Summary
Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell'altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.
Abstract
Il metodo descritto è stato sviluppato sulla base dei principi della levitazione magnetica, che separa cellule e particelle in base alla loro densità e proprietà magnetiche. La densità è una proprietà identificativa del tipo cellulare, direttamente correlata al suo tasso metabolico, differenziazione e stato di attivazione. La levitazione magnetica consente un approccio in un unico passaggio per separare, visualizzare e caratterizzare con successo le cellule del sangue circolanti e rilevare anemia, anemia falciforme e cellule tumorali circolanti in base alla densità e alle proprietà magnetiche. Questo approccio è anche suscettibile di rilevare antigeni solubili presenti in una soluzione utilizzando set di perline a bassa e alta densità rivestite rispettivamente con anticorpi di cattura e rilevamento. Se l'antigene è presente in soluzione, colmerà le due serie di pere, generando un nuovo complesso perla-perla, che levita tra le file di pere rivestite di anticorpi. L'aumento della concentrazione dell'antigene bersaglio in soluzione genererà un numero maggiore di complessi pere-pere rispetto a concentrazioni inferiori di antigene, consentendo così misurazioni quantitative dell'antigene bersaglio. La levitazione magnetica è vantaggiosa per altri metodi a causa della diminuzione del tempo di preparazione del campione e della mancanza di dipendenza dai metodi di lettura classici. L'immagine generata viene facilmente catturata e analizzata utilizzando un microscopio standard o un dispositivo mobile, come uno smartphone o un tablet.
Introduction
La levitazione magnetica è una tecnica sviluppata per separare, analizzare e identificare i tipi di cellule1,2,3,le proteine4,5 e gli oppioidi6 basandosi esclusivamente sulla loro densità specifica e proprietà paramagnetiche. La densità cellulare è una proprietà intrinseca unica di ciascun tipo di cellula direttamente correlata al suo tasso metabolico e allo stato di differenziazione7,8,9,10,11, 12,13,14. Quantificare i cambiamenti sottili e transitori nella densità cellulare durante le condizioni di stato stazionario e durante una varietà di processi cellulari, potrebbe offrire una visione senza pari della fisiologia cellulare e della fisiopatologia. I cambiamenti nella densità cellulare sono associatialla differenziazione cellulare15,16,alla progressione del ciclo cellulare9,17,18,19,all'apoptosi20,21,22,23e alla trasformazione maligna24,25,26 . Pertanto, la quantificazione di specifici cambiamenti nella densità cellulare, può essere utilizzata per differenziare tra cellule di diversi tipi, nonché discriminare tra lo stesso tipo di cellule sottoposte a vari processi di attivazione. Ciò consente esperimenti che prendono di mira una particolare sotto-popolazione cellulare, in cui i cambiamenti dinamici nella densità fungono da indicatore del metabolismo cellulare alterato27. Poiché è stato stabilito che una cellula può alterare la sua densità in risposta a un ambiente mutevole7, è imperativo misurare la cinetica della cellula in relazione alla sua densità per comprenderla pienamente, che i metodi attuali potrebbero non fornire12. La levitazione magnetica, d'altra parte, consente una valutazione dinamica delle cellule e delle loro proprietà28.
Le cellule sono diamagnetiche, il che significa che non hanno un momento di dipolo magnetico permanente. Tuttavia, quando esposto a un campo magnetico esterno, viene generato un debole momento di dipolo magnetico nelle cellule, nella direzione opposta del campo applicato. Pertanto, se le cellule sono sospese in una soluzione paramagnetica ed esposte a un forte campo magnetico verticale, levitano lontano dalla sorgente magnetica e si fermano ad un'altezza, che dipende principalmente dalla loro densità individuale. La levitazione diamagnetica di un oggetto confinato al minimo di un campo magnetico disomogeneo è possibile quando sono soddisfatti i due seguenti criteri: 1) la suscettibilità magnetica della particella deve essere inferiore a quella del mezzo circostante e 2) la forza magnetica deve essere abbastanza forte da controbilanciare la forza di galleggiamento della particella. Entrambi i criteri possono essere soddisfatti sospendendo i globuli rossi in un buffer magnetico e creando forti gradienti di campo magnetico con magneti permanenti piccoli, economici e disponibili in commercio1. La posizione di equilibrio di una particella intrappolata magneticamente su un asse lungo la direzione di gravità è determinata dalla sua densità (relativa alla densità del buffer), dalla sua suscettibilità magnetica (relativa alla suscettibilità magnetica del buffer) e dalla firma del campo magnetico applicato. Poiché la densità e le proprietà magnetiche della soluzione sono costanti in tutto il sistema, le proprietà di densità intrinseca delle cellule saranno il fattore principale che determina l'altezza di levitazione delle cellule, con cellule più dense che levitano più in basso rispetto alle cellule meno dense. Questo approccio utilizza una serie di due perle di riferimento di densità (1,05 e 1,2 g/ml) che ci consentono di utilizzare un'analisi puntuale precisa e rapportometrica per le misurazioni della densità. L'alterazione della concentrazione della soluzione magnetica consente di isolare diverse popolazioni cellulari, come i globuli rossi dai globuli bianchi, poiché la densità delle cellule circolanti è specifica della cellula, eliminando la necessità di protocolli di isolamento o altre manipolazioni cellulari.
La maggior parte dei metodi di rilevamento utilizzati nella ricerca in biologia si basano sull'estrapolazione di specifici eventi di legame in segnali lineari facili da quantificare. Questi metodi di lettura sono spesso complessi e coinvolgono attrezzature specializzate e personale scientifico dedicato. Un approccio volto alla rilevazione di antigeni trovati sulla membrana plasmatica delle cellule o delle vescicole extracellulari o che sono solubili nel plasma, utilizzando uno o due perle rivestite di anticorpi, è qui descritto. Le peri devono essere di densità diverse l'una dall'altra e da quelle dei bersagli interrogati. La presenza dell'antigene bersaglio in un dato biofluido si traduce in un cambiamento specifico e misurabile nell'altezza di levitazione di una cellula antigene-positiva che è legata a un perla di rilevamento. Nel caso di antigeni solubili o vescicole extracellulari, sono legati sia alle perle di cattura che a quelle di rilevamento, formando un complesso perle-perle piuttosto che un complesso perle-cellula. La variazione dell'altezza di levitazione dipende dalla nuova densità dei complessi perle-cella o perla-perla. Oltre alla variazione dell'altezza di levitazione dei complessi, che indica la presenza di antigene nel biofluido, il numero di complessi dipende anche dalla quantità di bersaglio, rendendo la levitazione magnetica anche un approccio quantitativo per il rilevamento dell'antigene24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il protocollo sperimentale utilizzato in questo studio è stato approvato dal Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Configurazione dello strumento
NOTA: l'imaging delle cellule levitanti richiede che due magneti al neodimio delle terre rare magnetizzati sull'asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all'altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata in base all'intensità del campo magnetico e alla densità dei bersagli. In questo caso i magneti sono separati da uno spazio di 1mm sufficiente per l'inserimento di un tubo capillare di vetro quadrato 1x1 mm lungo 50 mm. Il dispositivo è stato stampato in 3D utilizzando un design AutoCAD, disponibile su richiesta.
- Posare il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale.
NOTA: Un microscopio posto in posizione verticale standard non è direttamente adatto per l'imaging di oggetti levitanti a causa delle posizioni dei magneti rispetto al condensatore e all'obiettivo. Questa limitazione può essere aggirata posando il microscopio su un lato, perfettamente orizzontale consentendo al condensatore di focalizzare la luce nel capillare e alla lente dell'obiettivo di immaginare la cellula che levita tra i magneti, pur mantenendo i requisiti di illuminazione di Köhler. - Supporta e livella il supporto su un tavolo breadboard usando 2 o 3 jack da laboratorio.
- Per limitare le vibrazioni, appoggiare il tavolo breadboard con piedini in gomma.
- Rimuovere il palco e sostituirlo con un jack da laboratorio compatto per regolare l'altezza del dispositivo di levitazione(asse y)e due stadi di traslazione a singolo asse; uno per regolare la messa a fuoco(asse z)e il secondo per la scansione del tubo capillare.
- Collegare il dispositivo di levitazione magnetica al jack da laboratorio utilizzando due montanti ottici della mini-serie.
2. Legame di Anticorpi a Carbossi-Microparticelle/Perline (Modificato da un protocollo da PolyAn)
NOTA: solo le perle a bassa densità (1,05 g/mL) devono essere rivestite per il rilevamento di Rh(+), ma sia le perle ad alta che a bassa densità sono rivestite per il rilevamento di vescicole extracellulari.
