Summary
يتم وصف تقنيات إنشاء مكتبة من الببتيدات القصيرة التي يمكن تنشيط الخلايا السارية عن طريق مستقبلات MRGPRX2. التقنيات المرتبطة سهلة وغير مكلفة ، ويمكن تمديدها إلى مستقبلات الخلايا الأخرى.
Abstract
تحديد ligands محددة لمستقبلات الخلايا ذات الأهمية العلاجية أمر بالغ الأهمية بالنسبة للعديد من التطبيقات، بما في ذلك تصميم وتطوير علاجات جديدة. ماس ذات الصلة G-البروتين مستقبلات X2 (MRGPRX2) هو مستقبل مهم ينظم تنشيط الخلايا الصاري، وبالتالي، يوجه الاستجابة المناعية العامة. وقد تم تحديد العديد من الليجاندات لMRGPRX2 وتشمل الببتيدات الذاتية مثل PAMPs، defensins، LL-37 وغيرها من شظايا البروتين (أي، الألبومين المتدهورة). ويتطلب تحديد المزيد من الليجاندات المحددة MRGPRX2 فحص عدد كبير من الببتيدات (أي مكتبة الببتيد)؛ ومع ذلك، الخلايا الصاري صعبة ومكلفة للحفاظ على في المختبر، وبالتالي، ليست اقتصادية لاستخدامها لفحص أعداد كبيرة من الجزيئات. توضح هذه الورقة طريقة لتصميم وتطوير وفحص مكتبة من جزيئات الببتيد الصغيرة باستخدام MRGPRX2 التي تعبر عن خلايا HEK. هذا الخط الخلية سهلة نسبيا وغير مكلفة للحفاظ على ويمكن استخدامها لتحليل عالية الإنتاجية في المختبر. تم استخدام صبغة فلورية حساسة للكالسيوم Fura-2 لوضع علامة على تدفق الكالسيوم داخل الخلايا عند التنشيط لمراقبة التنشيط. واستخدمت نسبة كثافة الفلورية من Fura-2 في 510 نانومتر ضد أطوال موجية الإثارة من 340 و 380 نانومتر لحساب تركيز الكالسيوم. كانت مكتبة الببتيد المستخدمة للتحقق من هذا النظام تستند إلى الإفرازات الذاتية Proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12) ، والتي من المعروف أنها تربط MRGPRX2 بخصوصية وتقارب عاليين. تم إنشاء الببتيدات اللاحقة من خلال اقتطاع الأحماض الأمينية وتقنيات مسح ألانين المطبقة على PAMP-12. الطريقة الموصوفة هنا بسيطة وغير مكلفة ولكنها قوية لفحص مكتبة كبيرة من المركبات لتحديد نطاقات الربط والمعلمات الهامة الأخرى التي تلعب دورا هاما في تنشيط المستقبلات.
Introduction
الخلايا الصاري هي جزء لا يتجزأ من الجهاز المناعي وتلعب دورا حاسما في كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. يتم تنشيط الخلايا الصاري في المقام الأول إما عن طريق ربط مستضد للغلوبولين المناعي E (IgE) - مجمع مستقبلات FcεRI ، أو بواسطة ماس المكتشفة مؤخرا ذات الصلة G-البروتين مستقبلات X2 (MRGPRX2)1. وقد تم ربط تنشيط MRGPRX2 إلى العديد من الأمراض المناعية والالتهابية، وبالتالي، من المهم أن نفهم آلية ملزمة للمستقبلات إلى ليغاندس2. للقيام بذلك ، تم تطوير مكتبة من جزيئات الببتيد الصغيرة وفحصها ضد مستقبلات MRGPRX2 التي تم التعبير عنها بشكل مفرط في خلايا HEK. في الدراسة، تم بناء مكتبة الببتيد باستخدام تقنيات بسيطة ومتعددة الاستخدامات لمسح ألانين واقتطاع الأحماض الأمينية. يتضمن مسح ألانين استبدال الأحماض الأمينية المحددة ببقايا ألانين. ألانين يجري صغيرة ومحايدة، يجرد الببتيد من خصائص محددة التي تمنحها بقايا استبدال ويسلط الضوء على التوالي على أهمية الخصائص الفيزيائية الكيميائية لكل من الأحماض الأمينية في التفاعلات مستقبلات. على العكس من ذلك، في اقتطاع الأحماض الأمينية، تم تصميم تسلسل الببتيد بحيث يفتقر إلى واحد أو أكثر من بقايا الأحماض الأمينية من محطة N، محطة C، أو كليهما. تم استخدام هذه المجموعة من الببتيدات لتحديد تسلسل الأحماض الأمينية الحاسمة لربط MRGPRX2.
