Summary
Haemophilus influenzae inducerar inflammation i luftvägarna. Denna artikel kommer att fokusera på användningen av flödescytometri och konfokalmikroskopi för att definiera immunsvar av fagocyter och lymfocyter som svar på denna bakterie.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) är en utbredd bakterie som finns i en rad andningsbesvär. En mängd olika analyser/tekniker kan användas för att bedöma det respiratoriska immuna/inflammatoriska svaret på denna bakterie. Flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade tekniker som möjliggör detaljerad karakterisering av biologiska svar. Olika former av Hi-antigen kan användas, inklusive cellväggskomponenter, dödade / inaktiverade preparat och levande bakterier. Hej är en krånglig bakterie som kräver berikade medier men är i allmänhet lätt att odla i vanliga laboratoriemiljöer. Vävnadsprover för stimulering med Hi kan erhållas från perifert blod, bronkoskopi eller resekterad lunga (t.ex. hos patienter som genomgår kirurgi för behandling av lungcancer). Makrofag och neutrofil funktion kan utvärderas omfattande med hjälp av flödescytometri med en mängd olika parametrar uppmätta, inklusive fagocytos, reaktiva syrearter och intracellulär cytokinproduktion. Lymfocytfunktionen (t.ex. T-cells- och NK-cellfunktion) kan bedömas specifikt med hjälp av flödescytometri, främst för intracellulär cytokinproduktion. Hi-infektion är en potent inducerare av extracellulär fällproduktion, både av neutrofiler (NET) och makrofager (METs). Konfokalmikroskopi är utan tvekan det mest optimala sättet att bedöma NET- och MET-uttryck, som också kan användas för att bedöma proteasaktivitet. Lungimmunitet mot Haemophilus influenzae kan bedömas med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) är en normal kommensal bakterie som finns i svalget hos de flesta friska vuxna. Hi kan ha en polysackaridkapsel (typ A-F, t.ex. typ B eller HiB) eller sakna kapsel och vara icke-skrivbar (NTHi)1. Kolonisering av slemhinnan med denna bakterie börjar i tidig barndom, och det finns en omsättning av olika koloniserande stammar2. Denna bakterie kan också invasionen av både övre och nedre luftvägarna; I detta sammanhang kan det inducera aktivering av immunsvaret och inflammation 3,4. Detta inflammatoriska svar kan orsaka klinisk sjukdom och bidra till en mängd viktiga andningsbesvär, inklusive bihåleinflammation, otitis media, bronkit, cystisk fibros, lunginflammation och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). De flesta av dessa förhållanden beror på NTHi-stammar2. Denna artikel kommer att beskriva metoder för att bedöma respiratoriska immunsvar mot Hi med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.
Metoderna som beskrivs nedan har anpassats från väletablerade tekniker som har modifierats för att bedöma det inflammatoriska svaret på Hi. Valet av en lämplig antigenform av Hi är en viktig del av denna bedömning. Antigena preparat sträcker sig från cellväggskomponenter till levande bakterier. För att upprätta och standardisera analyser kan användningen av perifera blodprover vara till stor hjälp initialt.
Flödescytometri möjliggör mätning av en mängd olika parametrar och funktionella analyser från ett prov på cellulär nivå. Denna teknik har fördelen att specifika cellulära svar (t.ex. produktion av reaktiva syrearter (ROS) eller intracellulär cytokinproduktion) kan bedömas jämfört med andra mer allmänna metoder såsom enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) eller ELISspot.
Extracellulära fällor uttrycks av neutrofiler (NET)5,6,7 och av andra celler såsom makrofager (METs)8. De erkänns alltmer som ett viktigt inflammatoriskt svar, särskilt vid infektion i lungan9. De kan bedömas med konfokal fluorescensmikroskopi. Denna teknik möjliggör definitiv identifiering av NET/METs och skiljer deras uttryck från andra former av celldöd6.
Både flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade analyser. Deras framgång är beroende av optimala töjningsprotokoll för biologiska prover. Dessa metoder tar lite tid att lära sig och kräver lämplig övervakningsexpertis. De inblandade instrumenten är också dyra både att köpa och driva. Den optimala inställningen för deras användning inkluderar stora universitet och tertiära remisssjukhus.