- Eliminare 1 mg equivalente di sospensione di perline e aggiungere 0,5 mL di tampone di attivazione (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg in 1 mL)) pH 5,0 e 0,001% polisorbato-20).
- Aggiungere 12 μL di EDC da 1,5 M appena prodotto (MW 191,7, 0,28755 g in 1 mL) e 12 μL di 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g in 1 mL) in acqua ghiacciata.
- Posizionare i tubi su uno shaker orbitale e agitare vigorosamente per 1 ora a temperatura ambiente per attivare i gruppi carbossilici sulle perle.
- Interrompere l'attivazione dopo 1 ora aggiungendo 0,5 mL di tampone di accoppiamento (10x PBS o 0,1 M fosfato pH 7-9).
- Pellet le perline centrifugando a 20.000 x g per 10 min, oppure, se le perline non possono essere pellettizzato, utilizzare un filtro a tubo centrifugo da 0,45 μm. Aspirare il surnatante o flow-through.
- Lavare le perle con 1 mL di 10x PBS 3 volte come nel passaggio 2.5.
- Calcolare 25 μg di anticorpi per perle mg e mescolare l'anticorpo desiderato con perle attivate a una concentrazione di anticorpi finali di 0,7-1,0 mg/mL in 10X PBS.
- Posizionare i tubi su un bilanciere a tubo impostato a bassa velocità. Arrotolare delicatamente i tubi a temperatura ambiente durante la notte per l'accoppiamento.
- Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perle due volte con 1 mL di PBS 10x.
- Lavare con 0,5 mL di etanolamina 1 M (98% stock = 16,2 M) in tampone pH 8,0 con 0,02% polisorbato-20 per 1 ora a temperatura ambiente mentre si agita delicatamente.
- Ripetere il passaggio 2.5 e lavare le perle una volta ogni 1 ml di DPBS. Le perle possono essere conservate in 200 μL di DPBS a 4 °C fino a quando necessario.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Raccolta e preparazione del sangue per il rilevamento di Rh(+)
- Utilizzando un dispositivo di lancing con un clic, pungere il dito di un donatore rh (+) e raccogliere 10 μL di sangue in 1 mL di DPBS.
- Macchiare le cellule Rh+ con una macchia di membrana plasmatica fluorescente. Facoltativamente, aggiungere 1 μL di colorante fluorescente alla sospensione da 1 mL di celle Rh+ (diluizione 1:1000).
- Incubare le cellule con il colorante fluorescente a 37 °C per 15 min.
- Pellet le celle ruotando a 5.600 x g per 15 s e lavate 3 volte utilizzando 1 mL di DPBS. Spese in 1 mL di HBSS con calcio e magnesio (HBSS++).
- Utilizzando il dispositivo di lancing con un clic, pungere il dito di un donatore rh (-) e raccogliere 2 μL di sangue.
NOTA: Se si preparano più di 2 condizioni, raccogliere abbastanza sangue per aggiungere 1 μL di sangue Rh(-) a ciascun tubo. - Preparare le provette sperimentali necessarie: sole pere, controllo IgG, campione.
- Perle da sole: aggiungere 174 μL di HBSS++, 1 μL di perle di controllo IgG, 1 μL di perle ad alta densità (1,2 g/mL) e 24 μL di 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Controllo IgG: aggiungere 172 μL di HBSS++, 1 μL di perle di controllo IgG, 1 μL di perle ad alta densità, 1 μL di sangue Rh,1 μL di sospensione ematica Rh+ colorata e 24 μL di 500 mM Gd3+.
- La provetta del campione aggiunge 172 μL di HBSS++, 1 μL di perle rivestite anti-RhD, 1 μL di perle ad alta densità, 1 μL di Sangue Rh-, 1 μL di Sospensione Ematica Rh(+) colorata e 24 μL di 500 mM Gd3+.
NOTA: le perle ad alta densità vengono aggiunte ai campioni Rh come riferimento.
4. Isolamento di PMN per la dimostrazione della separazione cellulare
- Isolamento dei neutrofili
- Prelevare 40 mL di sangue venoso in una siringa da 60 mL contenente 6 mL di citrato di sodio/acido citrico (0,15 M, pH 5,5) e 14 mL di Destro-70 al 6%.
- Attendere 50 minuti affinché il sangue si sedimenti.
- Stratifica lentamente le cellule del buffy coat sopra 20 ml di Ficoll-Paque spingendo i primi 18 mL attraverso il tubo di raccolta del sangue in un tubo da 50 ml, evitando la contaminazione con globuli rossi sedimentati. Si consiglia di utilizzare un set di raccolta di sangue fresco, per ridurre al minimo la contaminazione con globuli rossi residui rimasti nel tubo di raccolta del sangue originale.
- Pellet le celle buffy coat mediante centrifugazione per 20 min a 3.000 x g. I neutrofili e i globuli rossi contaminanti si pellettino sul fondo del tubo. PBMC formerà uno strato bianco sopra Ficoll-Paque.
- Trasferire i neutrofili in un nuovo tubo da 50 ml.
- Lisi di eventuali globuli rossi residui incubando i neutrofili con 20 mL di soluzione fredda di NaCl allo 0,2% per 25 secondi, seguiti da ulteriori 20 mL di NaCl all'1,6%. La concertazione finale di NaCl dovrebbe essere dello 0,9% (isotonico).
- Centrifugare la sospensione per 10 min a 3.000 x g.
- Rimuovere il surnatante e risospendare i neutrofili alla concentrazione desiderata.
-
Isolamento dei linfociti
- Placcare i PBMC in RPMI con siero inattivato al calore al 5% in piastre di coltura a 6 pozzi.
- Incubare le piastre per 1 ora a 37 °C. I monociti aderiranno alla piastra, i linfociti fluttueranno liberamente.
- Rimuovere il tampone contenente i linfociti e lavarlo due volte con RPMI.
- Sospendare i linfociti alla concentrazione desiderata.
-
Etichettare globuli rossi, PMN e linfociti.
- Etichettare ogni tipo di cellula con un colorante fluorescente diverso. Assicurarsi che ogni colorante fluoresce in un canale diverso. Seguire le istruzioni del produttore per ciascuno dei coloranti scelti.
5. Generazione di vescicole extracellulari RBC tramite l'attivazione del complemento
- Ottenere sangue intero attraverso la venipuntura utilizzando tubi EDTA.
- Passare il sangue attraverso un filtro per globuli bianchi, quindi centrifugare 3 volte a 500 x g per 10 minuti ciascuno per isolare i globuli rossi. Utilizzare HBSS++ come tampone di lavaggio.
- Crea aliquote di globuli rossi confezionati da 100 μL in tubi da 1,5 mL e aumenta il volume a 1 mL aggiungendo HBSS++.
- Aggiungere C5b,6 a una concentrazione finale di 0,18 μg/mL in HBSS++, quindi vortex.
- Mettere su uno shaker lento a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Aggiungere la proteina C7 ad una concentrazione finale di 0,2 μg/ml. Mescolare invertendo delicatamente il tubo un paio di volte. Non vortice da questo punto in avanti.
- Posizionare il tubo su uno shaker a tubo impostato a bassa velocità per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere la proteina C8 a una concentrazione finale di 0,2 μg/mL e la proteina C9 a 0,45 μg/mL. Mescolare invertendo delicatamente i tubi un paio di volte.
- Incubare a 37 °C per 30 min.
- Centrifugare il tubo a 10.000 x g per 10 min.
- Raccogliere il surnatante contenente EV in un nuovo tubo o in un nuovo tubo. Non muovere il surnatante troppo vicino al pellet cellulare.
6. Analisi delle cellule sul dispositivo di levitazione magnetica
- Eseguire l'avvio dello strumento in base alle istruzioni del produttore.
- Caricare 50 μL di campione in un tubo capillare fino a quando il tubo non viene riempito. Sigillare le estremità del tubo capillare con sigillante capillare assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.
- Caricare il tubo capillare nel supporto tra i magneti superiore e inferiore. Regola il palco e la messa a fuoco per una visualizzazione ottimale.
NOTA: Le cellule / perle possono impiegare da 5-20 minuti per raggiungere la loro posizione di equilibrio magnetico in base alla loro densità e alla concentrazione di Gd3+. Maggiore è la concentrazione di Gd3+, più breve è il tempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La levitazione magnetica focalizza oggetti di densità diverse a diverse altezze di levitazione a seconda della densità dell'oggetto, della sua firma magnetica, della concentrazione di soluzione paramagnetica e della forza del campo magnetico creato da due forti magneti in terre rare. Poiché i due magneti sono posizionati uno sopra l'altro, i campioni levitanti possono essere visualizzati solo, pur mantenendo l'illuminazione di Köhler, utilizzando un microscopio girato su un lato (Figura 1). L'altezza di levitazione finale raggiunta da ciascun tipo di cellula può essere facilmente modificata modificando la concentrazione della soluzione paramagnetica. La Figura 2 illustra la separazione delle diverse cellule del sangue circolanti utilizzando varie concentrazioni di gadolinio. I due tipi di perle con densità diverse (1,05 e 1,2 g / mL) sono stati utilizzati per fornire altezze di levitazione della densità e riferimenti dimensionali. Poiché l'altezza di levitazione di un dato tipo di cellula dipende dalla sua densità intrinseca, la levitazione magnetica fornisce un mezzo diretto per isolare le cellule di interesse senza alcuna manipolazione significativa24. Lo scopo principale di questo protocollo era quello di dimostrare la capacità della levitazione magnetica di rilevare la presenza di antigeni legati alla membrana, in questo caso il fattore Rh, sui globuli rossi circolanti. Per questo esperimento, le pere a bassa densità sono state rivestite con anticorpi di controllo IgG o anti-RhD. I campioni sono stati quindi preparati picchiando il sangue di un donatore di Rh (-) con il sangue di un Rh (+) in un rapporto di 1: 1000. Le perle rivestite di Anti-RhD(+) o le perle rivestite di IgG di controllo sono state aggiunte al campione di sangue e incubate per 10 minuti. La Figura 3A mostra il campione di controllo IgG, che non ha generato alcun complesso di perlati e globuli rossi. Successivamente, l'identità dei globuli rossi catturati dalle perle Rh(+)-positive è stata verificata pre-colorando le cellule Rh(+) con una colorazione di membrana plasmatica fluorescente e quindi seguito seguito utilizzando la microscopia a fluorescenza (Figura 3B). Un evento di rilevamento positivo è mostrato nella Figura 3C. Il legame dell'anti-Rh-bead alle cellule Rh(+) crea un complesso di perle-cellule con una densità compresa tra quella delle perle e della cellula, quindi levitando ad un'altezza situata tra le perle di cattura non legate e i globuli rossi negativi. Un primo piano dei complessi di perle-cellule è stato ripreso sotto luce fluorescente per confermare la presenza delle cellule Rh(+) etichettate con una colorazione di membrana plasmatica fluorescente. (Figura 3D). La Figura 3E mostra complessi di perle-perle che si formano tra perle ad alta e bassa densità rivestite con anticorpi per CR1 e CD47, che indicano la presenza di vescicole extracellulari. Uno schema del complesso perla-cella è mostrato nella Figura 3F.
Figura 1. Principi di levitazione magnetica: (A) Schemi del campo magnetico. (B) Un microscopio di grado di ricerca ribaltato su un lato per consentire l'imaging laterale dei bersagli che levitano nel tubo capillare. (C) Vista angolata dell'apparecchio a levitazione magnetica sotto l'obiettivo del microscopio. (D) Apparecchio di levitazione magnetica vista frontale. (E) Schemi dell'apparato a levitazione magnetica con un tubo capillare montato tra due magneti, vista frontale e laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Dimostrazione dell'equilibrio di densità cello-specifica: (A)perle a bassa e alta densità (1,05 e 1,2 g/mL) da sole a 60 mM Gd3+ (viste su un obiettivo 10x). (B) PMN che levita sopra i globuli rossi a 21 mM Gd3+, con piastrine fuori fuoco circolanti (visto su un obiettivo 10x). (C) Sangue intero levitante a 60 mM Gd3+, che è una concentrazione che si concentra sui globuli rossi (visto su un obiettivo 10x). (D) Questa cifra è stata modificata da [Tasoglu, S. et al. Citometria a immagine levitazionale con risoluzione temporale. Materiali avanzati. 27 (26), 3901-3908, DOI:10.1002/adma.201405660 (2015).] Separazione di densità di globuli rossi (rosso), PMN (verde) e linfociti (blu) a 40 mM Gd3+. Ogni popolazione cellulare levitata ad un'altezza in base alle loro densità intrinseche (vista su un obiettivo 10x). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rilevazione del fattore Rh in un campione di sangue: (A)Rh(-) sangue con picco di sangue Rh(+) e perle di controllo IgG. Non si formano complessi di perle-cellule (visti su un obiettivo 10x). (B) Campione di controllo IgG sotto luce fluorescente che evidenzia le cellule Rh(+) (visualizzate su un obiettivo 10x). (C)Sangue Rh(-) con sangue Rh(+) e perle rivestite anti-RhD, che mostrano la formazione di complessi di cellule di perle (viste su un obiettivo 10x). (D) Una vista ravvicinata di un complesso di perle-cellule sotto luce fluorescente (vista su un obiettivo 10x). (E) Perle rivestite anti-CR1 e anti-CD47 che formano complessi, indicando la presenza di vescicole extracellulari derivate da RBC (viste su un obiettivo 10x). (F) Diagramma raffigurante il complesso perle-cella. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La centrifugazione a gradiente è attualmente la tecnica standard per isolare i componenti subcellulari in base alle loro densità uniche. Questo approccio, tuttavia, richiede l'uso di mezzi gradienti specializzati e apparecchiature centrifughe. L'approccio a levitazione magnetica qui presentato consente un'indagine dettagliata delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule circolanti, con una manipolazione minima, se non nulla, delle cellule, fornendo un accesso quasi in vivo alle cellule circolanti.
Tuttavia, quando si utilizza la levitazione magnetica, vale la pena menzionare diversi punti. In primo luogo, il microscopio utilizzato per l'imaging deve essere dedicato a questo metodo, in quanto la configurazione richiede molto tempo e richiede che il microscopio sia parzialmente smontato, posizionato perfettamente orizzontalmente con l'ottica allineata con precisione con i magneti e il tubo capillare. In secondo luogo, il jack da laboratorio e gli stadi traslazionali utilizzati per regolare i movimenti del vetro capillare e la messa a fuoco richiedono un posizionamento esatto e un movimento libero su ciascuno dei tre assi. Probabilmente l'allineamento più critico dell'intera configurazione, è il montaggio del dispositivo di levitazione magnetica nelle fasi traslazionali in modo tale che i magneti superiore e inferiore siano perfettamente allineati con il vettore gravitazionale e perfettamente orizzontali. Qualsiasi deviazione da questi requisiti creerebbe un angolo tra la forza magnetica e la gravità che spingerebbe le cellule verso entrambi i lati del tubo capillare, interrompendo il processo di levitazione e rendendo i risultati inaffidabili.
La concentrazione ottimale della soluzione di gadolinio utilizzata per levitare le cellule deve essere regolata per il tipo di cellula e l'obiettivo dell'esperimento. I cambiamenti nella concentrazione della soluzione di gadolinio altereranno significativamente l'altezza di levitazione delle cellule analizzate e quindi devono essere mantenuti costanti da una serie di esperimenti all'altro. Se la concentrazione è troppo bassa, a seconda della densità delle cellule bersaglio, potrebbero non levitare affatto, mentre se è troppo alta, limiteranno la gamma di cambiamenti rilevabili che possono essere quantificati con precisione.
Le strutture levitanti creeranno bande stabili se le uniche forze che agiscono su di esse sono la gravità e la repulsione magnetica. La presenza anche di una bolla di dimensioni millimetriche nel tubo capillare creerà piccole correnti circolari all'interfaccia aria-liquido, che disturberanno le cellule levitanti, rendendo praticamente impossibile qualsiasi analisi. Quando si carica un campione in un tubo capillare, e quindi dopo la sigillatura, è necessario assicurarsi che non sia presente aria, esaminando il capillare sotto uno stereomicroscopio o un obiettivo a bassa potenza (4x).
La levitazione delle cellule ad una stessa altezza dipende dal fatto che la loro firma magnetica rimanga la stessa nel tempo. Se gli ioni gadolinio paramagnetico dal mezzo di levitazione entrano nelle cellule, attraverso la pinocitosi o l'aumento della permeabilità della membrana, come durante l'apoptosi, l'aumento della densità cellulare misurato in base alle perle di riferimento della densità sarà errato. Fortunatamente, la maggior parte delle cellule circolanti ha scarse capacità pinocitiche26, rendendo questo metodo un approccio adatto per lo studio delle cellule per lunghi periodi di tempo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Getulio Pereira per il suo aiuto con il lavoro sulle vescicole extracellulari.
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni del National Institute of Health all'ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 e UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al.
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M.
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al.
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
