Summary
Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.
Abstract
Het identificeren van liganden die specifiek zijn voor therapeutisch significante celreceptoren is cruciaal voor veel toepassingen, waaronder het ontwerp en de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2) is een belangrijke receptor die mestcelactivatie reguleert en dus de algemene immuunrespons stuurt. Talrijke liganden voor MRGPRX2 zijn geïdentificeerd en omvatten endogene peptiden zoals PAMPs, defensinen, LL-37 en andere eiwitfragmenten (d.w.z. afgebroken albumine). Verdere identificatie van MRGPRX2-specifieke liganden vereist de screening van een groot aantal peptiden (d.w.z. peptidebibliotheek); mestcellen zijn echter moeilijk en duur om in vitro te onderhouden en daarom niet economisch in gebruik voor het screenen van grote aantallen moleculen. Het huidige artikel demonstreert een methode om een bibliotheek van kleine peptidemoleculen te ontwerpen, ontwikkelen en screenen met behulp van MRGPRX2 die HEK-cellen tot expressie brengen. Deze cellijn is relatief eenvoudig en goedkoop te onderhouden en kan worden gebruikt voor in vitro high-throughput analyse. Een calciumgevoelige Fura-2 fluorescerende kleurstof om intracellulaire calciumflux bij activering te markeren, werd gebruikt om de activering te controleren. De verhouding van fluorescentie-intensiteit van Fura-2 bij 510 nm tegen excitatiegolflengten van 340 en 380 nm werd gebruikt om de calciumconcentratie te berekenen. De peptidebibliotheek die werd gebruikt om dit systeem te verifiëren, was gebaseerd op de endogene proadrenomedulline N-terminal 12 (PAMP-12) secretagoge, waarvan bekend is dat het MRGPRX2 bindt met hoge specificiteit en affiniteit. Latere peptiden werden gegenereerd door aminozuur-truncation en alanine scanning technieken toegepast op PAMP-12. De hier beschreven methode is eenvoudig en goedkoop maar robuust voor het screenen van een grote bibliotheek van verbindingen om bindingsdomeinen en andere belangrijke parameters te identificeren die een belangrijke rol spelen bij receptoractivering.
Introduction
Mestcellen zijn een integraal onderdeel van het immuunsysteem en spelen een cruciale rol in zowel aangeboren als adaptieve immuunresponsen. Mestcellen worden voornamelijk geactiveerd door de binding van een antigeen aan het immunoglobuline E (IgE) - FcεRI-receptorcomplex, of door het onlangs ontdekte mas-gerelateerde G-eiwitreceptor-X2 (MRGPRX2)1. MRGPRX2-activering is in verband gebracht met verschillende immuun- en ontstekingsziekten en daarom is het belangrijk om het bindingsmechanisme van de receptor aan zijn liganden te begrijpen2. Om dit te doen, werd een bibliotheek van kleine peptidemoleculen ontwikkeld en gescreend tegen MRGPRX2-receptoren die overexpressie hadden in HEK-cellen. In de studie werd de peptidebibliotheek geconstrueerd met behulp van de eenvoudige en veelzijdige technieken van alaninescanning en aminozuur-truncation. Alanine scanning omvat het vervangen van specifieke aminozuren door een alanineresidu. Alanine is klein en neutraal, ontdoet het peptide van de specifieke eigenschappen die worden verleend door het vervangen residu en benadrukt achtereenvolgens de betekenis van de respectieve fysiochemische eigenschappen van het aminozuur in receptorinteracties. Integendeel, bij aminozuurafkapping zijn peptidesequenties zo ontworpen dat het een of meer aminozuurresiduen van de N-terminal, C-terminal of beide mist. Deze set peptiden werd gebruikt om de aminozuursequenties te identificeren die cruciaal zijn voor MRGPRX2-binding.
