Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/62550
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2
1Nano Flow Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Allergy and Inflammation, Beth Israel Deaconess Medical Center

Summary

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ריחוף מגנטית שיכולה לזהות באופן ספציפי נוכחות של אנטיגנים, מסיסים או קשורים לממברנה, על ידי כימות שינויים בגובה הריחוף של חרוזי לכידה עם צפיפות קבועה.

Abstract

השיטה המתוארת פותחה על בסיס עקרונות הריחוף המגנטי, המפריד בין תאים וחלקיקים על סמך צפיפותם ומאפייניהם המגנטיים. Density הוא מאפיין מזהה סוג תא, הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו, לבידול ולמצב ההפעלה שלו. ריחוף מגנטי מאפשר גישה חד-שלבית כדי להפריד, לדם ולאפיין בהצלחה תאי דם במחזור, ולזהות אנמיה, מחלת חרמשית ותאי גידול במחזור המבוססים על צפיפות ומאפיינים מגנטיים. גישה זו מקובלת גם על זיהוי אנטיגנים מסיסים הנמצאים בפתרון באמצעות סטים של חרוזים בצפיפות נמוכה וגבוהה מצופים בנוגדנים ללכידה וזיהוי, בהתאמה. אם האנטיגן נמצא בתמיסה, הוא יגשר בין שני סטים של חרוזים, יצירת קומפלקס חרוזים חדש, אשר מרחף בין השורות של חרוזים מצופים נוגדנים. ריכוז מוגבר של האנטיגן היעד בפתרון יפיק מספר גדול יותר של מתחמי חרוזים בהשוואה לריכוזים נמוכים יותר של אנטיגן, ובכך יאפשר מדידות כמותיות של אנטיגן היעד. ריחוף מגנטי הוא יתרון לשיטות אחרות בשל זמן הכנת המדגם הירידה שלה וחוסר תלות בשיטות קריאה קלאסיות. התמונה שנוצרת נלכדת ומנותחת בקלות באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי או מכשיר נייד, כגון טלפון חכם או טאבלט.

Introduction

ריחוף מגנטי הוא טכניקה שפותחה כדי להפריד, לנתח ולזהות סוגי תאים1,2,3, חלבונים4,5 ואופיואידים6 המבוססים אך ורק על הצפיפות הספציפית שלהם ואת המאפיינים paramagnetic. צפיפות תאים היא מאפיין ייחודי ומהותי של כל סוג תא הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו ומצב הבידולשלו 7,8,9,10,11,12,13,14. כימות שינויים עדינים וחולפים בצפיפות התאים בתנאי מצב קבועים, ובמגוון תהליכי תאים, יכול להרשות לעצמו תובנה שאין שני לה על פיזיולוגיה של תאים ופתופיזיולוגיה. שינויים בצפיפות התא קשורים לבידול תאים15,16, התקדמות מחזור התא9,17,18,19, אפופטוזיס20,21,22,23, ושינוי ממאיר24,25,26 . לכן, כימות של שינויים ספציפיים בצפיפות התא, יכול לשמש כדי להבדיל בין תאים מסוגים שונים, כמו גם להפלות בין אותו סוג של תאים העוברים תהליכי הפעלה שונים. זה מאפשר ניסויים המתמקדים תת-אוכלוסיית תאים מסוימת, שבו שינויים דינמיים בצפיפות משמש אינדיקטור של חילוף החומרים התא שונה27. כפי שנקבע כי תא עשוי לשנות את צפיפותו בתגובה לסביבה משתנה7, זה הכרחי למדוד את הקינטיקה של התא ביחס לצפיפותו כדי להבין אותו באופן מלא, אשר השיטות הנוכחיות לא יכול לספק12. ריחוף מגנטי לעומת זאת, מאפשר הערכה דינמית של תאים ומאפייניםשלהם 28.