وقد أظهرت تجربة مع خطوط الخلايا الصاري البشري (LAD-2) أن هذه الخلايا من الصعب على الثقافة والحفاظ على في المختبر: مضاعفة الوقت لمدة أسبوعين, ملاحق متوسطة مكلفة, والاهتمام المباشر المطلوب أثناء passaging3. هذه السمات تجعل الخلايا غير مناسبة لفحص واسع النطاق من الليغاند المحتملة. هنا، استخدمت خلايا HEK المصابة بشكل ثابت التي تعبر عن مستقبلات MRGPRX2 (HEK-X2) لفحص مكتبة الببتيد1. وتستخدم على نطاق واسع HEK-293 خلايا ودرس للتعبير heterologous من مستقبلات السطح بسبب كفاءتها عالية transfection, معدل مضاعفة أسرع, والحاجة إلى المكملات الغذائية المتوسطة غير مكلفة أن تكون مثقفة في المختبر4. وقد ثبت البروتوكول إلى خط الخلية HEK-293 transfect وراسخة5. تم تنشيط خلايا HEK-293 التي تعبر بشكل ثابت عن مستقبلات MRGPRX2 (الممر 13-19) مع الببتيدات المتولدة من خلال الاقتطاع N ، C-truncation ، N + C -truncation ، ومسح ألانين1. استخدمت خلايا HEK البرية من النوع (HEK-WT) (الممر 16-21) كتحكم. تم رصد إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا عند التنشيط لدراسة التنشيط القائم على MRGPRX2.
ويتبع تنشيط الخلية من قبل MRGPRX2 تعبئة الكالسيوم السيتوسوليك. وينظم هذا الإفراج عن الكالسيوم داخل الخلايا المنظمة في الخلايا الصاري من قبل مخزن تشغيل إدخال الكالسيوم (SOCE), منسقة من قبل جزيء التفاعل سترومال 1 (STIM1); وهو مركزي لسلسلة الاستجابة المناعية6،7. وقد استخدمت أساليب مختلفة للكشف عن تركيز الكالسيوم داخل الخلايا، بما في ذلك التصحيح المشابك والأصباغ الفلورية8. من بين جميع التقنيات المتاحة ، يتم استخدام أصباغ الكالسيوم الفلورية في اقترانها بتقنيات الكشف المختلفة على نطاق واسع9. نوعان من الأصباغ الفلورية التي اكتسبت مصالح هي، الأصباغ الطول الموجي واحد مثل فلوو-4، والأصباغ نسبة الطول الموجي المزدوج مثل الهند -1 وفورا-2. الميزة التي تجلب الأصباغ نسبة الطول الموجي المزدوج أكثر من الأصباغ الطول الموجي واحد هو أن الأصباغ ratiometric الصحيح للأخطاء التجريبية مثل تحميل صبغة، تبييض الصور، والتركيز10،11.
Fura-2 أستر أسيتوكسي ميثيل (Fura-2 AM) هي خلية تتخللها صبغة خضراء فلورية يتحول الإثارة إلى طول موجي أقل عند ربط الكالسيوم. من الناحية التجريبية، Fura-2 متحمس في 340 و 380 نانومتر، في حين يتم تسجيل الانبعاثات في 510 نانومتر. عند ربط الكالسيوم، تزداد كثافة الفلورسنت عند 340 نانومتر بينما تنخفض كثافة 380 نانومتر، كما هو موضح في الشكل 1. يتم تمثيل البيانات كنسبة من كثافة الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومتر (F340) إلى كثافة بعد الإثارة عند 380 نانومتر (F380) أي F340/F380. تتناسب نسبة F340/F380 مع الكالسيوم داخل الخلايا، والتي يمكن حساب قيمتها من خلال معادلة Grynkiewicz12. منذ يتم الحصول على إشارة مضان من إثارة الصبغة في اثنين من الأطوال الموجية (340 نانومتر و 380 نانومتر)، ونسبة إشارات مضان يصحح لعوامل تجريبية مثل تحميل صبغة، تسرب صبغ، photobleaching، وكثافات الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم وتطوير مكتبة الببتيد
- لتحديد ligands من مستقبلات MRGPRX2 الخلية الصاري على أساس ligand المعروفة أي PAMP-1213، اتبع الخطوات التالية.
