Summary
Se describen técnicas para generar una biblioteca de péptidos cortos que pueden activar los mastocitos a través del receptor MRGPRX2. Las técnicas asociadas son fáciles, económicas y se pueden extender a otros receptores celulares.
Abstract
La identificación de ligandos específicos para receptores celulares terapéuticamente significativos es crucial para muchas aplicaciones, incluido el diseño y desarrollo de nuevas terapias. Mas relacionado con el receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) es un receptor importante que regula la activación de los mastocitos y, por lo tanto, dirige la respuesta inmune general. Se han identificado numerosos ligandos para MRGPRX2 e incluyen péptidos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 y otros fragmentos de proteínas (es decir, albúmina degradada). La identificación adicional de ligandos específicos de MRGPRX2 requiere la detección de un gran número de péptidos (es decir, biblioteca de péptidos); sin embargo, los mastocitos son difíciles y costosos de mantener in vitro y, por lo tanto, no son económicos de usar para el cribado de un gran número de moléculas. El presente artículo demuestra un método para diseñar, desarrollar y examinar una biblioteca de moléculas peptídicas pequeñas utilizando células HEK que expresan MRGPRX2. Esta línea celular es relativamente fácil y económica de mantener y se puede utilizar para el análisis in vitro de alto rendimiento. Se utilizó un colorante fluorescente Fura-2 sensible al calcio para marcar el flujo de calcio intracelular tras la activación para monitorear la activación. Para calcular la concentración de calcio se utilizó la relación entre la intensidad de fluorescencia de Fura-2 a 510 nm frente a longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm. La biblioteca de péptidos utilizada para verificar este sistema se basó en el secretagogo endógeno proadrenomedulina N-terminal 12 (PAMP-12), que se sabe que se une a MRGPRX2 con alta especificidad y afinidad. Los péptidos posteriores se generaron a través de técnicas de truncamiento de aminoácidos y escaneo de alanina aplicadas a PAMP-12. El método descrito aquí es simple y económico pero robusto para la detección de una gran biblioteca de compuestos para identificar dominios de unión y otros parámetros importantes que juegan un papel importante en la activación del receptor.
Introduction
Los mastocitos son una parte integral del sistema inmunológico y desempeñan un papel crucial en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Los mastocitos se activan principalmente por la unión de un antígeno al complejo receptor de inmunoglobulina E (IgE) - FcεRI, o por el recientemente descubierto receptor de proteína G relacionado con mas-X2 (MRGPRX2)1. La activación de MRGPRX2 se ha relacionado con varias enfermedades inmunes e inflamatorias, y por lo tanto, es importante comprender el mecanismo de unión del receptor a sus ligandos2. Para hacerlo, se desarrolló una biblioteca de pequeñas moléculas peptídicas y se cribó contra los receptores MRGPRX2 que estaban sobreexpresados en las células HEK. En el estudio, la biblioteca de péptidos se construyó utilizando las técnicas simples y versátiles de escaneo de alanina y truncamiento de aminoácidos. La exploración con alanina implica reemplazar aminoácidos específicos con un residuo de alanina. La alanina es pequeña y neutra, despoja al péptido de las propiedades específicas conferidas por el residuo reemplazado y resalta consecutivamente la importancia de las respectivas propiedades fisicoquímicas del aminoácido en las interacciones receptoras. Por el contrario, en el truncamiento de aminoácidos, las secuencias peptídicas están diseñadas de tal manera que carecen de uno o más residuos de aminoácidos del terminal N, terminal C o ambos. Este conjunto de péptidos se utilizó para identificar las secuencias de aminoácidos cruciales para la unión a MRGPRX2.
