Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

القياس الكمي للكثافة الخلوية والخصائص المضادة للجينات باستخدام الارتفاع المغناطيسي

Published: May 17, 2021 doi: 10.3791/62550
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 2
1Nano Flow Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Allergy and Inflammation, Beth Israel Deaconess Medical Center

Summary

تصف هذه الورقة طريقة قائمة على الارتفاع المغناطيسي يمكنها الكشف على وجه التحديد عن وجود المستضدات ، إما قابلة للذوبان أو مقيدة بالغشاء ، عن طريق تحديد التغيرات في ارتفاع ارتفاع حبات الالتقاط ذات الكثافات الثابتة.

Abstract

تم تطوير الطريقة الموصوفة على أساس مبادئ الارتفاع المغناطيسي ، الذي يفصل بين الخلايا والجسيمات على أساس كثافتها وخصائصها المغناطيسية. الكثافة هي نوع الخلية تحديد الممتلكات، ترتبط مباشرة إلى معدل الأيض، والتمايز، وحالة التنشيط. يسمح الارتفاع المغناطيسي بنهج خطوة واحدة لفصل خلايا الدم المتداولة بشكل ناجح، وصورها وتوصيفها، والكشف عن فقر الدم، وأمراض الخلايا المنجلية، وتعميم الخلايا السرطانية على أساس الكثافة والخصائص المغناطيسية. هذا النهج قابل أيضا للكشف عن المستضدات القابلة للذوبان الموجودة في محلول باستخدام مجموعات من الخرز منخفض الكثافة وعالي الكثافة المغلفة بالأجسام المضادة للالتقاط والكشف ، على التوالي. إذا كان المستضد موجودا في الحل ، فإنه سيتم جسر مجموعتين من الخرز ، وتوليد مجمع حبة حبة جديدة ، والتي سوف ترتفع بين صفوف الخرز المغلفة بالأجسام المضادة. زيادة تركيز المستضد المستهدف في المحلول سوف تولد عددا أكبر من مجمعات حبة الخرز بالمقارنة مع تركيزات أقل من المستضد، مما يسمح بإجراء قياسات كمية للمضاد المستهدف. الارتفاع المغناطيسي مفيد لطرق أخرى بسبب انخفاض وقت إعداد العينة وعدم الاعتماد على طرق القراءة الكلاسيكية. يتم التقاط الصورة التي تم إنشاؤها بسهولة وتحليلها باستخدام المجهر القياسي أو الجهاز المحمول، مثل الهاتف الذكي أو الكمبيوتر اللوحي.

Introduction

الارتفاع المغناطيسي هو تقنية تم تطويرها لفصل وتحليل وتحديد أنواع الخلايا1و2و3والبروتينات4و5 والمواد الأفيونية6 استنادا فقط إلى كثافتها المحددة وخصائصها المغناطيسية. كثافة الخلية هي فريدة من نوعها، خاصية جوهرية من كل نوع الخلية ذات الصلة مباشرة لمعدل الأيض والتمايز حالة7،8،9،10،11،12،13،14. إن تحديد التغيرات الدقيقة والعابرة في كثافة الخلايا خلال ظروف الحالة الثابتة، وخلال مجموعة متنوعة من عمليات الخلايا، يمكن أن يوفر للمرء نظرة ثاقبة لا مثيل لها في فسيولوجيا الخلايا والفيزيولوجيا المرضية. وترتبط التغيرات في كثافة الخلية مع تمايز الخلية15،16، تطور دورة الخلية9،17،18،19، موت الخلايا المبرمج20،21،22،23، والتحول الخبيث24،25،26 . لذلك ، يمكن استخدام القياس الكمي للتغيرات المحددة في كثافة الخلايا ، للتمييز بين الخلايا من أنواع مختلفة ، وكذلك التمييز بين نفس النوع من الخلايا التي تخضع لعمليات تنشيط مختلفة. وهذا يمكن التجارب التي تستهدف خلية معينة من السكان الفرعيين، حيث التغيرات الديناميكية في الكثافة بمثابة مؤشر على تغيير استقلاب الخلية27. كما ثبت أن الخلية قد تغير كثافتها استجابة لبيئة متغيرة7، فمن الضروري قياس حركية الخلية فيما يتعلق بكثافتها لفهمها بشكل كامل ، والتي قد لا توفرها الطرق الحالية12. الارتفاع المغناطيسي من ناحية أخرى، يسمح لتقييم ديناميكي للخلايا وخصائصها28.

