Summary
Det kroniska psykosociala stressparadigmet (CGS) använder kliniskt relevanta stressfaktorer under graviditeten hos möss för att modellera psykiatriska störningar hos mödrar och spädbarn. Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-förfarande för att tillämpa CGS-paradigmet och nedströmsbedömningar för att validera denna modell.
Abstract
Peripartumperioden anses vara en känslig period där negativa mödraexponeringar kan leda till långsiktiga negativa konsekvenser för både mor och avkomma, inklusive utveckling av neuropsykiatriska störningar. Riskfaktorer kopplade till uppkomsten av affektiv dysregulation i moderns-spädbarn dyad har studerats utförligt. Exponering för psykosocial stress under graviditeten har konsekvent framkommit som en av de starkaste prediktorerna. Flera gnagare modeller har skapats för att utforska denna associering; Dessa modeller förlitar sig dock på användning av fysiska stressfaktorer eller ett begränsat antal psykosociala stressfaktorer som presenteras på ett repetitivt sätt, som inte exakt fångar den typ, intensitet och frekvens av stressfaktorer som upplevs av kvinnor. För att övervinna dessa begränsningar genererades ett kroniskt psykosocialt stressparadigm (CGS) som använder olika psykosociala förolämpningar av olika intensitet som presenteras på ett oförutsägbart sätt. Manuskriptet beskriver detta nya CGS-paradigm där gravida kvinnliga möss, från graviditetsdag 6,5 till 17,5, utsätts för olika stressfaktorer under dagen och över natten. Dagstressorer, två per dag åtskilda av en 2 h paus, sträcker sig från exponering för främmande föremål eller rovdjurslukt till frekventa förändringar i sängkläder, avlägsnande av sängkläder och burlutning. Över natten stressorer inkluderar kontinuerlig ljusexponering, byte av burkamrater eller våtsängkläder. Vi har tidigare visat att exponering för CGS resulterar i utveckling av moderns neuroendokrina och beteendemässiga avvikelser, inklusive ökad stress reaktivitet, uppkomsten av fragmenterade moderns vård mönster, anhedonia och ångest-relaterade beteenden, kärnfunktioner hos kvinnor som lider av perinatal humör och ångest störningar. Denna CGS-modell blir därför ett unikt verktyg som kan användas för att belysa molekylära defekter som ligger till grund för moderns affektiva dysregulering, liksom trans-placenta mekanismer som påverkar fetala neuroutveckling och resulterar i negativa långsiktiga beteendemässiga konsekvenser i avkomman.
Introduction
Mekanismerna bakom ökad mottaglighet för neuropsykiatriska störningar hos mödrar och spädbarn efter negativa moderns exponeringar under peripartum perioden är fortfarande i stort sett okända. Betydande moderns fysiologiska förändringar sker under graviditeten och övergången till postpartumperioden, inklusive flera neuroendokrina anpassningar som är hypotetiska för att vara kritiska inte bara för friska avkommor neuroutveckling utan också för att bevara moderns psykiska hälsa1,2. På nivån för moderns hypotalamus hypofysen binjureaxel (HPA) observeras adaptioner i både dygnsrytm och stressinducerade nivåer av glukokortikoidersättning, inklusive en mer utplattad rytm av dygns hpa axelaktivitet och dämpat HPA axel svar på akuta stressfaktorer3,4,5. Med tanke på att förbättrad HPA axel verksamhet rapporteras i en delmängd av kvinnor med postpartum affektiv dysregulation, inklusive ökade nivåer av cirkulerande glukokortikoider och hämmad negativ feedback6,7,8, exponering för stressfaktorer som resulterar i ökad postpartum stress reaktivitet och förhindra moderns HPA axeln adaptioner tros öka mottagligheten för neuropsykiatriska störningar.
För att belysa effekterna av stress på affektiv dysregulation hos mödrar och spädbarn har flera gnagare modeller av stress under peripartumperioden genererats. En majoritet av dessa modeller kännetecknas av tillämpning av fysiska stressfaktorer som resulterar i homeostatiska utmaningar och förändringar i dammfysiologisk status9, såsom kronisk återhållsamhet stress10 och simma stress under dräktighet11, eller postpartum chock exponering12. Även om dessa paradigm har visat sig resultera i uppkomsten av postpartum depressiva-liknande beteenden och förändringar imödravården 10,11,12, har de begränsats av deras oförmåga att noggrant fånga den psykosociala karaktären hos stressfaktorer som vanligtvis upplevs av mänskliga mödrar. Detta blir särskilt viktigt när man försöker avslöja de neuroendokrina konsekvenserna av kronisk stress under peripartumperioden, med tanke på att bearbetning av olika typer av stressfaktorer tros förmedlas av olika neurala nätverk som orkestrerade HPA-axelaktivering9.