La experiencia con líneas de mastocitos humanos (LAD-2) ha demostrado que estas células son difíciles de cultivar y mantener in vitro:un tiempo de duplicación de dos semanas, costosos suplementos medios y atención directa requerida durante el paso3. Estos atributos hacen que las células no sean adecuadas para el cribado a gran escala de ligandos potenciales. Aquí, se utilizaron células HEK transfectadas de manera estable que expresan el receptor MRGPRX2 (HEK-X2) para examinar la biblioteca de péptidos1. Las células HEK-293 son ampliamente utilizadas y estudiadas para la expresión heteróloga de receptores de superficie debido a su alta eficiencia de transfección, tasa de duplicación más rápida y la necesidad de que se culticen suplementos medios no costosos en laboratorio4. El protocolo para transfectar la línea celular HEK-293 ha sido demostrado y está bien establecido5. Las células HEK-293 que expresan de manera estable el receptor MRGPRX2 (paso 13-19) se activaron con los péptidos generados a través del N-truncamiento, C-truncamiento, N+C-truncamiento y escaneo de alanina1. Se utilizaron células HEK de tipo salvaje (HEK-WT) (paso 16-21) como control. La liberación intracelular de calcio tras la activación fue monitoreada para estudiar la activación basada en MRGPRX2.
La activación celular por MRGPRX2 es seguida por una movilización de calcio citosólico. Esta liberación de calcio intracelular regulada en los mastocitos está regulada por la entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE), coordinada por la molécula de interacción estromal 1 (STIM1); y es central en la cascada de respuesta inmune6,7. Se han utilizado varios métodos para detectar la concentración de calcio intracelular, incluyendo pinzas de parche y colorantes fluorescentes8. De todas las técnicas disponibles, los colorantes fluorométricos de calcio en conjugación con diversas técnicas de detección están siendo ampliamente utilizados9. Dos tipos de colorantes fluorométricos que han ganado interés son, a saber, los tintes de longitud de onda única como Fluo-4, y los tintes de relación de longitud de onda dual como Indo-1 y Fura-2. La ventaja que aportan los tintes ratiométricos de doble longitud de onda sobre los tintes de longitud de onda única es que los tintes ratiométricos corrigen errores experimentales como la carga del tinte, el fotoblanqueo y el enfoque10,11.
El éster acetoximetílico fura-2 (Fura-2 AM) es un colorante verde-fluorescente penetrante en las células cuya excitación cambia a una longitud de onda más baja al unirse al calcio. Experimentalmente, Fura-2 se excita a 340 y 380 nm, mientras que la emisión se registra a 510 nm. Tras la unión al calcio, la intensidad fluorescente a 340 nm aumenta mientras que la de 380 nm disminuye, como se muestra en la Figura 1. Los datos se representan como una relación entre la intensidad de fluorescencia después de la excitación a 340 nm (F340) y la intensidad después de la excitación a 380 nm (F380), es decir, F340 / F380. La relación F340/F380 es proporcional al calcio intracelular, cuyo valor se puede calcular mediante la ecuación de Grynkiewicz12. Dado que la señal de fluorescencia se obtiene de la excitación del tinte en dos longitudes de onda (340 nm y 380 nm), la relación de las señales de fluorescencia corrige factores experimentales como la carga del tinte, la fuga de tinte, el fotoblanqueo y las densidades celulares.
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Protocol
1. Diseño y desarrollo de la biblioteca de péptidos
- Para identificar los ligandos del receptor MRGPRX2 de mastocitos basado en un ligando conocido, es decir, PAMP-1213,siga los pasos a continuación.
- Generar una biblioteca de péptidos N-truncados truncando los residuos de aminoácidos N-terminales del ligando, sucesivamente, mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS).
- Generar la biblioteca de péptidos truncados C truncando los residuos de aminoácidos C-terminales del ligando conocido, en sucesión, por SPPS.
- Sobre la base de los resultados de 1.1.1 y 1.1.2, genere una biblioteca de péptidos truncados N + C utilizando SPPS truncando los residuos deseados del N y C-terminal, respectivamente.
- Utilice la síntesis de péptidos en fase sólida para sintetizar los péptidos13.
- Modifique el terminal N al grupo acetilo (Ac) y el terminal C al grupo amida.
- Caracterizar el péptido por su pureza mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y por la masa mediante un espectrofotómetro de masas.
- Para estudiar la importancia de aminoácidos específicos dentro de la molécula PAMP-12 madre, siga los pasos a continuación.
