Summary
В этой статье описывается метод на основе магнитной левитации, который может специфически обнаруживать присутствие антигенов, растворимых или связанных с мембраной, путем количественной оценки изменений высоты левитации бусин захвата с фиксированной плотностью.
Abstract
Описанный метод был разработан на основе принципов магнитной левитации, которая разделяет клетки и частицы на основе их плотности и магнитных свойств. Плотность — это свойство, идентифицирующее тип клетки, напрямую связанное с ее скоростью метаболизма, дифференцировкой и статусом активации. Магнитная левитация позволяет использовать одношаговый подход к успешному разделению, визуализации и характеристике циркулирующих клеток крови, а также к обнаружению анемии, серповидно-клеточной анемии и циркулирующих опухолевых клеток на основе плотности и магнитных свойств. Этот подход также поддается обнаружению растворимых антигенов, присутствующих в растворе, с использованием наборов бусин низкой и высокой плотности, покрытых антителами захвата и обнаружения, соответственно. Если антиген присутствует в растворе, он соединит два набора бусин, создавая новый комплекс бусины-шарик, который будет левитировать между рядами бусин, покрытых антителами. Повышенная концентрация антигена-мишени в растворе будет генерировать большее количество комплексов бисера-шарик по сравнению с более низкими концентрациями антигена, что позволит проводить количественные измерения антигена-мишени. Магнитная левитация выгодна для других методов из-за сокращения времени подготовки образца и отсутствия зависимости от классических методов считывания. Сгенерированное изображение легко захватывается и анализируется с помощью стандартного микроскопа или мобильного устройства, такого как смартфон или планшет.
Introduction
Магнитная левитация - это метод, разработанный для разделения, анализа и идентификации типов клеток1,2,3,белков4,5 и опиоидов 6 наоснове исключительно их удельной плотности и парамагнитных свойств. Плотность клетокявляется уникальным, неотъемлемым свойством каждого типа клеток, непосредственно связанным с ее скоростью метаболизма и статусом дифференцировки7,8,9,10, 11,12,13,14. Количественная оценка тонких и преходящих изменений плотности клеток во время стационарных условий и во время различных клеточных процессов может позволить себе непревзойденное понимание физиологии и патофизиологии клеток. Изменения плотности клеток связаны с дифференцировкой клеток15,16,прогрессированием клеточного цикла9,17,18,19,апоптозом20,21,22,23и злокачественной трансформацией24,25,26 . Поэтому количественная оценка специфических изменений плотности клеток может быть использована для дифференциации клеток разных типов, а также для различения между клетками одного и того же типа, подвергающимися различным процессам активации. Это позволяет проводить эксперименты, нацеленные на конкретную клеточную субпуплощадию, где динамические изменения плотности служат индикатором измененного клеточного метаболизма27. Поскольку было установлено, что клетка может изменять свою плотность в ответ на изменение среды7,необходимо измерить кинетику клетки по отношению к ее плотности, чтобы полностью понять ее, что современные методы могут не обеспечить12. Магнитная левитация, с другой стороны, позволяет динамически оценить клетки и их свойства28.
Клетки являются диамагнитными, что означает, что они не имеют постоянного магнитного дипольного момента. Однако при воздействии внешнего магнитного поля в ячейках генерируется слабый магнитный дипольный момент, в направлении, противоположном приложенного поля. Таким образом, если ячейки суспендировать в парамагнитном растворе и подвергнуть воздействию сильного вертикального магнитного поля, они будут левитировать в сторону от магнитного источника и останавливаться на высоте, которая зависит в первую очередь от их индивидуальной плотности. Диамагнитная левитация объекта, ограниченного минимумом неоднородного магнитного поля, возможна при выполнении двух следующих критериев: 1) магнитная восприимчивость частицы должна быть меньше, чем у окружающей среды, и 2) магнитная сила должна быть достаточно сильной, чтобы уравновесить силу плавучести частицы. Оба критерия могут быть выполнены путем приостановки эритроцитов в магнитном буфере и путем создания сильных градиентов магнитного поля с небольшими, недорогими, коммерчески доступными постоянными магнитами1. Равновесное положение магнитно захваченной частицы на оси вдоль направления гравитации определяется ее плотностью (относительно плотности буфера), ее магнитной восприимчивостью (относительно магнитной восприимчивости буфера) и сигнатурой приложенного магнитного поля. Поскольку плотность и магнитные свойства раствора постоянны во всей системе, свойства внутренней плотности клеток будут основным фактором, определяющим высоту левитации клеток, причем более плотные клетки левитируют ниже по сравнению с менее плотными клетками. Этот подход использует набор из двух эталонных шариков плотности (1,05 и 1,2 г / мл), что позволяет нам использовать точный логометрический анализ для измерения плотности. Изменение концентрации магнитного раствора позволяет изолировать различные клеточные популяции, такие как эритроциты, от WBC, поскольку плотность циркулирующих клеток специфична для клеток, устраняя необходимость в протоколах изоляции или других клеточных манипуляциях.
