Summary
Här presenteras sgRNA / CAS9-endonukleas och nästa generations sekvenseringsprotokoll som kan användas för att identifiera mutationerna i samband med reparation av dubbelsträngsbrott nära CD4-promotorn.
Abstract
Dubbelsträngsbrott (DSB) i DNA är den mest cytotoxiska typen av DNA-skador. Eftersom en myriad av förolämpningar kan resultera i dessa lesioner (t.ex. replikationsstress, joniserande strålning, oreparerad UV-skada), förekommer DSB i de flesta celler varje dag. Förutom celldöd minskar oreparerade DSB genomintegritet och de resulterande mutationerna kan driva tumorigenes. Dessa risker och förekomsten av DSB motiverar undersökningar av de mekanismer genom vilka celler reparerar dessa lesioner. Nästa generations sekvensering kan kombineras med induktion av DSB genom joniserande strålning för att ge ett kraftfullt verktyg för att exakt definiera mutationerna i samband med DSB-reparationsfel. Detta tillvägagångssätt kräver emellertid beräkningsmässigt utmanande och kostnadsoöverkomlig helgenomsekvensering för att upptäcka reparationen av de slumpmässigt förekommande DSB: erna i samband med joniserande strålning. Sällsynta skärande endonukleaser, såsom I-Sce1, ger möjlighet att generera en enda DSB, men deras igenkänningsställen måste införas i genomet av intresse. Som ett resultat är reparationsplatsen i sig artificiell. Nya framsteg gör det möjligt för guide RNA (sgRNA) att rikta en Cas9-endonukleas till alla genomplatser av intresse. Detta kan tillämpas på studien av DSB-reparation som gör nästa generations sekvensering mer kostnadseffektiv genom att låta den fokuseras på DNA som flankerar den Cas9-inducerade DSB. Målet med manuskriptet är att visa genomförbarheten av detta tillvägagångssätt genom att presentera ett protokoll som kan definiera mutationer som härrör från reparationen av en DSB uppströms CD4-genen. Protokollet kan anpassas för att bestämma förändringar i den mutagena potentialen hos DSB associerad med exogena faktorer, såsom reparationshämmare, viralt proteinuttryck, mutationer och miljöexponeringar med relativt begränsade beräkningskrav. När en organisms genom har sekvenserats kan denna metod teoretiskt användas vid vilken genomisk plats som helst och i vilken cellodlingsmodell som helst av den organismen som kan transfekteras. Liknande anpassningar av tillvägagångssättet kan möjliggöra jämförelser av reparationstrohet mellan olika loci i samma genetiska bakgrund.
Introduction
Att upprätthålla genomisk stabilitet är avgörande för alla levande organismer. Noggrann DNA-replikation och ett robust DNA-skadesvar (DDR) är nödvändiga för att troget sprida det genetiska materialet 1,2. DNA-skador uppstår regelbundet i de flesta celler 2,3. När dessa skador känns av stoppas cellcykelprogressionen och DNA-reparationsmekanismer aktiveras. Dubbelsträngsbrott i DNA eller DSB är den giftigaste och mutagena typen av DNA-skador 3,4.
Medan flera DDR-signalvägar kan reparera dessa lesioner, är de mest grundligt studerade DSB-reparationsvägarna homolog rekombination (HR) och icke-homolog ändfogning (NHEJ). HR är en i stort sett felfri väg som reparerar en DSB med hjälp av en systerkromatid som en homolog mall. Detta tenderar att hända i S-fasen och G2-fasen i en cellcykel 5,6,7. NHEJ är mer felbenägen, men det kan hända under hela cellcykeln 8,9. Olika reporteranalyser har utvecklats för att mäta effektiviteten hos specifika reparationsmekanismer 10,11,12. Dessa analyser tenderar att förlita sig på flödescytometri för en mätning med hög genomströmning av DSB-reparationsvägsaktivitet med GFP eller mCherry som en avläsning11,13. Även om de är mycket effektiva förlitar de sig på kanonisk reparation som sker vid en artificiellt introducerad DSB.