För att övervinna denna begränsning har flera grupper utformat stressparadigmer som använder psykosociala förolämpningar eller en kombination av fysiska och psykosociala stressfaktorer. Moderns separationsmodell, där dammar separeras från hennes valpar i flera timmar per dag under postpartumperioden13,14, och den kroniska sociala stressmodellen, där dammarna utsätts för en manlig inkräktare i närvaro av sina kullar15,16, har kunnat reproducera uppkomsten av avvikelser i mödravård och depressiva fenotyper i samband med fysiska stressparadigmer. Det kroniska ultramild stressparadigmet, där gravida kvinnliga möss utsätts för en mängd psykosociala förolämpningar, inklusive burlutning och nattlig belysning, samt betydande fysiologiska förolämpningar, såsom återhållsamhetsstress och livsmedelsbegränsning, har ytterligare avslöjat exponering för en blandad karaktär av stressfaktorer resulterar i avvikelser i moderns beteende, inklusive försämringar i moderns aggression, samt dysreglering i den dygnsrytmiska aktiviteten hos HPA-axeln17,18. I överensstämmelse med dessa resultat resulterar en alternerande återhållsamhet stress och överbeläggning modell under dräktigheten i höjder i postpartum moderns dygnsrytm kortikosteron nivåer samt förändringar i moderns vård, även om inga skillnader observeras i HPA axeln återaktivitet efter postpartum exponering för nya akuta förolämpningar1.
En utvidgning av detta arbete, genererar ett graviditetsstressparadigm som använder flera psykosociala förolämpningar som presenteras på ett oförutsägbart sätt och minimerar användningen av fysiologiska stressfaktorer. Studier har tidigare visat detta kroniska psykosociala stress paradigm (CGS) resulterar i utvecklingen av moderns HPA axeln dysfunktion, inklusive förbättrad stress reaktivitet i början av periodenpostpartum 19. Dessa förändringar är förknippade med avvikelser i moderns beteende, inklusive förändringar i kvaliteten på mödravården som tas emot av valpar, och uppkomsten av anhedoniska och ångestliknande beteenden19, funktioner som överensstämmer med perinatalt humör och ångeststörningar20,21. Dessutom minskar avkommans viktökning under den postnatala perioden efter exponering in-utero för CGS19, vilket tyder på att CGS kan ha ihållande negativa programmeringseffekter i framtida generationer.
Målet med att utveckla CGS paradigmet var att främst utnyttja kliniskt relevanta stressfaktorer, som noggrant fånga typ, intensitet och frekvens av förolämpningar som ofta förknippas med neuroendokrina dysregulation och utvecklingen av perinatal humör och ångest störningar. Här ger studien ett detaljerat protokoll över hur man utsätter gravida honmöss för CGS, samt nedströms bedömningar som kan användas för att testa modellens giltighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs godkändes av Animal Care and Use Committee vid Cincinnati Children's Medical Center och var i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer. Ad libitum tillgång till standard gnagare chow och vatten tillhandahölls hela tiden till möss, inklusive under CGS paradigm. Möss var inrymda på en 14 h / 10 h ljus-mörk cykel (lampor på 06:00 h) om inget annat anges (dvs exponering för ljus över natten).
1. Förberedelser för tidsenda parningar
- Minst 2 veckor före dukning av tidsenda parningar, husera de vuxna kvinnliga mössen tillsammans i en vanlig musbur (18,4 cm x 29,2 cm x 12,7 cm), fyra möss per bur. Märk varje kvinnlig mus med ett specifikt ID-nummer via en öronmärke.
OBS: C57BL6 kvinnliga möss utan föregående graviditet och mellan 3 och 6 månaders ålder användes för detta protokoll. - Minst 1 vecka före uppställning av tidsenliga parningar, individuellt hysa de vuxna manliga mössen som ska användas för parning.
2. Ställa in tidsenda parningar
- Ställ in de tidsenda parningen klockan 18:00. Ta två kvinnliga möss och placera dem i en bur som håller en individuellt inhyst hanmus. Separera de tidsenda parningen följande morgon vid 08:00 h.
3. Kontroll av kopulatorisk kontakt, avsedd som graviditetsdag 0,5 (G0.5)
- Omedelbart efter att ha separerat tidsenliga parningar, kontrollera om det finns en kopulatorisk plugg i de kvinnliga mössen. Närvaron av en kopulatorisk plugg kommer att markera G0.5. Låt musen hålla trådnätet inuti buret och lyft försiktigt det med svansen för att visualisera vaginalöppningen.