- توليد N-مبتورة مكتبة الببتيد عن طريق اقتطاع بقايا الأحماض الأمينية N-المحطة من ليغند, على التوالي, عن طريق تركيب الببتيد المرحلة الصلبة (SPPS).
- توليد مكتبة الببتيد C-مبتورة عن طريق اقتطاع بقايا الأحماض الأمينية C-المحطة الطرفية من ligand المعروفة، على التوالي، من قبل SPPS.
- استنادا إلى نتائج 1.1.1 و 1.1.2، قم بإنشاء مكتبة ببتيد N+C-مبتورة باستخدام SPPS عن طريق اقتطاع المخلفات المطلوبة من N و C-terminal، على التوالي.
- استخدام توليف الببتيد الصلبة المرحلة لتجميع الببتيدات13.
- تعديل N-المحطة الطرفية إلى أسيتيل (Ac) مجموعة و C-المحطة الطرفية إلى مجموعة أميد.
- تميز الببتيد لنقاوته باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) وللكتلة باستخدام مطياف الكتلة.
- لدراسة أهمية الأحماض الأمينية المحددة داخل جزيء PAMP-12 الأم، اتبع الخطوات أدناه.
- توليد مكتبة الببتيد ألانين المسح الضوئي عن طريق استبدال بقايا الأحماض الأمينية المعنية في جزيء الببتيد مع ألانين، واحد في وقت واحد باستخدام SPPS. تعديل N-المحطة الطرفية إلى أسيتيل (Ac) مجموعة و C-المحطة الطرفية إلى مجموعة أميد.
- تميز الببتيد لنقاوته باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط (HPLC) وللكتلة باستخدام مطياف الكتلة.
ملاحظة: تأكد من أن الببتيدات المركبة هي من نقاء عالية. تميز الببتيدات باستخدام التحليل الطيفي الشامل وHPLC.
2. في ثقافة الخلية المختبر
- الثقافة HEK-X2 وخلايا HEK-WT باتباع الخطوات أدناه.
- إعداد الثقافة المتوسطة عن طريق استكمال DMEM الجلوكوز عالية مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 MM L-الجلوتامين، 100 U/mL من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستريبتومايسين.
- مرور الخلايا في زراعة الأنسجة (TC) تعامل T-75 قوارير الثقافة وتنمو في حاضنة في 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2،حتى أنها التقاء 75-80٪.
- مرة واحدة التقاء 75٪، وغسل الخلايا وإضافة 2-3 مل من تريبسين لمدة 2-3 دقائق. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة CO2 لفصل الخلايا.
- بمجرد انفصال الخلايا، اجمع الخلايا في التريبسين. إضافة 6-9 مل من المتوسطة الطازجة.
- الطرد المركزي الخلايا في 1620 × ز لمدة 3-5 دقائق.
- بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant لجمع بيليه. إعادة إنفاق الخلايا في وسط ثقافة جديدة. تمييع الخلايا وفقا للتركيز المطلوب.
ملاحظة: خلايا HEK هي خلايا سريعة النمو وبالتالي تحسين المكملات الخلية المتوسطة. خلايا HEK هي خلايا معتنقة; تمريرها في قوارير الثقافة المعالجة ب TC لدعم التصاق.
- إعداد لوحة 96 جيدا المقايسة للتجربة.
- إضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر، مع تركيز 200،000 خلية / مل، إلى البذور 40،000 خلية / جيدا.
- تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: تحسين كثافة الخلية لكل بئر استنادا إلى حجم اللوحة ونوع سلالة الخلية. إجراء التجربة في ثلاثية في لوحة سوداء TC المعالجة 96 جيدا مع أسفل شفافة مسطحة.
3. Fura-2 AM فحص الكالسيوم
- إعداد صبغ باتباع الخطوات أدناه.
- استخدام Fura-2 AM صبغة للتجربة.