Metoderna som används i detta protokoll är överförbara för studier av andra liknande organismer som är involverade i andningssjukdomar (t.ex. Moxarella catarrhalis och Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerar också med andra vanliga andningsbakterier10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta arbete godkändes av den mänskliga forskningsetiska kommittén för Monash Health. Protokollet följer riktlinjerna från den etikprövningsetiska kommittén för mänsklig forskning.
1. Antigenpreparat
OBS: Tre olika antigena preparat kan användas för att bedöma immunsvaret mot Hi. Dessa är 1) en subcellulär komponent (vanligtvis från bakteriecellväggen); 2) dödade och inaktiverade bakterier; och 3) levande bakterier. Bestäm användningen av varje antigenpreparat innan några experiment inleds.
- Subcellulära komponenter
- Erhålla subcellulära komponenter från källor, inklusive kommersiella preparat, internt utvecklade komponenter och / eller från andra utredare.
OBS: Subcellulära komponenter vanligtvis från bakteriecellväggen kan användas och inkluderar yttre membranproteiner såsom P6 och lipooligosackarid (LOS)11,12. Dessa subcellulära komponenter härrör vanligtvis i specialiserade centra. Beskrivningen av hur de görs ligger utanför ramen för denna artikel. Direktkontakt med experter på detta område rekommenderas för att erhålla dessa komponenter.
- Erhålla subcellulära komponenter från källor, inklusive kommersiella preparat, internt utvecklade komponenter och / eller från andra utredare.
- Dödade/inaktiverade bakterier
- Hämta bakterierna från lämpligt prov (t.ex. sputum eller bronkoskopi). Bekräfta stammen som H. influenzae med hjälp av ett lämpligt mikrobiologiskt laboratorium. Utför typning av H. influenzae-proverna för att bekräfta att de inte är typbara (av ett specialiserat mikrobiologiskt laboratorium).
- För att erhålla ett representativt antigen, använd flera NTHi-stammar (minst 5, var och en av ungefär samma mängd) för att göra ett poolat antigen. Förvara stammarna vid -70 °C i glycerolbuljong i mikrocentrifugrör.
OBS: I detta experiment användes tio distinkta stammar. - Tina stammarna (ett mikrocentrifugrör i taget) ut på chokladagarplattor och odla över natten i en 37 °C inkubator med 5%CO2. Tillsätt bakterierna till 500 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tvätta dem två gånger (snurra vid 300 x g i 5 min). Använd en MacFarland-standard 10 eller en spektrofotometer13 för att alikvotera NTHi till en koncentration av10 8 ml (med en 5 ml behållare eller motsvarande).
- Värme inaktiverar bakterierna genom att placera dem i ett vattenbad vid en temperatur på 56 °C i 10 minuter.
- Sonicate bakterierna med hjälp av en kontinuerlig ultraljudsbehandling inställning vid en låg till mellanklass hastighet för 30 s.
- Alikvotera lämplig volym prover i mikrocentrifugrör. För ett prov på 108 ml, använd alikvoter på 50 μl (dvs. 20 prover per ml), frys dem vid -70 °C tillsde krävs 14.
- Levande bakterier
- För det första, karakterisera levande bakterier som nämns i steg 1.2.1. Använd en väl karakteriserad stam. Se till att stammen också förvaras i glycerolbuljong vid -70 °C som reserv.
- Odla bakterierna på berikade medier som chokladagarplattor eller i buljong.
- För att använda chokladagarplattor, sprid bakterierna i minst var 3-4: e dag med sterila spridare.
- Alternativt kan du använda Brain Heart Infusion (BHI) buljong berikad med faktorerna X (hemin) och V (β-nikotinamid adenindinukleotid) för att odla bakterierna. Inokulera NTHi från nattplattor i 5-10 ml BHI-buljong kompletterat med både hemin och β-nikotinamid-adenindinukleotid (båda 10 μg/ml) och odla över natten vid 37 °C i en 5%CO2-inkubator .