- Genere una biblioteca de péptidos de barrido de alanina reemplazando los respectivos residuos de aminoácidos en la molécula peptídica con alanina, uno a la vez utilizando SPPS. Modifique el terminal N al grupo acetilo (Ac) y el terminal C al grupo amida.
- Caracterizar el péptido por su pureza mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y por la masa mediante un espectrofotómetro de masas.
NOTA: Asegúrese de que los péptidos sintetizados sean de alta pureza. Caracterizar los péptidos mediante espectroscopia de masas y HPLC.
2. Cultivo celular in vitro
- Culta células HEK-X2 y HEK-WT siguiendo los pasos a continuación.
- Preparar el medio de cultivo suplementando DMEM de glucosa alta con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
- Pasar las células en cultivo de tejidos (CT) tratado con matraces de cultivo T-75 y crecer en una incubadora a 37 °C que contiene 5% de CO2,hasta que sean 75-80% confluentes.
- Una vez que el 75% sea confluente, lave las células y agregue 2-3 ml de tripsina durante 2 a 3 min. Incubar en una incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 para separar las células.
- Una vez que las células se hayan desprendido, recoja las células en tripsina. Añadir 6-9 mL de medio fresco.
- Centrifugar las células a 1620 x g durante 3-5 min.
- Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante para recoger el pellet. Resuspend las células en un medio de cultivo fresco. Diluya las células según la concentración deseada.
NOTA: Las células HEK son células de rápido crecimiento y, por lo tanto, optimizan los suplementos de medio celular. Las células HEK son células adherentes; pasarlos en matraces de cultivo tratados con CT para apoyar la adhesión.
- Prepare una placa de ensayo de 96 pozos para el experimento.
- Añadir 200 μL de suspensión celular en cada pozo, con una concentración de 200.000 células/ml, para sembrar 40.000 células/pozo.
- Cultive las células durante 24 h en una incubadora de 37 °C, 5% de CO2.
NOTA: Optimice la densidad celular por pozo en función del tamaño de la placa y el tipo de cepa celular. Realice el experimento por triplicado en una placa negra de 96 pozos tratada con TC con fondo plano transparente.
3. Ensayo de calcio Fura-2 AM
- Prepare el tinte siguiendo los pasos a continuación.
- Utilice el tinte Fura-2 AM para el experimento.
- Prepare el tampón tampón (HTB) de HEPES-Tyrode que contenga 25 mM de tampón HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mg/ml de glucosa, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y recién añadido 1,8 mM de CaCl2 en agua esterilizada en autoclave.
- Añadir 50 μL de DMSO en un vial de 50 μg de Fura-2 AM para preparar una solución de 1 mM de colorante Fura-2 AM. Añadir 1 μL de colorante Fura-2 AM de 1 mM por ml de medio fresco para preparar el medio de carga de colorante con una concentración de colorante de 1 μM.
- Retire la placa de 96 pozos de la incubadora y deseche el medio. Reemplace el medio con un medio de carga de tinte fresco. Añadir 200 μL de medio de carga de colorante en cada pozo. Incubar las células durante 30-40 min en una incubadora de 37 °C, 5% CO2.
- Después de 40 min de incubación, retire el medio. Lave las celdas con el tampón HTB. Agregue 100 μL de tampón HTB para la lectura de fluorescencia. Tome la placa para la lectura de fluorescencia.
NOTA: Optimizar la concentración de colorante en el medio de carga del tinte. La fuga de tinte y el fotobleaching son posibles preocupaciones asociadas con el tinte. Agregue CaCl2 fresco en el tampón HTB para evitar precipitaciones.
4. Activación celular y lectura fluorescente
NOTA: El lector de placas de fluorescencia con un sistema de pipeteo automatizado permite la transferencia automática de compuestos de una fuente compuesta a la placa de ensayo sin sacar la placa del lector de placas.
- Mientras se incuban las células, configure el lector de placas.
- Ajuste la temperatura a 37 °C.
- En Configuración, seleccione Flex.
- Establezca el modo de lectura en Fluorescencia y Lectura inferior.
- En Longitudes de onda, establezca el número de longitudes de onda en 2. Establezca la excitación en 340 nm y 380 nm. Establezca la emisión en 510 nm.
- Deje la sensibilidad al valor predeterminado.
- En Temporización, establezca el intervalo en 3,9 s. Establezca el tiempo de ejecución en 94 s para obtener 25 lecturas.
- A continuación, seleccione el Tipo de placa de ensayo.
- A continuación, seleccione los pozos para leer.
- En Transferencia de compuestos,establezca Transferencias a 1 y Volumen inicial a 100 μL. Establezca la altura de la pipeta en 100 μL, el volumen en 50 μL y el punto de tiempo en 36 s, para agregar el compuesto en la 10ª lectura.
- A continuación, seleccione el tipo de placa fuente compuesta.
- Dejar triturar a No usado.
- Seleccione las sugerencias en el Diseño de puntas de pipeta.
- Para las columnas compuestas y de punta,asegúrese de que los compuestos que se van a transferir se encuentran en la columna 1 de la placa compuesta. Establezca la columna de punta en 1 y la columna compuesta en 1.
- Deje el autocalibrado como ON.
- Haga clic en Aceptar.
- Cuando la temperatura haya alcanzado los 37 °C, cargue las placas en el lector de placas.
- Presione la cámara de lectura para colocar la placa de ensayo en el lector de placas defluorescencia.
- Pulse la fuente para colocar la placa compuesta. Prepare la placa compuesta agregando 200 μL de péptidos respectivos, ionomicina y etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)-Tritón X-100 soluciones.
- Presione el bastidor de punta para colocar el cuadro de punta. Use una punta negra para evitar la autofluorescencia de la punta.
- Una vez cargadas las placas, revise la configuración del software y pulse Leer.
5. Análisis de datos
- Determinar la concentración de calcio a partir de la relación de fluorescencia mediante la ecuación de Grynkiewicz -
donde, Kd es la constante de disociación de Fura-2 AM, R es la relación de emisión después de la excitación a 340 nm y 380 nm (F340/F380) para los péptidos respectivos, Rmax es la relación de fluorescencia máxima observada por la adición de 50 μL de ionomicina de 30 μM, Rmin es la fluorescencia mínima observada por la adición de 50 μL de 100 mM EGTA/2.5%Triton X-100, y F380min y F380max son la intensidad de fluorescencia absoluta de Fura-2 AM en estado libre de calcio y unido, respectivamente.
NOTA: La máquina dispensa el líquido con cierta fuerza. No ajuste la altura de dispensación del péptido demasiado cerca de la parte inferior de la placa; puede separar las células. Use puntas de pipeta negras para evitar la autofluorescencia. Lea la fluorescencia máxima y la fluorescencia mínima para cada placa para cada experimento.
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Representative Results
La Tabla 1 contiene las secuencias peptídicas generadas a través del truncamiento terminal de aminoácidos y el escaneo de alanina. Como se muestra en la Tabla 1,la secuencia peptídica RKKWNKWALSR carece de fenilalanina N-terminal (F) con respecto a su padre PAMP-12 y, por lo tanto, es un péptido representativo en la biblioteca N-truncada. Del mismo modo, en FRKKWNKWALS, se ha eliminado la serina C-terminal PAMP-12, lo que representa una biblioteca de péptidos truncados C derivada de PAMP-12. En la biblioteca de péptidos truncados N + C, se eliminan los aminoácidos de N y C-terminal. El truncamiento de 4 aminoácidos de N-terminal y 1 residuo de C-terminal de PAMP-12 da como resultado WNKWALS. La biblioteca de péptidos derivados del escaneo de alanina tiene un aminoácido reemplazado con alanina, como con ARKKWNKWALSR, donde la fenilalanina N-terminal se reemplaza con alanina. Se utilizó el colorante Fura-2 AM para estudiar el potencial de activación de péptidos contra células HEK transfectadas por MRGPRX21. Los datos se registraron en un lector de placas de fluorescencia. Si el ligando peptídico activa la célula, la fluorescencia bombeada a 340 nm (F340) aumenta, mientras que la misma disminuye para la longitud de onda de 380 nm (F380)(Figura 1a). Sin embargo, para un péptido en blanco (o para el caso no activador o control HEK-WT), el aumento y la disminución relativos serían respectivamente bajos, como se muestra en la Figura 2a. Sin embargo, la concentración de calcio está representada por la relación F340/F380 como se muestra en la Figura 1b,2b. La relación F340/F380 puede ser sustituida en la ecuación de Grynkiewicz para obtener la concentración de calcio utilizando calibraciones in situ(Figura 3). Los péptidos enumerados en la Tabla 1 se caracterizaron por espectroscopia de masas(Figura 4a)y HPLC(Figura 4b)y se encontró que eran de alta pureza.
| Técnica peptídica | Péptido representativo |
| Péptido padre | Ac-FRKKWNKWALSR-Amida |
| N-Truncamiento | Ac-RKKWNKWALSR-Amida |
| C-Truncamiento | Ac-FRKKWNKWALS-Amida |
| N+C-Truncamiento | Ac-WNKWALS-Amida |
| Escaneo de alanina | Ac-ARKKWNKWALSR-Amida |
Tabla 1: Secuencias peptídicas representativas generadas después de N, C y N+C - truncamiento y escaneo de alanina. El N-terminal de los péptidos fue modificado por acetilo, mientras que el C-Terminal contenía un grupo amida.
Figura 1: Datos representativos de un péptido activador. ( a ) Las señales de fluorescencia para un péptido activador. Los datos representados corresponden a PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). El péptido se agregó después de generar una línea de base para 10 ciclos de lectura (36 s), como se muestra en la flecha. b)Relación entre la emisión de fluorescencia después de la excitación a 340 nm (F340) y la emisión de fluorescencia después de la excitación a 380 nm (F380) (F340/F380). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos representativos para el espacio en blanco. a)Las señales de fluorescencia para el blank. HTB se agregó después de generar una línea de base para 10 ciclos de lectura (36 s), como se muestra en la flecha. b)Relación entre la emisión de fluorescencia después de la excitación a 340 nm (F340) y la emisión de fluorescencia después de la excitación a 380 nm (F380) (F340/F380). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos representativos de las normas de calibración de colorantes. (a ) La ionomicina se agregó en 10ª lecturas, como se muestra en la flecha, para obtener la máxima fluorescencia en estado unido a Ca+2. EGTA-Triton X-100 se agregó después de 20 lecturas, como se muestra en la flecha, para obtener una señal mínima. b)Relación entre la emisión de fluorescencia después de la excitación a 340 nm (F340) y la emisión de fluorescencia después de la excitación a 380 nm (F380) (F340/F380). Estos valores se ponen además en la ecuación de Grynkiewicz para obtener la concentración de calcio intracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización de un péptido representativo para confirmar la secuencia y pureza. (a) La masa teórica de la secuencia peptídica representativa WNKWAL fue de 857,90 Da, que se demostró mediante la relación m/z en espectroscopia de masas. b)Pureza del péptido del 99% confirmada por HPLC. Este péptido pertenece a la biblioteca de péptidos truncados N+C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La señalización de calcio es fundamental para la degranulación de mastocitos y se ha utilizado ampliamente en el estudio de las interacciones receptor-ligando, la identificación de ligandos y el descubrimiento de fármacos14. MRGPRX2 es un receptor de mastocitos recientemente descubierto que se ha encontrado que desempeña un papel clave en muchas enfermedades inflamatorias como la picazón, el asma y la dermatitis atópica, entre otras2. Además, se ha demostrado que varios fármacos aprobados provocan una respuesta inflamatoria a través del receptor MRGPRX215. Por lo tanto, es imperativo estudiar la interacción ligando-receptor, identificar nuevos ligandos y comprender el mecanismo de activación. Este estudio muestra el uso de técnicas peptídicas comunes en el diseño de una biblioteca de péptidos(Tabla 1)y en el estudio de la activación de mastocitos basada en MRGPRX2. La movilización de calcio subyacente se empleó como indicador de la activación de los mastocitos.