תאים הם דיאמגנטיים כלומר אין להם רגע דיפול מגנטי קבוע. עם זאת, כאשר נחשפים לשדה מגנטי חיצוני, נוצר רגע דיפול מגנטי חלש בתאים, בכיוון ההפוך של השדה המיושם. לכן, אם תאים מושעים בתמיסה פרמגנטית ונחשפים לשדה מגנטי אנכי חזק, הם ירחפו הרחק מהמקור המגנטי ויעצרו לגובה, אשר תלוי בעיקר בצפיפות האישית שלהם. ריחוף דימגנטי של עצם המרותק למינימום של שדה מגנטי אינומוגני אפשרי כאשר שני הקריטריונים הבאים מתקיימים: 1) הרגישות המגנטית של החלקיק חייבת להיות קטנה מזו של המדיום שמסביב, ו -2) הכוח המגנטי חייב להיות חזק מספיק כדי לאזן את כוח הציפה של החלקיק. שני הקריטריונים יכולים להתממש על ידי השעיית RBCs במאגר מגנטי ועל ידי יצירת שיפועי שדה מגנטי חזקים עם מגנטים קבועים קטנים, זולים וזמינים מסחרית1. מיקום שיווי המשקל של חלקיק לכוד מגנטית על ציר לאורך כיוון הכבידה נקבע על ידי צפיפותו (ביחס לצפיפות המאגר), הרגישות המגנטית שלו (ביחס לרגישות המגנטית של המאגר) וחתימת השדה המגנטי המיושם. מכיוון שהצפיפות והמאפיינים המגנטיים של הפתרון קבועים בכל המערכת, תכונות הצפיפות המהותיות של התאים יהיו הגורם העיקרי הקובע את גובה הריחוף של התאים, כאשר תאים צפופים יותר מרחפים נמוך יותר בהשוואה לתאים צפופים פחות. גישה זו משתמשת בערכה של שני חרוזי התייחסות בצפיפות (1.05 ו- 1.2 גרם/מ"ל) המאפשרים לנו להשתמש בניתוח מדויק ויחסי למדידות צפיפות. שינוי הריכוז של הפתרון המגנטי מאפשר לבודד אוכלוסיות תאיות שונות, כגון RBCs מ- WBCs, שכן צפיפות התאים במחזור היא ספציפית לתא, הסרת הצורך בפרוטוקולי בידוד או מניפולציה אחרת של תאים.

רוב שיטות הזיהוי המשמשות במחקר ביולוגי מסתמכות על אקסטרפולציה של אירועים מחייבים ספציפיים לאותות ליניאריים קלים לכימות. שיטות קריאה אלה הן לעתים קרובות מורכבות וכוללות ציוד מיוחד ואנשי צוות מדעיים ייעודיים. גישה שמטרתה זיהוי של אנטיגנים שנמצאו על קרום הפלזמה של תאים או שלל חוץ תאי או כי הם מסיסים בפלזמה, באמצעות אחד או שניים חרוזים מצופים נוגדן, מתואר בזאת. החרוזים חייבים להיות בצפיפות שונה זה מזה וממטרות שנחקרו. נוכחותו של אנטיגן היעד בכל ביופלואיד נתון מתורגמת לשינוי ספציפי, מדיד בגובה הריחוף של תא אנטיגן חיובי כי הוא קשור חרוז זיהוי. במקרה של אנטיגנים מסיסים או שלל חוץ-תאי, הם קשורים הן לחרוזים ללכוד ולזיהוי, ויוצרות קומפלקס חרוזים ולא קומפלקס של תאי חרוזים. השינוי בגובה הריחוף תלוי בצפיפות החדשה של מתחמי חרוזים או חרוזים. בנוסף לשינוי בגובה הריחוף של המתחמים, המציין את נוכחות האנטיגן בביופלואיד, מספר המתחמים תלוי גם בכמות היעד, מה שהופך את הריחוף המגנטי גם לגישה כמותית לזיהוי אנטיגן24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הניסיוני המשמש במחקר זה אושר על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס (IRB).