الخلايا هي ثنائية المغناطيسية بمعنى أنها لا تملك لحظة ثنائي القطب المغناطيسي الدائم. ومع ذلك ، عندما تتعرض لحقل مغناطيسي خارجي ، يتم إنشاء لحظة ثنائي القطب المغناطيسي ضعيفة في الخلايا ، في الاتجاه المعاكس للمجال التطبيقي. وهكذا، إذا تم تعليق الخلايا في محلول مغناطيسي وعرضها لحقل مغناطيسي عمودي قوي، فإنها سوف ترتفع بعيدا عن المصدر المغناطيسي وتتوقف إلى ارتفاع، والذي يعتمد في المقام الأول على كثافتها الفردية. الارتفاع ثنائي المغناطيسي للجسم المحصور في الحد الأدنى من المجال المغناطيسي غير المتجانس ممكن عندما يتم استيفاء المعيارين التاليين: 1) يجب أن تكون الحساسية المغناطيسية للجسيمات أصغر من المتوسط المحيط ، و 2) يجب أن تكون القوة المغناطيسية قوية بما يكفي لموازنة قوة الطفو للجسيمات. ويمكن الوفاء بكلا المعيارين عن طريق تعليق RBCs في العازلة المغناطيسية وخلق تدرجات المجال المغناطيسي قوية مع مغناطيس دائم صغيرة وغير مكلفة ومتاحة تجاريا1. يتم تحديد موضع توازن جسيم محصور مغناطيسيا على محور على طول اتجاه الجاذبية من خلال كثافته (بالنسبة لكثافة العازلة) ، وقابليته المغناطيسية (بالنسبة للحساسية المغناطيسية للحاجز) ، وتوقيع المجال المغناطيسي التطبيقي. وبما أن الكثافة والخصائص المغناطيسية للمحلول ثابتة في جميع أنحاء النظام ، فإن خصائص الكثافة الجوهرية للخلايا ستكون العامل الرئيسي الذي يحدد ارتفاع ارتفاع الخلايا ، مع خلايا أكثر كثافة ترتفع أقل مقارنة بالخلايا الأقل كثافة. يستخدم هذا النهج مجموعة من حبات مرجعية ذات كثافة (1.05 و 1.2 غرام/مل) تسمح لنا باستخدام تحليل دقيق وقياسي لقياس الكثافة. تغيير تركيز المحلول المغناطيسي يسمح لأحد لعزل مجموعات مختلفة من الخلايا، مثل RBCs من WBCs، وكثافة الخلايا المتداولة هي خلية محددة، وإزالة الحاجة إلى بروتوكولات العزل أو التلاعب الخلية الأخرى.

تعتمد غالبية طرق الكشف المستخدمة في أبحاث البيولوجيا على استقراء أحداث ملزمة محددة في سهولة تحديد الإشارات الخطية. وغالبا ما تكون أساليب القراءة هذه معقدة وتنطوي على معدات متخصصة وموظفين علميين متفرغين. وصف نهج يهدف إلى الكشف عن المستضدات الموجودة إما على غشاء البلازما للخلايا أو الحويصلات خارج الخلية أو القابلة للذوبان في البلازما ، باستخدام حبة واحدة أو اثنتين من الأجسام المضادة المغلفة . يجب أن تكون الخرز ذات كثافات مختلفة عن بعضها البعض ومن تلك الخاصة بالأهداف التي تم استجوابها. يتم ترجمة وجود مستضد الهدف في أي سائل حيوي معين إلى تغيير محدد وقابل للقياس في ارتفاع الارتفاع لخلية إيجابية مستضد مرتبطة بالخرزة الكشفية. في حالة المستضدات القابلة للذوبان أو الحويصلات خارج الخلية ، فهي ملزمة بالتقاط والخرز والكشف عنه ، مما يشكل مجمع حبة حبة بدلا من مجمع خلايا الخرز. يعتمد التغيير في ارتفاع الارتفاع على الكثافة الجديدة لمجمعات خلية الخرز أو حبة الخرز. بالإضافة إلى التغير في ارتفاع الارتفاع للمجمعات ، مما يشير إلى وجود مستضد في السائل الحيوي ، يعتمد عدد المجمعات أيضا على مقدار الهدف ، مما يجعل الارتفاع المغناطيسي أيضا نهجا كميا للكشف عن المستضد24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي المستخدم في هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمركز بيت إسرائيل الطبي (IRB).