Ervaring met menselijke mestcellijnen (LAD-2) heeft aangetoond dat deze cellen moeilijk in vitrote kweken en te onderhouden zijn: een verdubbelingstijd van twee weken, dure medium supplementen en directe aandacht vereist tijdens passaging3. Deze eigenschappen maken de cellen ongeschikt voor grootschalige screening van potentiële liganden. Hierin werden stabiel getransfecteerde HEK-cellen die MRGPRX2-receptor (HEK-X2) tot expressie brengen, gebruikt om de peptidebibliotheek1te screenen. HEK-293-cellen worden veel gebruikt en bestudeerd voor de heterologe expressie van oppervlaktereceptoren vanwege hun hoge transfectie-efficiëntie, snellere verdubbelingssnelheid en de noodzaak om niet-dure mediumsupplementen in laboratorium te kweken4. Het protocol om HEK-293 cellijn te transfecteren is aangetoond en is goed ingeburgerd5. HEK-293-cellen die stabiel MRGPRX2-receptor tot expressie brengen (passage 13-19) werden geactiveerd met de peptiden gegenereerd door N-truncation, C-truncation, N + C-truncation en alanine scanning1. Wild type HEK cellen (HEK-WT) (passage 16-21) werden gebruikt als controle. Intracellulaire calciumafgifte bij activering werd gecontroleerd om de op MRGPRX2 gebaseerde activering te bestuderen.
Celactivering door MRGPRX2 wordt gevolgd door een cytosolische calciummobilisatie. Deze gereguleerde intracellulaire calciumafgifte in mestcellen wordt gereguleerd door de store operated calcium entry (SOCE), gecoördineerd door het stromale interactiemolecuul 1 (STIM1); en staat centraal in de immuunresponscascade6,7. Er zijn verschillende methoden gebruikt om de intracellulaire calciumconcentratie te detecteren, waaronder patchklemmen en fluorescerende kleurstoffen8. Van alle beschikbare technieken worden fluorometrische calciumkleurstoffen in conjugatie met verschillende detectietechnieken op grote schaal gebruikt9. Twee soorten fluorometrische kleurstoffen die interesse hebben gekregen, zijn namelijk kleurstoffen met één golflengte zoals Fluo-4 en dubbele golflengte ratiometrische kleurstoffen zoals Indo -1 en Fura-2. Het voordeel dat dual golflengte ratiometrische kleurstoffen brengen ten opzichte van kleurstoffen met één golflengte is dat de ratiometrische kleurstoffen corrigeren voor experimentele fouten zoals kleurstofbelasting, fotobleken en scherpstellen10,11.
Fura-2 acetoxymethylester (Fura-2 AM) is een celdoordringing, groen-fluorescerende kleurstof waarvan de excitatie verschuift naar een lagere golflengte bij calciumbinding. Experimenteel wordt Fura-2 geëxtst bij 340 en 380 nm, terwijl de emissie wordt geregistreerd bij 510 nm. Bij calciumbinding neemt de fluorescerende intensiteit bij 340 nm toe, terwijl die van 380 nm afneemt, zoals weergegeven in figuur 1. Gegevens worden weergegeven als een verhouding van fluorescentie-intensiteit na excitatie bij 340 nm (F340) tot die van intensiteit na excitatie bij 380 nm (F380), d.w.z. F340 / F380. De F340/F380-verhouding is evenredig met intracellulair calcium, waarvan de waarde kan worden berekend met de Grynkiewicz-vergelijking12. Omdat het fluorescentiesignaal wordt verkregen uit de excitatie van de kleurstof op twee golflengten (340 nm en 380 nm), corrigeert de verhouding van de fluorescentiesignalen voor experimentele factoren zoals kleurstofbelasting, kleurstoflekkage, fotobleaching en celdichtheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontwerp en ontwikkeling van peptidebibliotheek
- Om de liganden van de mestcel MRGPRX2-receptor te identificeren op basis van een bekend ligand, d.w.z.PAMP-12 13,volgt u de onderstaande stappen.
- Genereer N-afgekapte peptidebibliotheek door de N-terminale aminozuurresiduen van het ligand achtereenvolgens af te kapen door middel van vastefasepeptidesynthese (SPPS).
- Genereer C-afgekapte peptidebibliotheek door de C-terminale aminozuurresiduen van het bekende ligand achtereenvolgens af te splitsen door SPPS.
- Op basis van de resultaten van 1.1.1 en 1.1.2, genereer een N+C-afgekapte peptidebibliotheek met behulp van SPPS door de gewenste residuen van respectievelijk de N- en C-terminal af te kapen.
- Gebruik vaste-fase peptidesynthese om de peptiden te synthetiseren13.
- Wijzig de N-terminale naar acetyl (Ac) groep en C-terminal naar amide groep.
- Karakteriseer het peptide voor zijn zuiverheid met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en voor de massa met behulp van een massaspectrofotometer.
- Om de betekenis van specifieke aminozuren binnen het ouder PAMP-12 molecuul te bestuderen, volgt u de onderstaande stappen.