Det finns en mängd andra metoder som används för att studera DSB-reparation. Många av dessa är beroende av immunofluorescens (IF) mikroskopi 1,14. OM mikroskopi detekterar diskreta kärnfoci som är representativa för reparationskomplex efter att DSB inducerats genom exponering för genotoxiska kemikalier eller joniserande strålning15,16. Spårning av bildandet och upplösningen av dessa foci ger en indikation på reparationsinitiering och slutförande, respektive14,17. Dessa metoder för DSB-induktion (dvs. kemikalier eller joniserande strålning) orsakar emellertid inte DSB på definierade platser i genomet. Det är också funktionellt omöjligt att använda dem för att konsekvent inducera endast ett litet antal (t.ex. 2-4) DSB. Som ett resultat orsakar de vanligaste metoderna för att inducera DSB en mängd lesioner slumpmässigt fördelade över hela genomet18. Ett litet antal DSB kan införas genom att införa igenkänningsstället för en sällsynt skärande endonukleas och uttrycka den relevanta endonukleasen, såsom I-Sce119. Tyvärr förhindrar den nödvändiga integrationen av ett målämne undersökningen av DSB vid endogena genomiska loci.
Detta manuskript beskriver en metod för att upptäcka mutationer associerade med reparationen av en DSB som genereras vid en användardefinierad plats. Vi ger ett representativt exempel på det tillvägagångssätt som används för att bedöma förmågan hos ett viralt protein att öka antalet mutationer associerade med en DSB. Specifikt beskriver detta manuskript användningen av ett enda guide-RNA (sgRNA) för att rikta en CAS9-endonukleas för att inducera en DSB vid human CD4 öppen läsram i humana förhudskeratinocyter som uttrycker vektorkontroll (HFK LXSN) och HFK som uttrycker E6-proteinet för humant papillomvirus typ 8 (HFK 8E6). Riktad nästa generations sekvensering (NGS) av regionen som omger pausen gör att mutationer i samband med reparationen av lesionen kan definieras noggrant. Dessa data visar att virusproteinet orsakar en cirka 20-faldig ökning av mutationer under DSB-reparation. Det ger också en opartisk karakterisering av de mutagena konsekvenserna av DSB vid en enda plats utan behov av helgenomsekvensering. I princip skulle protokollet lätt kunna anpassas för att jämföra den relativa risken för mutationer mellan genomlojningar eller cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellplätering
- Odla HFK LXSN- och HFK 8E6-celler i 10 cm-plattor i keratinocytodlingsmedier (10 ml/platta) med humant keratinocyttillväxttillskott (HKGS) och 1 % penicillin/streptomycin. Odla celler till cirka 80% sammanflöde vid 37 ° C i en jackinkubator med 5% CO2.
- Byt ut odlingsmedier med 3 ml trypsin-EDTA (0,05%, etylendiamine tetraättiksyra). Inkubera vid 37 °C i 3 min. Neutralisera trypsin med lika stor volym fetalt bovint serum (FBS) kompletterat media och överför celler till ett 15 ml centrifugrör. Centrifug vid 300 x g i 5 min.
- Resuspend celler med 10 ml keratinocytodlingsmedier med HKGS. Bestäm koncentrationen av celler med en hemocytometer.
- Platta 4 x 105 celler/6 cm plattor (frö två plattor för HFK LXSN och två plattor för HFK 8E6) i 4 ml keratinocytodlingsmedier med HKGS och 1% penicillin och streptomycin. Väx vid 37 °C i en jackinkubator med 5% CO2.
OBS: Analys av HFK-celler valdes för detta protokoll av två skäl. För det första är HFK en svår att transfektera cellinje. Således, genom att visa att protokollet fungerar i denna cellinje, ges bevis för att det sannolikt kommer att fungera i mer vanliga och lättare transfekterade celler. För det andra visar tidigare publicerade data att ett viralt protein (8E6) hindrar reparation av dubbla strängbrott i DNA 20,21,22. Genom att jämföra HFK LXSN och HFK 8E6 kan vi således visa analysens förmåga att upptäcka ökningar av mutationer associerade med en minskning av cellulär reparationskapacitet.
2. Transfektion
- På dagen för transfektion (24 timmar efter plätering), ersätt media med 3 ml antibiotikafritt kompletterat medium. Inkubera i 2 timmar vid 37 °C i en jackinkubator.
- Transfektceller med lämpliga lipidbaserade transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner.
- Värm transfektionsreagens till rumstemperatur och pipett försiktigt före användning.
