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Biology

चुंबकीय उत्तोलन का उपयोग करके सेलुलर घनत्व और एंटीजेनिक गुणों का मात्राकरण

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/62550
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2
1Nano Flow Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Allergy and Inflammation, Beth Israel Deaconess Medical Center

Summary

यह पत्र एक चुंबकीय उत्तोलन-आधारित विधि का वर्णन करता है जो विशेष रूप से निश्चित घनत्व के साथ कैप्चर मोतियों की उत्तोलन ऊंचाई में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करके, घुलनशील या झिल्ली से बंधे एंटीजन की उपस्थिति का पता लगा सकता है।

Abstract

वर्णित विधि चुंबकीय उत्तोलन के सिद्धांतों के आधार पर विकसित की गई थी, जो कोशिकाओं और कणों को उनके घनत्व और चुंबकीय गुणों के आधार पर अलग करती है। घनत्व एक सेल प्रकार है जो संपत्ति की पहचान करता है, जो सीधे इसकी मेटाबॉलिक दर, भेदभाव और सक्रियण स्थिति से संबंधित है। चुंबकीय उत्तोलन सफलतापूर्वक अलग करने के लिए एक कदम दृष्टिकोण की अनुमति देता है, छवि और परिसंचारी रक्त कोशिकाओं की विशेषता है, और एनीमिया, सिकल सेल रोग का पता लगाने के लिए, और घनत्व और चुंबकीय गुणों के आधार पर ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी । यह दृष्टिकोण क्रमशः कैप्चर और डिटेक्शन एंटीबॉडी के साथ लेपित कम और उच्च घनत्व वाले मोतियों के सेट का उपयोग करके समाधान में मौजूद घुलनशील एंटीजन का पता लगाने के लिए भी उत्तरदायी है। यदि एंटीजन समाधान में मौजूद है, तो यह मोतियों के दो सेटों को पाटदेगा, एक नया मनका-मनका परिसर उत्पन्न करेगा, जो एंटीबॉडी-लेपित मोतियों की पंक्तियों के बीच में उड़ जाएगा। समाधान में लक्ष्य एंटीजन की बढ़ी हुई एकाग्रता एंटीजन की कम सांद्रता की तुलना में बड़ी संख्या में मनका-मनका परिसरों को उत्पन्न करेगी, इस प्रकार लक्ष्य एंटीजन के मात्रात्मक मापन की अनुमति देगी। चुंबकीय उत्तोलन अपने कम नमूना तैयारी समय और शास्त्रीय readout तरीकों पर निर्भरता की कमी के कारण अन्य तरीकों के लिए लाभप्रद है। उत्पादित छवि को आसानी से एक मानक माइक्रोस्कोप या मोबाइल डिवाइस, जैसे स्मार्टफोन या टैबलेट का उपयोग करके कैप्चर और विश्लेषण किया जाता है।

Introduction

चुंबकीय उत्तोलन एक तकनीक है जो सेल प्रकार1, 2, 3,प्रोटीन4,5और ओपिओइड 6 को अलग, विश्लेषण और पहचानने के लिए विकसित की गई है जो पूरीतरह से उनके विशिष्ट घनत्व और पैरामैग्नेटिक गुणों पर आधारित है। कोशिका घनत्व प्रत्येक कोशिका प्रकार की एक अनूठी, आंतरिक संपत्ति है जो सीधे तौर पर इसकीमेटाबॉलिक दर और भेदभाव की स्थिति7, 8,9,10,11,12,13,14से संबंधित है । स्थिर राज्य की स्थितियों के दौरान सेल घनत्व में सूक्ष्म और क्षणिक परिवर्तनों की मात्रा, और विभिन्न प्रकार की कोशिका प्रक्रियाओं के दौरान, सेल फिजियोलॉजी और रोगविज्ञान में एक बेजोड़ अंतर्दृष्टि का खर्च उठा सकता है। कोशिका घनत्व में परिवर्तन कोशिका विभेदन15,16,कोशिका चक्रप्रगति9,17, 18,19,एपोप्टोसिस20, 21,22,23,और घातक परिवर्तन24,25, 26से जुड़ेहुए हैं। . इसलिए, कोशिका घनत्व में विशिष्ट परिवर्तनों की मात्रा का उपयोग विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच अंतर करने के साथ-साथ विभिन्न सक्रियण प्रक्रियाओं से गुजरने वाली कोशिकाओं के समान प्रकार के बीच भेदभाव करने के लिए किया जा सकता है। यह उन प्रयोगों को सक्षम बनाता है जो एक विशेष कोशिका उप-आबादी को लक्षित करते हैं, जहां घनत्व में गतिशील परिवर्तन परिवर्तित सेल मेटाबोलिज्म27के संकेतक के रूप में कार्य करता है। जैसा कि यह स्थापित किया गया है कि एक कोशिका बदलते वातावरण के जवाब में अपने घनत्व को बदल सकती है, इसे पूरी तरह से समझने के लिएइसकेघनत्व के संबंध में कोशिका की गतिज को मापना अनिवार्य है, जो वर्तमान तरीके12प्रदान नहीं कर सकते हैं। दूसरी ओर चुंबकीय उत्तोलन, कोशिकाओं और उनके गुणों के गतिशील मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है28।

कोशिकाएं डायमैग्नेटिक हैं जिसका अर्थ है कि उनके पास स्थायी चुंबकीय डाइपोल पल नहीं है। हालांकि, जब एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में, एक कमजोर चुंबकीय डाइपोल पल कोशिकाओं में उत्पन्न होता है, लागू क्षेत्र की विपरीत दिशा में। इस प्रकार, यदि कोशिकाओं को एक पैरामैग्नेटिक समाधान में निलंबित कर दिया जाता है और एक मजबूत ऊर्ध्वाधर चुंबकीय क्षेत्र के संपर्क में आता है, तो वे चुंबकीय स्रोत से दूर हो जाएंगे और ऊंचाई तक रुक जाएंगे, जो मुख्य रूप से उनके व्यक्तिगत घनत्व पर निर्भर करता है। एक असंगत चुंबकीय क्षेत्र के ंयूनतम तक ही सीमित एक वस्तु का मंद चुम्बकीय उत्तोलन संभव है जब दो निम्नलिखित मानदंडों को पूरा कर रहे हैं: 1) कण की चुंबकीय संवेदनशीलता आसपास के माध्यम की तुलना में छोटा होना चाहिए, और 2) चुंबकीय बल कण के उछाल बल को संतुलित करने के लिए काफी मजबूत होना चाहिए । दोनों मानदंडों को चुंबकीय बफर में आरबीसी को निलंबित करके और छोटे, सस्ती, वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध स्थायी मैग्नेट1के साथ मजबूत चुंबकीय क्षेत्र ढाल बनाकर पूरा किया जा सकता है। गुरुत्वाकर्षण की दिशा में धुरी पर चुंबकीय रूप से फंसे कण की संतुलन की स्थिति इसके घनत्व (बफर के घनत्व के सापेक्ष), इसकी चुंबकीय संवेदनशीलता (बफर की चुंबकीय संवेदनशीलता के सापेक्ष) और एक लागू चुंबकीय क्षेत्र के हस्ताक्षर से निर्धारित होती है। चूंकि समाधान के घनत्व और चुंबकीय गुण पूरे सिस्टम में स्थिर हैं, कोशिकाओं के आंतरिक घनत्व गुण कोशिकाओं की उत्तोलन ऊंचाई का निर्धारण करने वाले प्रमुख कारक होंगे, जिसमें डेंजर कोशिकाएं कम घने कोशिकाओं की तुलना में कम उड़ती हैं। यह दृष्टिकोण दो घनत्व संदर्भ मोतियों (1.05 और 1.2 ग्राम/एमएल) के एक सेट का उपयोग करता है जो हमें घनत्व मापन के लिए सटीक, अनुपातमेषिक विश्लेषण का उपयोग करने की अनुमति देता है। चुंबकीय समाधान की एकाग्रता में फेरबदल एक विभिन्न सेलुलर आबादी को अलग करने की अनुमति देता है, जैसे WBCs से आरबीसी, परिसंचारी कोशिकाओं का घनत्व सेल विशिष्ट है, अलगाव प्रोटोकॉल या अन्य सेल हेरफेर की आवश्यकता को हटा रहा है।

जीव विज्ञान अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश पहचान विधियों विशिष्ट बाध्यकारी घटनाओं के बहिष्करण पर निर्भर करते हैं ताकि रैखिक संकेतों की मात्रा आसान हो सके। ये रीडआउट विधियां अक्सर जटिल होती हैं और इसमें विशेष उपकरण और समर्पित वैज्ञानिक कर्मी शामिल होते हैं। कोशिकाओं या बाहुलर वेसिकल्स की प्लाज्मा झिल्ली पर या जो प्लाज्मा में घुलनशील हैं, या तो एक या दो एंटीबॉडी लेपित मोतियों का उपयोग करके, यहां वर्णित है, एंटीजन का पता लगाने के उद्देश्य से एक दृष्टिकोण। मोती एक दूसरे से और पूछताछ लक्ष्यों के उन लोगों से अलग घनत्व के होना चाहिए । किसी भी बायोफ्लुइड में लक्ष्य एंटीजन की उपस्थिति को एंटीजन-पॉजिटिव सेल की उत्तोलन ऊंचाई में एक विशिष्ट, मापने योग्य परिवर्तन में अनुवादित किया जाता है जो एक डिटेक्शन मनका से बंधा होता है। घुलनशील एंटीजन या बाहुलर वेसिकल्स के मामले में, वे मनका-सेल परिसर के बजाय मनका-मनका परिसर बनाने, कैप्चर और डिटेक्शन मोतियों दोनों से बंधे होते हैं। उत्तोलन ऊंचाई में परिवर्तन मनका-कोशिका या मनका-मनका परिसरों के नए घनत्व पर निर्भर करता है। परिसरों की उत्तोलन ऊंचाई में परिवर्तन के अलावा, जो बायोफ्लुइड में एंटीजन की उपस्थिति को इंगित करता है, परिसरों की संख्या भी लक्ष्य की मात्रा पर निर्भर है, जिससे चुंबकीय उत्तोलन भी एंटीजन डिटेक्शन24के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण बन गया है।

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Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए जाने वाले प्रायोगिक प्रोटोकॉल को बेथ इजराइल डेकोनेस मेडिकल सेंटर इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) ने मंजूरी दी थी ।

1. इंस्ट्रूमेंट सेटअप

नोट: इमेजिंग उड़ती कोशिकाओं को एक चुंबकीय क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए एक दूसरे का सामना कर रहे एक ही ध्रुव के साथ रखा जाने वाले जेड-अक्ष पर चुंबकीय दो दुर्लभ पृथ्वी नियोडिमियम मैग्नेट की आवश्यकता होती है। मैग्नेट के बीच की दूरी को चुंबकीय क्षेत्र की तीव्रता और लक्ष्यों के घनत्व के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। इस मामले में मैग्नेट को 50 मिमी लंबी 1x1 मिमी चुकता ग्लास केशिका ट्यूब के सम्मिलन के लिए पर्याप्त 1 मिमी जगह से अलग किया जाता है। डिवाइस एक ऑटोकैड डिजाइन का उपयोग करके 3-डी मुद्रित किया गया था, जो अनुरोध पर उपलब्ध है।

  1. इसके पक्ष में माइक्रोस्कोप रखना, पूरी तरह से क्षैतिज।
    नोट: एक मानक ईमानदार स्थिति में रखा एक माइक्रोस्कोप सीधे कंडेनसर और उद्देश्य के संबंध में मैग्नेट की स्थिति के कारण उड़ती वस्तुओं इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है । इस सीमा को माइक्रोस्कोप को अपनी तरफ रखकर दरकिनार किया जा सकता है, पूरी तरह से क्षैतिज रूप से कंडेनसर को केशिका में प्रकाश को केंद्रित करने की अनुमति देता है, और उद्देश्य लेंस को कोहलर रोशनी आवश्यकताओं को बनाए रखते हुए मैग्नेट के बीच में उड़ती कोशिका को छवि देने के लिए।
  2. 2 या 3 लैब जैक का उपयोग करके ब्रेडबोर्ड टेबल पर स्टैंड का समर्थन और स्तर दें।
  3. कंपन को सीमित करने के लिए, रबर गीला पैर के साथ ब्रेडबोर्ड टेबल का समर्थन करें।
  4. चरण को हटा दें और उत्तोलन डिवाइस(वाई-एक्सिस)और दो एकल-अक्ष अनुवाद चरणों की ऊंचाई को समायोजित करने के लिए इसे एक कॉम्पैक्ट लैब जैक के साथ बदलें; एक फोकस(जेड-एक्सिस)को समायोजित करने के लिए, और दूसरा केशिका ट्यूब को स्कैन करने के लिए।
  5. दो मिनी-सीरीज ऑप्टिकल पोस्ट का उपयोग करके प्रयोगशाला जैक में चुंबकीय उत्तोलन डिवाइस संलग्न करें।

2. एंटीबॉडी का बंधन कार्बक्सी-माइक्रोकणों/मोतियों के लिए (पॉलीअन द्वारा एक प्रोटोकॉल से संशोधित)

नोट: केवल कम घनत्व वाले मोतियों (१.०५ ग्राम/एमएल) को आरएच (+) का पता लगाने के लिए लेपित करने की आवश्यकता होती है, लेकिन बाह्य और कम घनत्व वाले मोतियों दोनों को बाह्य अनुक्रमिक वेसिकल्स का पता लगाने के लिए लेपित किया जाता है ।

  1. मनका निलंबन के 1 मिलीग्राम समकक्ष बाहर ले लो और एक्टिवेशन बफर के 0.5 मिलीग्राम में जोड़ें (50 mM एमईएस (MW195.2, 1 मिलीएल में 9.72 मिलीग्राम)) पीएच 5.0 और 0.001% पॉलीसोरबेट-20)।
  2. बर्फ-ठंडे पानी में 1.5 एम ईडीसी (एमडब्ल्यू 191.7, 0.28755 ग्राम) और 0.3 एम सल्फो-एनएचएस (मेगावाट 217.14, 0.0651 ग्राम में 1 एमएलए) के 12 माइक्रोन जोड़ें।
  3. एक कक्षीय शेखर पर ट्यूब रखें और मोतियों पर कार्बोक्सिल समूहों को सक्रिय करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सख्ती से हिलाएं।
  4. 1 घंटे के बाद कपलिंग बफर (10x पीबीएस, या 0.1 एम फॉस्फेट पीएच 7-9) के 0.5 एमएल जोड़कर सक्रियण बंद करें।
  5. 10 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा मोतियों को गोली मारें, या, यदि मोतियों को गोली नहीं दी जा सकती है, तो 0.45 माइक्रोन सेंट्रलाइज ट्यूब फिल्टर का उपयोग करें। सुपरनेट या प्रवाह के माध्यम से आकांक्षी।
  6. 10x पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ मोतियों को 3 बार चरण 2.5 के रूप में धोएं।
  7. प्रति मिलीग्राम मोतियों के 25 माइक्रोन की गणना करें और 10X पीबीएस में 0.7-1.0 मिलीग्राम/एमएल अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए सक्रिय मोतियों के साथ वांछित एंटीबॉडी मिलाएं।
  8. कम गति पर सेट ट्यूब रॉकर पर ट्यूब रखें। कपलिंग के लिए रात भर कमरे के तापमान पर धीरे-धीरे ट्यूब रोल करें।
  9. चरण 2.5 दोहराएं और 10x पीबीएस के 1 एमसीएल के साथ मोतियों को दो बार धोएं।
  10. बफर पीएच 8.0 में 1 मीटर इथेनॉलमाइन (98% स्टॉक = 16.2 एम) के 0.5 मिलीलन के साथ 0.02% पॉलीसोरबेट-20 के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए धोएं जबकि धीरे-धीरे मिलाते हुए।
  11. चरण 2.5 दोहराएं और डीपीबीएस के 1 एमएल में एक बार मोतियों को धोएं। मोतियों को आवश्यकता होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर डीपीबीएस के 200 माइक्रोन में संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

3. आरएच (+) का पता लगाने के लिए रक्त का संग्रह और तैयारी

  1. एक क्लिक लांसिंग डिवाइस का उपयोग करके, एक आरएच (+) दाता की उंगली को चुभन और डीपीबीएस के 1 एमएल में 10 माइक्रोन रक्त एकत्र करें।
  2. एक फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली दाग के साथ आरएच + कोशिकाओं को दाग। वैकल्पिक रूप से, आरएच + कोशिकाओं (1:1000 कमजोर पड़ने) के 1 एमएल निलंबन में फ्लोरोसेंट डाई का 1 माइक्रोल जोड़ें।
  3. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लोरोसेंट डाई के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. 15 एस के लिए 5,600 x ग्राम पर कताई करके कोशिकाओं को गोली मारें और डीपीबीएस के 1 एमएल का उपयोग करके 3 बार धोएं। कैल्शियम और मैग्नीशियम (एचबीएसएस ++) के साथ एचबीबीएस के 1 एमसीएल में पुनर्सुस्ल व्यय करें।
  5. एक क्लिक लांसिंग डिवाइस का उपयोग करके, एक आरएच (-) दाता की उंगली को चुभन और रक्त के 2 μL इकट्ठा ।
    नोट: यदि 2 से अधिक शर्तों की तैयारी कर रहे हैं, तो प्रत्येक ट्यूब में आरएच (-) रक्त के 1 माइक्रोन को जोड़ने के लिए पर्याप्त रक्त एकत्र करें।
  6. आवश्यक प्रयोगात्मक ट्यूब तैयार करें: अकेले मोती, आईजीजी नियंत्रण, नमूना।
    1. अकेले मोती: एचबीएसएस + +, आईजीजी नियंत्रण मोतियों के 1 माइक्रोन, उच्च घनत्व वाले मोतियों के 1 माइक्रोन (1.2 ग्राम/एमएल) और 500 m M Gd3 + (60 mM) के 24 माइक्रोन जोड़ें।
    2. आईजीजी नियंत्रण: एचबीएसएस ++, आईजीजी नियंत्रण मोतियों के 1 माइक्रोन, उच्च घनत्व वाले मोतियों के 1 माइक्रोन, आरएच-रक्त के 1 माइक्रोन, सना हुआ आरएच + रक्त निलंबन का 1 माइक्रोन, और 500 मिलियन जीडी3 +के 24 माइक्रोन जोड़ें।
    3. नमूना ट्यूब एचबीएसएस ++, एंटी-आरएचडी कोटेड मोतियों का 1 माइक्रोन, उच्च घनत्व वाले मोतियों का 1 माइक्रोन, आरएच-रक्त का 1 माइक्रोन, सना हुआ आरएच (+) रक्त निलंबन का 1 माइक्रोन और 500 एमएम जीडी3 +का 24 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: उच्च घनत्व मोती संदर्भ के लिए आरएच नमूनों में जोड़े जाते हैं ।

4. सेल जुदाई प्रदर्शन के लिए PMNs का अलगाव

  1. न्यूट्रोफिल का अलगाव
    1. 60 मिली सी सिरिंज में 40 एमएल शिरिंज में ड्रा करें जिसमें सोडियम साइट्रेट/साइट्रिक एसिड (0.15 एम, पीएच 5.5) और 6% डेक्सट्रान-70 का 14 एमएल होता है।
    2. खून से तलछट के लिए 50 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. धीरे-धीरे रक्त संग्रह ट्यूबिंग के माध्यम से शीर्ष 18 एमएल को 50 एमएल ट्यूब में धकेलकर फिकोल-पैक के 20 एमएल के शीर्ष पर बफी कोट कोशिकाओं को परत करें, तलछट आरबीसी के साथ संदूषण से बचें। मूल रक्त संग्रह ट्यूब में छोड़े गए अवशिष्ट आरबीसी के साथ संदूषण को कम करने के लिए, एक ताजा रक्त संग्रह सेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    4. 3,000 x ग्रामपर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा बफी कोट कोशिकाओं को गोली मार दें। न्यूट्रोफिल और दूषित आरबीसी ट्यूब के तल पर गोली होगा । पीबीएमसी फिकोल-पैक के शीर्ष पर एक सफेद परत बनाएगा।
    5. न्यूट्रोफिल को एक नई 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. Lyse किसी भी अवशिष्ट RBCs 25 सेकंड के लिए 0.2% ठंडे NaCl समाधान के 20 मिलीएल के साथ न्यूट्रोफिल इनक्यूबेटिंग द्वारा, 1.6% NaCl के एक अतिरिक्त 20 मिलीएल के बाद। एनएसीएल का अंतिम संगीत कार्यक्रम 09% (आइसोटोनिक) होना चाहिए।
    7. 3,000 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र।
    8. सुपरनेट निकालें और न्यूट्रोफिल को वांछित एकाग्रता तक फिर से रीसस्ट करें।
  2. लिम्फोसाइट्स का अलगाव
    1. 6-अच्छी संस्कृति प्लेटों में 5% गर्मी निष्क्रिय सीरम के साथ आरपीएमआई में पीबीएमसी प्लेट करें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। मोनोसाइट्स प्लेट का पालन करेंगे, लिम्फोसाइट्स स्वतंत्र रूप से तैर रहे होंगे।
    3. लिम्फोसाइट्स युक्त बफर को हटा दें और इसे आरपीएमआई के साथ दो बार धोएं।
    4. वांछित एकाग्रता पर लिम्फोसाइट्स को फिर से रखें।
  3. लेबल आरबीसी, पीएमएन, और लिम्फोसाइट्स।
    1. प्रत्येक कोशिका प्रकार को एक अलग फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक डाई फ्लोरेस्क एक अलग चैनल में फ्लोरेसेस। प्रत्येक चुने हुए रंगों के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

5. पूरक सक्रियण के माध्यम से आरबीसी एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स का उत्पादन

  1. EDTA ट्यूबों का उपयोग कर venipuncture के माध्यम से पूरे रक्त प्राप्त करें।
  2. एक सफेद रक्त कोशिका फिल्टर के माध्यम से रक्त पास, और फिर 10 मिनट प्रत्येक के लिए 500 x ग्राम पर 3 बार अपकेंद्रित्र लाल रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए। वॉशिंग बफर के रूप में एचबीएसएस ++ का उपयोग करें।
  3. 1.5 एमएल ट्यूबों में 100 माइक्रोन पैक आरबीसी के एलिकोट बनाएं और एचबीएसएस + + जोड़कर वॉल्यूम को 1 मिलील तक बनाएं।
  4. C5b, 6 में एक 0.18 μg/mL अंतिम एकाग्रता HBSS ++, और फिर भंवर जोड़ें ।
  5. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक धीमी गति से शेखर पर रखो ।
  6. 0.2 μg/mL की अंतिम एकाग्रता में C7 प्रोटीन जोड़ें। ट्यूब को धीरे-धीरे कई बार उलटा करके मिलाएं। आगे इस बिंदु से भंवर न करें।
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कम गति से सेट ट्यूब शेखर पर ट्यूब रखें।
  8. 0.2 μg/mL की अंतिम एकाग्रता में C8 प्रोटीन जोड़ें, और C9 प्रोटीन 0.45 μg/mL करने के लिए। ट्यूबों को धीरे-धीरे कई बार उलटा करके मिलाएं।
  9. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  10. 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
  11. एक नई ट्यूब (एस) में ईवी युक्त सुपरनेटेंट लीजिए। सेल पैलेट के बहुत करीब सुपरनेट को न हटाएं।

6. चुंबकीय उत्तोलन डिवाइस पर कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. निर्माता निर्देशों के अनुसार इंस्ट्रूमेंट स्टार्टअप करें।
  2. ट्यूब भर जाने तक एक केशिका ट्यूब में नमूने के 50 μL लोड करें। केशिका सीलेंट के साथ केशिका ट्यूब के सिरों को सील करें जो सुनिश्चित करें कि कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
  3. ऊपर और नीचे मैग्नेट के बीच धारक में केशिका ट्यूब लोड करें। मंच को समायोजित करें और इष्टतम देखने के लिए ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: कोशिकाएं/मोती उनके घनत्व और जीडी 3 + की एकाग्रता के आधार पर अपने चुंबकीय संतुलन की स्थिति तक पहुंचने के लिए5-20मिनट से कहीं भी ले जा सकते हैं । जीडी3 +की एकाग्रता जितनी अधिक होगी, समय उतना ही कम होगा।

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Representative Results

चुंबकीय उत्तोलन वस्तु के घनत्व, इसके चुंबकीय हस्ताक्षर, पैरामैग्नेटिक समाधान की एकाग्रता, और दो मजबूत, दुर्लभ-पृथ्वी मैग्नेट द्वारा बनाए गए चुंबकीय क्षेत्र की ताकत के आधार पर विभिन्न उत्तोलन ऊंचाइयों पर विभिन्न घनत्व की वस्तुओं को केंद्रित करता है। चूंकि दो मैग्नेट एक दूसरे के ऊपर रखे जाते हैं, इसलिए कोहलर रोशनी को बनाए रखते हुए, माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, इसके पक्ष में(चित्र 1)का उपयोग करके, उड़ते हुए नमूनों को केवल देखा जा सकता है। प्रत्येक कोशिका प्रकार द्वारा पहुंच गई अंतिम उत्तोलन ऊंचाई को आसानी से पैरामैग्नेटिक समाधान की एकाग्रता को बदलकर संशोधित किया जा सकता है। चित्रा 2 गाडोलिनियम की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके विभिन्न परिसंचारी रक्त कोशिकाओं के पृथक्करण को दर्शाता है। विभिन्न घनत्व (1.05 और 1.2 ग्राम/एमएल) के साथ दो मनका प्रकार का उपयोग घनत्व उत्तोलन ऊंचाइयों और आकार संदर्भ प्रदान करने के लिए किया जाता था। चूंकि किसी दिए गए कोशिका प्रकार की उत्तोलन ऊंचाई इसके आंतरिक घनत्व पर निर्भर करती है, चुंबकीय उत्तोलन बिना किसी महत्वपूर्ण हेरफेरकेब्याज की कोशिकाओं को अलग-थलग करने का प्रत्यक्ष साधन प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य झिल्ली बाध्य एंटीजन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए चुंबकीय उत्तोलन की क्षमता को प्रदर्शित करना था, इस मामले में आरएच कारक, लाल रक्त कोशिकाओं को प्रसारित करने पर। इस प्रयोग के लिए, कम घनत्व वाले मोतियों को या तो आईजीजी नियंत्रण एंटीबॉडी या एंटी-आरएचडी के साथ लेपित किया गया था। इसके बाद 1:1000 के अनुपात में आरएच (+) से रक्त के साथ आरएच (-) डोनर से रक्त की स्पाइकिंग करके नमूने तैयार किए गए । एंटी-आरएचडी (+) लेपित मोती या नियंत्रण आईजीजी लेपित मोतियों को रक्त नमूने में जोड़ा गया और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटेड किया गया। चित्रा 3A आईजीजी नियंत्रण नमूना दिखाता है, जिसने किसी भी मनका-लाल रक्त कोशिका परिसरों को उत्पन्न नहीं किया। इसके बाद, आरएच (+)) सकारात्मक मोतियों द्वारा कैप्चर की गई लाल रक्त कोशिकाओं की पहचान को फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली दाग के साथ आरएच (+) कोशिकाओं को पूर्व-धुंधला करके सत्यापित किया गया था, और फिर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3 बी)का उपयोग करके चित्रित किया गया था। एक सकारात्मक पता लगाने की घटना चित्रा 3Cमें दिखाया गया है । आरएच (+) कोशिकाओं के लिए एंटी-आरएच-मनका का बंधन मोतियों और कोशिका के बीच में घनत्व के साथ एक मनका-सेल परिसर बनाता है, इसलिए अनबाउंड कैप्चर मोतियों और नकारात्मक आरबीसी के बीच स्थित ऊंचाई पर उड़ता है। एक फ्लोरोसेंट प्लाज्मा झिल्ली दाग के साथ लेबल आरएच (+) कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए मनका-सेल परिसरों के एक बंद को फ्लोरोसेंट प्रकाश के तहत चित्रित किया गया था। (चित्रा 3 डी)। चित्रा 3E CR1 और CD47 के लिए एंटीबॉडी के साथ लेपित उच्च और कम घनत्व वाले मोतियों के बीच बनाने वाले मनका-मनका परिसरों को दिखाता है, जो बाह्राश वेसिकल्स की उपस्थिति का संकेत देते हैं। मनका-सेल परिसर का एक योजनाबद्ध चित्रा 3Fमें दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1। चुंबकीय उत्तोलन के सिद्धांत: (क)चुंबकीय क्षेत्र की योजनाबद्धताएं। (ख)एक अनुसंधान ग्रेड माइक्रोस्कोप अपने पक्ष पर इत्तला दे दी पक्ष की अनुमति के लिए केशिका ट्यूब में उड़ रहे लक्ष्यों इमेजिंग । (ग)माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत चुंबकीय उत्तोलन तंत्र का कोणीय दृश्य। (घ)चुंबकीय उत्तोलन उपकरण ललाट दृश्य। (ई)दो मैग्नेट, सामने और साइड व्यू के बीच घुड़सवार एक केशिका ट्यूब के साथ चुंबकीय उत्तोलन तंत्र की योजनाबद्धता । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। सेल-विशिष्ट घनत्व संतुलन का प्रदर्शन: (ए)कम और उच्च घनत्व वाले मोती (1.05 और 1.2 ग्राम/एमएल) अकेले 60 mM Gd3 + (10x उद्देश्य पर देखा) पर। (ख)पीएमएन 21 m Gd3 +पर लाल रक्त कोशिकाओं से ऊपर उड़ती, ध्यान प्लेटलेट्स परिसंचारी से बाहर के साथ (एक 10x उद्देश्य पर देखा) । (ग)60 m M Gd3 +पर पूरे रक्त उड़ता है, जो एक एकाग्रता है कि RBCs पर केंद्रित है (एक 10x उद्देश्य पर देखा) । (घ)इस आंकड़े को [तासोग्लू, एस एट अल से संशोधित किया गया है । शंख संकल्प के साथ लेविटेशनल इमेज साइटोमेट्री। उन्नत सामग्री। 27 (26), 3901-3908, डोई:10.1002/adma.201405660 (2015.] 40 m M Gd3 +पर आरबीसी (लाल), पीएमएन (ग्रीन) और लिम्फोसाइट्स (नीला) का घनत्व पृथक्करण। प्रत्येक कोशिका आबादी अपने आंतरिक घनत्व के आधार पर ऊंचाई पर उड़ती है (10x उद्देश्य पर देखी जाती है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 3
चित्रा 3। रक्त नमूने में आरएच फैक्टर का पता लगाना: (ए)आरएच (-) रक्त के साथ नुकीला रक्त (+) रक्त और आईजीजी नियंत्रण मोती। कोई मनका-सेल परिसर नहीं बनते हैं (10x उद्देश्य पर देखा जाता है)। (ख)फ्लोरोसेंट लाइट के तहत आईजीजी कंट्रोल सैंपल आरएच (+) कोशिकाओं को हाइलाइट करता है (10x उद्देश्य पर देखा जाता है)। (ग)आरएच (+) रक्त (+) रक्त और एंटी-आरएचडी लेपित मोतियों के साथ नुकीला, मनका-सेल परिसरों के गठन को दिखाता है (10x उद्देश्य पर देखा जाता है)। (घ)फ्लोरोसेंट लाइट के तहत मनका-सेल परिसर का एक क्लोज-अप दृश्य (10x उद्देश्य पर देखा गया)। (ई)एंटी-सीआर1 और एंटी-सीडी 47 लेपित मोती कॉम्प्लेक्स बनाते हैं, जो आरबीसी व्युत्पन्न एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स (10x उद्देश्य पर देखे गए) की उपस्थिति का संकेत देते हैं। (च)मनका-सेल परिसर को दर्शाते हुए आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ढाल अपकेंद्रित्र वर्तमान में उनके अद्वितीय घनत्व के आधार पर उपकोशिकीय घटकों को अलग करने के लिए मानक तकनीक है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए विशेष ढाल वाले मीडिया के साथ-साथ अपकेंद्रित्र उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत चुंबकीय उत्तोलन दृष्टिकोण परिसंचारी कोशिकाओं के रूपात्मक और कार्यात्मक गुणों की विस्तृत जांच की अनुमति देता है, न्यूनतम के साथ, यदि कोशिकाओं में कोई हेरफेर, परिसंचारी कोशिकाओं के लिए वीवो पहुंच में निकट प्रदान करता है।

हालांकि, चुंबकीय उत्तोलन का उपयोग करते समय कई बिंदुओं का उल्लेख करने लायक हैं। सबसे पहले, इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला माइक्रोस्कोप इस विधि को समर्पित होना चाहिए, क्योंकि सेटअप समय लेने वाला है, और माइक्रोस्कोप को आंशिक रूप से अलग करने की आवश्यकता होती है, जो मैग्नेट और केशिका ट्यूब के साथ ठीक से गठबंधन प्रकाशिकी के साथ पूरी तरह से क्षैतिज रूप से तैनात है। दूसरे, प्रयोगशाला जैक और अनुवाद चरणों केशिका ग्लास के आंदोलनों को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया और ध्यान तीन कुल्हाड़ियों में से प्रत्येक पर सटीक स्थिति और मुक्त आंदोलन की आवश्यकता है । पूरे सेटअप के सबसे महत्वपूर्ण संरेखण की संभावना है, ट्रांसलेशनल चरणों में चुंबकीय उत्तोलन डिवाइस बढ़ रहा है जैसे कि ऊपर और नीचे मैग्नेट पूरी तरह से गुरुत्वाकर्षण वेक्टर के साथ-साथ पूरी तरह से क्षैतिज हैं। इन आवश्यकताओं से कोई भी विचलन चुंबकीय बल और गुरुत्वाकर्षण के बीच एक कोण बनाएगा जो कोशिकाओं को केशिका ट्यूब के दोनों ओर धकेल देगा, उत्तोलन प्रक्रिया को बाधित करेगा, और परिणामों को अविश्वसनीय बना देगा।