1. התקנת מכשיר

הערה: הדמיה של תאים מרחפים דורשת שני מגנטים נדירים של ניאודימיום אדמה הממוגנטים על ציר z כדי להיות ממוקמים עם אותו מוט אחד מול השני כדי ליצור שדה מגנטי. המרחק בין המגנטים יכול להיות מותאם אישית בהתאם לעוצמת השדה המגנטי וצפיפות המטרות. במקרה זה המגנטים מופרדים על ידי שטח 1 מ"מ מספיק להחדרה של צינור נימי זכוכית מרובע באורך 50 מ"מ 1x1 מ"מ. ההתקן הודפס בתלת-ממד באמצעות עיצוב AutoCAD, הזמין על פי בקשה.

  1. הנח מיקרוסקופ על צידו, אופקי לחלוטין.
    הערה: מיקרוסקופ הממוקם בתנוחה זקופה סטנדרטית אינו מתאים ישירות להדמיית עצמים מרחפים בשל מיקומי המגנטים ביחס למחזק ולמטרה. מגבלה זו יכולה להיות עקף על ידי הנחת המיקרוסקופ על צדו, אופקי לחלוטין המאפשר הממקד למקד את האור לתוך נימי, ואת העדשה האובייקטיבית כדי לדמיין את התא מרחף בין המגנטים, תוך שמירה על דרישות תאורת Köhler.
  2. תמיכה וחלוקת המעמד על שולחן לוח לחם באמצעות 2 או 3 שקעי מעבדה.
  3. כדי להגביל את התנודות, תמוך בשולחן לוח הלחם עם רגלי שיכוך גומי.
  4. הסר את הבמה והחלף אותו בשקע מעבדה קומפקטי להתאמת גובה התקן הריחוף (ציר y)ושני שלבי תרגום חד-ציריים; אחד להתאמת המוקד (z-ציר), והשני לסריקת צינור נימי.
  5. חבר את מכשיר הריחוף המגנטי לשקע המעבדה באמצעות שני עמודים אופטיים מסדרה קטנה.

2. קשירת נוגדנים למיקרו-חלקיקים/חרוזים קרבוקסיים (שונה מפרוטוקול על ידי PolyAn)

הערה: רק חרוזים בצפיפות נמוכה (1.05 גרם/מ"ל) צריכים להיות מצופים לגילוי Rh(+), אך חרוזי צפיפות גבוהה ונמוכה מצופים לגילוי שלשלות חוץ-תאיות.

  1. מוציאים מ"ג אחד שווה ערך להשעיית חרוזים ומוסיפים ל-0.5 מ"ל של מאגר הפעלה (50 מ"מ MES (MW195.2, 9.72 מ"ג ב-1 מ"ל)) pH 5.0 ו-0.001% פוליסורבט-20).
  2. הוסף 12 μL של 1.5 M EDC טרי (MW 191.7, 0.28755 גרם ב 1 מ"ל) ו 12 μL של 0.3 M סולפו-NHS (MW 217.14, 0.0651 גרם ב 1 מ"ל) במים קרים כקרח.
  3. מניחים צינורות על שייקר מסלולי ומנערים במרץ במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להפעיל את קבוצות הקרוקסיל על חרוזים.
  4. הפסק את ההפעלה לאחר שעה אחת על-ידי הוספת 0.5 מ"ל של מאגר צימוד (10x PBS, או 0.1 M פוספט pH 7-9).
  5. גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 10 דקות, או, אם החרוזים לא ניתן לכדור, להשתמש במסנן צינור צנטריפוגה 0.45 מיקרומטר. שאפו את סופר-טבעי או זרימה דרך.
  6. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של 10x PBS פי 3 כמו בשלב 2.5.
  7. חשב 25 מיקרוגרם של נוגדן לכל חרוזים מ"ג ולערבב נוגדן הרצוי עם חרוזים מופעלים 0.7-1.0 מ"ג / מ"ל ריכוז נוגדנים סופי ב 10X PBS.
  8. מניחים צינורות על נדנדת צינור להגדיר על מהירות נמוכה. גלגלו צינורות בעדינות בטמפרטורת החדר למשך הלילה לצימוד.
  9. חזור על שלב 2.5 ושטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של 10x PBS.
  10. לשטוף עם 0.5 מ"ל של 1 M אתנולמין (98% מלאי = 16.2 M) ב- pH 8.0 חיץ עם 0.02% פוליסורבט-20 עבור שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי רעדה עדינה.
  11. חזור על שלב 2.5 ולשטוף את החרוזים פעם אחת ב 1 מ"ל של DPBS. החרוזים ניתן לאחסן ב 200 μL של DPBS ב 4 °C (55 °F) עד הצורך.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. איסוף והכנת דם לגילוי Rh(+)