1. إعداد الصك

ملاحظة: يتطلب التصوير رفع الخلايا اثنين من المغناطيس النيودميوم الأرض النادرة ممغنطة على المحور ض ليتم وضعها مع القطب نفسه التي تواجه بعضها البعض لتوليد حقل مغناطيسي. يمكن تخصيص المسافة بين المغناطيس اعتمادا على كثافة المجال المغناطيسي وكثافة الأهداف. في هذه الحالة يتم فصل المغناطيس بمساحة 1mm كافية لإدراج 50 ملم طويلة 1x1 مم مربع أنبوب زجاجي شعري. تم طباعة الجهاز ثلاثي الأبعاد باستخدام تصميم AutoCAD ، وهو متاح عند الطلب.

  1. وضع المجهر على جانبها، أفقي تماما.
    ملاحظة: المجهر الموضوع في وضع مستقيم قياسي غير مناسب مباشرة لتصوير الأجسام المرفوعة بسبب مواقع المغناطيس فيما يتعلق بالمكثف والهدف. يمكن تجاوز هذا القيد عن طريق وضع المجهر على جانبه ، أفقيا تماما مما يسمح للمكثف بتركيز الضوء في الشعرية ، والعدسة الموضوعية لتصوير الخلية التي ترتفع بين المغناطيس ، مع الحفاظ على متطلبات إضاءة Köhler.
  2. دعم ومستوى الموقف على طاولة الاتساع باستخدام 2 أو 3 مقابس المختبر.
  3. للحد من الاهتزازات، قم بدعم طاولة لوح الخبز بأقدام مطاطية مبللة.
  4. إزالة المرحلة واستبدالها بمقبس معمل مضغوط لضبط ارتفاع جهاز الرفع(المحور ص)،ومرحلتين تحويليتين أحاديتي المحور؛ واحد لضبط التركيز(ض المحور)، والثاني لمسح أنبوب الشعرية.
  5. قم بتوصيل جهاز الرفع المغناطيسي بمقبس المختبر باستخدام وظيفتين بصريتين صغيرتين.

2. ربط الأجسام المضادة لكاربوكوسي-Microparticles/الخرز (تعديل من بروتوكول من قبل PolyAn)

ملاحظة: تحتاج الخرز منخفض الكثافة فقط (1.05 جم/مل) إلى أن تكون مغلفة للكشف عن Rh(+)، ولكن يتم تغطية كل من الخرز عالي الكثافة ومنخفض الكثافة للكشف عن الحويصلات خارج الخلية.

  1. إخراج 1 ملغ ما يعادل تعليق حبة وإضافة إلى 0.5 مل من تنشيط العازلة (50 mM MES (MW195.2, 9.72 ملغ في 1 مل)) الرقم الحموضة 5.0 و 0.001٪ بوليسوربات-20).
  2. إضافة 12 ميكرولتر من EDC 1.5 M الطازجة (MW 191.7، 0.28755 غرام في 1 مل) و 12 ميكرولتر من 0.3 M Sulfo-NHS (MW 217.14، 0.0651 غرام في 1 مل) في الماء البارد الجليد.
  3. وضع أنابيب على شاكر المداري ويهز بقوة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لتنشيط مجموعات الكربوسيل على الخرز.
  4. إيقاف التنشيط بعد 1 ساعة بإضافة 0.5 مل من اقتران المخزن المؤقت (10x PBS، أو 0.1 M فوسفات pH 7-9).
  5. بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي في 20،000 × ز لمدة 10 دقيقة، أو، إذا كان لا يمكن بيليه الخرز، واستخدام 0.45 ميكرومتر فلتر أنبوب الطرد المركزي. يستنشق الفائقة أو التدفق من خلال.
  6. غسل الخرز مع 1 مل من 10x برنامج تلفزيوني 3 مرات كما هو الحال في الخطوة 2.5.
  7. حساب 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل حبات ملغ ومزيج الأجسام المضادة المطلوبة مع الخرز المنشط إلى تركيز الأجسام المضادة النهائي 0.7-1.0 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني 10X.
  8. وضع أنابيب على أنبوب الروك تعيين على سرعة منخفضة. لفة أنابيب بلطف في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لاقتران.
  9. كرر الخطوة 2.5 وغسل الخرز مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 10x.
  10. اغسله مع 0.5 مل من 1 M الإيثانولامين (98٪ مخزون = 16.2 M) في درجة الحموضة العازلة 8.0 مع 0.02٪ Polysorbate-20 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أثناء اهتزاز بلطف.
  11. كرر الخطوة 2.5 واغسل الخرز مرة واحدة في 1 مل من DPBS. يمكن تخزين الخرز في 200 ميكرولتر من DPBS عند 4 درجة مئوية حتى الحاجة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