OBS: Detta har fördelen av reproducerbarhet, högre kolonibildande enheter (CFU) räknas och alla bakterier befinner sig i en liknande fas av stocktillväxt (på plattor kan bakteriell livskraft vara större beroende på positionen i kulturen)13,15.
- Använd en mångfald av infektion (MOI) av 100 bakterier till en cell för att framkalla ett starkt immunsvar samtidigt som cellulär livskraft upprätthålls. Använd MacFarland Standard10 eller spektrofotometer13 för att bedöma antalet bakterier.
- Se till att media som används för levande NTHi-analyser är fria från humant serum, eftersom detta kommer att döda bakterierna16. Djurserumprover (t.ex. serum från fosterkalvar) orsakar i allmänhet inga problem.
OBS: Använd metoderna som beskrivs nedan för att analysera standardvävnadsprover som perifert blod, bronkoskopiprover (särskilt bronkoalveolär sköljning (BAL)) och resekterad lungvävnad. Inkubera proverna med Hi-antigen från 10 min till 24 timmar eller mer.
2. Bedömning av fagocytisk funktion genom flödescytometri
OBS: Denna analys kräver celler i lösning och görs vanligtvis i helblod eller med BAL-vätska. Denna analys är modifierad från ett tidigare publicerat protokoll baserat på användningen av inaktiverat Staphylococcus aureus-preparat och Pansorbin17. Inaktiverat helblod och fixerat H. influenzae ersätts med Pansorbin17.
- Blanda dödad, inaktiverad NTHi (1.2) med propidiumjodid (PI) vid 100 μg/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i förhållandet 1:1 i 30 minuter vid rumstemperatur. Centrifugera vid 450 x g i 5 min och tvätta sedan i 500 μL PBS. Snurra ner vid 450 x g i 5 minuter och återsuspendera pelleten i 500 μL PBS.
- Inkubera 450 μl perifert blod (från venepunktur hos en människa) med 50 μL inaktiverad PI märkt H. influenzae i 20 minuter i ett vattenbad vid 37 °C i ett 5 ml rör.
- Ta bort proverna från vattenbadet och tillsätt 5 μl dihydrorhodamin-1,2,3 (DHR). Vortex i 10 s och lägg sedan tillbaka den i vattenbadet i ytterligare 10 minuter.
- Ta bort proverna från vattenbadet och lys erytrocyterna (500 μl volym enligt ovan i steg 2.2) med 10:1 (dvs. 5 ml) 0,8 % ammoniumkloridlösning (150 mMNH4Cl, 1 mM NaHCO3 och 0,1 mM EDTA).
OBS: Alternativt kan ett automatiserat system som Q-prep användas. - Analysera proverna på en flödescytometer inom en timme. Analysera minst 3 000-5 000 celler (från varje delmängd av intresse) från varje prov för att få representativa resultat (figur 1).
- För att analysera proverna för fagocytos, bestäm andelen celler som har intagit märkta bakterier (mät andelen celler som har den fluorescerande fläcken).
- Kvantifiera ROS genom oxidation av DHR, vilket resulterar i en fluorescerande signal (förskjutningen i medianfluorescens jämförs mellan baslinjeprover och stimulerade prover).
OBS: Neutrofiler är mer detaljerade och har mer sidospridning, medan makrofager är större och har mer framåtspridning. - Skilj neutrofilerna och makrofagerna morfologiskt från varandra genom deras storlek (makrofager är större) och granularitet (neutrofiler är mer granulära).
OBS: Specifika markörer för neutrofiler och makrofager används vanligtvis inte, även om CD14 kan användas för att märka blodmonocyter. Flödescytometri kan potentiellt användas för att skilja mellan olika funktionella former av monocyter och makrofager (t.ex. M1- och M2-delmängder)18.
- Ändra analysen efter behov (t.ex. använd levande omärkta NTHi för att stimulera fagocyter och mäta ROS-uttrycket genom DHR-klyvning).
- Isolera mononukleära celler i perifert blod genom densitetsgradientcentrifugering. Lägg blodet över den avsedda polymeren för densitetsgradientcentrifugering och snurra vid 2300 x g i 30 minuter. Ta bort det mononukleära skiktet med en pipett, tvätta det två gånger med PBS och återsuspendera cellerna i PBS vid 106 celler per ml.