- För varje cellinje (HFK LXSN och HFK 8E6), placera lämplig mängd transfektionsbuffert (enligt tillverkarens anvisningar) i ett sterilt 1,5 ml centrifugrör (rör 1). Inkludera ett annat rör med samma mängd transfektionsbuffert (mock transfektion eller rör 2).
- Tillsätt 2 μg plasmid-DNA som uttrycker CAS9/sgRNA riktat mot humant CD4 (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) till rör 1 från steg 2.2.2. Pipett försiktigt för att blanda helt. Tillsätt lika stor volym sterilt vatten till rör 2.
- Inkludera en kontrollplatta med enbart transfektionsreagens (ingen plasmid) för varje cellinje.
OBS: Den andra plattan fungerar som en negativ kontroll i experimentet, vilket gör det möjligt för användaren att bekräfta att transfektion med CAS9 / sgRNA inte är ansvarig för några mutationer. - Tillsätt lämplig mängd transfektionsreagens (enligt tillverkarens anvisningar) till röret med DNA-blandning (rör 1) från steg 2.2.3 och den fingerade transfektionen (rör 2) från steg 2.2.2. Pipett försiktigt för att blanda helt. Inkubera vid rumstemperatur i 15-30 min för att ge tillräckligt med tid för komplex att bildas.
- Tillsätt transfektionsblandningen droppvis på plattan. Gunga försiktigt kulturen i 1 min för att jämnt fördela transfektionsblandningen.
- Inkubera i 48 timmar efter transfektionen för att tillåta CAS9-uttryck.
- Skörda celler genom trypsinisering.
- Byt ut odlingsmedier med 1 ml trypsin-EDTA (0,05%, etylendiamine tetraättiksyra). Inkubera vid 37 °C i 3 min. Neutralisera trypsin med lika stor volym FBS-kompletterade medier.
- För varje cellplatta, överför cellsuspensionen till två mikrocentrifugrör med lika alikvoter. Centrifug vid 300 x g i 5 min.
- Återutnytt cellpelleten från ett rör i steg 2.4.2 i 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för sekvensering. Resuspend det andra röret från steg 2.4.2 med iskall PBS för immunoblot.
- Skörda hela celllysaterna för immunoblot.
- Centrifugera röret vid 300 x g i 5 min. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 100 μL buffert för radioimmunoprecipitationsanalys (RIPA-lysbuffert) blandad med 1 % proteashämmare och 1 % fosfatashämmare i röret, blanda noggrant med en pipett och inkubera i 10 min på is.
OBS: RIPA lysbuffert innehåller 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% natriumdeoxikolat; 0,1% SDS; 140 mM NaCl och avjoniserat vatten. - Centrifuglysater vid 13 000 x g i 10 min. Samla supernatanter för immunoblot.
3. Mätning av CAS9-uttryck via immunoblot
- Bestäm proteinkoncentrationen med en bicinkoninsyraanalys (BCA) enligt tillverkarens instruktioner.
- Kör 20 μg protein av varje prov i brunnarna i en 3% -8% Tris-acetatgel i 150 min och semidry överföring (10 V i 30 min och sedan 25 V i 12 min) till polyvinyliden difluoridmembran.
- Efter att ha blockerat membranet i 5% fettfri torrmjölk i PBS med 0,1% tween (PBST) i 1 timme vid rumstemperatur, tillsätt anti-CAS9 (1: 1000) och anti-GAPDH (1: 1000) antikroppar. Inkubera vid 4 ° C över natten.
- Efter tvättning av membranet med PBST, inkubera membranet med sekundär antikropp i 5% fettfri torrmjölk i PBST i 1 timme vid rumstemperatur.
- Avbilda fläcken och bestäm CAS9-nivån med densitometri23. Se figur 1 för en representativ fläck.
OBS: Detektion av fosforylerad H2AX (S139) foci-bildning genom immunofluorescensmikroskopi kan användas för att validera CAS9-aktivitet14. Ett lågt antal distinkta foci (vanligtvis 1-4 foci) förväntas beroende på cellcykelpositionen, om mutationer i CAS9-målplatsen förhindrar ytterligare skärning och hur många kopior av CAS9-skärplatsen som finns i genomet av intresse. En representativ bild visas i figur 2.
4. Nukleinsyraextraktion och amplikongenerering
- Extrahera DNA från cellprover från steg 2.4.3 med hjälp av ett DNA-extraktionssats med hög molekylvikt, enligt tillverkarens specifikation.
- Resuspendprimrar med indikerat lösningsmedel enligt databladet. Späd med samma reagens till 20 μM och poola 20 μM primers i de angivna poolerna.
OBS: Primerpoolen är listad i kompletterande tabell 1. - Skapa en PCR Master-blandning med en lång förstärkning Taq-polymeras för varje 20 μM primerpool enligt specifikationerna i tabell 1.
- Tillsätt 21 μL av mastermixerna för att separera PCR-rör.
- Tillsätt 4 μL av målprovet (100 ng/μL) från steg 4.1 till PCR-analysrör som innehåller mastermix- och lockanalysrör. Säkerställ separata reaktioner för varje primerpool.
- Vortex för att blanda PCR-analysrör och centrifug (snabb snurrning) för att ta bort droppar från rörlocken.
- Placera PCR-rören på en konventionell termisk cykelmaskin.
- Programmera PCR-maskinen enligt tabell 2.
- Kör programmet på en termisk cykel.
5. PCR-sanering
- Ta bort primers från PCR-reaktioner med ett pärlbaserat PCR-rengöringssystem.
- Ta bort rengöringspärlor från kylskåpet 30 minuter före användning.
- Vortex pärlor väl före användning och se till att alla pärlor resuspenderas.
- Tillsätt 30 μL (1,2x) resuspenderade pärlor till varje brunn på en djup brunn 96-brunnsplatta.
- Tillsätt 25 μL PCR-reaktion till brunnar som innehåller pärlor.
- Placera plattan på en plattskakare vid 2000 rpm i 2 min.
- Låt plattan ligga kvar i rumstemperatur i 5 minuter efter skakning.
- Placera den djupa brunnsplattan på en 96-brunns plattmagnet och inkubera i 2 minuter.
- Ta bort och kassera supernatanten utan de störande pärlorna.
- Medan plattan förblir på magneten, tillsätt 180 μL 80% etanol och inkubera i 30 s. Ta bort och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 5.1.9.
- Ta bort och kassera eventuell kvarvarande vätska från brunnarna med en pipett på 10 μL.
- Låt pärlorna torka i rumstemperatur i 10 minuter.
- Tillsätt 20 μL nukleasfritt vatten till brunnarna som innehåller pärlor och ta bort plattan från magneten.
- Skaka plattan vid 2000 rpm i 2 min vid rumstemperatur.
- Inkubera plattan vid rumstemperatur i 5 min.
- Placera plattan på ett magnetstativ och inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten till en andra, märkt PCR-platta. Detta innehåller det rensade DNA: t.
- Mät koncentrationen av varje reaktion med en fluorometer.
- Se till att dsDNA-fluorometerreagenser har rumstemperatur.
- Ställ in fluorometriska analysrör plus ytterligare två rör för standarder.
- Tillsätt 199 μL 1x dsDNA arbetslösning till alla utom två rör. Tillsätt 190 μL av arbetslösningen till de två sista rören.
- Lägg till 10 μL av de två standarderna (ingår i materialförteckningen) för att separera analysrören.
- Tillsätt 1 μL av varje PCR-reaktion till Fluorometer mastermix-rör.
- Vortexrör för att blanda och inkubera vid rumstemperatur i 2 minuter.
- På fluorometerns startskärm väljer du knappen med analyskitinanvändningen (1x dsDNA) och väljer sedan Läs standarder och kör prover.
- Sätt i standard 1-röret, välj läsknappen och upprepa sedan för standard 2.
- Efter steg 5.2.6, upprepa för ett prov, välj en provvolym på 1 μL och den resulterande koncentrationen kommer att tillhandahållas.
- Upprepa steg 5.2.7 för de återstående proverna.
- Beräkna den projicerade molariteten för alla reaktioner och poola lika koncentrationer av reaktioner från varje enskilt prov separat (en slutlig pool per prov) med hjälp av ekvationen nedan.
- Upprepa steg 5.2.1 till 5.2.7 för att erhålla den slutliga poolkoncentrationen.
- Kontrollera amplikonpoolen på en kapillärelektroforesmaskin / agarosgel enligt tillverkarens specifikation.
