Summary
Dette papir beskriver en magnetisk levitation-baseret metode, der specifikt kan opdage tilstedeværelsen af antigener, enten opløselige eller membran-bundet, ved at kvantificere ændringer i levitation højde fange perler med faste tætheder.
Abstract
Den beskrevne metode blev udviklet baseret på principperne om magnetisk levitation, som adskiller celler og partikler baseret på deres tæthed og magnetiske egenskaber. Tæthed er en celletype identificere egenskab, direkte relateret til dens stofskifte, differentiering, og aktivering status. Magnetisk levitation giver mulighed for en et-trins tilgang til med succes at adskille, billede og karakterisere cirkulerende blodlegemer, og at opdage anæmi, seglcellesygdom, og cirkulerende tumorceller baseret på densitet og magnetiske egenskaber. Denne tilgang er også modtagelig for at opdage opløselige antigener til stede i en løsning ved hjælp af sæt af lav- og høj densitet perler belagt med fangst og detektion antistoffer, henholdsvis. Hvis antigen er til stede i opløsning, vil det bygge bro over de to sæt perler og generere et nyt perleperlekompleks, som vil svæve mellem rækkerne af antistofbelagte perler. Øget koncentration af målantigen i opløsningen vil generere et større antal perleperlekomplekser sammenlignet med lavere koncentrationer af antigen, hvilket giver mulighed for kvantitative målinger af målantigen. Magnetisk levitation er fordelagtig for andre metoder på grund af dens reducerede prøveforberedelsestid og manglende afhængighed af klassiske udlæsningsmetoder. Det genererede billede optages og analyseres nemt ved hjælp af et standardmikroskop eller en mobil enhed, f.eks. en smartphone eller en tablet.
Introduction
Magnetisk levitation er en teknik udviklet til at adskille, analysere og identificere celletyper1,2,3, proteiner4,5 og opioider6 udelukkende baseret på deres specifikke tæthed og paramagnetiske egenskaber. Celletæthed er en unik, iboende egenskab for hver celletype, der er direkte relateret til dens stofskifte og differentieringsstatus7,8,9,10,11,12,13,14. Kvantificering subtile og forbigående ændringer i celletæthed under steady state betingelser, og under en række celle processer, kunne give en en uovertruffen indsigt i cellefysiologi og patofysiologi. Ændringer i celletæthed er forbundet med celledifferentiering15,16, cellecyklus progression9,17,18,19, apoptose20,21,22,23og ondartet transformation24,25,26 . Derfor kan kvantificering af specifikke ændringer i celletætheden bruges til at skelne mellem celler af forskellige typer samt skelne mellem samme type celler, der gennemgår forskellige aktiveringsprocesser. Dette muliggør eksperimenter, der er målrettet mod en bestemt celleunderpopulation, hvor dynamiske ændringer i densitet tjener som en indikator for ændret cellemetabolisme27. Da det er blevet fastslået, at en celle kan ændre sin tæthed som reaktion på et skiftende miljø7, er det bydende nødvendigt at måle kinetikken i cellen i forhold til dens tæthed for at forstå den fuldt ud, hvilke nuværende metoder der muligvis ikke giver12. Magnetisk levitation på den anden side giver mulighed for en dynamisk evaluering af celler og deres egenskaber28.
Celler er diamagnetiske, hvilket betyder, at de ikke har et permanent magnetisk dipoløjemoment. Men når det udsættes for et eksternt magnetfelt, genereres et svagt magnetisk dipoløjemoment i cellerne i den modsatte retning af det anvendte felt. Således, hvis celler er suspenderet i en paramagnetisk opløsning og udsat for et stærkt lodret magnetfelt, vil de svæve væk fra den magnetiske kilde og stoppe til en højde, som primært afhænger af deres individuelle tæthed. Diamagnetisk levitation af et objekt, der er begrænset til et minimum af et inhomogent magnetfelt, er mulig, når følgende to kriterier er opfyldt: 1) partiklens magnetiske modtagelighed skal være mindre end det omgivende medium, og 2) den magnetiske kraft skal være stærk nok til at opveje partiklens opdriftskraft. Begge kriterier kan opfyldes ved at suspendere RBCs i en magnetisk buffer og ved at skabe stærke magnetfelt gradienter med små, billige, kommercielt tilgængelige permanente magneter1. Ligevægtspositionen af en magnetisk fanget partikel på en akse langs tyngderetningen bestemmes af dens tæthed (i forhold til bufferens massefylde), dens magnetiske modtagelighed (i forhold til bufferens magnetiske modtagelighed) og signaturen af det anvendte magnetfelt. Da opløsningens tæthed og magnetiske egenskaber er konstante i hele systemet, vil cellernes iboende tæthedsegenskaber være den vigtigste faktor, der bestemmer cellernes levitationshøjde, med tættere celler, der svæver lavere sammenlignet med mindre tætte celler. Denne tilgang bruger et sæt af to tæthed reference perler (1,05 og 1,2 g / mL), der giver os mulighed for at bruge præcis, ratiometrisk analyse for tæthed målinger. Ændring af koncentrationen af den magnetiske opløsning gør det muligt at isolere forskellige cellulære populationer, såsom RBCs fra WBCs, da tætheden af cirkulerende celler er cellespecifik, hvilket fjerner behovet for isolationsprotokoller eller anden cellemanipulation.
De fleste påvisningsmetoder, der anvendes i biologiforskning, er afhængige af ekstrapolering af specifikke bindende hændelser til let at kvantificere lineære signaler. Disse udlæsningsmetoder er ofte komplekse og involverer specialiseret udstyr og dedikeret videnskabeligt personale. En fremgangsmåde, der tager sigte på påvisning af antigener, der findes enten på cellernes plasmamembran eller ekstracellulære vesikler, eller som er opløselige i plasma, ved hjælp af enten en eller to antistofbelagte perler, er heri beskrevet. Perlerne skal være af forskellig tæthed fra hinanden og fra de forhørte mål. Tilstedeværelsen af målantigen i en given biofluid oversættes til en specifik, målbar ændring i levitationshøjden af en antigenpositiv celle, der er bundet til en detektionsperle. I tilfælde af opløselige antigener eller ekstracellulære vesikler er de bundet til både opsamlings- og detektionsperler, der danner et perleperlekompleks snarere end perlecellekompleks. Ændringen i levitationshøjden afhænger af den nye tæthed af perlecelle- eller perleadkomplekserne. Ud over ændringen i levitationshøjden af komplekserne, hvilket indikerer tilstedeværelsen af antigen i biofluiden, er antallet af komplekser også afhængig af mængden af mål, hvilket gør magnetisk levitation også en kvantitativ tilgang til antigendetektering24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den eksperimentelle protokol, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Opsætning af instrumenter
BEMÆRK: Imaging svævende celler kræver to sjældne jordarters neodym magneter magnetiseret på z-aksen, der skal placeres med den samme pol mod hinanden for at generere et magnetfelt. Afstanden mellem magneterne kan tilpasses afhængigt af intensiteten af magnetfeltet og tætheden af målene. I dette tilfælde er magneterne adskilt af et 1 mm rum, der er tilstrækkeligt til indsættelse af et 50 mm langt 1x1 mm kvadreret glaskapillarrør. Enheden blev 3D-printet ved hjælp af et AutoCAD-design, som er tilgængeligt efter anmodning.
- Læg mikroskop på siden, helt vandret.
BEMÆRK: Et mikroskop placeret i en standard opretstående stilling er ikke direkte egnet til billeddannelse svævende objekter på grund af placeringen af magneter med hensyn til kondensator og mål. Denne begrænsning kan omgås ved at lægge mikroskopet på sin side, perfekt vandret, så kondensatoren kan fokusere lyset ind i kapillæren, og den objektive linse til at afbilde cellen svæver mellem magneterne, samtidig med at Köhler belysningskrav bevares. - Støtte og niveau stativet på et breadboard bord ved hjælp af 2 eller 3 lab stik.
- For at begrænse vibrationer skal du støtte brødbrættet med gummidæmpende fødder.
- Fjern scenen og udskift den med et kompakt laboratoriestik til justering af levitationsenhedens højde (y-akse) og to oversætterstadier med en enkelt akse. den ene til justering af fokus (z-akse), og den anden til scanning af kapillærrøret.
- Fastgør den magnetiske levitationsenhed til laboratoriestikket ved hjælp af to optiske stolper i miniserien.
2. Binding af antistof til Carboxy-mikropartikler /perler (Ændret fra en protokol af PolyAn)
BEMÆRK: Kun perler med lav densitet (1,05 g/mL) skal belagt til Rh(+) detektion, men både perler med høj og lav densitet er belagt til påvisning af ekstracellulære vesikler.
- Ækvivalent med perleaffjedring på 1 mg, og der tilsættes aktiveringsbufferen på 0,5 mL (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg i 1 mL)) pH 5,0 og 0,001% Polysorbate-20).
- Der tilsættes 12 μL frisklavet 1,5 M EDC (MW 191,7, 0,28755 g i 1 mL) og 12 μL på 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g i 1 mL) i iskoldt vand.
- Placer rør på en orbital shaker og ryst kraftigt i 1 time ved stuetemperatur for at aktivere carboxyl grupper på perler.
- Stop aktiveringen efter 1 time ved at tilsætte 0,5 mL koblingsbuffer (10x PBS eller 0,1 M fosfat pH 7-9).
- Pellet perlerne ved centrifugering ved 20.000 x g i 10 min, eller, hvis perlerne ikke kan pelleted, bruge en 0,45 μm centrifuge rørfilter. Aspirere supernatant eller flow-through.
- Vask perlerne med 1 mL 10x PBS 3 gange som i trin 2.5.
- 25 μg antistof pr. mgperler og bland ønsket antistof med aktiverede perler til en 0,7-1,0 mg/mL endelig antistofkoncentration i 10X PBS.
- Placer rør på en tube rocker indstillet på en lav hastighed. Rul forsigtigt rør ved stuetemperatur natten over til kobling.
- Gentag trin 2.5 og vask perlerne to gange med 1 mL 10x PBS.
- Vask med 0,5 mL 1 M ethanolamin (98% lager = 16,2 M) i buffer pH 8,0 med 0,02% polysorbat-20 i 1 time ved stuetemperatur, mens du forsigtigt ryster.
- Gentag trin 2.5 og vask perlerne en gang i 1 mL DPBS. Perlerne kan opbevares i 200 μL DPBS ved 4 °C, indtil det er nødvendigt.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
3. Indsamling og tilberedning af blod til rh(+) detektion
- Ved hjælp af en lancing-enhed med et enkelt klik skal du stikke fingeren på en Rh(+)-donor og opsamle 10 μL blod i 1 mL DPBS.
- Plette Rh + celler med en fluorescerende plasma membran plet. Eventuelt tilsættes 1 μL fluorescerende farvestof til 1 mL suspension af Rh + celler (1:1000 fortynding).
- Inkuberes cellerne med fluorescerende farvestof ved 37 °C i 15 min.
- Pellet cellerne ved at dreje ved 5.600 x g for 15 s og vask 3 gange ved hjælp af 1 mL DPBS. Resuspend i 1 minut HBSS med calcium og magnesium (HBSS++).
- Ved hjælp af et-klik lancing enhed, prik fingeren på en Rh (-) donor og indsamle 2 μL blod.
BEMÆRK: Hvis der forberedes mere end 2 tilstande, opsamles nok blod til at tilsætte 1 μL Rh(-) blod til hvert rør. - Forbered de nødvendige eksperimentelle rør: Perler alene, IgG kontrol, prøve.
- Perler alene: tilsæt 174 μL HBSS++, 1 μL IgG-kontrolperler, 1 μL perler med høj densitet (1,2 g/mL) og 24 μL på 500 mM Gd3+ (60 mM).
- IgG-kontrol: tilsættes 172 μL HBSS++, 1 μL IgG-kontrolperler, 1 μL perler med høj densitet, 1 μL rh-blod, 1 μL af plettet Rh+ blodaffjedring og 24 μL på 500 mM Gd3+.
- Prøverøret tilsættes 172 μL HBSS++, 1 μL anti-rhd coatede perler, 1 μL af perler med høj densitet, 1 μL rh- blod, 1 μL af plettet Rh(+) blodaffjedring og 24 μL på 500 mM Gd3+.
BEMÆRK: Perler med høj densitet tilsættes rh-prøver til reference.
4. Isolering af PMN'er til demonstration af celleadskillelse
- Isolering af Neutrofiler
- Træk 40 mL venøst blod i en 60 mL sprøjte, der indeholder 6 mL natriumcitrat/citronsyre (0,15 M, pH 5,5) og 14 mL på 6% Dextran-70.
- Vent i 50 minutter på, at blodet bliver sedimentet.
- Lag langsomt buffy frakkecellerne oven på 20 mL Ficoll-Paque ved at skubbe de øverste 18 mL gennem blodopsamlingsrøret i et 50 mL-rør og undgå forurening med sedimenterede RBCs. Det anbefales at bruge et nyt blodopsamlingssæt for at minimere forureningen med resterende RBCs tilovers i det originale blodopsamlingsrør.
- Pellet buffy pelsceller ved centrifugering i 20 min ved 3.000 x g. Neutrofiler og forurenende RBCs vil pellet i bunden af røret. PBMC vil danne et hvidt lag oven på Ficoll-Paque.
- Overfør neutrofiler til et nyt 50 mL rør.
- Lyse eventuelle resterende RBCs ved at inkubere neutrofiler med 20 mL 0,2% kold NaCl opløsning i 25 sekunder, efterfulgt af yderligere 20 mL på 1,6% NaCl. Den endelige koncert med NaCl bør være 0,9% (isotonisk).
- Centrifuge suspensionen i 10 min ved 3.000 x g.
- Fjern supernatanten og genbrug neutrofiler til den ønskede koncentration.
-
Isolering af lymfocytter
- Plade PBMCs i RPMI med 5% varmeinaktiveret serum i 6-brønds kulturplader.
- Pladerne inkuberes i 1 time ved 37 °C. Monocytter vil klæbe til pladen, lymfocytter vil være frit flydende.
- Fjern bufferen, der indeholder lymfocytterne, og vask den to gange med RPMI.
- Resuspend lymfocytterne i den ønskede koncentration.
-
Mærk RTU'er, PMN og lymfocytter.
- Mærk hver celletype med et andet fluorescerende farvestof. Sørg for, at hvert farvestof fluorescerer i en anden kanal. Følg producentens anvisninger for hvert af de valgte farvestoffer.
5. Generering af RBC Ekstracellulære vesikler via komplementaktivering
- Få fuldblod gennem venipuncture ved hjælp af EDTA rør.
- Pass blod gennem en hvid blodcelle filter, og derefter centrifuge 3 gange ved 500 x g i 10 min hver for at isolere røde blodlegemer. Brug HBSS++ som vaskebuffer.
- Lav aliquots af 100 μL pakket RBCs i 1,5 mL rør og udgør volumen til 1 mL ved at tilføje HBSS ++.
- C5b,6 til en 0,18 μg/mL endelig koncentration i HBSS++, og hvirvlende.
- Sæt på en langsom shaker ved stuetemperatur i 15 minutter.
- C7-protein tilsættes til en endelig koncentration på 0,2 μg/mL. Bland ved at vende røret forsigtigt et par gange. Må ikke hvirvler fra dette punkt fremad.
- Placer røret på en rør shaker indstillet ved en lav hastighed i 5 min ved stuetemperatur.
- C8-protein til en endelig koncentration på 0,2 μg/mL og C9-protein til 0,45 μg/mL. Bland ved at vende rørene forsigtigt et par gange.
- Inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Centrifuge røret ved 10.000 x g i 10 min.
- Opsamle den EV-holdige supernatant i et nyt rør( r). Må ikke tremove supernatanten for tæt på cellepillen.
6. Analyse af celler på den magnetiske levitationsenhed
- Udfør start af instrumenter i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Prøven skal lægges 50 μL i et kapillært rør, indtil røret er fyldt. Forsegl enderne af kapillærrøret med kapillær fugemasse og sørg for, at der ikke er luftbobler til stede.
- Læg kapillærrøret i holderen mellem top- og bundmagneterne. Juster scenen og fokuser for optimal visning.
BEMÆRK: Celler /perler kan tage alt fra 5-20 min at nå deres magnetiske ligevægt position baseret på deres tæthed og koncentrationen af Gd3 +. Jo højere koncentrationen af Gd3+,jo kortere tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnetisk levitation fokuserer objekter af forskellige tætheder i forskellige levitationshøjder afhængigt af objektets tæthed, dets magnetiske signatur, koncentrationen af paramagnetisk opløsning og styrken af magnetfeltet skabt af to stærke, sjældne jordarters magneter. Da de to magneter er placeret oven på hinanden, kan svævende prøver kun ses, samtidig med at Köhler belysning, ved hjælp af et mikroskop vendt på sin side (Figur 1). Den endelige levitationshøjde, der nås af hver celletype, kan let ændres ved at ændre koncentrationen af den paramagnetiske opløsning. Figur 2 illustrerer adskillelsen af de forskellige cirkulerende blodlegemer ved hjælp af forskellige koncentrationer af gadolinium. De to perletyper med forskellige tætheder (1,05 og 1,2 g/mL) blev brugt til at levere densitet levitationshøjder og størrelsesreferencer. Da levitationshøjden af en given celletype afhænger af dens iboende tæthed, giver magnetisk levitation et direkte middel til at isolere celler af interesse uden nogen signifikant manipulation24. Hovedformålet med denne protokol var at demonstrere evnen til magnetisk levitation til at opdage tilstedeværelsen af membranbundne antigener, i dette tilfælde Rh-faktoren, på cirkulerende røde blodlegemer. Til dette eksperiment blev perler med lav densitet belagt med enten IgG-kontrolantistof eller anti-RhD. Prøver blev derefter fremstillet ved spiking blod fra en Rh (-) donor med blod fra en Rh (+) i et forhold på 1:1000. Anti-RhD(+) coatede perler eller kontrol IgG belagt perler blev tilføjet til blodprøven og inkuberet i 10 minutter. Figur 3A viser IgG-kontrolprøven, som ikke genererede perlerøde blodlegemer. Dernæst blev identiteten af de røde blodlegemer, der blev fanget af rh(+)positive perler, verificeret ved at forflake Rh(+)-cellerne med en fluorescerende plasmamembranplet og derefter afbildet ved hjælp af fluorescensmikroskopi (Figur 3B). Der vises en positiv registreringshændelse i figur 3C. Bindingen af anti-Rh-perlen til Rh(+) celler skaber en perle-celle kompleks med en tæthed i mellem perlerne og cellen, derfor svæver i en højde beliggende i mellem de ubundne fange perler og negative RBCs. Et nærbillede af perlecellekomplekserne blev afbildet under fluorescerende lys for at bekræfte tilstedeværelsen af Rh(+)-cellerne mærket med en fluorescerende plasmamembranplet. (Figur 3D). Figur 3E viser perleperlekomplekser, der danner mellem perler med høj og lav densitet belagt med antistoffer mod CR1 og CD47, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ekstracellulære vesikler. Et skema over perlecellekomplekset vises i figur 3F.
Figur 1. Principper for magnetisk levitation: (A) Skemaer af magnetfelt. (B) Et mikroskop af forskningskvalitet tippet på siden for at tillade sidebilleddannelse af de mål, der svæver i kapillærrøret. (C) Vinklet syn på det magnetiske levitationsapparat under mikroskopmålet. (D) Magnetisk levitation apparat frontal visning. (E) Skemaer for det magnetiske levitationsapparat med kapillærrør monteret mellem to magneter, for- og sidevisning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Demonstration af cellespecifik tæthed Ligevægt: (A) Lav- og høj densitet perler (1,05 og 1,2 g / mL) alene på 60 mM Gd3 + (set på en 10x mål). (B) PMN'er, der svæver over røde blodlegemer ved 21 mM Gd3+,med ude af fokus blodplader cirkulerer (set på en 10x mål). (C) Fuldblod, der svæver ved 60 mM Gd3+,hvilket er en koncentration, der fokuserer på RTU'er (set på et 10x-mål). (D) Dette tal er blevet ændret fra [Tasoglu, S. et al. Levitational billede cytometri med tidsmæssig opløsning. Avancerede materialer. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] Densitetsadskillelse af RTU'er (rød), PMN'er (grøn) og lymfocytter (blå) ved 40 mM Gd3+. Hver cellepopulation svævede i en højde baseret på deres indre tætheder (set på et 10x-mål). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Påvisning af Rh Factor i en blodprøve: (A) Rh (-) blod spiked med Rh (+) blod og IgG kontrol perler. Der dannes ingen perlecellekomplekser (ses på et 10x-mål). (B) IgG-kontrolprøve under fluorescerende lys, der fremhæver Rh(+)-cellerne (set på et 10x-mål). (C) Rh(-) blod tilsat Rh (+) blod og anti-RhD coated perler, der viser dannelsen af perle-celle komplekser (set på en 10x mål). (D) Et nærbillede af et perlecellekompleks under fluorescerende lys (set på et 10x-mål). (E) Anti-CR1 og anti-CD47 coatede perler danner komplekser, der angiver tilstedeværelsen af RBC afledte ekstracellulære vesikler (set på en 10x mål). (F) Diagram, der viser perlecellekomplekset. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gradient centrifugering er i øjeblikket standard teknikken til isolering subcellulære komponenter baseret på deres unikke tætheder. Denne tilgang kræver imidlertid brug af specialiserede gradientmedier samt centrifugeudstyr. Den magnetiske levitationsmetode, der præsenteres her, giver mulighed for detaljeret undersøgelse af cirkulerende cellers morfologiske og funktionelle egenskaber med minimum, hvis nogen manipulation af cellerne, hvilket giver en nær in vivo-adgang til cirkulerende celler.
Men når du bruger magnetisk levitation flere punkter er værd at nævne. For det første skal det mikroskop, der anvendes til billeddannelse, være dedikeret til denne metode, da opsætningen er tidskrævende, og kræver, at mikroskopet adskilles delvist, placeres perfekt vandret med optik, der er nøjagtigt tilpasset magneterne og kapillærrøret. For det andet kræver laboratoriestikket og de translationelle stadier, der bruges til at justere kapillærglasets bevægelser, og fokus nøjagtig positionering og fri bevægelighed på hver af de tre akser. Sandsynligvis den mest kritiske justering af hele opsætningen, er montering af magnetisk levitation enhed i de translationelle faser, således at de øverste og nederste magneter er perfekt afstemt med tyngdekraften vektor samt perfekt vandret. Enhver afvigelse fra disse krav ville skabe en vinkel mellem den magnetiske kraft og tyngdekraften, som ville skubbe cellerne mod begge sider af kapillær rør, forstyrre levitation proces, og gøre resultaterne upålidelige.
Den optimale koncentration af gadoliniumopløsningen, der anvendes til svævende celler, skal justeres for celletypen og eksperimentets mål. Ændringer i koncentrationen af gadoliniumopløsningen vil væsentligt ændre levitationshøjden af de celler, der analyseres, og skal derfor holdes konstant fra et sæt eksperimenter til et andet. Hvis koncentrationen er for lav, afhængigt af tætheden af målcellerne, kan de slet ikke svæve, mens hvis den er for høj, begrænse det antal påviselige ændringer, der kan kvantificeres nøjagtigt.
Svævende strukturer vil skabe stabile bånd, hvis de eneste kræfter, der virker på dem, er tyngdekraft og magnetisk frastødning. Tilstedeværelsen af selv en millimeter-størrelse boble i kapillærrøret vil skabe små cirkulære strømme på luft-flydende interface, som vil forstyrre de svævende celler, hvilket gør enhver analyse næsten umuligt. Ved indsætning af en prøve i et kapillærrør og derefter efter forsegling skal man sørge for, at der ikke er luft til stede, ved at undersøge kapillæren under et stereomikroskop eller et 4x-mål (low power).
Levitation af celler i en bestemt højde afhænger af, at deres magnetiske signatur forbliver den samme over tid. Hvis de paramagnetiske gadoliniumioner fra levitationsmedierne kommer ind i cellerne, enten gennem pinocytose eller øget membrangennemtrængelighed, såsom under apoptose, vil den øgede celletæthed målt baseret på densitetsreferenceperler være fejlagtig. Heldigvis har de fleste cirkulerende celler dårlige pinocytiske evner26, hvilket gør denne metode til en passende tilgang til at studere celler over lange perioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Getulio Pereira for hans hjælp med ekstracellulære vesikel arbejde.
Dette arbejde blev støttet af følgende Nationale Institut for Sundhed tilskud til ICG: RO1CA218500, UG3HL147353, og UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al.
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M.
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al.
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