- Som ett alternativ, använd BAL-makrofager.
- Suspendera monocyterna/makrofagerna i en koncentration av 106 celler/ml i odlingsmediet (RPMI). Infektera dem med levande NTHi vid en MOI på 100: 1 i 1 h enligt beskrivningen i steg 1.3.
- Tillsätt DHR till suspensionen enligt beskrivningen i steg 2.3 i 10 minuter. Utför analysen för ROS med hjälp av flödescytometri.
3. Bedömning av lymfocytfunktionen i perifert blod
- Använd helblod eller mononukleära cellpreparat för flödescytometrianalyser14.
- Skaffa prover från varje ämne genom venepunktur. Samla 4 ml blod från en perifer ven i ett litiumheparinrör och dela proverna i alikvoter för kontroll och antigenstimulering.
- Tillsätt kostimulatoriska antikroppar (anti-CD28 och CD49d, 1 μL/ml) till båda proverna. Tillsätt NTHi till antigenprovet och inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 1 timme. För det dödade NTHi-preparatet, tillsätt 200 μL av antigenet till 2 ml blod. För levande NTHi, lägg till levande NTHi-celler vid en MOI på 100: 1 till de vita cellerna (mätt med hemocytometer).
- Tillsätt det Golgiblockerande medlet Brefeldin A (10 μl/ml) till proverna och inkubera dem i ytterligare 5 timmar.
OBS: Blockering av Golgi-apparaten förhindrar att cytokinerna exporteras utanför cellen. - Om helblod används, lysera erytrocyterna med 0,8% ammoniumklorid (steg 2.4) för att lämna endast leukocyter i lösning. Fixera leukocyterna med 500 μl 1% -2% paraformaldehyd i 1 timme.
- Räkna cellerna med hemocytometer, permeabilisera 106 celler med 100 μL 0,1% saponin i 15 min och inkubera cellerna med fluorescerande märkta antikroppar. Tvätta cellerna och analysera dem med hjälp av en flödescytometer.
OBS: Mängden fluorescerande märkta antikroppar kommer att vara specifik för varje cytokin. Följ tillverkarens instruktioner. Vanligtvis kommer 106 celler i 100 μl lösning att färgas i 1 h. De flesta kommersiellt erhållna antikroppar kommer att räcka för att utföra 25-100 tester. - Bestäm andelen antigensvarande celler genom att gating den relevanta lymfocytpopulationen (celler är gated på med CD45, sedan med CD3 och senare med CD4- eller CD8-uttryck) som visas i figur 2. Utför bakgrundsfärgning på icke-stimulerade celler för alla cytokiner som ska analyseras. Screena 100 000 celler för att analysera varje cytokin för både stimulerade celler och kontroll.
4. Bedömning av lymfocytfunktion/inflammatoriska mediatorer i lungvävnad
- Det är vanligtvis inte möjligt att få tillräckligt med lymfocyter från bronkoskopi; Använd därför lungvävnaden från lobektomiprover. Optimeringen av lungvävnadsprover kräver nära samarbete med den anatomiska patologitjänsten. Se till att vävnaden har en marginal på minst 3 cm från tumören och är cellvävnaden utan signifikant emfysem (som bestäms av patologen).
- Bryt lungvävnaden i en cellulär suspension innan den kan användas för flödescytometrianalyser. Smält lungvävnaden kemiskt (t.ex. med kollagenas) eller dela upp den mekaniskt.
OBS: Den mekaniska uppdelningen av vävnad kan föredras eftersom detta är förknippat med bättre ytfärgning av celler (t.ex. CD3/4-märkning)19.- Få lobektomiprover från en patolog (vanligtvis erhållen från patienter som genomgår behandling av lungcancer). Skiva ca 20-40 g av provet i 3-5 mm3 sektioner. Placera dem i en steril 50 μl kammare innan de fragmenteras mekaniskt med hjälp av en lämplig disaggregator.
- Efter vävnadsdisaggregering, lysera de röda blodkropparna med 0,8%NH4Cl som nämnts i steg 2.4.