  1. באמצעות התקן lancing בלחיצה אחת, לדקור את האצבע של תורם Rh(+) ולאסוף 10 μL של דם לתוך 1 מ"ל של DPBS.
  2. הכתימו את תאי ה-Rh+ בכתם קרום פלזמה פלואורסצנטי. לחלופין, להוסיף 1 μL של צבע פלואורסצנטי השעיה 1 מ"ל של תאי Rh + (1:1000 דילול).
  3. לדגור על התאים עם צבע פלואורסצנטי ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות.
  4. גלולה את התאים על ידי ספינינג ב 5,600 x g עבור 15 s לשטוף 3 פעמים באמצעות 1 מ"ל של DPBS. Resuspend ב 1 מ"ל של HBSS עם סידן ומגנזיום (HBSS++).
  5. באמצעות מכשיר lancing בלחיצה אחת, לדקור את האצבע של תורם Rh(-) ולאסוף 2 μL של דם.
    הערה: אם מכינים יותר מ 2 תנאים, לאסוף מספיק דם כדי להוסיף 1 μL של Rh (-) דם לכל צינור.
  6. הכן את הצינורות הניסיוניים הדרושים: חרוזים לבד, בקרת IgG, מדגם.
    1. חרוזים בלבד: להוסיף 174 μL של HBSS ++, 1 μL של חרוזי בקרה IgG, 1 μL של חרוזים בצפיפות גבוהה (1.2 גרם / מ"ל), ו 24 μL של 500 mM Gd3 + (60 mM).
    2. בקרת IgG: להוסיף 172 μL של HBSS ++, 1 μL של חרוזי בקרה IgG, 1 μL של חרוזים בצפיפות גבוהה, 1 μL של דם Rh, 1 μL של השעיית דם מוכתמת Rh + , ו 24 μL של 500 mM Gd3 +.
    3. צינור מדגם להוסיף 172 μL של HBSS ++, 1 μL של חרוזים מצופים נגד RhD, 1 μL של חרוזים בצפיפות גבוהה, 1 μL של Rh- דם, 1 μL של השעיית דם מוכתמת Rh(+) ו 24 μL של 500 mM Gd3 +.
      הערה: חרוזי צפיפות גבוהה מתווספים דגימות Rh לעיון.