उड़ती कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले गैडोलिनियम समाधान की इष्टतम एकाग्रता को कोशिका प्रकार और प्रयोग के लक्ष्य के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है। गैडोलिनियम समाधान की एकाग्रता में परिवर्तन कोशिकाओं की उत्तोलन ऊंचाई का विश्लेषण करने में काफी बदलाव करेगा, और इसलिए प्रयोगों के एक सेट से दूसरे में स्थिर रखने की आवश्यकता है। यदि एकाग्रता बहुत कम है, लक्ष्य कोशिकाओं के घनत्व के आधार पर, वे बिल्कुल उड़ जाना नहीं हो सकता है, जबकि अगर यह बहुत अधिक है, तो पता लगाने योग्य परिवर्तनों की सीमा को सीमित करेगा जिसे सटीक मात्रात्मक किया जा सकता है।

उड़ती संरचनाएं स्थिर बैंड बनाएगी यदि उन पर कार्य करने वाली एकमात्र ताकतें गुरुत्वाकर्षण और चुंबकीय प्रतिकर्षण हैं। केशिका ट्यूब में एक मिलीमीटर आकार के बुलबुले की उपस्थिति हवा-तरल इंटरफ़ेस पर छोटे परिपत्र धाराएं बनाएगी, जो उड़ती कोशिकाओं को परेशान करेगी, जिससे कोई भी विश्लेषण लगभग असंभव हो जाएगा। एक केशिका ट्यूब में एक नमूना लोड करते समय, और फिर सील करने के बाद, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि स्टीरियोमाइक्रोस्कोप या कम शक्ति (4x) उद्देश्य के तहत केशिका की जांच करके कोई हवा मौजूद नहीं है।

एक निर्धारित ऊंचाई पर कोशिकाओं का उत्तोलन उनके चुंबकीय हस्ताक्षर समय के साथ ही रहने पर निर्भर करता है । यदि उत्तोलन मीडिया से पैरामैग्नेटिक गैडोलिनियम आयन कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं, या तो पिनोसाइटोसिस या बढ़ी हुई झिल्ली पारगम्यता के माध्यम से, जैसे एपोप्टोसिस के दौरान, घनत्व संदर्भ मोतियों के आधार पर मापा गया बढ़ा हुआ सेल घनत्व गलत होगा। सौभाग्य से, अधिकांश परिसंच कोशिकाओं में खराब पिनोसाइटिक क्षमताएं होती हैं26,इस विधि को लंबे समय तक कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण बनाते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक डॉ गीतालियो परेरा को एक्सट्रासेलुलर वेसिकल वर्क के साथ मदद के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।

इस काम को आईसीजी को निम्नलिखित राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था: RO1CA218500, UG3HL147353, और UG3TR002881।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma Aldrich M-2933 (MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness K&J Magnetics Custom Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal) Leica Microsystems 267620 Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) Sigma Aldrich CLS8163 Used to wash beads
Compact Lab Jack Thorlabs LJ750 Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-144 Solution for bead suspensions
Ethanolamine Sigma Aldrich E9508-100ML Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) Invitrogen C37608 Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection ProHance NDC 0270-1111-03 Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++ Gibco 14025-092 Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex Complement Technology, Inc A122 Used to generate RBC Evs
Human C7 protein Complement Technology, Inc A124 Used to generate RBC Evs
Human C8 protein Complement Technology, Inc A125 Used to generate RBC Evs
Human C9 protein Complement Technology, Inc A126 Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar Thorlabs MSR2 Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E1769-10G (EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control R&D Systems AB-105-C Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) Boston Bioproducts BM-220 Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20) Sigma Aldrich P7949-500ML Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer Bangs Laboratories PC06004 Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody Invitrogen PA5-112694 Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope Olympus Provis AX-70 Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet Thorlabs RDF1 Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing VitroTubes 8100-050 Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS Thermoscientific 24510 Used in antibody coupling reaction
Translational Stage Thorlabs PT1 Used for focusing and for scanning capillary tube

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जीव विज्ञान अंक 171 चुंबकीय उत्तोलन सेल घनत्व मनका-सेल कॉम्प्लेक्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी
चुंबकीय उत्तोलन का उपयोग करके सेलुलर घनत्व और एंटीजेनिक गुणों का मात्राकरण
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Thompson, L., Pinckney, B., Lu, S., Gregory, M., Tigges, J., Ghiran, I. Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation. J. Vis. Exp. (171), e62550, doi:10.3791/62550 (2021).

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