- Genereer een alanine scanning peptide bibliotheek door de respectieve aminozuurresiduen in het peptide molecuul te vervangen door alanine, één voor één met behulp van SPPS. Wijzig de N-terminale naar acetyl (Ac) groep en C-terminal naar amide groep.
- Karakteriseer het peptide voor zijn zuiverheid met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en voor de massa met behulp van een massaspectrofotometer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de gesynthetiseerde peptiden van hoge zuiverheid zijn. Karakteriseer de peptiden met behulp van massaspectroscopie en HPLC.
2. In vitro celkweek
- Kweek HEK-X2- en HEK-WT-cellen door de onderstaande stappen te volgen.
- Bereid kweekmedium voor door dmem met hoge glucose aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 E / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine.
- Doorloop de cellen in met weefselkweek (TC) behandelde T-75 kweekkolven en groei in een incubator bij 37 °C met 5% CO2,totdat ze 75-80% confluent zijn.
- Zodra 75% confluent, was de cellen en voeg 2-3 ml trypsine toe gedurende 2 - 3 minuten. Incubeer in een 37 °C, 5% CO2 incubator om de cellen los te maken.
- Zodra de cellen zich hebben losgemaakt, verzamel je de cellen in trypsine. Voeg 6-9 ml vers medium toe.
- Centrifugeer de cellen bij 1620 x g gedurende 3-5 min.
- Gooi na het centrifugeren het supernatant weg om de pellet op te vangen. Resuspend de cellen in een vers kweekmedium. Verdun de cellen volgens de gewenste concentratie.
OPMERKING: HEK-cellen zijn snelgroeiende cellen en optimaliseren daarom de celmediumsupplementen. HEK-cellen zijn aanhankelijke cellen; plaats ze in tc-behandelde kweekkolven om de hechting te ondersteunen.
- Bereid een 96 well assay plaat voor het experiment.
- Voeg 200 μL van de celsuspensie toe in elke put, met een concentratie van 200.000 cellen / ml, om 40.000 cellen / put te zaaien.
- Kweek de cellen gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Optimaliseer de celdichtheid per put op basis van de plaatgrootte en het celstamtype. Voer het experiment uit in drievoud in een zwarte TC-behandelde 96-putplaat met vlakke transparante bodem.
3. Fura-2 AM calcium assay
- Bereid kleurstof voor door de onderstaande stappen te volgen.
- Gebruik Fura-2 AM-kleurstof voor het experiment.
- Bereid de bufferbuffer (HTB) van HEPES-Tyrode met 25 mM HEPES-buffer, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml glucose, 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA) en vers toegevoegde 1,8 mM CaCl2 in autoclaaf gesteriliseerd water.
- Voeg 50 μL DMSO toe in een injectieflacon van 50 μg Fura-2 AM om 1 mM stamoplossing van Fura-2 AM-kleurstof te bereiden. Voeg 1 μL van 1 mM Fura-2 AM-kleurstof per ml vers medium toe om het kleurstofbelastingsmedium met een kleurstofconcentratie van 1 μM te bereiden.
- Haal de 96 well plaat uit de couveuse en gooi het medium weg. Vervang het medium door een nieuw kleurstofbeladingsmedium. Voeg in elke put 200 μL kleurstofbeladingsmedium toe. Incubeer de cellen gedurende 30-40 minuten in een incubator van 37 °C, 5% CO2.
- Verwijder na 40 minuten incubatie het medium. Was de cellen met de HTB-buffer. Voeg 100 μL HTB-buffer toe voor fluorescentiemeting. Neem de plaat voor fluorescentiemeting.
OPMERKING: Optimaliseer de concentratie van kleurstof in het kleurstofbelastingsmedium. Kleurstoflekkage en fotobleaching zijn mogelijke zorgen in verband met de kleurstof. Voeg CaCl2 vers toe aan de HTB-buffer om neerslag te voorkomen.
4. Celactivering en fluorescerende aflezing
OPMERKING: Fluorescentieplaatlezer met een geautomatiseerd pipettersysteem maakt de automatische overdracht van verbindingen van een samengestelde bron naar de testplaat mogelijk zonder de plaat uit de plaatlezer te halen.
- Terwijl de cellen worden geïncubeerd, stelt u de plaatlezer in.
- Stel de temperatuur in op 37 °C.
- Selecteer in Instellingende optie Flex.
- Stel de leesmodus in op Fluorescentie en Onder lezen.
- Stel bij Golflengten het aantal golflengten in op 2. Stel de excitatie in op 340 nm en 380 nm. Stel de emissie in op 510 nm.
- Laat de gevoeligheid op Standaard staan.
- Stel in Timinghet interval in op 3,9 s. Stel de looptijd in op 94 s om 25 keer te lezen.
- Selecteer vervolgens het type testplaat.
- Selecteer vervolgens de te lezen putten.
- Stel in Compound Transfer Transfers in op 1 en Initial Volume op 100 μL. Stel de pipethoogte in op 100 μL, Volume op 50 μL en Time Point op 36 s om de verbinding toe te voegen bij de 10e meting.
- Selecteer vervolgens het type compoundbronplaat.
- Laat Triturate staan op Niet gebruikt.
- Selecteer de tips in de pipettipslay-out.
- Zorg er voor samengestelde en tipkolommenvoor dat de over te brengen verbindingen zich in kolom 1 van de samengestelde plaat bevinden. Stel de tipkolom in op 1 en samengestelde kolom op 1.
- Laat de Autocalibrate aan .
- Klik op OK.
- Wanneer de temperatuur 37 °C heeft bereikt, laadt u de platen in de plaatlezer.
- Druk op de leeskamer om de testplaat in de fluorescentieplaatlezerte plaatsen.
- Druk op de bron om de samengestelde plaatte plaatsen. Bereid de samengestelde plaat door 200 μL van respectievelijke peptiden, ionomycine en ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N′, N′-tetra-azijnzuur (EGTA) - Triton X-100-oplossingen toe te voegen.
- Druk op het tiprek om de tipbox teplaatsen. Gebruik een zwarte punt om autofluorescentie van de tip te voorkomen.
- Zodra de platen zijn geladen, controleert u de instellingen van de software en drukt u op Lezen.
5. Data-analyse
- Bepaal de calciumconcentratie uit de fluorescentieverhouding met de Grynkiewicz-vergelijking -
waarbij Kd de dissociatieconstante is van Fura-2 AM, R de emissieverhouding is na excitatie bij 340 nm en 380 nm (F340/F380) voor respectievelijke peptiden, Rmax de maximale fluorescentieverhouding is die wordt waargenomen door de toevoeging van 50 μL van 30 μM ionomycine, Rmin de minimale fluorescentie is die wordt waargenomen door de toevoeging van 50 μL van 100 mM EGTA/2,5%Triton X-100; en F380min en F380max zijn de absolute fluorescentie-intensiteit van Fura-2 AM in respectievelijk calciumvrije en gebonden toestand.
OPMERKING: De machine geeft de vloeistof met enige kracht af. Stel de peptidedoseerhoogte niet te dicht bij de bodem van de plaat in; het kan de cellen losmaken. Gebruik zwarte pipetpunten om autofluorescentie te voorkomen. Lees de maximale fluorescentie en de minimale fluorescentie voor elke plaat voor elk experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 bevat de peptidesequenties die worden gegenereerd door terminale aminozuur-truncation en alanine scanning. Zoals weergegeven in tabel 1,mist peptidesequentie RKKWNKWALSR N-terminale fenylalanine (F) ten opzichte van zijn moeder PAMP-12 en is daarom een representatief peptide in de N-afgekapte bibliotheek. Evenzo is in FRKKWNKWALS PAMP-12 C-terminal serine verwijderd, wat een C-afgekapte peptidebibliotheek vertegenwoordigt die is afgeleid van PAMP-12. In de N+C-afgeknotte peptidebibliotheek worden aminozuren uit zowel N- als C-terminal verwijderd. Afkapping van 4 aminozuren uit N-terminal en 1 residu uit C-terminal van PAMP-12 resulteert in WNKWALS. Peptidebibliotheek afgeleid van alaninescanning heeft één aminozuur vervangen door alanine, zoals bij ARKKWNKWALSR, waar N-terminale fenylalanine wordt vervangen door alanine. Fura-2 AM-kleurstof werd gebruikt om het activeringspotentieel van peptiden tegen MRGPRX2 getransfecteerde HEK-cellente bestuderen 1. De gegevens werden vastgelegd op een fluorescentieplaatlezer. Als het peptideligand de cel activeert, neemt de fluorescentie gepompt bij 340 nm (F340) toe, terwijl hetzelfde afneemt voor 380 nm golflengte (F380) (Figuur 1a). Voor een blanco (of wat dat betreft niet-activerende peptide- of HEK-WT-controle) zou de relatieve toename en afname echter respectievelijk laag zijn, zoals weergegeven in figuur 2a. De calciumconcentratie wordt echter weergegeven door de F340/F380-verhouding zoals weergegeven in figuur 1b,2b. De verhouding F340/F380 kan verder worden vervangen in de Grynkiewicz-vergelijking om de calciumconcentratie te krijgen met behulp van in situ kalibraties (figuur 3). De in tabel 1 vermelde peptiden werden gekenmerkt door massaspectroscopie (figuur 4a) en HPLC (figuur 4b) en bleken van hoge zuiverheid te zijn.
| Peptide Techniek | Representatieve Peptide |
| Ouderpeptide | Ac-FRKKWNKWALSR-Amide |
| N-Afkapping | AC-RKKWNKWALSR-Amide |
| C-Afkapping | Ac-FRKKWNKWALS-Amide |
| N+C-Afkapping | Ac-WNKWALS-Amide |
| Alanine scannen | Ac-ARKKWNKWALSR-Amide |
Tabel 1: Representatieve peptidesequenties gegenereerd na N, C en N+C - afkapping en alaninescanning. De N-terminal van de peptiden was acetyl gemodificeerd, terwijl de C-Terminal een amidegroep bevatte.
Figuur 1: Representatieve gegevens voor een activerend peptide. (a) De fluorescentiesignalen voor een activerend peptide. De weergegeven gegevens komen overeen met PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Peptide werd toegevoegd na het genereren van een basislijn voor 10 leescycli (36 s), zoals aangegeven door de pijl. b) De verhouding tussen de fluorescentie-emissie na excitatie bij 340 nm (F340) en die van fluorescentie-emissie na excitatie bij 380 nm (F380) (F340/F380). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve gegevens voor de blanco. (a) De fluorescentiesignalen voor de Blanco. HTB werd toegevoegd na het genereren van een basislijn voor 10 leescycli (36 s), zoals aangegeven door de pijl. b) De verhouding tussen de fluorescentie-emissie na excitatie bij 340 nm (F340) en die van fluorescentie-emissie na excitatie bij 380 nm (F380) (F340/F380). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve gegevens voor de normen voor kleurstofkalibratie. (a) Ionomycine werd toegevoegd bij 10e metingen, zoals aangegeven door de pijl, om maximale fluorescentie in Ca+2 gebonden toestand te krijgen. EGTA-Triton X-100 werd toegevoegd na 20 metingen, zoals aangegeven door de pijl, om een minimaal signaal te krijgen. b) De verhouding tussen de fluorescentie-emissie na excitatie bij 340 nm (F340) en die van fluorescentie-emissie na excitatie bij 380 nm (F380) (F340/F380). Deze waarden worden verder in de Grynkiewicz-vergelijking geplaatst om de intracellulaire calciumconcentratie te krijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van een representatief peptide om de sequentie en zuiverheid te bevestigen. (a) De theoretische massa van de representatieve peptidesequentie WNKWAL was 857,90 Da, wat werd aangetoond door de m/z-verhouding in massaspectroscopie. (b) Peptide's zuiverheid van 99% zoals bevestigd door HPLC. Dit peptide behoort tot de N+C-afgeknotte peptidebibliotheek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calciumsignalering staat centraal bij mestceldegranulatie en is veel gebruikt in de studie van receptor-ligandinteracties, ligandidentificatie en medicijnontdekking14. MRGPRX2 is een recent ontdekte mestcelreceptor waarvan is gebleken dat deze een sleutelrol speelt bij veel ontstekingsziekten zoals jeuk, astma en atopische dermatitis, onder andere2. Bovendien is aangetoond dat verschillende goedgekeurde geneesmiddelen een ontstekingsreactie opwekken via de MRGPRX2-receptor15. Het is daarom noodzakelijk om de ligand-receptorinteractie te bestuderen, nieuwe liganden te identificeren en het activeringsmechanisme te begrijpen. Deze studie toont het gebruik van gemeenschappelijke peptidetechnieken bij het ontwerpen van een peptidebibliotheek (tabel 1) en bij het bestuderen van de op MRGPRX2 gebaseerde mestcelactivatie. De onderliggende calciummobilisatie werd gebruikt als indicator voor mestcelactivatie.