Большинство методов обнаружения, используемых в биологических исследованиях, основаны на экстраполяции конкретных событий связывания в простые для количественной оценки линейные сигналы. Эти методы считывания часто являются сложными и включают специализированное оборудование и специализированный научный персонал. В настоящем описан подход, направленный на обнаружение антигенов, обнаруженных либо на плазматической мембране клеток или внеклеточных везикул, либо растворимых в плазме, с использованием одного или двух шариков, покрытых антителами. Бусины должны быть разной плотности друг от друга и от плотности опрашиваемых целей. Присутствие антигена-мишени в любой данной биожидкости переводится в специфическое, измеримое изменение высоты левитации антиген-положительной клетки, которая связана с обнаруженной шариком. В случае растворимых антигенов или внеклеточных везикул они связаны как с захватом, так и с обнаружением бусин, образуя комплекс бисера-шарик, а не комплекс бисероплетение-клетка. Изменение высоты левитации зависит от новой плотности комплексов бисероплетение или бисероплетение. Помимо изменения высоты левитации комплексов, что указывает на наличие антигена в биожидкости, количество комплексов также зависит от количества мишени, что делает магнитную левитацию также количественным подходом для обнаружения антигена24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальный протокол, используемый в этом исследовании, был одобрен Институциональным наблюдательным советом Медицинского центра диакониссы Бет Исраэль (IRB).
1. Настройка приборов
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация левитирующих клеток требует, чтобы два редкоземельных неодимовых магнита, намагниченные на оси Z, были размещены с тем же полюсом, обращенным друг к другу, для создания магнитного поля. Расстояние между магнитами может быть настроено в зависимости от интенсивности магнитного поля и плотности целей. В этом случае магниты разделены пространством 1 мм, достаточным для вставки стеклянной капиллярной трубки длиной 1x1 мм длиной 1x1 мм. Устройство было напечатано на 3 D принтере с использованием дизайна AutoCAD, который доступен по запросу.
- Положите микроскоп на бок, идеально горизонтальный.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп, помещенный в стандартное вертикальное положение, не подходит непосредственно для визуализации левитирующих объектов из-за положения магнитов по отношению к конденсатору и объективу. Это ограничение можно обойти, положив микроскоп на бок, идеально горизонтальный, что позволяет конденсатору фокусировать свет в капилляре, а объектив для изображения ячейки левитирует между магнитами, сохраняя при этом требования Кёлера к освещению. - Поддерживайте и выравнивать подставку на макетном столе с помощью 2 или 3 лабораторных разъемов.
- Чтобы ограничить вибрации, поддерживайте макетный стол резиновыми амортизирующими ножками.
- Снимите ступень и замените ее компактным лабораторным домкратом для регулировки высоты левитационного устройства(ось Y)и двумя одноосевыми трансляционными ступеней; один для регулировки фокуса(ось Z),а второй для сканирования капиллярной трубки.
- Прикрепите устройство магнитной левитации к лабораторному разъему с помощью двух оптических стоек мини-серии.
2. Связывание антител с карбокси-микрочастицами/шариками (изменено по протоколу PolyAn)
ПРИМЕЧАНИЕ: Только бусины низкой плотности (1,05 г/мл) должны быть покрыты для обнаружения rh(+), но для обнаружения внеклеточных везикул покрываются как бусины высокой, так и низкой плотности.