- Återsuspendera cellerna i steril RPMI (volymen beror på cellnumren och är i allmänhet 10-20 ml) och filtrera dem sedan genom ett 100 μm sterilt nylonnät. Räkna antalet livskraftiga celler med trypanblå uteslutningsmetod.
- Analys av infektion
- Återsuspendera lungcellerna till en slutlig cellkoncentration på 4 x 106 celler/ml per rör (kontroll och stimulerade prover).
- Använd en suspension av 4 x 10 6-6 x 106 celler i 1 ml RPMI för det (negativa) kontrollröret. Använd samma mängd för NTHi-röret (eventuellt ytterligare prov kan användas som en positiv kontroll med SEB). Infektera cellerna i NTHi-röret vid en MOI på 100 bakterier per cell. Lossa locket en halv rotation för att tillåta gasöverföring i rören.
- Placera cellerna i en rörrotator och inkubera dem vid 37 °C medan de roterar vid 12 varv / min.
- För att förhindra extracellulär export av cytokiner, tillsätt en Golgi-blockerare (Brefeldin A) till cellsuspensionerna 1 h efter stimulering till en slutlig koncentration av 10 μg / ml. Återför cellsuspensionerna för ytterligare 16-22 timmars inkubation vid rotation (steg 4.3.3).
- Tvätta cellsuspensionen med 500 μl PBS innehållande 1 % bovint serumalbumin (BSA) och 0,01 % NaN3. Fixera och permeabilisera cellerna enligt beskrivningen i steg 3.5 respektive steg 3.6.
- Tillsätt antikropparna för intracellulär cytokinfärgning (valet av antikroppar ska bestämmas av prövaren, enligt vad som anges i anmärkningen i steg 3.6). Färga cellsuspensionen för specifika markörer för humana lymfocytcellytor (t.ex. CD45, CD3, etc.) i 1 timme. Tvätta cellerna med PBS, fixa och permeabilisera dem enligt beskrivningen i steg 3.5-3.6.
- Inkubera cellerna med intracellulära cytokinfärgningsantikroppar (t.ex. IFN-γ och TNF-α eller IL-13 och IL-17A) i 1 h.
OBS: Det rekommenderas att färga ytmarkörer först, sedan intracellulär eftersom fixering kan orsaka konformationsförändringar i ytproteinerna som antikroppar binder till. - Tvätta cellerna med 500 μL PBS och återsuspendera i 100 μL PBS före datainsamling på en flödescytometer.
- En bead array-analys kan användas tillsammans för att analysera supernatanten som beskrivs i steg 3.2 (Utför detta utan Brefeldin A). Detta möjliggör analys av en mängd olika inflammatoriska mediatorer (potentiellt upp till 40-50 mediatorer). Samla supernatanten i 100 μl alikvoter och förvara vid -70 °C tills den är klar för analys. Alternativt kan man använda multiplex kemiluminescerande analyser20.
- Använd multiplex pärlmatriser för att analysera de tinade proverna. Använd den lagrade supernatanten för att analysera cytokinproduktionen enligt tillverkarens instruktioner.
- Utför förvärvet av multiplexpärlmatrisen på en flödescytometer. Använd relevant programvara för att utföra nedströms dataanalys.
OBS: Denna analys av pärlmatriser kan också utföras på supernatant från perifert blod och / eller BAL-prover.
5. Bedömning av lungproteolys genom konfokalmikroskopi
OBS: Fluorescerande konfokalmikroskopi är gratis för flödescytometri och kan användas för att bedöma proteas och ROS inflammatoriska svar. Extracellulära fällor som NET och METs består av extracellulärt kromatin (DNA) med andra inflammatoriska mediatorer, särskilt proteaser såsom neutrofilt elastas (NE) och matrismetalloproteinaser (MMP). De kan bedömas i BAL och lungvävnad med konfokalmikroskopi, och detta har beskrivits tidigare av Sharma, R. et al.21.
- Bedöm direkt proteasuttryck i lungvävnad (enligt beskrivningen i steg 4.2.1) med hjälp av konfokalmikroskopi och in situ zymografi15,17.