Fura-2 is een calciumgevoelige kleurstof die wordt gebruikt om de intracellulaire calciumconcentratie te meten. De acetoxymethylestervariant (Fura-2 AM) verhoogt de permeabiliteit van het celmembraan, wat een eenvoudige methode oplevert voor het kwantificeren van de cytoplasmatische calciumafgifte. De kleurstof is vaak gebruikt met verschillende karakteriseringstechnieken zoals flowcytometer, microscopie en fluorimeters9,16,17. Hoewel ze veel worden gebruikt, zijn er uitdagingen verbonden aan de kleurstof, die moeten worden aangepakt voordat deze efficiënt kunnen worden gebruikt. Intracellulaire calciumbinding is afhankelijk van de de-verestering van de kleurstof, die grotendeels afhankelijk is van de kleurstofbelastingsomstandigheden, het celsysteem en de celkweektypen. Gedeeltelijke de-esterificatie resulteert in onvoldoende fluorescentiesignalen. Bovendien resulteert onvolledige de-esterificatie ook in de lokalisatie van kleurstof in de celorganellen, wat resulteert in onnauwkeurige gegevens. Lekkage van gede-veresterde kleurstof uit de cel is een ander probleem waarmee Fura-210,11wordtgeconfronteerd.
Naast de kleurstofbelasting speelt ook het gebruik van de detectietechniek een belangrijke rol. Het onvermogen van flowcytometers om met UV-lasers te werken, maakt ze ongunstig voor de kleurstof9. Evenzo vereisen fluorescerende beeldvormingstechnieken geavanceerde training in microscoopbediening. De voorbijgaande aard van calciumafgifte bij ligandactivering vereist een snelle reactie in de verandering in golflengten en dus een snellere sluitertijd van de microscoop. Bovendien maakt het gebruik van gespecialiseerde celbeeldvormingskamers, het gebruik van coverslips en constante beeldfocus het een omslachtige techniek voor grootschalige screening16.
Er is veel tijd gestoken in de methode optimalisatie. Op cuvette gebaseerde fluorometer, waarbij cellen na het losmaken van de kweekkolf in het donker werden geïncubeerd met het met kleurstof beladen medium en vervolgens werden gewassen en geresuspendeerd in de HTB-buffer voor het onderzoek. Cellen die in HTB-buffer waren opgehangen, werden in een cuvette genomen en afgelezen met behulp van een op fotomultiplicator gebaseerde fluorometer. De detectiesystemen konden slechts weinig (2-4) cuvetten tegelijk bevatten en waren dus niet geschikt voor de grootschalige screening van peptiden. Verder, HEK-cellen zijn aanhankelijke cellen, de celsuspensiemeting vertoonde grote variaties binnen individuele herhalingen binnen een experiment. Daarom werd een fluorescerende beeldvormingstechniek gebruikt, die opnieuw vervelend en traag bleek te zijn. De behoefte aan een geavanceerde microscoop met snel golflengte veranderend vermogen, microscoopspecifieke celkamers en uitstekende beeldvormingsvaardigheden belemmerde de studie. Bovendien was in situ peptidesimulatie tijdsgepoog en resulteerde in het verlies van belangrijke gegevens. Inefficiënte celverwerkingstechniek resulteerde in celflotaties tijdens metingen, waardoor het moeilijk was om scherp te stellen en inconsistente resultaten op te leveren.
Voor het onderzoek werd een fluorescentieplaatlezersysteem gebruikt met een geautomatiseerd pipetteersysteem dat verbindingen tijdens experimenten kan afgeven. Het feit dat veel monsters snel achter elkaar worden gelezen in een 96 putplaat is een extra voordeel van deze techniek. De resultaten toonden aan dat de metingen consistenter waren wanneer cellen werden bevestigd in vergelijking met suspensie. Celtellingen van 40.000 cellen /put in een TC-behandelde 96 putplaat die gedurende een dag werd gekweekt, gaven de beste resultaten. Een kleurstofincubatietijd van 30-40 min bij 37 °C incubator was optimaal. Wanneer echter experimenten werden uitgevoerd met experimentele herhalingen, werden variaties in de overeenkomstige putten van verschillende kolommen waargenomen. Om dit te ondervangen, werd een positieve (PAMP-12) en een negatieve controle (Blank) voor elke kolom van de plaat gebruikt. Dit leverde meer consistente en reproduceerbare gegevens op. De hier beschreven methode is een eenvoudige en veelzijdige methode, die efficiënt kan worden gebruikt voor grootschalige screening op basis van calcium. Er zijn echter verschillende factoren die de kwaliteit van de gegevens bepalen en daarom moet de methode worden geoptimaliseerd voor een bepaald celinstrumentsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
SR en LDU willen alberta innovates strategic research project, NRC en NSERC-Discovery subsidie voor dit project bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal - acetyl group C terminal - amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