- Добавьте 1 мг эквивалента бисероплетения и добавьте в 0,5 мл буфера активации (50 мМ MES (MW195,2, 9,72 мг в 1 мл)) рН 5,0 и 0,001% полисорбата-20).
- Добавьте 12 мкл свежеприготовленных 1,5 М EDC (MW 191,7, 0,28755 г в 1 мл) и 12 мкл 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 г в 1 мл) в ледяную воду.
- Поместите трубки на орбитальный шейкер и энергично встряхивайте в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы активировать карбоксильные группы на шариках.
- Остановите активацию через 1 ч, добавив 0,5 мл буфера связи (10x PBS или 0,1 M фосфата pH 7-9).
- Гранулировать шарики центрифугированием при 20 000 х г в течение 10 мин или, если шарики не могут быть гранулированы, использовать центрифужный трубчатый фильтр 0,45 мкм. Аспирировать супернатант или проточной.
- Вымойте бусины 1 мл 10x PBS 3 раза, как на шаге 2.5.
- Рассчитайте 25 мкг антител на мг шариков и смешайте желаемое антитело с активированными шариками до конечной концентрации антител 0,7-1,0 мг/мл в 10X PBS.
- Поместите трубки на трубный коромысл, установленный на низкой скорости. Аккуратно прокатываем трубы при комнатной температуре в течение ночи для сцепки.
- Повторите шаг 2.5 и дважды вымойте бусины 1 мл 10x PBS.
- Промыть 0,5 мл 1 М этаноламина (98% запаса = 16,2 М) в буфере рН 8,0 с 0,02% полисорбатом-20 в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании.
- Повторите шаг 2.5 и вымойте бусины один раз в 1 мл DPBS. Бусины могут храниться в 200 мкл DPBS при 4 °C до тех пор, пока это не понадобится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
3. Сбор и подготовка крови для определения резус-(+)
- Используя устройство для прокалывания одним щелчком мыши, уколойте палец rh(+) донора и соберите 10 мкл крови в 1 мл DPBS.
- Окрашивание резус-клеток флуоресцентной плазматической мембраной. Необязательно добавляют 1 мкл флуоресцентного красителя к 1 мл суспензии Rh+ клеток (разбавление 1:1000).
- Инкубировать клетки флуоресцентным красителем при 37 °C в течение 15 мин.
- Гранулируют ячейки, вращаясь при 5 600 х г в течение 15 с и промывая 3 раза, используя 1 мл DPBS. Повторное суспенд в 1 мл HBSS с кальцием и магнием (HBSS++).
- Используя устройство для прокалывания одним щелчком мыши, уколоть палец резус-донора и собрать 2 мкл крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке более 2 условий соберите достаточно крови, чтобы добавить 1 мкл резус-крови в каждую пробирку. - Подготовьте необходимые экспериментальные пробирки: только бусины, контроль IgG, образец.
- Только бусины: добавьте 174 мкл HBSS++, 1 мкл контрольных шариков IgG, 1 мкл бусин высокой плотности (1,2 г/мл) и 24 мкл 500 мМ Gd3+ (60 мМ).
- Контроль IgG: добавьте 172 мкл HBSS++, 1 мкл контрольных шариков IgG, 1 мкл бусин высокой плотности, 1 мкл резус-крови, 1 мкл окрашенной суспензии крови Rh+ и 24 мкл 500 мМ Gd3+.
- В пробирку добавляют 172 мкл HBSS++, 1 мкл бусин с анти-RhD-покрытием, 1 мкл бусин высокой плотности, 1 мкл резус-крови, 1 мкл окрашенной Rh(+) суспензии крови и 24 мкл 500 мМ Gd3+.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бусины высокой плотности добавляются в образцы Rh для справки.
4. Изоляция PMN для демонстрации разделения клеток
- Выделение нейтрофилов
- Втяните 40 мл венозной крови в шприц объемом 60 мл, содержащий 6 мл цитрата натрия/лимонной кислоты (0,15 М, рН 5,5) и 14 мл 6% декстрана-70.