- Använd antingen färsk eller frusen ofixerad lungvävnad. Montera sektionerna skurna till en tjocklek av 4 μm på superfrost/vidhäftningsglas. Förvärm sektionerna i 1x reaktionsbuffert i 5 min.
- Tillsätt fluoresceinmärkt gelatinsubstrat (30 μg / ml per sektion) direkt på enskilda objekt för att mäta proteolys via verkan av metalloproteinaser.
- Placera objektglasen i horisontellt läge och inkubera i en ljusskyddad, fuktad kammare vid 37 °C i 1 timme.
- Skölj sektionerna i 1x reaktionsbuffert innan de monteras.
- Som en negativ kontroll, lägg endast till reaktionsbufferten utan fluorescerande gelatin till sektionerna.
- Använd ett konfokalmikroskop för att analysera substratets lys genom undersökning. Använd ImageJ för att bestämma lungområdet med bevis på proteolys. För detta, mäta lungområdet som har färgning ovanför bakgrunden av det släckta provet. Som en annan kontroll, använd lungvävnaden utan fluorescerande gelatin tillsatt15.
OBS: Utför detta på minst 10 synfält med hög effekt (FOV) för varje prov.
- Mät det extracellulära ROS-uttrycket i lungvävnad genom immunreaktivitet för 3-nitrotyrosin (en toxisk oxidativ stressprodukt)13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa resultaten visar hur inflammatoriska immunsvar mot NTHi kan bedömas/kvantifieras med flödescytometri och konfokalmikroskopi. En viktig del av tolkningen av resultaten är jämförelsen i fluorescens mellan kontroll och stimulerade prover. Ett antal preliminära experiment krävs vanligtvis för att optimera färgningen av prover. Hur många olika färger som kan undersökas samtidigt beror på antalet tillgängliga kanaler på flödescytometern/konfokalmikroskopet. Resultaten visas för bedömning av 1) ROS-produktion, 2) intracellulär cytokinfärgning av human lungvävnad och 3) in situ zymografi för att mäta lungproteolys.
Figur 1 visar representationen av ROS-produktion av monocyter. Mätningen av ROS sker genom oxidation av DHR123 för att producera fluorescens. Cellerna är gated on, och deras medianfluorescens bedöms genom flödescytometri. Medianfluorescensen för det stimulerade provet jämförs med kontrollen.
Figur 2 visar den intracellulära produktionen av cytokiner av lymfocyter härrörande från human lungvävnad. Lungvävnaden måste brytas ner till encellssuspension innan flödescytometrianalyser kan utföras för att bedöma inflammatorisk mediatorproduktion, t.ex. cytokinproduktion av lymfocyter. Lungvävnad kan brytas ner mekaniskt eller smältas kemiskt, t.ex. genom kollagenas. De mekaniska nedbrytningsmetoderna kan ge överlägsna resultat, särskilt när det gäller att behålla cellytans färgning (t.ex. CD3 och CD4). Filtrering av proverna är viktigt för att utesluta skräp som kan störa analysen.
Figur 3 visar uttrycket av proteasaktivitet mätt med in situ zymografi. Ofixerad vävnad används för att bedöma proteasaktiviteten. Dessa prover fryses vanligtvis vid -70 °C tills de analyseras. Området av vävnaden som har proteasfluorescens mäts och resultaten jämförs mellan kontroll och stimulerade prover.
Figur 1: ROS-produktion av monocyter. (A) Panelen visar grindstrategin för mononukleära celler i perifert blod (PBMC), där framåtspridning och sidospridning används för att definiera fagocytpopulationen. I panel (B) definieras fagocytpopulationen ytterligare av CD14-uttryck för att märka monocyterna. Denna monocytpopulation analyseras för DHR-fluorescens i kontroll (C) och stimulerade prover (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Cytokinproduktion i lungvävnad. Celler analyseras först för deras uttryck av leukocytmarkören CD45 (A) med hjälp av flödescytometri. Denna population analyseras sedan vidare för CD3-uttryck (B) och CD4/CD8-uttryck (C). CD3/CD4+-celler utvärderas för intracellulär cytokinproduktion i kontroll (D) och NTHi-stimulerade prover (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lung in situ zymografi. Panel (A) visar uttrycket av kromatin/DAPI i delar av lungvävnaden. Panel (B) visar fluorescerande färgning, vilket indikerar närvaron av MMP-aktivitet. Panel (C) visar den sammanslagna bilden som indikerar att MMP-aktiviteten också är samlokaliserad med uttrycket kromatin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna som listas här använder fluorescensbaserad flödescytometri och konfokalmikroskopitekniker som kan användas tillsammans för att få detaljerad information om det inflammatoriska lungsvaret på Hi.