- Förbered kapillärelektroforesrör för lämpligt antal prover. Tillsätt 7 μL av DNA-bufferten enligt tillverkarens specifikation.
- Tillsätt 4 μL av amplikonpoolen till röret som innehåller DNA-buffert.
- Placera rör på elektroforesmaskinen och kör maskinen enligt tillverkarens specifikation för dsDNA.
- Visa elektroforesgelbilderna så att banden lokaliseras till ~ 5 kb (amplikonernas storlek).
- Beräkna den projicerade molariteten för alla reaktioner och poola lika koncentrationer av reaktioner från varje enskilt prov separat (en slutlig pool per prov) med hjälp av ekvationen nedan.
6. Förberedelse av biblioteket
- Späd provpoolerna från steg 5.3.1 till 0,2 ng/μL för biblioteksberedning.
- Med hjälp av ett biblioteksförberedelsepaket med låg indata som är kompatibelt med korta sekvenser (300bp) förbereds bibliotek med unika indexkombinationer för varje provpool som skapades i steg 5.3 enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Följ tillverkarens instruktioner för att välja indexsekvenser. Alla index som är mottagliga för bibliotekets förberedelsepaket fungerar för exemplen. - Efter biblioteksberedning, slå samman alla prover enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Innan du skapar bibliotekspoolen, beräkna antalet läsningar som krävs för 250x täckning av din målsekvens och se till att den valda sekvenseringspatronen kan ge tillräcklig täckning för varje inkluderat prov. För totalt 0,5 Mb motsvarar detta 1 M läsningar.
- Med hjälp av ett biblioteksförberedelsepaket med låg indata som är kompatibelt med korta sekvenser (300bp) förbereds bibliotek med unika indexkombinationer för varje provpool som skapades i steg 5.3 enligt tillverkarens anvisningar.
- Förbered bibliotekspoolen för sekvensering.
- Tina och förbered en 300-cykels patron och sekvenseringsreagens.
- Denaturera och späd ut sekvenseringspoolen som skapades i steg 5.1.1 enligt sequencerens tillverkares instruktioner.
- Lägg till denaturerad och utspädd bibliotekspool i sekvenseringsreagenser och kör sekvenseringsmaskinen enligt tillverkarens specifikation.
OBS: Se bifogad tabell 3 för felsökning.
7. Analys av data
OBS: Alla datasteg utförs i programvaran för genomisk dataanalys. Parenteser anger användarinmatning. Större än tecken anger ordningen på musklick för ett visst steg (t.ex. 1: a musklick>2: a musklicket)
- Importera läsningarna genom att klicka på Öppna programvara > Importera > Illumina > Välj filer > Nästa > Välj plats för att spara > slutföra. Läsningarna kommer nu att visas i programvaran.
- Trimma och filtrera läsningarna.
- Trimma standardparametrarna för djupsekvensdataanalys i den djupa sekvensen.
- Markera läsningarna och klicka på Verktygslåda > Förbered sekvenseringsdata > Trimma läser > Nästa > Nästa > Nästa > Nästa > Spara > Nästa > (Välj plats att spara) > Slutför
- Kartlägg de trimmade läsningarna till referens.
- Kartan trimmas läser till referenssekvensen som används i steg 4.1 med hjälp av matchningspoängen 2, kostnaden för matchningsfel på 3 och infognings-/borttagningskostnaderna för 2. Se till att längdfraktionen är över 0,7 och likhetsfraktionen är vid eller över 0,8.
- Markera den trimmade läsfilen och klicka på Verktygslåda > Omsekvenseringsanalys > Mappa läsningar till referens > Nästa > (Välj referenssekvens) > Nästa > (Se till att parametrarna anges enligt ovan) > Nästa > Spara > (Välj plats att spara) > Slutför.
- Extrahera varianter och indels.
- Använd en lämplig indel caller och extrahera indels med ett p-värdeströskelvärde på 0,005 eller lägre och ett maximalt antal missmatchningar på 3.
- Markera mappad läsfil och klicka på Verktygslåda > Omsekvenseringsanalys > Variantdetektering > Indels och Structural Variants > Next > (Se till att nödvändig betydelse är indata > Nästa > Spara > (Välj plats att spara) > Slutför.
- Använd en lämplig variantanropare och anropa varianter från läsmappningen med en signifikans på 5 %.
- Markera mappad läsfil och klicka på Verktygslåda > Omsekvenseringsanalys > Variantdetektering > Identifiering av lågfrekventa varianter > Nästa > (Se till att nödvändig betydelse matas in > Nästa > Nästa > Spara > (Välj plats att spara) > Slutför.
OBS: Se till att ta hänsyn till värdgenomets knep i indel- och variantuppringarna. Extrahera inte mutanter under 5%. Detta tröskelvärde står för PCR- och sekvenseringsfel som är associerade med analysen. Normalisering (baserat på immunoblot detektion av CAS9) bör göras genom att justera sekvenseringstäckningen. Till exempel, om prov A har dubbelt så hög transfektionseffektivitet som prov B, bör 50% av läsningarna från prov A användas för analys. Detta bör göras genom slumpmässig provtagning och inte minska täckningen för något prov under 100x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre representativa resultat presenteras för detta protokoll. Figur 1 är en immunoblot som bekräftar uttryck av CAS9 i HFK-kontroll (LXSN) och HFK som uttrycker beta-HPV 8E6 (8E6). 48 timmar efter transfektion skördades helcellslysat och undersöktes därefter med en anti-CAS9-antikropp (eller GAPDH som belastningskontroll). Resultatet visar att HFK LXSN och HFK 8E6 uttrycker liknande mängd CAS9 vilket indikerar att transfektionseffektiviteten är likartad mellan två cellinjer. Figur 2 är en immunofluorescensmikroskopibild som visar CAS9-inducerade DSB med pH2AX-foci, en standardmarkör för DSB24. Detta indikerar att två DSB induceras av CAS9/sgRNA och bekräftar därmed att DSB-induktion sker som förväntat. Figur 3 visar att 8E6 ökar genomiska variationer inom 200 Kb runt CAS9-inducerad DSB22. Detta överensstämmer med hypotesen att HPV8 E6 avreglerar DSB-reparation och ökar genomisk instabilitet. Denna figur visar ett sätt på vilket data som erhållits från denna metod kan visas.
Figur 1: Representativ bild av immunoblot som jämför CAS9-uttryck i otransfekterade och transfekterade HFK-celler. sgRNA/CAS9-plasmider användes för att transfektera HFK-celler. Anti-CAS9-antikropp användes för att detektera CAS9-proteinet. GAPDH används som lastkontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ immunofluorescensbild av fosforylerad histon H2AX (S139) i sgRNA/CAS9-transfekterad cell och otransfekterad kontroll. DAPI användes för att färga DNA (Blå). pH2AX (röd) är en markör för CAS9-inducerad DSB. Detta visar att optimalt CAS9-uttryck har uppnåtts genom frånvaro av klyvning utanför målet. Beroende på antalet riktade genomloki (förändrat av förändringar i cellens ploidi, variationer i målplatskopieringsnummer eller cellcykelposition) kan antalet foci vara högre. Varje ökning bör dock vara förutsägbar baserat på den celltyp och målplats som analyseras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Beta-HPV 8E6 ökar genomisk instabilitet under DSB-reparation. (A) Schematisk över placeringen av CAS9-inducerad DSB längs den sekvenserade delen av genomet. (B) Genomiska variationer grupperade efter typer av mutationshändelser i HFK LXSN och HFK 8E6. Varje grupp av genomiska variationer och totalt antal variationer jämfördes mellan HFK LXSN och HFK 8E6. (C) Circos plot av DNA-mutationer i HFK LXSN (höger sida) och HFK 8E6 celler (vänster sida). Svarta pilar indikerar CAS9-skärplatser. Den innersta cirkeln visar kopplingar mellan identiska genomiska omarrangemang. Placeringen av genomiska omarrangemang färgade av typer av genomiska variationer visas i fem koncentriska cirklar (blått representerar SNP, grönt representerar införande, rött representerar radering, lila representerar MNV och svart representerar ersättning). Spridningsdiagrammet i den yttersta cirkeln visar brytpunkter (svart), tandemduplikaler (röda) och punktindels (grå), där närheten till ytterkanten representerar ett högt variantförhållande. SNP, enkel nukleotidpolymorfism. MNV, multinukleotidvariation. Statistiska skillnader mellan cellinjer mättes med hjälp av ett elevernas t-test. indikerar p < 0,001". Detta är anpassat från en tidigare publicerad referens med tillstånd22. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: PCR Master mix-komponenter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Inställningar för PCR-program. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Felsökning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande tabell 1: Förteckning över primerpool för PCR. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förutom djupet av den information som tillhandahålls finns det flera fördelar med denna metod. För det första kan DSB-reparation i teorin bedömas vid vilken genomisk loci som helst utan att modifiera genomet hos den intressanta cellen. För det andra ökar tillgången till NGS-analys av reparation genom den minskade kostnaden och beräkningsinsatsen genom att göra och analysera en enda DSB riktad mot ett definierat område. Slutligen, med genomerna hos ytterligare organismer som rutinmässigt blir tillgängliga och flera publikationer som visar framgångsrik transfektion av olika däggdjurs- och icke-däggdjurscellinjer, förväntas nyttan av detta tillvägagångssätt vara brett 10,23,24.