3. جمع وإعداد الدم للكشف Rh(+)

  1. باستخدام جهاز lancing بنقرة واحدة، وخز إصبع المتبرع Rh(+) وجمع 10 ميكرولتر من الدم إلى 1 مل من DPBS.
  2. وصمة عار في الخلايا Rh + مع بقعة غشاء البلازما الفلورسنت. اختياريا، إضافة 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت إلى تعليق 1 مل من الخلايا Rh+ (1:1000 التخفيف).
  3. احتضان الخلايا مع صبغة الفلورسنت في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. بيليه الخلايا عن طريق الغزل في 5600 × غرام لمدة 15 ق وغسل 3 مرات باستخدام 1 مل من DPBS. ريسوسبند في 1 مل من HBSS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS ++).
  5. باستخدام جهاز lancing بنقرة واحدة ، وخز إصبع متبرع Rh(-) وجمع 2 ميكرولتر من الدم.
    ملاحظة: إذا كان إعداد أكثر من 2 الشروط، وجمع ما يكفي من الدم لإضافة 1 ميكرولتر من Rh(-) الدم إلى كل أنبوب.
  6. إعداد الأنابيب التجريبية اللازمة: الخرز وحدها، التحكم IgG، عينة.
    1. الخرز وحده: إضافة 174 ميكرولتر من HBSS ++، 1 ميكرولتر من الخرز التحكم IgG، 1 ميكرولتر من الخرز عالية الكثافة (1.2 غرام / مل)، و 24 ميكروغرام من 500 MM GD3+ (60 mM).
    2. التحكم IgG: إضافة 172 ميكرولتر من HBSS ++, 1 ميكرولتر من الخرز التحكم IgG, 1 ميكرولتر من الخرز عالية الكثافة, 1 ميكرولتر من Rh- الدم, 1 ميكرولتر من ملطخة Rh + تعليق الدم, و 24 ميكرولتر من 500 mM GD3+.
    3. أنبوب عينة إضافة 172 ميكرولتر من HBSS ++، 1 ميكرولتر من الخرز المغلفة المضادة لل RhD، 1 ميكرولتر من الخرز عالية الكثافة، 1 ميكرولتر من Rh-الدم، 1 ميكرولتر من تعليق الدم الملون Rh(+)، و 24 ميكروغرام من 500 مليون غرام من GD3 +.
      ملاحظة: تضاف الخرز عالية الكثافة إلى عينات Rh للرجوع إليها.