4. בידוד PMNs להדגמת הפרדה סלולרית

  1. בידוד של נויטרופילים
    1. צייר 40 מ"ל של דם ורידי לתוך מזרק 60 מ"ל המכיל 6 מ"ל של נתרן ציטראט / חומצת לימון (0.15 M, pH 5.5) ו 14 מ"ל של 6% Dextran-70.
    2. המתן 50 דקות עד שהדם יהיה מ משקעים.
    3. שכב לאט את תאי מעיל באפי על גבי 20 מ"ל של Ficoll-Paque על ידי דחיפת העליון 18 מ"ל דרך צינורות איסוף הדם לתוך צינור 50 mL, הימנעות זיהום עם RBCs מ משקעים. מומלץ להשתמש בערכת איסוף דם טרי, כדי למזער את הזיהום עם שאריות RBCs שנותרו בצינור איסוף הדם המקורי.
    4. גלולה את תאי מעיל באפי על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 3,000 x גרם. נויטרופילים ו-RBCs מזהמים יזרקו בתחתית הצינור. PBMC תיצור שכבה לבנה על גבי פיקול-פאק.
    5. העבר את הנויטרופילים לצינור חדש של 50 מ"ל.
    6. Lyse כל שאריות RBCs על ידי דגירה נויטרופילים עם 20 מ"ל של 0.2% פתרון NaCl קר במשך 25 שניות, ואחריו 20 מ"ל נוספים של 1.6% NaCl. הקונצרט הסופי של NaCl צריך להיות 0.9% (איזוטוני).
    7. צנטריפוגה ההשעיה למשך 10 דקות ב 3,000 x g.
    8. הסר את supernatant ו resuspend הנויטרופילים לריכוז הרצוי.
  2. בידוד לימפוציטים
    1. צלחת PBMCs ב RPMI עם סרום מומת בחום 5% ב 6 טוב צלחות תרבות.
    2. לדגור את הצלחות במשך 1 שעה ב 37 °C (50 °F). מונוציטים ידבקו בצלחת, לימפוציטים יצופו בחופשיות.
    3. הסר את המאגר המכיל את הלימפוציטים ולשטוף אותו פעמיים עם RPMI.
    4. resuspend הלימפוציטים בריכוז הרצוי.
  3. תווית RBCs, PMN, ולימפוציטים.
    1. סמן כל סוג תא בצבע פלואורסצנטי שונה. ודא שכל צבע פלואורסצ'ים בערוץ אחר. בצע את הוראות היצרן עבור כל אחד מהצבעים שנבחרו.

5. יצירת שלשלות חוץ-תאיות RBC באמצעות ההפעלה המשלימה

  1. להשיג דם שלם באמצעות venipuncture באמצעות צינורות EDTA.
  2. להעביר דם דרך מסנן תא דם לבן, ולאחר מכן צנטריפוגה 3 פעמים ב 500 x g במשך 10 דקות כל אחד כדי לבודד תאי דם אדומים. השתמש ב- HBSS+ כמאגר כביסה.
  3. הפוך aliquots של 100 μL ארוז RBCs ב 1.5 mL צינורות לפצות את הנפח ל 1 מ"ל על ידי הוספת HBSS ++.
  4. הוסף C5b,6 לריכוז הסופי של 0.18 מיקרוגרם/מ"ל ב- HBSS++, ולאחר מכן מערבולת.
  5. שמים על שייקר איטי בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  6. הוסיפו חלבון C7 לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים על ידי היפוך הצינור בעדינות כמה פעמים. אל תמערבולת מנקודה זו ואילך.
  7. מניחים את הצינור על שייקר צינור להגדיר במהירות נמוכה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. הוסיפו חלבון C8 לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, וחלבון C9 ל-0.45 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים על ידי היפוך הצינורות בעדינות כמה פעמים.
  9. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
  10. צנטריפוגה הצינור ב 10,000 x g במשך 10 דקות.
  11. לאסוף את EV המכיל supernatant בצינור חדש(ים). אין לטרפד את הסופר-טבעי קרוב מדי לכדור התא.