OBS: Närvaron av en kopulatorisk plugg indikerar att sexuell aktivitet har inträffat men garanterar inte en graviditet. När du försöker beräkna antalet experimentella möss som behövs, förvänta dig att 50% av mössen är pluggade från tidsbekrade parningar och en graviditet för att ansluta incidensen på 60%-70%. - Använd enkel visuell undersökning för att identifiera förekomsten av en kopulatorisk plugg (en ogenomskinlig vitaktig härdad massa inuti eller något utskjutande från vaginalöppningen). Om kopulatoriska kontakten inte lätt kan identifieras genom enkel visuell undersökning, sätt försiktigt in en trubbig ändsond i vaginalöppningen. Identifiera pluggarna som finns längre bak i slidan genom motståndet från sondinsättning.
- Separera de kvinnliga mössen med kopulatoriska pluggar och grupphus i vanliga musburar, 3 till 4 möss per bur.
4. Förberedelser för CGS-paradigm
- Slumpmässigt tilldela burar som inhyser honmöss med kopulatoriska pluggar i två grupper på G5.5: Kontroll- och CGS-grupp. Försök att randomisera burar för att ha ett ungefär lika stort antal möss per grupp. Överför mössen för att rengöra vanliga musburar och etikett med ett "stör ej"-tecken. Utse dessa burar som "hemburar" för möss att placera dem i slutet av varje stressor.
- Utse ett separat rum i musanläggningen för att utföra CGS-paradigmet. Designa en 11-dagars stressorregim, som går från G6.5 till G17.5, för att använda var och en av 7-dagars stressorerna [exponering för främmande föremål (marmor eller lego), rovdjursluktexponering (smutsig råttsäng), 30° burlutning, frekventa förändringar av sängkläder, borttagning av sängkläder, rörelse på shaker] två gånger per dag och för att använda var och en av de 3 nattstressorerna (nattljus på, bur mate förändring, exponering för våta sängkläder) över natten på ett slumpmässigt sätt. Ett eventuellt urvalsschema och ett schema över de experiment som beskrivs nedan finns i figur 1.
OBS: Varje dag bör stressorn falla inom mössens ljuscykel (lampor på 06:00 h-20:00 h) och vara 2 h, med minst 2 h avbrott mellan stressfaktorer. Varje nattstressor ska ställas in i början av den mörka cykeln (lyser 20:00 h) och separeras i början av ljuscykeln (lampor på 06:00 h).
5. Utföra CGS-paradigmet
- Ställ in specifika stressfaktorer på en vanlig statisk bur med filtrerad topp och vattenflaska i rummet som är avsett för CGS-paradigmet. Förbered antalet statiska burar som behövs för experimentet beroende på antalet musburar som utsetts att genomgå CGS under randomisering. Innan du startar varje stressor, överför CGS-gruppens musburar från bostadsrummet till CGS-rummet.
OBS: Utför hantering/överföring av möss från hembur till experimentell bur och tillbaka i laminära flödeshuvar. - Applicera följande stressfaktorer enligt den fördesignade regimen (se steg 4. 2).
- Exponering för främmande föremål (kulor eller lego): Placera sex kulor (14 mm i diameter) eller sex lego (olika former, för att inte överstiga 4 cm i höjd) slumpmässigt fördelade i en ren statisk bur med mussängkläder, utan att inkludera musboen. Placera mössen tillsammans med sina motsvarigheter i hemmaburen i den statiska buren med främmande föremål i 2 timmar. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
OBS: Rengör de främmande föremålen efter användning. - Predator luktexponering (smutsig råttsängkläder): Placera 1 cm på djupet av färska smutsiga råttsängkläder från honråttor i en ren statisk bur utan mussängkläder, utan att inkludera musboen. Placera mössen tillsammans med sina motsvarigheter i hemmaburen i den statiska buren med smutsiga råttsängkläder i 2 timmar. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- 30° burlutning: Placera mössen med sina motsvarigheter i hemmaburen i en ren statisk bur med mussängkläder, utan att inkludera musboen. Luta buret i 30° mot väggen i 2 timmar. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- Frekventa förändringar av sängkläder: Placera mössen med sina motsvarigheter i hemburen i en ren statisk bur med mussängkläder, utan att inkludera musboen. Byt ut mussängkläderna mot rena mussängkläder var 10:e minut i 2 timmar. Under mussängbyten, placera försiktigt mössen i en annan ren bur för att undvika direkt kontakt med mössen. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- Borttagning av sängkläder: Placera mössen tillsammans med sina motsvarigheter i hemburen i en tom ren statisk bur (utan mussängkläder eller bon) i 2 timmar. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- Rörelse på shaker: Placera mössen med sina motsvarigheter i hemmaburen i en ren statisk bur med mussängkläder, utan att inkludera musboet. Placera den statiska buren ovanpå en ömsesidig labbskakapparat inställd på 140 slag per min i 2 timmar. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- Exponering över natten för ljus: Placera mössen med sina motsvarigheter i hemmaburen i en ren statisk bur med mussängkläder, utan att inkludera musboen. Håll lamporna tända över natten (20:00 h-06:00 h) för att störa den mörka cykeln. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- Förändring av burkompis: Överför musen till en ren statisk bur med mussängkläder som hålls inhyst av en annan grupp av två kvinnliga möss (intakta honor ingår inte i behandlings- eller kontrollgruppen). Håll musen i den statiska buren med okända burkamrater över natten. Sätt tillbaka musen i hemburen med sina specifika motsvarigheter i hemmaburen när stressorn är slut.