- Подождите 50 мин, пока кровь не дожидает.
- Медленно наложите клетки шерсти сверху на 20 мл Ficoll-Paque, протолкнув верхние 18 мл через трубку для сбора крови в трубку 50 мл, избегая загрязнения осажденными эритроцитами. Рекомендуется использовать свежий набор для сбора крови, чтобы свести к минимуму загрязнение остаточными эритроцитами, оставшимися в исходной пробирке для сбора крови.
- Гранулировать баффи клетки покрытия центрифугированием в течение 20 мин при 3000 х г. Нейтрофилы и загрязняющие эритроциты будут гранулироваться в нижней части трубки. PBMC образует белый слой поверх Ficoll-Paque.
- Перенесите нейтрофилы в новую трубку 50 мл.
- Лизе любые остаточные эритроциты путем инкубации нейтрофилов с 20 мл 0,2% холодного раствора NaCl в течение 25 секунд с последующим дополнительным 20 мл 1,6% NaCl. Итоговая концертация NaCl должна составлять 0,9% (изотоническая).
- Центрифугировать суспензию в течение 10 мин при 3000 х г.
- Удалите супернатант и повторно суспендировать нейтрофилы до нужной концентрации.
-
Выделение лимфоцитов
- Обмазывая НБМК в RPMI 5% термоинкционированной сывороткой в 6-скважинных культурных пластинах.
- Инкубировать пластины в течение 1 ч при 37 °C. Моноциты будут прилипать к пластине, лимфоциты будут свободно плавать.
- Удалите буфер, содержащий лимфоциты, и дважды промыть его RPMI.
- Повторное суспендирует лимфоциты в нужной концентрации.
-
Маркировка эритроцитов, PMN и лимфоцитов.
- Пометьте каждый тип клеток различным флуоресцентным красителем. Убедитесь, что каждый краситель флуоресцирует в другом канале. Следуйте инструкциям производителя для каждого из выбранных красителей.
5. Генерация внеклеточных везикул эрицитов через активацию комплемента
- Получение цельной крови путем венипункции с использованием пробирок ЭДТА.
- Пропускают кровь через фильтр лейкоцитов, а затем центрифугируют 3 раза по 500 х г в течение 10 мин каждый для выделения эритроцитов. Используйте HBSS++ в качестве буфера для стирки.
- Сделайте аликвоты по 100 мкл, упакованные эритроциты в пробирки по 1,5 мл и добавьте объем до 1 мл, добавив HBSS++.
- Добавьте C5b,6 к конечной концентрации 0,18 мкг/мл в HBSS++, а затем вихрь.
- Поставить на медленный шейкер при комнатной температуре на 15 мин.
- Добавьте белок C7 до конечной концентрации 0,2 мкг/мл. Перемешайте, аккуратно перевернутый тюбик несколько раз. Не вихряйте от этой точки вперед.
- Поместите трубку на шейкер для трубок, установленный на низкой скорости в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте белок C8 до конечной концентрации 0,2 мкг/мл, а белок C9 до 0,45 мкг/мл. Перемешайте, аккуратно перевернутые трубки несколько раз.
- Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
- Центрифугировать трубку при 10 000 х г в течение 10 мин.
- Соберите EV-содержащий супернатант в новую трубку (трубки). Не раздвиживайте супернатант слишком близко к грануле клетки.
6. Анализ клеток на устройстве магнитной левитации
- Выполните запуск прибора в соответствии с инструкциями производителя.
- Загрузите 50 мкл образца в капиллярную трубку до тех пор, пока трубка не будет заполнена. Запечатайте концы капиллярной трубки капиллярным герметиком, убедившись, что в ней нет пузырьков воздуха.
- Загрузите капиллярную трубку в держатель между верхним и нижним магнитами. Отрегулируйте сцену и фокус для оптимального просмотра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеткам/шарикам может потребоваться от 5 до 20 мин, чтобы достичь своего магнитного равновесного положения в зависимости от их плотности и концентрации Gd3+. Чем выше концентрация Gd3+,тем короче время.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Магнитная левитация фокусирует объекты разной плотности на разных высотах левитации в зависимости от плотности объекта, его магнитной сигнатуры, концентрации парамагнитного раствора и силы магнитного поля, создаваемого двумя сильными редкоземельными магнитами. Поскольку два магнита расположены друг на друге, левитирующие образцы можно просматривать только при сохранении освещения Келера с помощью микроскопа, повернутого на бок(рисунок 1). Конечная высота левитации, достигаемая каждым типом клеток, может быть легко изменена путем изменения концентрации парамагнитного раствора. Рисунок 2 иллюстрирует разделение различных циркулирующих клеток крови с использованием различных концентраций гадолиния. Два типа бусин с различной плотностью (1,05 и 1,2 г/мл) использовались для обеспечения высоты левитации плотности и ссылок на размер. Поскольку высота левитации данного типа клеток зависит от ее внутренней плотности, магнитная левитация обеспечивает прямое средство изоляции интересующих клеток без каких-либо существенных манипуляций24. Основной целью данного протокола была демонстрация способности магнитной левитации обнаруживать наличие мембранно-связанных антигенов, в данном случае резус-фактора, на циркулирующих эритроцитах. Для этого эксперимента шарики низкой плотности были покрыты либо контрольным антителом IgG, либо анти-RhD. Затем образцы были подготовлены путем пропитки крови от rh(-) донора с кровью из Rh(+) в соотношении 1:1000. Бусины с анти-RhD(+) или контрольные бусины, покрытые IgG, добавляли в образец крови и инкубировали в течение 10 минут. На рисунке 3А показан контрольный образец IgG, который не генерировал никаких комплексов бисероплеточных эритроцитов. Затем идентичность эритроцитов, захваченных резус-положительными шариками, была проверена путем предварительного окрашивания резус-клеток флуоресцентным окрашиванием плазматической мембраны, а затем визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии(рисунок 3B). Событие положительного обнаружения показано на рисунке 3C. Связывание анти-Rh-шарика с резус-клетками (+) создает комплекс шариково-клеточных с плотностью между бусинами и ячейкой, поэтому левитирует на высоте, расположенной между несвязанными захватными шариками и отрицательными эритроцитами. Крупный план комплексов шариковых клеток был сфотоцирован под флуоресцентным светом, чтобы подтвердить наличие резус-клеток, помеченных флуоресцентным пятном плазматической мембраны. (Рисунок 3D). На рисунке 3E показаны бисероплетищные комплексы, образующиеся между бусинами высокой и низкой плотности, покрытыми антителами к CR1 и CD47, которые указывают на наличие внеклеточных везикул. Схема комплекса шарик-ячейка показана на рисунке 3F.
Рисунок 1. Принципы магнитной левитации: (A) Схемы магнитного поля. (B)Микроскоп исследовательского класса, наконечник на боку, чтобы позволить боковой визуализации целей, левитирующих в капиллярной трубке. (C) Угловой вид аппарата магнитной левитации под объективом микроскопа. (D) Аппарат магнитной левитации фронтального вида. (E)Схемы аппарата магнитной левитации с капиллярной трубкой, установленной между двумя магнитами, вид спереди и сбоку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Демонстрация клеточно-удельного равновесия плотности: (A)Шарики низкой и высокой плотности (1,05 и 1,2 г/мл) только при 60 мМ Gd3+ (при 10-кратном объективе). (B)ПМН, левитирующие над эритроцитами при 21 мМ Gd3+,с циркулирующими вне фокуса тромбоцитами (при просмотре на 10-кратном объективе). (C)Цельная кровь левитирует при 60 мМ Gd3+,которая представляет собой концентрацию, которая фокусируется на эритроцитах (при 10-кратном объективе). (D)Эта цифра была изменена с [Tasoglu, S. et al. Левитационная цитометрия изображений с временным разрешением. Передовые материалы. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] Плотность разделения эритроцитов (красный), PMN (зеленый) и лимфоцитов (синий) при 40 мМ Gd3+. Каждая клеточная популяция левитировала на высоте, основанной на их внутренней плотности (если смотреть на 10-кратную цель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Обнаружение резус-фактора в образце крови: (A)резус(-) кровь, шиповаемая резус-кровью (+) и контрольными шариками IgG. Комплексы шариковых ячеек не образуются (при просмотре на 10-кратном объективе). (B)Контрольный образец IgG под флуоресцентным светом, выделяющим резус(+) ячейки (просмотр на объективе 10x). (C)Резус(-) кровь, шиповающаяся с резус-кровью (+) и бусинами, покрытыми анти-RhD, показывая образование комплексов шарик-клетка (при просмотре на 10-кратном объективе). (D)Крупный план комплекса шариковых ячеек под флуоресцентным светом (на 10-кратный объектив). (E)Анти-CR1 и анти-CD47 шарики, образующие комплексы, указывающие на наличие внеклеточных везикул, полученных из эрицитов (при просмотре на 10-кратном объективе). (F) Диаграмма, изображающая комплекс шариково-клеточный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Градиентное центрифугирование в настоящее время является стандартным методом выделения субклеточных компонентов на основе их уникальных плотностей. Этот подход, однако, требует использования специализированных градиентных сред, а также центрифужного оборудования. Представленный здесь подход магнитной левитации позволяет детально иследовать морфологические и функциональные свойства циркулирующих клеток с минимальными, если таковые вообще могут быть, манипуляциями с клетками, обеспечивая почти in vivo доступ к циркулирующим клеткам.
Однако при использовании магнитной левитации стоит упомянуть несколько моментов. Во-первых, микроскоп, используемый для визуализации, должен быть посвящен этому методу, так как настройка занимает много времени и требует, чтобы микроскоп был частично разобран, расположен идеально горизонтально с оптикой, точно выровненной с магнитами и капиллярной трубкой. Во-вторых, лабораторный домкрат и трансляционные ступени, используемые для регулировки движений капиллярного стекла и фокуса, требуют точного позиционирования и свободного движения по каждой из трех осей. Вероятно, наиболее важным выравниванием всей установки является установка магнитного левитационного устройства на поступательных стадиях таким образом, чтобы верхние и нижние магниты идеально соответствовали вектору гравитации, а также идеально горизонтальны. Любое отклонение от этих требований создаст угол между магнитной силой и гравитацией, который будет толкать клетки к обеим сторонам капиллярной трубки, нарушая процесс левитации и делая результаты ненадежными.
Оптимальная концентрация раствора гадолиния, используемого для левитации клеток, должна быть скорректирована с учетом типа клеток и цели эксперимента. Изменения в концентрации раствора гадолиния значительно изменят высоту левитации анализируемых клеток, и поэтому должны быть постоянными от одного набора экспериментов к другому. Если концентрация слишком низкая, в зависимости от плотности клеток-мишеней, они могут вообще не левитировать, в то время как если она слишком высока, ограничит диапазон обнаруживаемых изменений, которые могут быть точно количественно определены.
Левитирующие структуры будут создавать устойчивые полосы, если единственными силами, действующими на них, являются гравитация и магнитное отталкивание. Наличие даже пузырька миллиметрового размера в капиллярной трубке создаст небольшие круговые токи на границе раздела воздух-жидкость, которые будут беспокоить левитирующие клетки, делая любой анализ практически невозможным. При загрузке образца в капиллярную трубку, а затем после герметизации необходимо убедиться, что воздуха нет, исследуя капилляр под стереомикроскопом или маломощным (4x) объективом.
Левитация клеток на заданной высоте зависит от того, остается ли их магнитная сигнатура неизменной с течением времени. Если парамагнитные ионы гадолиния из левитационных сред попадают в клетки либо через пиноцитоз, либо через повышенную проницаемость мембраны, например, во время апоптоза, повышенная плотность клеток, измеренная на основе эталонных шариков плотности, будет ошибочной. К счастью, большинство циркулирующих клеток имеют плохие пиноцитарные возможности26,что делает этот метод подходящим подходом для изучения клеток в течение длительных периодов времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Жетулио Перейру за помощь во внеклеточной работе с везикулами.
Эта работа была поддержана следующими грантами Национального института здравоохранения для МКГ: RO1CA218500, UG3HL147353 и UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al.
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M.
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al.
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