6. ניתוח תאים במכשיר הריחוף המגנטי

  1. בצע אתחול מכשיר בהתאם להוראות היצרן.
  2. לטעון 50 μL של מדגם לתוך צינור נימי עד הצינור מתמלא. לאטום את הקצוות של הצינור נימי עם איטום נימי לוודא שאין בועות אוויר נוכחים.
  3. טען את צינור נימי לתוך המחזיק בין המגנטים העליונים והתחתונים. התאם את הבמה ואת המוקד לצפייה מיטבית.
    הערה: תאים / חרוזים יכולים לקחת בכל מקום בין 5-20 דקות כדי להגיע למיקום שיווי המשקל המגנטי שלהם בהתבסס על הצפיפות שלהם ואת הריכוז של Gd3 +. ככל שריכוז GD3+גבוה יותר, כך הזמן קצר יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ריחוף מגנטי ממקד עצמים בצפיפות שונה בגבהי ריחוף שונים בהתאם לצפיפות האובייקט, החתימה המגנטית שלו, ריכוז התמיסה הפרמגנטית וכוח השדה המגנטי שנוצר על ידי שני מגנטים חזקים ונדירים של כדור הארץ. כששני המגנטים מונחים זה על גבי זה, ניתן לצפות רק בדגימות מרחפות, תוך שמירה על תאורת קולר, באמצעות מיקרוסקופ שהופנה על צידו(איור 1). ניתן לשנות בקלות את גובה הריחוף הסופי אליו מגיע כל סוג תא על ידי שינוי הריכוז של הפתרון הפרמגנטי. איור 2 ממחיש את ההפרדה בין תאי הדם השונים במחזור באמצעות ריכוזים שונים של גדליניום. שני סוגי החרוזים עם דחיסות שונה (1.05 ו-1.2 גרם/מ"ל) שימשו כדי לספק גובה ריחוף צפיפות והפניות לגודל. כמו גובה הריחוף של סוג תא נתון תלוי בצפיפות המהותית שלה, ריחוף מגנטי מספק אמצעי ישיר של בידוד תאים עניין ללא כל מניפולציה משמעותית24. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה הייתה להדגים את היכולת של ריחוף מגנטי לזהות את נוכחותם של אנטיגנים הקשורים לממברנה, במקרה זה גורם Rh, על תאי דם אדומים במחזור. לניסוי זה, חרוזי צפיפות נמוכה היו מצופים בנוגדן בקרת IgG או אנטי RhD. דגימות הוכנו אז על ידי שפיכת דם מתורם Rh (-) עם דם מ Rh(+) ביחס של 1:1000. חרוזים מצופים נגד RhD(+) או החרוזים מצופים IgG שליטה נוספו לדגימת הדם ודגרו במשך 10 דקות. איור 3A מציג את דגימת הבקרה של IgG, שלא יצרה קומפלקסים של תאי דם אדומים-חרוזים. לאחר מכן, זהות תאי הדם האדומים שנתפסו על ידי החרוזים החיוביים Rh (+) אומתה על ידי הכתמת תאי Rh(+) עם כתם קרום פלזמה פלואורסצנטי, ולאחר מכן בתמונה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית(איור 3B). אירוע זיהוי חיובי מוצג באיור 3C. הכריכה של האנטי-Rh-חרוז לתאי Rh(+) יוצרת קומפלקס של תאי חרוזים עם צפיפות בין זה של החרוזים והתא, ולכן מרחפת בגובה הממוקם בין חרוזי לכידה לא מאוגדים לבין RBCs שליליים. תקריב של מתחמי תאי החרוזים צולם תחת אור פלואורסצנטי כדי לאשר את נוכחותם של תאי Rh (+) המסומנים בכתם קרום פלזמה פלואורסצנטי. (איור3D). איור 3E מציג מתחמי חרוזים היוצרים בין חרוזים בצפיפות גבוהה ונמוכה מצופים בנוגדנים עבור CR1 ו- CD47, המצביעים על נוכחות של שלל חוץ-תאי. תרשים של קומפלקס תאי החרוזים מוצג באיור 3F.