- Exponering för våtsängkläder: Fyll den statiska buren med mussängkläder med rent vatten som hålls vid 24 °C tills sängkläderna är mättade med vatten. Placera mössen tillsammans med sina motsvarigheter i hemmaburen i den statiska buren med våta sängkläder över natten. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- Exponering för främmande föremål (kulor eller lego): Placera sex kulor (14 mm i diameter) eller sex lego (olika former, för att inte överstiga 4 cm i höjd) slumpmässigt fördelade i en ren statisk bur med mussängkläder, utan att inkludera musboen. Placera mössen tillsammans med sina motsvarigheter i hemmaburen i den statiska buren med främmande föremål i 2 timmar. Returnera mössen till sin hembur med samma motsvarigheter vid stressorns slut.
- Under CGS-paradigmet, håll kontrollmössen ostört i sina hemburar inne i bostadsrummet.
- Byt ut de använda hemmaburarna mot nya hemmaburar på G10.5. På G17.5, vid avslutningen av över natten stressor, en-house alla experimentella möss att förbereda sig för förlossning och nedströms funktionella bedömningar.
6. Övervakning av de experimentella mössen under CGS-paradigmet
- Övervaka mössen var 1 timme under stressorapplikationen, utom under stressfaktorer över natten.
- Exkludera mössen som uppvisar nödtecken, inklusive sår, letargi eller fysiska avvikelser från experimentet. Kontakta veterinärpersonalen vid behov.
7. Mätning av den procentuella kroppsviktsökningen under dräktigheten hos de experimentella mössen (frivillig uppgift)
- På G6.5, väg mössen individuellt före exponering för stressfaktorer. På G17.5, vid avslutningen av över natten stressor, väg mössen individuellt. Väg kontrollmössen vid motsvarande graviditetspunkter.
- Mät den procentuella kroppsviktökningen under dräktigheten genom att ställa in vikten på den första dagen av CGS-paradigmet (G6.5) som 100%.
8. Mätning av postpartum relativa binjurevikter hos experimentella möss (valfritt)
- På postpartum dag 2 (PP2), väg kontrollen och CGS-dammarna individuellt. Avliva dammarna genom koldioxidinandning följt av livmoderhalsförskjutning i en rökhuva.
- Placera mössen på en dissektionsplatta, sterilisera bukområdet med 70% etanol och öppna bukhålan med en sax för att göra ett vertikalt snitt. Isolera binjurarna som ligger intill njurarnas främre pol med tång, bilateralt. Dissekera försiktigt fettvävnaden som omger binjurarna under ett dissekerande mikroskop.
- Väg de bilaterala binjurarna individuellt. Beräkna de relativa binjurarnas vikter i milligram per gram (totalvikt för höger och vänster binjurar/kroppsvikt).
9. Mätning av postpartum hypotalamus hypofysens binjureaxelaktivitet (HPA) hos de experimentella mössen (frivillig uppgift)
- Som förberedelse för HPA-axelmätningar avlivar du kullar till 6 valpar per kull på postpartum dag 0 (PP0). Använd koldioxidinandning, följt av halshuggning med kirurgisk sax som sekundär metod för dödshjälp.
- På postpartum dag 2 (PP2), individuellt hålla kontrollen och CGS dammar inuti en välventilerad 50 mL polypropylen konisk rör i 20 min. Omedelbart efter fasthållningsspänning, ta bort musen från det koniska röret och håll musen med den icke-dominerande handen genom att hålla den lösa huden över axlarna och bakre till öronen för att ha huden över underdårig spänd.
- Punktera den submandibulära venen med en lansett något bakom underkäken men främre till öronkanalen. Samla upp till 100 μL moderns blod i ett serumavskiljarrör. Efter provuppsamling, applicera försiktigt tryck med gasväv på punkteringsstället för att stoppa blödningen. Sätt tillbaka dammarna i hemmaburen när blödningen upphör.
- Centrifugera serumavskiljarröret vid 21 130 x g i 6 minuter och ta försiktigt bort serumet. Förvara serumet vid -20 °C för senare användning. Mät serumkortikosteronkoncentrationen med ett ELISA-kit enligt tillverkarens protokoll.