- إعداد العازلة HEPES-التيرود (HTB) العازلة التي تحتوي على 25 mM HEPES العازلة، 120 mM NaCl، 5 MM KCl، 1 ملغ / مل الجلوكوز، 1 ملغ / مل ألبوم مصل البقري (BSA) وأضاف حديثا 1.8 mM CaCl2 في الماء المعقم الأوتوكلاف.
- إضافة 50 ميكرولتر من DMSO في 50 ميكروغرام Fura-2 AM قارورة لإعداد 1 mM الأسهم حل من Fura-2 AM صبغ. إضافة 1 ميكرولتر من 1 م فورا-2 AM صبغ لكل مل من المتوسطة الطازجة لإعداد متوسط تحميل صبغ وجود تركيز صبغة 1 ميكرومتر.
- إزالة لوحة البئر 96 من الحاضنة والتخلص من المتوسطة. استبدال المتوسطة مع صبغة جديدة تحميل المتوسطة. إضافة 200 ميكرولتر من صبغة تحميل المتوسطة في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 30-40 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 .
- بعد 40 دقيقة من الحضانة، قم بإزالة الوسط. اغسل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت HTB. أضف 100 ميكرولتر من العازلة HTB للقراءة الفلورية. خذ الطبق للقراءة الفلورية.
ملاحظة: تحسين تركيز الصبغة في متوسط تحميل الصبغة. تسرب صبغ وphotobleaching هي المخاوف المحتملة المرتبطة الصبغة. إضافة CaCl2 جديدة في المخزن المؤقت HTB لتجنب هطول الأمطار.
4. تنشيط الخلية والقراءة الفلورية
ملاحظة: يسمح قارئ لوحة فلورسينس مع نظام ماسورة الآلي لنقل تلقائي للمركبات من مصدر مركب إلى لوحة المقايسة دون أخذ لوحة من قارئ لوحة.
- بينما يتم احتضان الخلايا، تعيين قارئ لوحة.
- تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- في الإعدادات، حدد فليكس.
- تعيين وضع القراءة إلى الفلورسينس و قراءة القاع.
- في الأطوال الموجية، حدد عدد الأطوال الموجية إلى 2. تعيين الإثارة إلى 340 نانومتر و 380 نانومتر. تعيين الانبعاثات إلى 510 نانومتر.
- اترك الحساسية إلى الافتراضي.
- في التوقيت، قم بتعيين الفاصل الزمني إلى 3.9 ثانية. تعيين وقت التشغيل إلى 94 s للحصول على 25 يقرأ.
- بعد ذلك، حدد نوع لوحة المقايسة.
- بعد ذلك، حدد ويلز للقراءة.
- في نقل المركب، تعيين التحويلات إلى 1 وحجم الأولية إلى 100 μL. تعيين ارتفاع ماصة إلى 100 ميكرولتر، وحجم إلى 50 ميكرولتر، ونقطة زمنية إلى 36 ثانية، لإضافة المركب في القراءة 10.
- بعد ذلك، حدد نوع لوحة المصدر المركب.
- ترك تريتورات إلى غير مستخدم.
- حدد التلميحات في تخطيط تلميحات ماصة.
- بالنسبة للأعمدة المركبة والأعمدة الرأسية،تأكد من أن المركبات المراد نقلها موجودة في العمود 1 من لوحة المركب. تعيين العمود تلميح إلى 1 والعمود المركب إلى 1.
- اترك المعايرة التلقائية على أنها ON.
- انقر فوق موافق.
- عندما تصل درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، قم بتحميل اللوحات في قارئ اللوحة.
- اضغط على غرفة القراءة لوضع لوحة المقايسة في قارئ لوحةمضان .
- اضغط على المصدر لوضع لوحة المركب. إعداد لوحة مركب بإضافة 200 ميكرولتر من الببتيدات ذات الصلة، أيونوميسين وإيثيلين غليكول بيس (β أمينوثيل الأثير)-N،N،N′،N′-حمض رباعي الأرجل (EGTA)-تريتون X-100 الحلول.
- اضغط على حامل البقشيش لوضع صندوق البقشيش. استخدام طرف أسود لتجنب الفلورة التلقائية تلميح.
- بمجرد تحميل لوحات، ومراجعة إعدادات البرنامج واضغط على قراءة.