Figure 1
איור 1. עקרונות הריחוף המגנטי: (A) שרטוטים של שדה מגנטי. (B)מיקרוסקופ כיתה מחקר היטה על צידו כדי לאפשר הדמיה צדדית המטרות מרחפות בצינור נימי. (C)מבט זוויתי של מנגנון הריחוף המגנטי תחת מטרת המיקרוסקופ. (D)מבט חזיתי של מנגנון ריחוף מגנטי. (E)שרטוטים של מנגנון הריחוף המגנטי עם צינור נימי רכוב בין שני מגנטים, מבט קדמי וצדדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. הדגמה של שיווי משקל צפיפות ספציפי לתא: (A)חרוזים בצפיפות נמוכה וגבוהה (1.05 ו 1.2 גרם / מ"ל) לבד ב 60 mM Gd3 + (נצפה על מטרה 10x). (B)PMNs מרחף מעל תאי דם אדומים ב 21 mM Gd3+, עם טסיות מחוץ לפוקוס מסתובבות (נצפה על מטרה 10x). (C)דם שלם מרחף ב 60 mM Gd3 +, שהוא ריכוז המתמקד RBCs (נצפה על מטרה 10x). (ד)נתון זה שונה מ [ טסוגלו, ס ואח '. ציטומטריית תמונה ריחוף עם רזולוציה זמנית. חומרים מתקדמים. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] הפרדת צפיפות של RBCs (אדום), PMNs (ירוק) ולימפוציטים (כחול) ב 40 mM Gd3 +. כל אוכלוסיית תאים ריחפה בגובה בהתבסס על הצפיפות המהותית שלה (נצפתה על יעד של פי 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 3
איור 3. זיהוי של Rh Factor בדגימת דם: (A) Rh (-) דם מסומם עם Rh (+) דם וחרוזי בקרת IgG. לא נוצרים מתחמי תאי חרוזים (מוצג על מטרה של 10x). (B)דגימת בקרת IgG תחת אור פלואורסצנטי המדגיש את תאי Rh (+) (נצפה על מטרה 10x). (C)Rh (-) דם מסומם עם דם Rh (+) וחרוזים מצופים נגד RhD, מראה את היווצרותם של מתחמי תאי חרוזים (נצפה על מטרה 10x). (D)מבט מקרוב על קומפלקס תאי חרוזים תחת אור פלואורסצנטי (מוצג על מטרה 10x). (E)נגד CR1 וחרוזים מצופים אנטי CD47 היוצרים מתחמים, המציין את נוכחותם של שלשלשות חוץ-תאיות נגזרות RBC (נצפו על מטרה 10x). (ו)דיאגרמה המתארת את קומפלקס תאי החרוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צנטריפוגה הדרגתית היא כיום הטכניקה הסטנדרטית לבידוד רכיבים תת-תאיים בהתבסס על הצפיפות הייחודית שלהם. גישה זו, לעומת זאת, דורשת שימוש במדיה הדרגתית מיוחדת, כמו גם ציוד צנטריפוגות. גישת הריחוף המגנטי המוצגת כאן מאפשרת חקירה מפורטת של התכונות המורפולוגיות והתפקודיות של תאים במחזור, עם מינימום, אם בכלל מניפולציה של התאים, המספקת גישה כמעט in vivo לתאים במחזור.

עם זאת, בעת שימוש בריחוף מגנטי מספר נקודות ראוי להזכיר. ראשית, המיקרוסקופ המשמש להדמיה חייב להיות מוקדש לשיטה זו, שכן ההתקנה גוזלת זמן רב, ודורשת את המיקרוסקופ להיות מפורק חלקית, ממוקם בצורה אופקית לחלוטין עם האופטיקה מיושרת בדיוק עם המגנטים ואת הצינור נימי. שנית, שקע המעבדה ושלבי התרגום המשמשים להתאמת תנועות הזכוכית הנימית והמיקוד דורשים מיקום מדויק ותנועה חופשית על כל אחד משלושת הצירים. סביר להניח שהיישור הקריטי ביותר של ההתקנה כולה, הוא הרכבה של מכשיר הריחוף המגנטי בשלבים התרגומיים, כך שהמגנטים העליונים והתחתונים מיושרים באופן מושלם עם וקטור הכבידה, כמו גם אופקי לחלוטין. כל סטייה מדרישות אלה תיצור זווית בין הכוח המגנטי לכוח המשיכה שתדחוף את התאים לכיוון שני צידי הצינור הנימי, תשבש את תהליך הריחוף ותגרום לתוצאות להיות אמינות.

הריכוז האופטימלי של תמיסה gadolinium המשמש עבור תאים מרחפים צריך להיות מותאם עבור סוג התא ואת המטרה של הניסוי. שינויים בריכוז של פתרון גדליניום ישנו באופן משמעותי את גובה הריחוף של התאים המנותחים, ולכן יש לשמור על קבוע מסט אחד של ניסויים לאחר. אם הריכוז נמוך מדי, בהתאם לצפיפות של תאי היעד, הם לא יכולים לרחף בכלל, בעוד שאם הוא גבוה מדי, יגביל את טווח השינויים הניתנים לזיהוי שניתן לכמת במדויק.

מבנים מרחפים ייצרו רצועות יציבות אם הכוחות היחידים הפועלים עליהם הם כוח המשיכה ודחייה מגנטית. נוכחותה של אפילו בועה בגודל מילימטר בצינור הנימי תיצור זרמים מעגליים קטנים בממשק נוזלי האוויר, אשר יפריע לתאים המרחף, מה שהופך כל ניתוח כמעט בלתי אפשרי. בעת טעינת מדגם לתוך צינור נימי, ולאחר מכן לאחר איטום, יש לוודא כי אין אוויר נוכח, על ידי בחינת נימי תחת סטריאומיקוסקופ או כוח נמוך (4x) המטרה.

ריחוף של תאים בגובה מוגדר תלוי החתימה המגנטית שלהם להישאר זהה לאורך זמן. אם יונים גדליניום פרמגנטיים ממדיית הריחוף נכנסים לתאים, בין אם באמצעות פינוקיטוזיס או חדירות קרום מוגברת, כגון במהלך אפופטוזיס, צפיפות התאים המוגברת הנמדדת בהתבסס על חרוזי הייחוס של הצפיפות תהיה שגויה. למרבה המזל, רוב התאים במחזור יש יכולות פינוקיטיות ירודות26, מה שהופך שיטה זו גישה מתאימה לחקר תאים על פני פרקי זמן ארוכים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לד"ר גטוליו פריירה על עזרתו בעבודה צעיפית חוץ-תאית.

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים של המכון הלאומי לבריאות ל- ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 ו- UG3TR002881.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma Aldrich M-2933 (MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness K&J Magnetics Custom Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal) Leica Microsystems 267620 Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) Sigma Aldrich CLS8163 Used to wash beads
Compact Lab Jack Thorlabs LJ750 Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-144 Solution for bead suspensions
Ethanolamine Sigma Aldrich E9508-100ML Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) Invitrogen C37608 Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection ProHance NDC 0270-1111-03 Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++ Gibco 14025-092 Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex Complement Technology, Inc A122 Used to generate RBC Evs
Human C7 protein Complement Technology, Inc A124 Used to generate RBC Evs
Human C8 protein Complement Technology, Inc A125 Used to generate RBC Evs
Human C9 protein Complement Technology, Inc A126 Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar Thorlabs MSR2 Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E1769-10G (EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control R&D Systems AB-105-C Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) Boston Bioproducts BM-220 Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20) Sigma Aldrich P7949-500ML Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer Bangs Laboratories PC06004 Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody Invitrogen PA5-112694 Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope Olympus Provis AX-70 Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet Thorlabs RDF1 Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing VitroTubes 8100-050 Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS Thermoscientific 24510 Used in antibody coupling reaction
Translational Stage Thorlabs PT1 Used for focusing and for scanning capillary tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
  2. Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
  3. Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
  4. Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
  5. Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
  6. Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
  7. Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
  8. Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
  9. Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
  10. Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
  11. Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
  12. Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
  13. Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
  14. Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
  15. Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
  16. Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
  17. Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
  18. Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
  19. Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
  20. Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
  21. Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
  22. Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
  23. Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
  24. Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
  25. Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
  26. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  27. Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
  28. Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
  29. Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).

Tags

ביולוגיה גיליון 171 ריחוף מגנטי צפיפות תאים קומפלקס חרוזים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thompson, L., Pinckney, B., Lu, S.,… More

Thompson, L., Pinckney, B., Lu, S., Gregory, M., Tigges, J., Ghiran, I. Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation. J. Vis. Exp. (171), e62550, doi:10.3791/62550 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter