) pompalanırken, aynı şey 380 nm dalga boyu (F380) için azalır (Şekil 1a). Ancak, boş bir (veya bu konuda peptit veya HEK-WT kontrolü aktive olmayan) için, şekil 2a'dagösterildiği gibi göreli artış ve azalma sırasıyla düşük olacaktır. Bununla birlikte, kalsiyum konsantrasyonu Şekil 1b ,2b'degösterildiği gibi F340/F380 oranı ile temsil edilir. F340/F380 oranı, yerinde kalibrasyonlar kullanarak kalsiyum konsantrasyonu elde etmek için Grynkiewicz denkleminde daha fazla değiştirilebilir (Şekil 3). Tablo 1'de listelenen peptitler kitle spektroskopisi (Şekil 4a) ve HPLC (Şekil 4b) ile karakterize edildi ve yüksek saflıkta bulundu.
| Peptit Tekniği | Temsilci Peptid |
| Ebeveyn peptidi | Ac-FRKKWNKWALSR-Amide |
| N-Kesilme | Ac-RKKWNKWALSR-Amide |
| C-Kesilme | Ac-FRKKWNKWALS-Amide |
| N+C-Kesilme | Ac-WNKWALS-Amide |
| Alanine Tarama | Ac-ARKKWNKWALSR-Amide |
Tablo 1: N, C ve N+C'den sonra oluşturulan temsili peptit dizileri - kesilme ve alanin taraması. Peptitlerin N terminali asetil olarak değiştirilmiş, C-Terminali ise bir amid grubu içeriyordu.
Şekil 1: Aktive edici bir peptit için temsili veriler. (a) Aktive edici bir peptit için floresan sinyalleri. Temsil edilen veriler PAMP-12'ye (FRKKWNKWALSR) karşılık gelir. Peptit, okla gösterildiği gibi 10 okuma döngüsü (36 s) için bir taban çizgisi oluşturduktan sonra eklendi. (b) 340 nm (F340) 340 nm 'de (F340) heyecandan sonra floresan emisyonunun floresan emisyonu oranı 380 nm 'de (F340/F380). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Boş için temsili veriler. (a) Blank için floresan sinyalleri. HTB, okla gösterildiği gibi 10 okuma döngüsü (36 s) için bir taban çizgisi oluşturduktan sonra eklendi. (b) 340 nm (F340) 340 nm 'de (F340) heyecandan sonra floresan emisyonunun floresan emisyonu oranı 380 nm 'de (F340/F380). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Boya kalibrasyonu standartları için temsili veriler. (a) İyonomisinin, okta gösterildiği gibi, Ca+2 bağlı durumda maksimum floresan elde etmek için10. EGTA-Triton X-100, minimum sinyal almak için okta gösterildiği gibi 20 okumadan sonra eklendi. (b) 340 nm (F340) 340 nm 'de (F340) heyecandan sonra floresan emisyonunun floresan emisyonu oranı 380 nm 'de (F340/F380). Bu değerler hücre içi kalsiyum konsantrasyonu elde etmek için Grynkiewicz denklemine daha da konur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Diziyi ve saflığı doğrulamak için temsili bir peptitin karakterizasyonu. (a) Temsili peptit dizisi WNKWAL'ın teorik kütlesi 857.90 Da idi ve bu kitle spektroskopisinde m/z oranı ile gösterilmiştir. (b) Peptidin saflığı HPLC tarafından onaylanan% 99'dur. Bu peptit N+C kesilmiş peptit kütüphanesine aittir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsiyum sinyali mast hücre degranülasyonu için merkezidir ve reseptör-ligand etkileşimleri, ligand tanımlama ve ilaç keşfi çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır14. MRGPRX2, kaşıntı, astım ve atopik dermatit gibi birçok enflamatuar hastalıkta önemli bir rol oynadığı tespit edilen yakın zamanda keşfedilen bir mast hücre reseptörüdür2. Ayrıca, mrgprx2 reseptör15aracılığıyla enflamatuar yanıt ortaya çıkarmak için onaylanmış birkaç ilaç gösterilmiştir. Bu nedenle, ligand-reseptör etkileşimini incelemek, yeni ligandları tanımlamak ve aktivasyon mekanizmasını anlamak zorunludur. Bu çalışma, peptit kütüphanesinin tasarımında(Tablo 1)ve MRGPRX2 tabanlı mast hücre aktivasyonunun incelenmesinde yaygın peptit tekniklerinin kullanımını göstermektedir. Mast hücre aktivasyonunun göstergesi olarak alttaki kalsiyum mobilizasyon kullanıldı.
Fura-2 hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ölçmek için kullanılan kalsiyuma duyarlı bir boyadır. Asetoksimetril ester varyantı (Fura-2 AM), hücre zarının geçirgenliğini artırarak sitoplazmik kalsiyum salınımlarını ölçmek için kolay bir yöntem verir. Boya, akış sitometresi, mikroskopi ve florometreler9, 16,17gibi çeşitli karakterizasyon teknikleri ile sıklıkla kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bunların verimli bir şekilde kullanılabilmesi için ele alınması gereken boya ile ilgili zorluklar vardır. Hücre içi kalsiyum bağlanması, büyük ölçüde boya yükleme koşullarına, hücre sistemine ve hücre kültürü türlerine bağlı olan boyanın esterleşmesinin giderilmesine dayanır. Kısmi esterleşme yetersiz floresan sinyalleri ile sonuçlanır. Ayrıca, eksik esterifikasyon, boyanın hücre organellerine lokalizasyonu ile de sonuçlanır ve yanlış verilerle sonuçlanır. Hücreden esterleşmiş boya sızıntısı Fura-210,11ile karşı karşıya kalınan başka bir konudur.
Boya yüklemesi dışında algılama tekniğinin kullanılması da önemli rol oynar. Akış sitometrelerinin UV lazerlerle çalışamaması, onları boya için elverişsiz hale getirir9. Benzer şekilde, floresan görüntüleme teknikleri mikroskop operasyonunda ileri düzeyde eğitim gerektirir. Ligand aktivasyonu üzerine kalsiyum salınımının geçici doğası, dalga boylarındaki değişimde hızlı bir yanıt ve böylece mikroskobun daha hızlı deklanşör hızını gerektirir. Ek olarak, özel hücre görüntüleme odalarının kullanımı, kapak altlıklarının kullanımı ve sürekli görüntü odaklama, onu büyük ölçekli tarama için hantal bir teknik haline getirir16.
Yöntem optimizasyonuna önemli miktarda zaman yatırıldı. Kültür şişesinden çıkarıldıktan sonra hücrelerin karanlıkta boya yüklü ortamla kuluçkaya yatırıldığı ve daha sonra çalışma için HTB tamponunda yıkandığı ve yeniden biriktirildiği Cuvette bazlı florometre. HTB tamponunda asılı hücreler bir cuvette alındı ve fotomultiplier bazlı florometre kullanılarak okundu. Algılama sistemleri aynı anda sadece birkaç (2-4) cuvette tutabiliyordu ve bu nedenle peptitlerin büyük ölçekli taraması için uygun değildi. Ayrıca, HEK hücreleri yapışan hücrelerdir, hücre süspansiyonu okuması bir deney içinde bireysel tekrarlarda büyük farklılıklar göstermiştir. Sonuç olarak, yine sıkıcı ve yavaş olduğu kanıtlanan floresan görüntüleme tekniği kullanılmıştır. Hızlı dalga boyu değiştirme yeteneğine, mikroskop spesifik hücre odalarına ve mükemmel görüntüleme becerilerine sahip gelişmiş bir mikroskop gereksinimi çalışmayı engellemiştir. Ek olarak, yerinde peptit simülasyonu zaman kapsamlıydı ve önemli verilerin kaybına neden oldu. Verimsiz hücre işleme tekniği, okumalar sırasında hücre yüzdürmelerine neden oldu ve bu da odaklanmayı zorlaştırdı ve tutarsız sonuçlar verdi.
Çalışma için deneyler sırasında bileşikleri dağıtabilen otomatik pipetleme sistemine sahip bir floresan plaka okuyucu sistemi kullanılmıştır. Birçok numunenin 96 kuyu plakasında hızlı bir şekilde art arda okunması bu tekniğin ek bir faydasıdır. Sonuçlar, hücreler süspansiyona kıyasla bağlandığında okumaların daha tutarlı olduğunu gösterdi. Bir gün boyunca yetiştirilen TC ile tedavi edilen 96 kuyu plakasında 40.000 hücre/kuyu hücre sayısı en iyi sonuçları verdi. 37 °C inkübatörde 30-40 dk boya inkübasyon süresi optimumdu. Bununla birlikte, deneyler deneysel tekrarlarla yapıldığında, farklı sütunların karşılık gelen kuyularında farklılıklar gözlenmiştir. Bunun üstesinden gelmek için plakanın her sütunu için pozitif (PAMP-12) ve negatif kontrol (Boş) kullanılmıştır. Bu daha tutarlı ve tekrarlanabilir veriler verdi. Burada açıklanan yöntem, büyük ölçekli kalsiyum bazlı tarama için verimli bir şekilde gerçekleştirilen kolay ve çok yönlü bir yöntemdir. Bununla birlikte, verilerin kalitesini belirleyen çeşitli faktörler vardır ve bu nedenle yöntemin belirli bir hücre cihazı sistemi için optimize edilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
SR ve LDU, Alberta Innovates Stratejik Araştırma Projesi, NRC ve NSERC-Discovery'nin bu proje için hibesini kabul etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