5. تحليل البيانات
- تحديد تركيز الكالسيوم من نسبة الفلورسينس بواسطة معادلة غرينكيفيتش -
حيث، KD هو ثابت التفكك من Fura-2 AM، R هو نسبة الانبعاثات بعد الإثارة في 340 نانومتر و 380 نانومتر (F340/F380) للببتيدات المعنية، Rmax هو الحد الأقصى لنسبة الفلورسينس التي لوحظت بإضافة 50 ميكرولتر من 30 ميكرومتر أيونوميسين، Rmin هو الحد الأدنى للفلورسينس الذي لوحظ بإضافة 50 ميكرولتر من 100 mM EGTA/2.5٪ تريتون X-100، وF380دقيقة وF380ماكس هي كثافة مضان المطلقة من Fura-2 AM في حالة خالية من الكالسيوم وملزمة، على التوالي.
ملاحظة: الجهاز يوزع السائل مع بعض القوة. لا تقم بتعيين ارتفاع الاستغناء الببتيد قريبة جدا من الجزء السفلي من لوحة; قد يفصل الخلايا. استخدام نصائح ماصة سوداء لتجنب autofluorescence. اقرأ أقصى مضان والحد الأدنى من الفلورسين لكل لوحة لكل تجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يحتوي الجدول 1 على تسلسل الببتيد المتولد من خلال اقتطاع الأحماض الأمينية الطرفية ومسح ألانين. كما هو مبين في الجدول 1، تسلسل الببتيد RKKWNKWALSR يفتقر إلى N-محطة phenylalanine (F) فيما يتعلق الأم PAMP-12، وبالتالي هو الببتيد ممثل في مكتبة ن مبتورة. وبالمثل، في FRKKWNKWALS، تمت إزالة PAMP-12 C-terminal serine، وهو ما يمثل مكتبة الببتيد C-مبتورة المستمدة من PAMP-12. في مكتبة الببتيد N+C-المبتورة، تتم إزالة الأحماض الأمينية من كل من N و C-terminal. اقتطاع 4 حمض أميني من N-terminal و 1 بقايا من C-terminal من PAMP-12 النتائج في WNKWALS. مكتبة الببتيد المستمدة من المسح ألانين واحد الأحماض الأمينية استبدال ألانين, كما هو الحال مع ARKKWNKWALSR, حيث يتم استبدال N-محطة الفينيل ألانين. تم استخدام صبغة Fura-2 AM لدراسة إمكانات تنشيط الببتيدات ضد خلايا HEK المصابة MRGPRX21. تم تسجيل البيانات على قارئ لوحة مضان. إذا كان ليغاند الببتيد تنشيط الخلية، وفلورسينس ضخها في 340 نانومتر (F340) يزيد، في حين أن نفس الانخفاضات لطول الموجة 380 نانومتر (F380) (الشكل 1a). بالنسبة للفراغ (أو لهذه المسألة عدم تنشيط الببتيد أو التحكم HEK-WT) ومع ذلك ، فإن الزيادة والانخفاض النسبيين سيكونان منخفضين على التوالي ، كما هو موضح في الشكل 2a. ومع ذلك، يمثل تركيز الكالسيوم بنسبة F340/F380 كما هو موضح في الشكل 1b, 2b. ويمكن الاستعاضة عن نسبة F340/F380 في معادلة Grynkiewicz للحصول على تركيز الكالسيوم باستخدام معايرة الموقع(الشكل 3). وتتميز الببتيدات المدرجة في الجدول 1 بالمنظار الكتلي(الشكل 4 أ)وHPLC(الشكل 4ب)وتبين أنها ذات نقاء عال.
| تقنية الببتيد | ممثل الببتيد |
| الببتيد الأم | Ac-FRKKWNKWALSR-أميد |
| ن-اقتطاع | Ac-RKKWNKWALSR-أميد |
| C-اقتطاع | أك-فركونكوالس-أميد |
| N + C-اقتطاع | أك-ونكولس-أميدي |
| ألانين المسح الضوئي | أك-أركونكوالسر-أميد |
الجدول 1: تسلسل الببتيد التمثيلي المتولد بعد N و C و N +C - الاقتطاع، ومسح ألانين. تم تعديل N-محطة الببتيدات أسيتيل في حين أن C-المحطة تحتوي على مجموعة أميد.