4. عزل PMNs للتظاهر فصل الخلية

  1. عزل العدلات
    1. ارسم 40 مل من الدم الوريدي في حقنة سعة 60 مل تحتوي على 6 مل من حمض سيترات الصوديوم /الستريك (0.15 م، درجة الحموضة 5.5) و14 مل من 6٪ Dextran-70.
    2. انتظر لمدة 50 دقيقة للدم إلى الرواسب.
    3. طبقة ببطء خلايا معطف برتقالي على رأس 20 مل من Ficoll-Paque عن طريق دفع أعلى 18 مل من خلال أنابيب جمع الدم في أنبوب 50 مل، وتجنب التلوث مع RBCs المترسبة. فمن المستحسن استخدام مجموعة جديدة لجمع الدم، لتقليل التلوث مع RBCs المتبقية المتبقية في أنبوب جمع الدم الأصلي.
    4. بيليه الخلايا معطف بافي عن طريق الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3000 × ز. العدلات وتلوث RBCs سوف بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. سوف PBMC تشكيل طبقة بيضاء على رأس Ficoll-باك.
    5. نقل العدلات إلى أنبوب جديد 50 مل.
    6. Lyse أي RBCs المتبقية عن طريق احتضان العدلات مع 20 مل من 0.2٪ محلول NaCl الباردة لمدة 25 ثانية، تليها إضافية 20 مل من 1.6٪ NaCl. يجب أن يكون الحفل النهائي ل NaCl 0.9٪ (متساوي التوتر).
    7. الطرد المركزي تعليق لمدة 10 دقيقة في 3000 x ز.
    8. إزالة supernatant وإعادة إنفاق العدلات إلى التركيز المطلوب.
  2. عزل الخلايا الليمفاوية
    1. لوحة PBMCs في RPMI مع 5٪ الحرارة المعطل المصل في لوحات الثقافة 6-جيدا.
    2. احتضان لوحات لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. سوف Monocytes تلتزم لوحة، وسوف تكون الخلايا الليمفاوية العائمة بحرية.
    3. إزالة العازلة التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية وغسله مرتين مع RPMI.
    4. إعادة تمركز الخلايا اللمفاوية في التركيز المطلوب.
  3. تسمية RBCs، PMN، والخلايا الليمفاوية.
    1. تسمية كل نوع الخلية مع صبغة الفلورسنت مختلفة. تأكد من كل فلوريس صبغة في قناة مختلفة. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لكل من الأصباغ المختارة.

5. جيل من Vesicles خارج الخلية RBC عن طريق تفعيل تكملة

  1. الحصول على الدم الكامل من خلال venipuncture باستخدام أنابيب EDTA.
  2. تمرير الدم من خلال مرشح خلايا الدم البيضاء، ومن ثم الطرد المركزي 3 مرات في 500 × ز لمدة 10 دقيقة لكل لعزل خلايا الدم الحمراء. استخدم HBSS++ كحاجز غسيل.
  3. جعل aliquots من 100 ميكرولتر RBCs معبأة في أنابيب 1.5 مل، وجعل حجم إلى 1 مل عن طريق إضافة HBSS ++.
  4. إضافة C5b,6 إلى تركيز نهائي 0.18 ميكروغرام/مل في HBSS++, ثم دوامة.
  5. وضع على شاكر بطيء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. أضف بروتين C7 إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ميكروغرام/مل. مزيج عن طريق عكس الأنبوب بلطف عدة مرات. لا دوامة من هذه النقطة إلى الأمام.
  7. ضع الأنبوب على أنبوب شاكر تعيين بسرعة منخفضة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. أضف بروتين C8 إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ميكروغرام/مل، وبروتين C9 إلى 0.45 ميكروغرام/مل. مزيج عن طريق عكس الأنابيب بلطف عدة مرات.
  9. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. الطرد المركزي الأنبوب في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة.
  11. جمع النافورة التي تحتوي على EV في أنبوب جديد (ق). لا تترى نقل الناطقة قريبة جدا من بيليه الخلية.