Att fastställa lämplig antigenformulering av Hi som ska användas är avgörande, och det är lämpligt att ha specifik input från en mikrobiolog i detta avseende. Live Hi inducerar ett starkare svar, medan dödade Hi-preparat och Hi-komponenter är mer standardiserade och är lättare att lagra. PI kommer endast att märka döda bakterier22; andra färgämnen såsom karboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) kan användas för att märka levande bakterier för fagocytosanalyser23. En serie preliminära experiment bör genomföras för att optimera lämpligt antigen. För att använda live NTHi är en MOI på 100: 1 optimal; en lägre MOI kanske inte inducerar ett tydligt immunsvar, medan en högre MOI kan vara giftig för cellerna. En dos-responskurva kan dock ge användbar information och kan vara mycket värdefull, särskilt med den initiala optimeringen av tekniken24. Som en positiv kontroll kan en kommersiellt erhållen form av inaktiverat Staphylococcus aureus-antigen användas, vilket också är märkt med PI som ovan för ROS / fagocytosanalysen. För T-cellstester kan stimulering med Staphylococcal superantigen E (SEB) användas som en positiv kontroll19,25.
Protokollen för att erhålla BAL- och/eller lungvävnadsprover måste fastställas tydligt. BAL-proverna kan vara ganska varierande mellan olika operatörer. En handhållen spruta för höger mittlobssköljning ger bra resultat26. Erhållandet av lungvävnadsprovet från lobektomiprover kräver upprättande av ett samarbete med en patolog. Lungvävnadsprovet bör ha en viss marginal från tumören (helst minst 3-4 cm). Större prover (t.ex. minst 25-50 g) kommer att ge fler celler, liksom prover som är mer proximala utan uppenbart emfysem. Den mekaniska uppdelningen av lungvävnaden är tidskrävande och tar i allmänhet minst 2-3 timmar för varje prov19,27.
Preliminära experiment bör göras för att optimera färgningen av olika fluoroforer för både flödescytometri och konfokalmikroskopi. Områden att koncentrera sig på inkluderar identifiering av den bästa färgningspanelen, färgning / koncentration och behandling av celler / vävnad för att maximera livskraften28. Användningen av lungvävnad kan vara associerad med mer vävnadsskräp än andra vätskeprover som blod eller BAL, och detta kan ha viss effekt på differentieringen av olika cellulära populationer genom flödescytometri. Det lämpliga valet av antikroppar måste bestämmas och optimeras i preliminära experiment. För ytmärkning av lymfocyter kan anti-CD3 och CD4 användas för T-hjälparceller, anti-CD3 och CD8 för cytotoxiska T-celler och anti-CD3 och CD56 för NK-celler. Valet av intracellulära cytokiner som ska studeras beror på mediatorerna av intresse och antalet parametrar/färger som kan analyseras på flödescytometern29. En specifik utmaning med att arbeta med makrofager i lungvävnad är deras höga nivå av autofluorescens30; Detta problem kan hanteras genom att jämföra stimulerade celler med bakgrundskontroll och tillsats av specifika markörer för inflammation såsom proteaser och histoner.
En begränsning av dessa tekniker är kravet på lämpligt utbildad och kvalificerad personal för att utföra experimenten. Väletablerade flödescytometri och mikroskopianläggningar krävs också. Användningen av mänskliga vävnadsprover är förknippad med betydande variation, särskilt vid användning av lungvävnad; Detta kan kräva en serie preliminära experiment för att optimera analyser (särskilt med problem med bakgrundsfärgning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka personalen på Clinical Immunology på Monash Health för deras hjälp med detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