الشكل 1: بيانات تمثيلية عن الببتيد المنشط. (أ) إشارات الفلورسينس لتنشيط الببتيد. البيانات الممثلة تتوافق مع PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). تمت إضافة الببتيد بعد إنشاء خط أساس ل 10 دورات قراءة (36 s) ، كما هو موضح في السهم. (ب)نسبة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومتر (F340) إلى انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 380 نانومتر (F380) (F340/F380). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بيانات تمثيلية للفراغ. (أ)إشارات الفلورسينس للفراغ. تمت إضافة HTB بعد إنشاء خط أساس ل 10 دورات قراءة (36 s) ، كما هو موضح في السهم. (ب)نسبة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومتر (F340) إلى انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 380 نانومتر (F380) (F340/F380). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:بيانات تمثيلية لمعايير معايرة الصبغة. (أ)تمت إضافة أيونوميسين في10 قراءات، كما هو مبين من قبل السهم، للحصول على أقصى قدر من الفلورسينس في ولاية كاليفورنيا+2 ملزمة. تمت إضافة EGTA-Triton X-100 بعد 20 قراءة ، كما هو موضح في السهم ، للحصول على الحد الأدنى من الإشارة. (ب)نسبة انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 340 نانومتر (F340) إلى انبعاث الفلورسينس بعد الإثارة عند 380 نانومتر (F380) (F340/F380). يتم وضع هذه القيم كذلك في معادلة Grynkiewicz للحصول على تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيف الببتيد التمثيلي لتأكيد التسلسل والنقاء. (أ)الكتلة النظرية لتسلسل الببتيد التمثيلي WNKWAL كان 857.90 دا، والذي تبين من نسبة m/z في التحليل الطيفي الشامل. (ب) نقاء الببتيد من 99٪ كما أكد HPLC. ينتمي هذا الببتيد إلى مكتبة الببتيد N +C المبتورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إشارات الكالسيوم أمر مركزي ل degranulation الخلايا الصاري، وقد استخدمت على نطاق واسع في دراسة التفاعلات مستقبلات ليغاند, تحديد ligand, واكتشاف المخدرات14. MRGPRX2 هو مستقبلات الخلايا الصاري المكتشفة مؤخرا التي تم العثور عليها للعب دور رئيسي في العديد من الأمراض الالتهابية مثل الحكة والربو والتهاب الجلد التأتبي، من بين أمور أخرى2. وعلاوة على ذلك، وقد ثبت العديد من الأدوية المعتمدة للحصول على استجابة التهابية من خلال مستقبلات MRGPRX215. ولذلك، فمن الضروري لدراسة التفاعل بين مستقبلات ليغاند، وتحديد ligands جديدة، وفهم آلية التنشيط. وتبين هذه الدراسة استخدام تقنيات الببتيد الشائعة في تصميم مكتبة الببتيد(الجدول 1)وفي دراسة MRGPRX2 القائم على تنشيط الخلايا الصاري. تم استخدام تعبئة الكالسيوم الأساسية كمؤشر لتنشيط الخلايا السارية.
Fura-2 هو صبغة حساسة للكالسيوم تستخدم لقياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. البديل أستوكسي ميثيل إستر (Fura-2 AM) يزيد من نفاذية غشاء الخلية مما أسفر عن طريقة سهلة لقياس إطلاقات الكالسيوم السيتوبلازمية. وقد استخدمت الصبغة في كثير من الأحيان مع تقنيات توصيف مختلفة مثل تدفق السيتومتر، المجهر، والفلوريمترات9،16،17. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع ، هناك تحديات مرتبطة بالصبغة ، والتي تحتاج إلى معالجة قبل استخدامها بكفاءة. يعتمد ربط الكالسيوم داخل الخلية على إزالة استيريشن الصبغة ، والتي تعتمد إلى حد كبير على ظروف تحميل الصبغة ونظام الخلايا وأنواع ثقافة الخلية. يؤدي إزالة الترهيد الجزئي إلى إشارات مضان غير كافية. وعلاوة على ذلك، فإن إزالة الاجتثاث غير الكاملة تؤدي أيضا إلى توطين الصبغة في العضيات الخلوية مما يؤدي إلى بيانات غير دقيقة. تسرب صبغة دي استرified من الخلية هي قضية أخرى تواجه Fura-210،11.
وبصرف النظر عن تحميل الصبغة ، فإن استخدام تقنية الكشف يلعب أيضا دورا مهما. عدم قدرة تدفق السيتومترات للعمل مع أشعة الليزر للأشعة فوق البنفسجية يجعلها غير مواتيةللصبغة 9. وبالمثل، تتطلب تقنيات التصوير الفلورية تدريبا متقدما في عملية المجهر. تتطلب الطبيعة العابرة لإطلاق الكالسيوم عند تنشيط الليغند استجابة سريعة في التغير في الأطوال الموجية وبالتالي سرعة مصراع أسرع للمجهر. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام غرف التصوير الخلايا المتخصصة، واستخدام coverlips والتركيز المستمر على الصورة يجعلها تقنية مرهقة لفحص واسع النطاق16.
تم استثمار مقدار كبير من الوقت في تحسين الأسلوب. تم احتضان مقياس الفلورومتر القائم على Cuvette ، حيث تم احتضان الخلايا بعد انفصالها عن قارورة الثقافة ، مع وسيط محمل بالصبغة في الظلام ثم تم غسلها وإعادة إنفاقها في المخزن المؤقت HTB للدراسة. تم التقاط الخلايا المعلقة في المخزن المؤقت HTB في cuvette وتم قراءتها باستخدام مقياس الفلور القائم على photomultiplier. ولا يمكن لنظم الكشف إلا أن تحمل عددا قليلا من الكفيتات (2-4) في كل مرة، وبالتالي فهي غير مناسبة للفحص الواسع النطاق للببتيدات. علاوة على ذلك ، خلايا HEK كونها خلايا معتنقة ، أظهرت قراءة تعليق الخلية اختلافات كبيرة داخل التكرار الفردي داخل التجربة. ونتيجة لذلك، تم استخدام تقنية التصوير الفلوري، والتي أثبتت مرة أخرى أنها مملة وبطيئة. وقد أعاق الدراسة شرط وجود مجهر متقدم مع قدرة سريعة على تغيير الطول الموجي، وغرف خلايا خاصة بالمجهر، ومهارات تصوير ممتازة. وبالإضافة إلى ذلك، كانت محاكاة الببتيد في الموقع واسعة النطاق في الوقت المناسب وأسفرت عن فقدان بيانات هامة. أدى عدم كفاءة تقنية معالجة الخلايا إلى تعويم الخلايا أثناء القراءات مما جعل من الصعب التركيز وأعطى نتائج غير متسقة.
تم استخدام نظام قارئ لوحة مضان مع نظام الأنابيب الآلي الذي يمكن الاستغناء عن المركبات أثناء التجارب للدراسة. حقيقة أن العديد من العينات تقرأ في تعاقب سريع في لوحة بئر 96 هو فائدة إضافية لهذه التقنية. وأظهرت النتائج أن القراءات كانت أكثر اتساقا عندما تعلق الخلايا بالمقارنة مع التعليق. عدد الخلايا من 40،000 الخلايا / جيدا في لوحة TC تعامل 96 جيدا نمت ليوم واحد أعطى أفضل النتائج. وكان الوقت حضانة صبغ من 30-40 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية الأمثل. ومع ذلك، عندما أجريت التجارب مع تكرارات تجريبية، لوحظت اختلافات في الآبار المقابلة لأعمدة مختلفة. للتغلب على ذلك، تم استخدام موجب (PAMP-12) وعنصر تحكم سالب (فارغ) لكل عمود من اللوحة. وقدم ذلك بيانات أكثر اتساقا وقابلية للاستنساخ. الطريقة الموصوفة هنا هي طريقة سهلة ومتعددة الاستخدامات ، والتي يمكن استخدامها بكفاءة للفحص على نطاق واسع على أساس الكالسيوم. ومع ذلك ، هناك العديد من العوامل التي تحدد نوعية البيانات ، وبالتالي فإن الطريقة تحتاج إلى تحسين لنظام معين من أجهزة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن المؤلفون عن وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
ريال وLDU ترغب في الاعتراف ألبرتا يبتكر مشروع البحوث الاستراتيجية، NRC، وNSERC-ديسكفري منحة لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