6. تحليل الخلايا على جهاز الارتفاع المغناطيسي

  1. تنفيذ بدء تشغيل الأداة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. تحميل 50 ميكرولتر من العينة في أنبوب الشعرية حتى يتم تعبئة الأنبوب. ختم نهايات الأنبوب الشعري مع تسرب الشعرية التأكد من عدم وجود فقاعات الهواء الحالية.
  3. تحميل أنبوب الشعرية في حامل بين المغناطيس العلوي والسفلي. ضبط المرحلة والتركيز على عرض الأمثل.
    ملاحظة: يمكن أن تأخذ الخلايا / الخرز في أي مكان من 5-20 دقيقة للوصول إلى وضع التوازن المغناطيسي على أساس كثافتها وتركيز GD3 +. كلما زاد تركيز GD3 +، كلما كان الوقت أقصر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يركز الارتفاع المغناطيسي الأجسام ذات الكثافات المختلفة على ارتفاعات مختلفة للارتفاع اعتمادا على كثافة الجسم ، وتوقيعه المغناطيسي ، وتركيز المحلول المغناطيسي ، وقوة المجال المغناطيسي الذي أنشأه مغناطيسان قويان نادران. كما يتم وضع المغناطيس اثنين فوق بعضها البعض، يمكن فقط أن ينظر إلى عينات الرفع، مع الحفاظ على الإضاءة كوهلر، وذلك باستخدام المجهر تحولت على جانبها(الشكل 1). يمكن بسهولة تعديل الارتفاع النهائي للارتفاع الذي يصل إليه كل نوع من أنواع الخلايا عن طريق تغيير تركيز المحلول المغنطيسي. يوضح الشكل 2 فصل خلايا الدم المتداولة المختلفة باستخدام تركيزات مختلفة من gadolinium. تم استخدام نوعي الخرز بكثافات مختلفة (1.05 و 1.2 غرام / مل) لتوفير ارتفاعات ارتفاع الكثافة ومراجع الحجم. كما ارتفاع الارتفاع من نوع خلية معينة يعتمد على كثافتها الجوهرية، الارتفاع المغناطيسي يوفر وسيلة مباشرة لعزل الخلايا ذات الأهمية دون أي تلاعب كبير24. كان الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول هو إظهار قدرة الارتفاع المغناطيسي على اكتشاف وجود مستضدات ملزمة بالغشاء ، في هذه الحالة عامل Rh ، على تداول خلايا الدم الحمراء. لهذه التجربة، كانت مغلفة الخرز منخفضة الكثافة مع الأجسام المضادة للسيطرة IgG أو المضادة للRhD. ثم تم إعداد العينات عن طريق رفع الدم من متبرع Rh(-) مع الدم من Rh(+) بنسبة 1:1000. تمت إضافة الخرز المغلف المضاد ل RhD(+) أو الخرز المغلف IgG إلى عينة الدم واحتضانه لمدة 10 دقائق. ويبين الشكل 3 ألف عينة التحكم في IgG، التي لم تولد أي مجمعات خلايا الدم الحمراء الخرز. بعد ذلك ، تم التحقق من هوية خلايا الدم الحمراء التي استولت عليها الخرز Rh(+) الإيجابية عن طريق تلطيخ خلايا Rh(+) مسبقا ببقعة غشاء البلازما الفلورية ، ثم صورت باستخدام المجهر الفلوري(الشكل 3B). يظهر حدث الكشف الإيجابي في الشكل 3C. الربط بين مكافحة Rh-حبة ل Rh(+) الخلايا يخلق مجمع خلية حبة مع كثافة بين أن من الخرز والخلية، وبالتالي رفع على ارتفاع يقع بين حبات التقاط غير منضم وRBCs السلبية. تم تصوير صورة عن قرب لمجمعات خلايا الخرز تحت ضوء الفلورسنت لتأكيد وجود خلايا Rh(+) المسماة ببقعة غشاء البلازما الفلورية. (الشكل 3D). ويبين الشكل 3E مجمعات حبة حبة تتشكل بين حبات عالية ومنخفضة الكثافة مغلفة بأجسام مضادة ل CR1 و CD47، مما يشير إلى وجود حويصلات خارج الخلية. يظهر تخطيطي لمجمع خلية الخرز في الشكل 3F.