Detta manuskript analyserade DSB-reparation i mänskliga förhudskeratinocyter som ett illustrativt exempel. Transfektionseffektiviteten tenderar att vara lägre i keratinocyter än andra vävnadstyper. Därför använde detta protokoll en transfektionsmetod optimerad för dessa svårtransfekta celler. Transfektionsmetoden bör optimeras för den analyserade celltypen. Förmågan hos CAS9-inducerad DSB som används i detta protokoll har bekräftats i osteosarkom, tjocktarmscancer, lungcancer, fibroblast, embryonal njure och humana keratinocytceller10,23. Innan du utför nästa generations sekvensering rekommenderar vi dock att CAS9-uttryck och -aktivitet bekräftas.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är att jämföra mellan eller mellan olika prover för att normalisera analysen för att ta hänsyn till skillnader i CAS9-transfektionseffektivitet. För att göra detta bör den relativa CAS9-proteinnivån mätas med immunoblotting och densitometri (figur 1). Det är också viktigt att säkerställa specificiteten hos CAS9-klyvning som indikeras av distinkt pH2AX (S139) foci-bildning, detekterbar med IF-mikroskopi14 (figur 3). Alternativt kan T7-endonukleasanalysen användas för att undersöka CRISPR/Cas9-aktivitet och sgRNA-effektivitet.
En anmärkningsvärd begränsning av detta tillvägagångssätt är att CAS9-inducerad DSB tenderar att vara "renare" än DSB orsakad av strålning eller liknande fysiologisk skada. Därför kan metoden som beskrivs här underskatta antalet eller svårighetsgraden av mutationerna i samband med reparation av naturligt förekommande lesioner. Användningen av andra sekvensspecifika nukleaser som inducerar DSB med längre överhäng kan hjälpa till att övervinna denna begränsning26. Dessutom är det inte helt förstått huruvida kromatinregionen (t.ex. heterokromatin och eukromatin) påverkar CAS9-aktiviteten. Därför bör användaren vara noga med att bekräfta motsvarande CAS9-aktivitet när man jämför mutationer på olika platser.
Metoden som beskrivs här kan användas för att definiera de relativa mutagena konsekvenserna av att reparera DSB i en mängd olika sammanhang. Det kan till exempel underlätta undersökning av nya SMÅMOLEKYLÄRA DNA-reparationshämmare. Detta skulle göra det möjligt för hämmare som är mer mutagena i transformerade (jämfört med otransformerade) celler att prioriteras för utveckling som kemoterapeutiska medel. Detta tillvägagångssätt kan också vara användbart för att jämföra inom samma genomiska bakgrund för att bestämma frekvensen av mutationer associerade med DSB-reparation vid olika genkontexter (t.ex. nära en promotor, förstärkare eller repressor), mellan celler med olika mutationer (t.ex. signalgener som är konstitutivt aktiva eller missense mutationer) eller andra liknande permutationer. Flexibiliteten och överkomligheten i tillvägagångssättet ger ett kraftfullt verktyg för framtida analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporteras i detta manuskript stöddes av National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW och RP); Nationella cancerinstitutet vid National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center i Kansas State University; och USA:s försvarsdepartement (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Vi uppskattar KSU-CVM Confocal Core och Joel Sanneman för vår immunofluorescensmikroskopi. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis dessa finansieringsorgans officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W.
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