10. Mätning av beteendeförändringar efter förlossningen hos de experimentella mössen (frivillig uppgift)
- För att förbereda sig för beteendeanalysen, slakta kullar till 6 valpar per kull på PP0.
- Utför analys av moderns vård fragmentering från PP2 till PP5. På varje dag, under ljuscykeln, exponera dammarna till testrummet under en 5 minuters habituationsperiod innan du videofilmar moderns beteende under en 30-minuters period.
- Utvärdera moderns vårdfragmentering genom att mäta den genomsnittliga längden på en individuell slickning / grooming bout och det totala antalet anfall som utförs av dammar19.
OBS: Slickande/ grooming beteende definieras som ett beteende där dammen tar kontakt med valpens kropp med tungan, eller valpen hanteras av dammen med hennes forepaws. En match definieras som en oavbruten tidsperiod där dammen ägnar sig åt att slicka/prepareras av sina valpar.
- Utvärdera moderns vårdfragmentering genom att mäta den genomsnittliga längden på en individuell slickning / grooming bout och det totala antalet anfall som utförs av dammar19.
- Utför analys av anhedonia via sucrose preferenstest (SPT) från PP0 till PP6. Exponera dammarna för en 100 ml flaska rent vatten och en 100 ml flaska 4% sackaroslösning i hemmaburen. Mät mängden vatten och sackaros som förbrukas (i ml) dagligen. Byt ut flaskplaceringen i hemburen. Beräkna sackarospreferensen med hjälp av medelvärdena från de senaste 4 dagarna: preferens % = [(sackarosförbrukning / sackaros + vattenförbrukning) x 100].
- Utför analys av ångestliknande beteende via förhöjd noll labyrint (EZM) på PP8. Placera dammarna individuellt på EZM-apparaten som består av två slutna kvadranter och två öppna kvadranter upphöjda från golvet. Låt dammarna utforska labyrinten ostört i 5 minuter. Kvantifiera den tid som tillbringas i den öppna kvadranten och antalet poster i de öppna kvadranterna.
11. Mätning av postnatala avkommor viktförändringar (valfritt)
- För att förbereda sig för avkommans viktanalys, slakta kullar till 6 valpar per kull på födelsedagen (postnatal dag 0, PN0).
- Registrera vikten av valpar på PN0 och vid olika tidpunkter under postnatalperioden (PN2, 7, 15, 21).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att utsätta de gravida honmössen för CGS leder till förändringar i kroniska stressrelevanta parametrar, inklusive en minskning av kroppsviktsökningen under graviditeten (figur 2A) och ökade binjurevikter under den tidiga postpartumperioden (Figur 2B)19. Viktigt, exponering för CGS resulterar i postpartum avvikelser i moderns neuroendokrina funktion. CGS-dammar uppvisar en hyperaktiv HPA-axel, vilket framgår av de ökade serumkortikosteronnivåerna efter applicering av en ny akut förolämpning (figur 3)19.
Att utsätta de gravida kvinnliga mössen för CGS ytterligare resulterar i beteendemässiga avvikelser i den tidiga postpartum perioden som verkar återspegla uppkomsten av en depressiv-liknande fenotyp. CGS-dammar visar förändringar i mödravården som återspeglas av en ökning av graden av fragmentering av moderns signaler som tas emot av valparna. Den genomsnittliga varaktigheten av slickande / grooming bouts minskas och associeras med en ökning av det genomsnittliga antalet matcher efter CGS, vilket indikerar många korta episoder av vårdande beteende (Figur 4A, B)19. Sackarospreferensen är också deprimerad i CGS-dammar jämfört med kontrolldammar, vilket tyder på förekomst av anhedonia (Figur 4C)19. Slutligen uppvisar CGS-dammarna också ökade ångestrelaterade beteenden mätt med en minskning av tiden i de öppna kvadranterna i EZM jämfört med kontrolldammar (Figur 4D)19.
Hos avkomman resulterar exponering för CGS in-utero i minskad viktökning under den postnatala perioden, från postnatal dag 7 till 21, även om inga förändringar observeras vid födseln. Denna minskning av kroppsviktsökningen är närvarande hos avkommor av båda könen(figur 5)19. Observera att CGS-paradigmet inte hade någon effekt på graviditetslängd, kullstorlek eller könsförhållande per kull (uppgifter som inte visas)19.
Figur 1: Schematiska CGS-paradigm och funktionella bedömningar för validering. Denna siffra har modifierats från Zoubovsky, S.P. et al.19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Förändringar i de kroniska stressrelaterade parametrarna i dammarna efter CGS-exponering. (A) Kroppsviktsförändringar från G6,5-G17,5, Kontroll = 17, CGS = 17. B)Relativa kroppsliga binjurar vid PP2, Control = 20, CGS = 15. Data som presenteras som medelvärde + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Denna siffra har modifierats från Zoubovsky, S.P. et al.19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Mätningar av hpa-axeln efter CGS-exponering. Moderns serum kortikosteron nivåer mätt efter 20 min återhållsamhet stress på PP2, Kontroll = 8, CGS = 5. Data presenteras som medelvärde + SEM. *p < 0,05. Denna siffra har modifierats från Zoubovsky, S.P. et al.19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Beteendeförändringar underden tidiga postpartumperioden i dammar efter CGS-exponering. (A) Genomsnittlig varaktighet och (B) antal slickande/ grooming-matcher registrerade från PP2-PP5, Control = 17, CGS = 17. (C) Procent sackaros preferens i SPT, Control = 17, CGS = 19. (D) Total tid i öppen kvadrant av EZM under 5 min perioden, Kontroll = 17, CGS = 19. Data som presenteras som medelvärde + SEM *p < 0,05, **p < 0,01. Denna siffra har modifierats från Zoubovsky, S.P. et al.19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Förändringar i avkommans kroppsvikt under postnatal utveckling efter exponering in-utero för CGS. Avkommans kroppsvikt mätt från PN0 till PN21, Control = 17 kullar, CGS = 17 kullar. Data som presenteras som medelvärde + SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Denna siffra har modifierats från Zoubovsky, S.P. et al.19. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exponera de gravida mössen för CGS-störningar postpartum moderns neuroendokrina funktion, inklusive HPA-axelns svar på nya stressfaktorer, och är associerad med olika beteendemässiga avvikelser som är relevanta för perinatalt humör och ångeststörningar. Med tanke på att modellen använder utnyttjande av en miljöriskfaktor förväntas högre fenotypisk variation än vad som annars observerats i genetiska modeller22. Resultat från tillämpningen av CGS-paradigmet kan dock vara konsekventa mellan forskningslaboratorier om man är noga med att minimera variabler som kan förvirra resultaten.
Kritiska steg i protokollet inkluderar steg relaterade till allmänna djurhållningsmetoder, inklusive huskontrollmöss åtskilda från CGS-möss och tidsbegränsade parningssteg. Co-housing kontroll och CGS möss kan i sig vara en stressig stimulans för kontrollgruppen och därför förvirra neuroendokrina eller beteendemässiga resultat23,24. På samma sätt rekommenderas inte att inleda experiment med gravida möss som skickas från leverantören. För att maximera effektiviteten hos tidsstiderade parningar rekommenderas att hysa vuxna kvinnliga möss tillsammans minst 2 veckor innan du ställer in tidsenda parningar för att synkronisera deras estruscykler. På samma sätt, att använda sexuellt erfarna vuxna manliga möss och förhindra män från att para sig minst 1 vecka innan du ställer in tidsbestämda parningar kommer att maximera deras fertilitet och öka risken för framgångsrika graviditeter. Tidsplanen för CGS-paradigmet måste också följas noggrant. Applicering av dessa stressfaktorer av varierande intensitet för tidigt i dräktigheten kan påverka livmoderns decidualisering och hämma embryoimplantation25. Stressexponering under olika graviditetstidsfönster har också visat sig medföra varierande könsspecifik neurodevelopmental sjukdomsrisk för avkommor, där manliga avkommor är betydligt mer sårbara än kvinnliga avkommor för stressfaktorer under tidiggraviditet 26,27. CGS-schemat skall utformas på ett sådant sätt att det säkerställer oförutsägbarhet för att förhindra utveckling av anpassningsmekanismer och acklimatisering som ofta förknippas med upprepad exponering för förutsägbara stressfaktorer28. Slutligen bör kullar slaktas till sex valpar på födelsedagen för att säkerställa jämförbara förhållanden i alla dammar och förhindra att variabiliteter i kullstorlek förvirrar modershormon eller beteendeanalys. På samma sätt bör olika kohorter användas för neuroendokrina och beteendemässiga bedömningar för att minimera förvirrande effekter av återhållsamhet stress och submandibular blödningar på beteende. Olika kohorter bör också användas för bedömning av mödravård och analys av andra beteendeparametrar för att minimera störningar i moderns interaktion med valparna.
Det finns flera begränsningar i det aktuella protokollet. Oförmågan att exakt förutsäga antalet gravida möss före starten av CGS-paradigmet kan utgöra en betydande ekonomisk och djurisk användningsbörda. Ändringar kan göras i protokollet för att uppnå mer förutsägbar framgång med tidsenlig parning, inklusive utvärdering av vaginal cytologi för att identifiera möss i estrusstadiet, där både parning och ägglossning vanligtvis förekommer29. Ultrasonografisk undersökning av möss kan också införlivas i CGS-paradigmet som en alternativ icke-invasiv teknik för att exakt identifiera graviditeter från mycket tidiga stadier avdräktighet 30. Användningen av speciell avelsmat, med ökad fetthalt, har också använts av andra grupper för att förbättra parningsframgången31. Försiktighet måste dock iakttas vid förändringar i kosten, med tanke på att detta kan påverka moderns stress reaktivitet och beteende32. Dessutom har det nuvarande protokollet visat sig vara effektivt hos vilda C57BL/6 möss, men ändringar av protokollet kan behövas för olika stammar eller genetiska bakgrunder samt arter, eftersom de kan ha stora variationer i stresskänslighet, mödravård och känslomässig reglering.
Jämfört med nuvarande befintliga peripartum stress modeller, CGS paradigm visar sig vara mer translationellt relevant med tanke på de resulterande sjukdom-relevanta endophenotyper som observerats, inklusive förbättrad moderns stress reaktivitet och postpartum avvikelser i moderns vård, anhedonia och ångest. Dessa förändringar verkar rekapitulera kliniska resultat i samband med perinatal humör och ångest störningar. Framtida tillämpningar av denna modell inkluderar användning av CGS paradigm för att identifiera könsspecifika effekter av moderns psykosociala stress på avkomma hjärnans utveckling och sjukdom mottaglighet. Studera effekterna av CGS på placenta funktion bör övervägas, med tanke på att dysfunktion i viktiga placenta funktioner har visat sig påverka fetala hjärnans utveckling33. Införliva korsbetalande experiment med CGS paradigm skulle ytterligare bidra till att förstå de enskilda bidragen in-utero CGS exponering och tillhörande moderns hormonella miljö förändringar kontra postpartum avvikelser i vårda beteende spela i forma avkomma känslomässig utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna stöd från National Institute of General Medical Sciences T32 GM063483-14 grant och Cincinnati Children's Research Foundation. För data anpassade från Zoubovsky et al., 2019, Creative Common License finns på följande plats: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal lancet | Braintree Scientific Inc. | GR4MM | |
| Blunt end probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Used to check for copulatory plugs |
| Bottles for SPT | Braintree Scientific Inc. | WTRBTL S-BL | 100 mL glass water bottle with stopper and sipper ball point tube, graduted by 1 mL. |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Inc. | 352098 | Used for restraining mice to measure HPA axis response to acute stress. Make sure conical tube has small opening at the end for ventilation. |
| Legos | Amazon | - | |
| Marbles | Amazon | - | |
| Mouse Corticosterone ELISA kit | Biovendor | RTC002R | |
| Mouse EZM | TSE Systems | - | |
| Reciprocal laboratory shaker | Labnet international | S2030-RC-B | |
| Serum separator tubes | Becton Dickinson | 365967 | |
| Static cage- bottom | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | RC71D-PC | |
| Static cage - filtered ventilated tops | Alternative Design Manufacturing and Supply Inc. | FT71H-PC |
References
- Hillerer, K. M., Reber, S. O., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. Exposure to chronic pregnancy stress reverses peripartum-associated adaptations: implications for postpartum anxiety and mood disorders. Endocrinology. 152 (10), 3930-3940 (2011).
- Hillerer, K. M., Neumann, I. D., Slaterry, D. A. From stress to postpartum mood and anxiety disorders: how chronic peripartum stress can impair maternal adaptations. Neuroendocrinology. 95 (1), 22-38 (2018).
- Altemus, M., Deuster, P. A., Galliven, E., Carter, C. S., Gold, P. W. Suppression of hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to stress in lactating women. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 80 (10), 2954-2959 (1995).
- Slattery, D. A., Neumann, I. D. No stress please! Mechanisms of stress hyporesponsiveness of the maternal brain. The Journal of Physiology. 586 (2), 377-385 (2008).
- Hasiec, M., Misztal, T. Adaptive modifications of maternal hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity during lactation and salsolinol as a new player in this phenomenon. International Journal of Endocrinology. 10 (2), 1-11 (2018).
- Bloch, M., et al. Cortisol response to ovine corticotropin-releasing hormone in a model of pregnancy and parturition in euthymic women with and without a history of postpartum depression. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (2), 695-699 (2005).
- Jolley, S. N., Elmore, S., Barnard, K. E., Carr, D. B. Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in postpartum depression. Biological Research for Nursing. 8 (3), 210-222 (2007).
- Nierop, A., Bratsikas, A., Zimmermann, R., Ehlert, U. Are stress-induced cortisol changes during pregnancy associated with postpartum depressive symptoms. Psychosomatic Medicine. 68 (6), 931-937 (2006).
- Ulrich-Lai, Y. M., Herman, J. P. Neural regulation of endocrine and autonomic stress responses. Nature Reviews Neuroscience. 10 (6), 397-409 (2009).
- Smith, J. W., Seckl, J. R., Evans, A. T., Costall, B., Smythe, J. W. Gestational stress induces post-partum depression-like behavior and alters maternal care in rats. Psychoneuroendocrinology. 29 (2), 227-244 (2004).
- Leuner, B., Fredericks, P. J., Nealer, C., Albin-Brooks, C. Chronic gestational stress leads to depressive-like behavior and compromises medial prefrontal cortex structure and function during the postpartum period. PLOS One. 9 (3), 89912 (2014).
- Kurata, A., Morinobu, S., Fuchikami, M., Yamamoto, S., Yamawaki, S. Maternal postpartum learned helplessness (LH) affects maternal care by dams and responses to the LH test in adolescent offspring. Hormones and Behavior. 56 (1), 112-120 (2009).
- Boccia, M. L., Pedersen, C. A. Brief vs. long maternal separations in infancy: Contrasting relationships with adult maternal behavior and lactation levels of aggression and anxiety. Psychoneuroendocrinology. 26 (7), 657-672 (2001).
- Boccia, M. L., et al. Repeated long separations from pups produce depression-like behavior in rat mothers. Psychoneuroendocrinology. 32 (1), 65-71 (2007).
- Nephew, B. C., Bridges, R. S. Effects of chronic social stress during lactation on maternal behavior and growth in rats. Stress. 14 (6), 677-684 (2011).
- Carini, L. M., Murgatroyd, C. A., Nephew, B. C. Using chronic social stress to model postpartum depression in lactating rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50324 (2013).
- Pardon, M., Gérardin, P., Joubert, C., Pérez-Diaz, F., Cohen-Salmon, C. Influence of prepartum chronic ultramild stress on maternal pup care behavior in mice. Biological Psychiatry. 47 (10), 858-863 (2000).
- Misdrahi, D., Pardon, M. C., Pérez-Diaz, F., Hanoun, N., Cohen-Salmon, C. Prepartum chronic ultramild stress increases corticosterone and estradiol levels in gestating mice: Implications for postpartum depressive disorders. Psychiatry Research. 137 (12), 123-130 (2005).
- Zoubovsky, S. P., et al. Chronic psychosocial stress during pregnancy affects maternal behavior and neuroendocrine function and modulates hypothalamic CRH and nuclear steroid receptor expression. Translational Psychiatry. 10 (6), 1-13 (2020).
- Yim, I. S., et al. Biological and psychosocial predictors of postpartum depression: systematic review and call for integration. Annual Review of Clinical Psychology. 11, 99-137 (2015).
- Slomian, J., Honvo, G., Emonts, P., Reginster, J. Y., Bruyere, O. Consequences of maternal postpartum depression: a systematic review of maternal and infant outcomes. Women's Health. 15, 1-55 (2019).
- Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of maternal immune activation in mice at mid-gestation stage with viral mimic poly(I:C). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53643 (2016).
- Zalaquett, C., Thiessen, D. The effects of odors from stressed mice on conspecific behavior. Physiology and Behavior. 50 (1), 221-227 (1991).
- Burstein, O., Doron, R. The unpredictable chronic mild stress protocol for inducing anhedonia in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58184 (2018).
- Zheng, H. T., et al. The detrimental effects of stress-induced glucocorticoid exposure on mouse uterine receptivity and decidualization. FASEB Journal: Official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (11), 14200-14216 (2020).
- Mueller, B. R., Bale, T. L. Sex-specific programming of offspring emotionality after stress early in pregnancy. Journal of Neuroscience. 28 (36), 9055-9065 (2008).
- Bale, T. L. The placenta and neurodevelopment: sex differences in prenatal vulnerability. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18 (4), 459-464 (2016).
- Herman, J. P., Tasker, J. G. Paraventricular hypothalamic mechanisms of chronic stress adaptation. Frontiers in Endocrinology. 7, Lausanne. 137-147 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLOS One. 7 (4), 35538 (2012).
- Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. Use of ultrasound imaging for early diagnosis of pregnancy and determination of litter size in the mouse. Laboratory Animals. 43 (1), 91-95 (2009).
- Froberg-Fejko, K., Lecker, J. Using environmental enrichment and nutritional supplementation to improve breeding success in rodents. Lab Animal (NY). 45 (1), 406-407 (2016).
- Perani, C. V., Neumann, I. D., Reber, S. O., Slattery, D. A. High-fat diet prevents adaptive peripartum-associated adrenal gland plasticity and anxiolysis. Scientific Reports. 5, 14821-14831 (2015).
- Nugent, B. M., Bale, T. L. The omniscient placenta: metabolic and epigenetic regulation of fetal programming. Frontiers in Neuroendocrinology. 39, 28-37 (2015).