Figure 1
الشكل 1. مبادئ الارتفاع المغناطيسي: (أ) تخطيطات المجال المغناطيسي. (ب)المجهر درجة البحث يميل على جانبها للسماح التصوير الجانبي للأهداف الارتفاع في أنبوب الشعرية. (ج) منظر زاوية لجهاز الرفع المغناطيسي تحت الهدف المجهر. (د) جهاز الارتفاع المغناطيسي عرض أمامي. (E) تخطيطات جهاز الرفع المغناطيسي مع أنبوب شعري مثبت بين مغناطيسين، وجهة نظر أمامية وجانبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. عرض توضيحي لتوازن الكثافة الخاصة بالخلايا: (A)حبات منخفضة وعالية الكثافة (1.05 و 1.2 غرام/مل) وحدها عند 60 mM GD3+ (ينظر إليها على هدف 10x). (ب) PMNs ترتفع فوق خلايا الدم الحمراء في 21 MM GD3 +، مع الصفائح الدموية خارج التركيز المتداولة (ينظر إليها على هدف 10x). (ج) ارتفاع الدم كله في 60 mM GD3 +، وهو التركيز الذي يركز على RBCs (ينظر إليها على هدف 10x). (د)تم تعديل هذا الرقم من [تاسوغلو، س. وآخرون. قياس الخلايا للصورة الارتفاعية مع الدقة الزمنية. المواد المتقدمة. 27 (26)، 3901-3908، doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] فصل الكثافة من RBCs (أحمر) ، PMNs (الأخضر) والخلايا الليمفاوية (الأزرق) في 40 mM GD3 +. كل مجموعة خلايا ترتفع على ارتفاع على أساس كثافاتها الجوهرية (ينظر إليها على هدف 10x). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 3
الشكل 3. الكشف عن عامل Rh في عينة الدم: (أ)Rh(-) الدم ارتفعت مع Rh(+) الدم والخرز التحكم IgG. لا يتم تشكيل مجمعات خلية حبة (ينظر إليها على هدف 10x). (ب) عينة التحكم IgG تحت ضوء الفلورسنت تسليط الضوء على الخلايا Rh(+) (ينظر إليها على هدف 10x). (ج)Rh(-) الدم ارتفعت مع Rh(+) الدم والخرز المغلفة المضادة للRhD، مما يدل على تشكيل مجمعات خلية حبة (ينظر إليها على هدف 10x). (D)عرض عن قرب لمجمع خلية حبة تحت ضوء الفلورسنت (ينظر إليها على هدف 10x). (ه) مكافحة CR1 ومكافحة CD47 الخرز المغلفة تشكيل المجمعات، مما يدل على وجود الحويصلات RBC المستمدة خارج الخلية (ينظر إليها على هدف 10x). (F) رسم تخطيطي يصور مجمع خلية الخرز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطارد المركزي المتدرجة حاليا تقنية قياسية لعزل المكونات دون الخلوية على أساس كثافات فريدة من نوعها. غير أن هذا النهج يتطلب استخدام وسائط متخصصة متدرجة ومعدات للطرد المركزي. يسمح نهج الارتفاع المغناطيسي المعروض هنا بإجراء تحقيق مفصل في الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا المتداولة ، مع الحد الأدنى ، إن وجد من التلاعب بالخلايا ، مما يوفر وصولا قريبا في الجسم الحي إلى الخلايا المتداولة.

ومع ذلك، عند استخدام الارتفاع المغناطيسي عدة نقاط جديرة بالذكر. أولا ، يجب أن يكون المجهر المستخدم للتصوير مخصصا لهذه الطريقة ، حيث أن الإعداد يستغرق وقتا طويلا ، ويتطلب تفكيك المجهر جزئيا ، ووضعه أفقيا تماما مع البصريات المنحازة بدقة مع المغناطيس وأنبوب الشعرية. ثانيا، جاك المختبر والمراحل التحويلية المستخدمة لضبط حركات الزجاج الشعري والتركيز تتطلب تحديد المواقع الدقيق وحرية الحركة على كل من المحاور الثلاثة. من المرجح أن المحاذاة الأكثر أهمية من الإعداد بأكمله ، هو تركيب جهاز الارتفاع المغناطيسي في المراحل التحويلية بحيث يتم محاذاة المغناطيس العلوي والسفلي تماما مع متجه الجاذبية وكذلك أفقي تماما. أي انحراف عن هذه المتطلبات من شأنه أن يخلق زاوية بين القوة المغناطيسية والجاذبية التي من شأنها دفع الخلايا نحو جانبي الأنبوب الشعري ، وتعطيل عملية الارتفاع ، وجعل النتائج غير موثوقة.