Fura-2 es un colorante sensible al calcio utilizado para medir la concentración intracelular de calcio. La variante de éster acetoximetil (Fura-2 AM) aumenta la permeabilidad de la membrana celular produciendo un método fácil para cuantificar las liberaciones de calcio citoplasmático. El tinte se ha utilizado con frecuencia con diversas técnicas de caracterización como citómetro de flujo, microscopía y fluorímetros9,16,17. Aunque se usa ampliamente, existen desafíos asociados con el tinte, que deben abordarse antes de que puedan emplearse de manera eficiente. La unión intracelular al calcio se basa en la desesterificación del colorante, que depende en gran medida de las condiciones de carga del colorante, el sistema celular y los tipos de cultivo celular. La desesterificación parcial da como resultado señales de fluorescencia inadecuadas. Además, la desesterificación incompleta también resulta en la localización del tinte en los orgánulos celulares, lo que resulta en datos inexactos. La fuga de colorante desesterificado de la célula es otro problema que enfrenta Fura-210,11.
Aparte de la carga de tinte, el uso de la técnica de detección también juega un papel importante. La incapacidad de los citómetros de flujo para operar con láseres UV los hace desfavorables para el tinte9. Del mismo modo, las técnicas de imágenes fluorescentes requieren capacitación avanzada en la operación del microscopio. La naturaleza transitoria de la liberación de calcio tras la activación del ligando requiere una respuesta rápida en el cambio de longitudes de onda y, por lo tanto, una velocidad de obturación más rápida del microscopio. Además, el uso de cámaras especializadas de imágenes celulares, el uso de coverslips y el enfoque constante de imágenes lo convierten en una técnica engorrosa para el cribado a gran escala16.
Se invirtió una cantidad significativa de tiempo en la optimización del método. Fluorómetro basado en cubeta, en el que las células después de desprenderse del matraz de cultivo, se incubaron con el medio cargado de colorante en la oscuridad y luego se lavaron y resuspendieron en el tampón HTB para el estudio. Las células suspendidas en tampón HTB se tomaron en una cubeta y se leyeron utilizando un fluorómetro basado en fotomultiplicador. Los sistemas de detección solo podían contener pocas (2-4) cubetas a la vez y, por lo tanto, no eran adecuados para el cribado a gran escala de péptidos. Además, al ser células HEK células adherentes, la lectura de suspensión celular mostró grandes variaciones dentro de las repeticiones individuales dentro de un experimento. En consecuencia, se utilizó la técnica de imagen fluorescente, que nuevamente resultó ser tediosa y lenta. El requisito de un microscopio avanzado con capacidad de cambio rápido de longitud de onda, cámaras celulares específicas del microscopio y excelentes habilidades de imagen impidieron el estudio. Además, la simulación de péptidos in situ fue extensa en el tiempo y resultó en la pérdida de datos importantes. La técnica de procesamiento celular ineficiente dio lugar a flotaciones celulares durante las lecturas que dificultaron el enfoque y dieron resultados inconsistentes.
Para el estudio se utilizó un sistema lector de placas de fluorescencia con un sistema de pipeteo automatizado que puede dispensar compuestos durante los experimentos. El hecho de que muchas muestras se lean en rápida sucesión en una placa de 96 pozos es un beneficio adicional de esta técnica. Los resultados mostraron que las lecturas fueron más consistentes cuando las células se unieron en comparación con la suspensión. Los recuentos celulares de 40,000 células / pozo en una placa de 96 pozos tratada con TC cultivada durante un día dieron los mejores resultados. Un tiempo de incubación del tinte de 30-40 min a 37 °C de incubadora fue óptimo. Sin embargo, cuando se realizaron experimentos con repeticiones experimentales, se observaron variaciones en los pozos correspondientes de diferentes columnas. Para superar esto, se utilizó un control positivo (PAMP-12) y un control negativo (Blank) para cada columna de la placa. Esto dio datos más consistentes y reproducibles. El método descrito aquí es un método fácil y versátil, que se puede emplear de manera eficiente para la detección a gran escala basada en calcio. Sin embargo, hay varios factores que determinan la calidad de los datos y, por lo tanto, el método debe optimizarse para un sistema de instrumento celular determinado.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
SR y LDU desean reconocer el Proyecto de Investigación Estratégica Alberta Innovates, NRC y la subvención NSERC-Discovery para este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
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