التركيز الأمثل للمحلول gadolinium المستخدمة لرفع الخلايا يحتاج إلى تعديل لنوع الخلية والهدف من التجربة. التغيرات في تركيز محلول gadolinium سوف تغير بشكل كبير ارتفاع الارتفاع من الخلايا التي يجري تحليلها، وبالتالي يحتاج إلى أن تبقى ثابتة من مجموعة واحدة من التجارب إلى أخرى. إذا كان التركيز منخفضا جدا ، اعتمادا على كثافة الخلايا المستهدفة ، فقد لا ترتفع على الإطلاق ، في حين أنه إذا كان مرتفعا جدا ، فسوف يحد من نطاق التغييرات القابلة للكشف التي يمكن قياسها بدقة.

سوف الهياكل رفع خلق عصابات مستقرة إذا كانت القوى الوحيدة التي تعمل عليها هي الجاذبية والنفور المغناطيسي. وجود حتى فقاعة بحجم ملليمتر في الأنبوب الشعري سيخلق تيارات دائرية صغيرة في واجهة الهواء السائل ، مما سيزعج الخلايا الارتفاعية ، مما يجعل أي تحليل مستحيلا تقريبا. عند تحميل عينة في أنبوب شعري، وبعد ذلك بعد الختم، يجب على المرء التأكد من عدم وجود هواء، من خلال فحص الشعرية تحت منظار مجسم أو هدف منخفض الطاقة (4x).

ارتفاع الخلايا على ارتفاع مجموعة يعتمد على توقيعها المغناطيسي البقاء على حاله مع مرور الوقت. إذا دخلت أيونات gadolinium paramagnetic من وسائط الرفع إلى الخلايا ، إما عن طريق pinocytosis أو زيادة نفاذية الغشاء ، كما هو الحال أثناء موت الخلايا المبرمج ، فإن كثافة الخلية المتزايدة التي تقاس استنادا إلى الخرز المرجعي للكثافة ستكون خاطئة. لحسن الحظ، فإن معظم الخلايا المتداولة لديها قدرات بينوسيتيك ضعيفة26،مما يجعل هذه الطريقة نهجا مناسبا لدراسة الخلايا على مدى فترات طويلة من الزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في الكشف عن المعلومات.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جيلوليو بيريرا على مساعدته في العمل خارج الخلية.

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للصحة التالية إلى ICG: RO1CA218500 وUG3HL147353 وUG3TR002881.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma Aldrich M-2933 (MES); component of activation buffer
50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness K&J Magnetics Custom Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal) Leica Microsystems 267620 Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) Sigma Aldrich CLS8163 Used to wash beads
Compact Lab Jack Thorlabs LJ750 Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-144 Solution for bead suspensions
Ethanolamine Sigma Aldrich E9508-100ML Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) Invitrogen C37608 Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection ProHance NDC 0270-1111-03 Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++ Gibco 14025-092 Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex Complement Technology, Inc A122 Used to generate RBC Evs
Human C7 protein Complement Technology, Inc A124 Used to generate RBC Evs
Human C8 protein Complement Technology, Inc A125 Used to generate RBC Evs
Human C9 protein Complement Technology, Inc A126 Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar Thorlabs MSR2 Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E1769-10G (EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control R&D Systems AB-105-C Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) Boston Bioproducts BM-220 Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20) Sigma Aldrich P7949-500ML Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer Bangs Laboratories PC06004 Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody Invitrogen PA5-112694 Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope Olympus Provis AX-70 Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet Thorlabs RDF1 Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing VitroTubes 8100-050 Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS Thermoscientific 24510 Used in antibody coupling reaction
Translational Stage Thorlabs PT1 Used for focusing and for scanning capillary tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
  2. Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
  3. Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
  4. Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
  5. Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
  6. Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
  7. Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
  8. Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
  9. Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
  10. Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
  11. Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
  12. Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
  13. Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
  14. Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
  15. Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
  16. Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
  17. Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
  18. Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
  19. Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
  20. Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
  21. Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
  22. Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
  23. Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
  24. Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
  25. Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
  26. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  27. Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
  28. Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
  29. Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).

Tags

علم الأحياء، العدد 171، الارتفاع المغناطيسي، كثافة الخلية، مجمع الخرز والخلايا، المجهر الفلوري
القياس الكمي للكثافة الخلوية والخصائص المضادة للجينات باستخدام الارتفاع المغناطيسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thompson, L., Pinckney, B., Lu, S.,… More

Thompson, L., Pinckney, B., Lu, S., Gregory, M., Tigges, J., Ghiran, I. Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation. J. Vis. Exp. (171), e62550, doi:10.3791/62550 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter