Summary
Hier gepresenteerd is sgRNA / CAS9 endonuclease en next-generation sequencing protocol dat kan worden gebruikt om de mutaties te identificeren die geassocieerd zijn met dubbelstrengs breukherstel in de buurt van de CD4-promotor.
Abstract
Dubbelstrengsbreuken (DSB's) in DNA zijn de meest cytotoxische vorm van DNA-schade. Omdat een groot aantal beledigingen kan resulteren in deze laesies (bijv. Replicatiestress, ioniserende straling, niet-herstelde UV-schade), komen DSB's elke dag in de meeste cellen voor. Naast celdood verminderen niet-herstelde DSB's de genoomintegriteit en de resulterende mutaties kunnen tumorigenese stimuleren. Deze risico's en de prevalentie van DSB's motiveren onderzoek naar de mechanismen waarmee cellen deze laesies herstellen. Next generation sequencing kan worden gecombineerd met de inductie van DSB's door ioniserende straling om een krachtig hulpmiddel te bieden om de mutaties geassocieerd met DSB-reparatiedefecten nauwkeurig te definiëren. Deze aanpak vereist echter computationeel uitdagende en onbetaalbare whole genome sequencing om de reparatie van de willekeurig voorkomende DSB's geassocieerd met ioniserende straling te detecteren. Zeldzame snijdende endonucleasen, zoals I-Sce1, bieden de mogelijkheid om een enkele DSB te genereren, maar hun herkenningsplaatsen moeten in het genoom van belang worden ingevoegd. Als gevolg hiervan is de plaats van reparatie inherent kunstmatig. Recente ontwikkelingen maken het mogelijk om gids-RNA (sgRNA) een Cas9-endonuclease naar elke genoomlocus van belang te sturen. Dit kan worden toegepast op de studie van DSB-reparatie waardoor sequencing van de volgende generatie kosteneffectiever wordt door het mogelijk te maken dat het wordt gericht op het DNA dat de Cas9-geïnduceerde DSB flankeert. Het doel van het manuscript is om de haalbaarheid van deze aanpak aan te tonen door een protocol te presenteren dat mutaties kan definiëren die voortkomen uit het herstel van een DSB stroomopwaarts van het CD4-gen. Het protocol kan worden aangepast om veranderingen in het mutagene potentieel van DSB geassocieerd met exogene factoren te bepalen, zoals reparatieremmers, virale eiwitexpressie, mutaties en omgevingsblootstellingen met relatief beperkte berekeningsvereisten. Zodra het genoom van een organisme is gesequenced, kan deze methode theoretisch worden gebruikt op elke genomische locus en in elk celkweekmodel van dat organisme dat kan worden getransfecteerd. Vergelijkbare aanpassingen van de aanpak zouden vergelijkingen van reparatiegetrouwheid tussen verschillende loci met dezelfde genetische achtergrond mogelijk kunnen maken.
Introduction
Het handhaven van genomische stabiliteit is van cruciaal belang voor alle levende organismen. Nauwkeurige DNA-replicatie en een robuuste DNA damage response (DDR) zijn nodig om het genetisch materiaalgetrouw te vermeerderen 1,2. DNA-schade komt in de meeste cellen regelmatig voor 2,3. Wanneer deze schade wordt waargenomen, wordt de progressie van de celcyclus gestopt en worden DNA-reparatiemechanismen geactiveerd. Dubbelstrengsbreuken in DNA of DSB's zijn de meest toxische en mutagene vorm van DNA-schade 3,4.
Hoewel verschillende DDR-signaleringsroutes deze laesies kunnen repareren, zijn de meest grondig bestudeerde DSB-reparatieroutes homologe recombinatie (HR) en niet-homologe eindverbinding (NHEJ). HR is een grotendeels foutloos pad dat een DSB repareert met behulp van een zusterchromatide als homoloog sjabloon. Dit gebeurt meestal in de S-fase en G2-fase van een celcyclus 5,6,7. NHEJ is meer foutgevoelig, maar het kan gebeuren gedurende de hele celcyclus 8,9. Er zijn verschillende reporter assays ontwikkeld om de efficiëntie van specifieke reparatiemechanismen te meten 10,11,12. Deze testen hebben de neiging om te vertrouwen op flowcytometrie voor een hoge doorvoermeting van DSB-reparatiepadactiviteit met behulp van GFP of mCherry als een uitlezing11,13. Hoewel ze zeer efficiënt zijn, vertrouwen ze op canonieke reparatie die plaatsvindt bij een kunstmatig geïntroduceerde DSB.
Er zijn verschillende andere methoden die worden gebruikt om DSB-reparatie te bestuderen. Veel van deze zijn afhankelijk van immunofluorescentie (IF) microscopie 1,14. IF-microscopie detecteert discrete nucleaire foci die representatief zijn voor reparatiecomplexen nadat DSB's zijn geïnduceerd door blootstelling aan genotoxische chemicaliën of ioniserende straling15,16. Het volgen van de vorming en resolutie van deze foci geeft een indicatie van reparatie-initiatie en voltooiing, respectievelijk14,17. Deze methoden van DSB-inductie (d.w.z. chemicaliën of ioniserende straling) veroorzaken echter geen DSB's op gedefinieerde locaties in het genoom. Het is ook functioneel onmogelijk om ze te gebruiken om consequent slechts een klein aantal (bijv. 2-4) DSB's te induceren. Als gevolg hiervan veroorzaken de meest gebruikte methoden voor het induceren van DSB's een groot aantal laesies die willekeurig over het genoom zijn verdeeld18. Een klein aantal DSB's kan worden geïntroduceerd door de herkenningsplaats voor een zeldzaam snijdend endonuclease in te voegen en het relevante endonuclease tot expressie te brengen, zoals I-Sce119. Helaas voorkomt de vereiste integratie van een doellocatie het onderzoek van DSB bij endogene genomische loci.
Dit manuscript beschrijft een methode om mutaties te detecteren die verband houden met de reparatie van een DSB gegenereerd op een door de gebruiker gedefinieerde locus. We geven een representatief voorbeeld van de aanpak die wordt toegepast om het vermogen van een viraal eiwit te beoordelen om het aantal mutaties geassocieerd met een DSB te verhogen. Specifiek beschrijft dit manuscript het gebruik van een single guide RNA (sgRNA) om een CAS9-endonuclease te sturen om een DSB te induceren bij menselijk CD4 open leesframe in menselijke voorhuid keratinocyten die vectorcontrole tot expressie brengen (HFK LXSN) en HFK die het E6-eiwit van humaan papillomavirus type 8 (HFK 8E6) tot expressie brengt. Gerichte next-generation sequencing (NGS) van het gebied rond de breuk maakt het mogelijk mutaties geassocieerd met het herstel van de laesie rigoureus te definiëren. Deze gegevens tonen aan dat het virale eiwit een ongeveer 20-voudige toename van mutaties veroorzaakt tijdens DSB-reparatie. Het biedt ook een onbevooroordeelde karakterisering van de mutagene gevolgen van DSB's op een enkele locatie zonder de noodzaak van sequencing van het hele genoom. In principe zou het protocol gemakkelijk kunnen worden aangepast om het relatieve risico op mutaties tussen genoomloci of cellijnen te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celbeplating
- Kweek HFK LXSN- en HFK 8E6-cellen in platen van 10 cm in keratinocytenkweekmedia (10 ml / plaat) met menselijk keratinocytengroeisupplement (HKGS) en 1% penicilline / streptomycine. Kweek cellen tot ongeveer 80% confluentie bij 37 °C in een couveuse met 5% CO2.
- Vervang kweekmedia door 3 ml trypsine-EDTA (0,05%, ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Incubeer bij 37 °C gedurende 3 min. Neutraliseer trypsine met een gelijk volume foetaal runderserum (FBS) aangevulde media en breng cellen over naar een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Resuspend cellen met 10 ml keratinocytenkweekmedia met HKGS. Bepaal de concentratie van cellen met een hemocytometer.
- Plaat 4 x 105 cellen/6 cm platen (zaad twee platen voor HFK LXSN en twee platen voor HFK 8E6) in 4 ml keratinocyten kweekmedia met HKGS en 1% penicilline en streptomycine. Kweek bij 37 °C in een couveuse met 5% CO2.
OPMERKING: Analyse van HFK-cellen is om twee redenen gekozen voor dit protocol. Ten eerste is HFK een moeilijk te transfecteren cellijn. Dus door aan te tonen dat het protocol in deze cellijn werkt, wordt bewijs geleverd dat het waarschijnlijk zal werken in meer algemeen gebruikte en gemakkelijker getransfecteerde cellen. Ten tweede tonen eerder gepubliceerde gegevens aan dat een viraal eiwit (8E6) het herstel van dubbelstrengsbreuken in DNA belemmert 20,21,22. Dus, het vergelijken van HFK LXSN en HFK 8E6 stelt ons in staat om het vermogen van de test aan te tonen om toenames in mutaties te detecteren die verband houden met een vermindering van de cellulaire reparatiecapaciteit.
2. Transfectie
- Vervang op de dag van transfectie (24 uur na plating) de media door 3 ml antibioticavrije aangevulde media. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C in een couveuse.
- Transfectcellen met geschikte transfectiereagentia op basis van lipiden volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwarm transfectiereagentia tot kamertemperatuur en pipetteer voorzichtig voor gebruik.
- Plaats voor elke cellijn (HFK LXSN en HFK 8E6) de juiste hoeveelheid transfectiebuffer (zoals voorgeschreven door de fabrikant) in een steriele centrifugebuis van 1,5 ml (buis 1). Voeg een andere buis toe met dezelfde hoeveelheid transfectiebuffer (mock transfection of Tube 2).
- Voeg 2 μg plasmide-DNA dat CAS9/sgRNA tot expressie brengt dat gericht is op menselijke CD4 (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) toe aan buis 1 uit stap 2.2.2. Pipetteer voorzichtig om volledig te mengen. Voeg een gelijk volume steriel water toe aan buis 2.
- Voeg een controleplaat toe met alleen transfectiereagentia (geen plasmide) voor elke cellijn.
OPMERKING: De tweede plaat dient als een negatieve controle in het experiment, waardoor de gebruiker kan bevestigen dat transfectie met het CAS9/sgRNA niet verantwoordelijk is voor eventuele mutaties. - Voeg de juiste hoeveelheid van het transfectiereagens (zoals aangegeven door de fabrikant) toe aan de buis met DNA-mengsel (buis 1) uit stap 2.2.3 en de neptransfectie (buis 2) uit stap 2.2.2. Pipetteer voorzichtig om volledig te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten om voldoende tijd te geven voor complexen om zich te vormen.
- Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan het bord. Laat de cultuur gedurende 1 minuut zachtjes schommelen om het transfectiemengsel gelijkmatig te verdelen.
- Incubeer gedurende 48 uur na de transfectie om CAS9-expressie mogelijk te maken.
- Oogst cellen door trypsinisatie.
- Vervang kweekmedia door 1 ml trypsine-EDTA (0,05%, ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Incubeer bij 37 °C gedurende 3 min. Neutraliseer trypsine met een gelijk volume FBS-aangevulde media.
- Breng voor elke celplaat de celsuspensie over in twee microcentrifugebuizen met gelijke aliquots. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
- Resuspend de celkorrel uit één buis in stap 2.4.2 in 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor sequencing. Resuspend de andere buis uit stap 2.4.2 met ijskoude PBS voor immunoblot.
- Oogst de hele cel lysaten voor immunoblot.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 300 x g . Gooi het supernatant weg.
- Voeg 100 μL radioimmunoprecipitatie assay buffer (RIPA lysis buffer) gemengd met 1% proteaseremmer en 1% fosfataseremmer toe aan de buis, meng grondig met een pipet en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
OPMERKING: RIPA lysis buffer bevat 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% natriumdeoxycholaat; 0,1% SDS; 140 mM NaCl, en gedeïoniseerd water. - Centrifugeer lyseert bij 13.000 x g gedurende 10 minuten. Verzamel supernatanten voor immunoblot.
3. Cas9-expressie meten via immunoblot
- Bepaal de eiwitconcentratie met een bicinchoninezuur (BCA) -test volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer 20 μg eiwit van elk monster uit in de putten van een 3% -8% Tris-acetaatgel gedurende 150 minuten en semidroogtransfer (10 V gedurende 30 minuten en vervolgens 25 V gedurende 12 minuten) naar polyvinylideendifluoridemembraan.
- Na het blokkeren van het membraan in 5% magere droge melk in PBS met 0,1% tween (PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, voeg anti-CAS9 (1:1000) en anti-GAPDH (1:1000) antilichamen toe. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Na het wassen van het membraan met PBST, incubeer het membraan met secundair antilichaam in 5% magere droge melk in PBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Stel de vlek voor en bepaal het CAS9-niveau met densitometrie23. Zie figuur 1 voor een representatieve vlek.
OPMERKING: Detectie van gefosforyleerde H2AX (S139) focivorming door immunofluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om CAS9-activiteit te valideren14. Een laag aantal verschillende foci (meestal 1-4 foci) wordt verwacht, afhankelijk van de positie van de celcyclus, of mutaties in de CAS9-doellocatie verdere knip voorkomen en hoeveel kopieën van de CAS9-snijplaats er in het genoom van belang bestaan. Een representatief beeld is weergegeven in figuur 2.
4. Nucleïnezuurextractie en amplicongeneratie
- Extraheer DNA uit celmonsters uit stap 2.4.3 met behulp van een DNA-extractiekit met hoog molecuulgewicht, zoals gespecificeerd door de fabrikant.
- Resuspend primers met aangegeven oplosmiddel volgens de datasheet. Verdun met hetzelfde reagens tot 20 μM en pool 20 μM primers in de aangegeven pools.
OPMERKING: Primer pool staat vermeld in Aanvullende tabel 1. - Maak een PCR Master-mix met behulp van een lange versterking Taq polymerase voor elke 20 μM primer pool zoals gespecificeerd in tabel 1.
- Voeg 21 μL van de mastermixen toe aan afzonderlijke PCR-buizen.
- Voeg 4 μL van het doelmonster (100 ng/μL) van stap 4.1 toe aan PCR-testbuizen die mastermix- en doptestbuizen bevatten. Zorg voor afzonderlijke reacties voor elke primerpool.
- Vortex om PCR-testbuizen te mengen en centrifuge (snelle spin) om druppels van buisdeksels te verwijderen.
- Plaats de PCR-buizen op een conventionele thermische cyclermachine.
- Programmeer de PCR-machine zoals gespecificeerd in tabel 2.
- Voer het programma uit op een thermische cycler.
5. PCR-opschoning
- Verwijder primers uit PCR-reacties met behulp van een op kralen gebaseerd PCR-opruimsysteem.
- Verwijder opruimparels 30 minuten voor gebruik uit de koelkast.
- Vortex kralen ruim voor gebruik en zorg ervoor dat alle kralen opnieuw worden gespuspendeerd.
- Voeg 30 μL (1,2x) geresuspendeerde kralen toe aan elke put van een diepe put met 96 putten.
- Voeg 25 μL PCR-reactie toe aan putjes met kralen.
- Leg de plaat op een platenschudder bij 2000 rpm gedurende 2 min.
- Laat de plaat na het schudden 5 minuten op kamertemperatuur blijven.
- Plaats de diepe putplaat op een 96-well plaatmagneet en incubeer gedurende 2 min.
- Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de storende kralen.
- Terwijl de plaat op de magneet blijft, voegt u 180 μL 80% ethanol toe en incubeert u gedurende 30 s. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Herhaal stap 5.1.9.
- Gebruik een pipet van 10 μL om de resterende vloeistof uit de putten te verwijderen en weg te gooien.
- Laat kralen 10 min drogen bij kamertemperatuur.
- Voeg 20 μL nucleasevrij water toe aan de putjes met kralen en verwijder de plaat van de magneet.
- Schud de plaat bij 2000 rpm gedurende 2 min bij kamertemperatuur.
- Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Plaats de plaat op een magneetstandaard en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant in een tweede, gelabelde PCR-plaat. Hierin zit het opgeschoonde DNA.
- Meet de concentratie van elke reactie met een fluorometer.
- Zorg ervoor dat dsDNA Fluorometer reagentia op kamertemperatuur zijn.
- Stel fluorometrische assaybuizen in plus twee extra buizen voor normen.
- Voeg 199 μL 1x dsDNA-werkoplossing toe aan alle buizen, op twee na. Voeg 190 μL van de werkoplossing toe aan de laatste twee buisjes.
- Voeg 10 μL van de twee normen (opgenomen in de tabel met materialen) toe om de testbuizen te scheiden.
- Voeg 1 μL van elke PCR-reactie toe aan fluorometer mastermixbuizen.
- Vortexbuizen om te mengen en te incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Selecteer op het startscherm van de fluorometer de knop met de testkitin(1x dsDNA) en selecteer vervolgens Leesstandaarden en Voer monsters uit.
- Plaats standaard 1 buis, selecteer de knop Lezen en herhaal dit voor standaard 2.
- Herhaal na stap 5.2.6 voor één monster, selecteer een monstervolume van 1 μL en de resulterende concentratie zal worden opgegeven.
- Herhaal stap 5.2.7 voor de overige monsters.
- Bereken de geprojecteerde molariteit van alle reacties en pool gelijke concentraties reacties van elk afzonderlijk monster afzonderlijk (één laatste pool per monster) met behulp van de onderstaande vergelijking.
- Herhaal stap 5.2.1 tot en met 5.2.7 om de uiteindelijke poolconcentratie te verkrijgen.
- Controleer het ampliconzwembad op een capillaire elektroforesemachine/agarosegel zoals opgegeven door de fabrikant.
- Bereid capillaire elektroforesebuizen voor op het juiste aantal monsters. Voeg 7 μL van de DNA-buffer toe zoals opgegeven door de fabrikant.
- Voeg 4 μL van de ampliconpool toe aan de buis met DNA-buffer.
- Plaats buizen op de elektroforesemachine en laat de machine draaien zoals opgegeven door de fabrikant voor dsDNA.
- Bekijk de elektroforese gel foto's ervoor zorgen dat de banden lokaliseren tot ~ 5 kb (grootte van amplicons).
- Bereken de geprojecteerde molariteit van alle reacties en pool gelijke concentraties reacties van elk afzonderlijk monster afzonderlijk (één laatste pool per monster) met behulp van de onderstaande vergelijking.
6. Bibliotheekvoorbereiding
- Verdun monsterpools van stap 5.3.1 tot 0,2 ng/μL voor bibliotheekvoorbereiding.
- Met behulp van een bibliotheekvoorbereidingskit met lage invoer die compatibel is met korte reeksen (300bp), worden bibliotheken voorbereid met behulp van unieke indexcombinaties voor elke monstergroep die in stap 5.3 is gemaakt volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant om indexsequenties te selecteren. Alle indexen die toegankelijk zijn voor de bibliotheekvoorbereidingskit werken voor de monsters. - Na de voorbereiding van de bibliotheek, pool alle monsters volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Voordat u de bibliotheekgroep maakt, berekent u het aantal leesbewerkingen dat nodig is voor 250x dekking van uw doelsequentie en zorgt u ervoor dat de geselecteerde sequencingcartridge voldoende dekking kan bieden voor elk opgenomen monster. Voor 0,5Mb totaal komt dit overeen met 1M reads.
- Met behulp van een bibliotheekvoorbereidingskit met lage invoer die compatibel is met korte reeksen (300bp), worden bibliotheken voorbereid met behulp van unieke indexcombinaties voor elke monstergroep die in stap 5.3 is gemaakt volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid de bibliotheekpool voor op volgorde.
- Ontdooi en bereid een patroon met 300 patronen en sequencingreagentia voor.
- Denatureer en verdun de sequencingpool die in stap 5.1.1 is gemaakt volgens de instructies van de fabrikant van de sequencer.
- Voeg gedenatureerde en verdunde bibliotheekgroep toe aan sequencingreagentia en voer de sequencingmachine uit zoals opgegeven door de fabrikant.
OPMERKING: Zie bijgevoegde tabel 3 voor probleemoplossing.
7. Data-analyse
OPMERKING: Alle gegevensstappen worden uitgevoerd in de genomische gegevensanalysesoftware. Haakjes geven gebruikersinvoer aan. Groter dan teken geeft de volgorde van muisklikken aan voor een bepaalde stap (bijv.1e muisklik>2e muisklik)
- Importeer de reads door te klikken op Open Software > Import > Illumina > Select Files > Next > Selecteer locatie om op te slaan > voltooien. De reads verschijnen nu in de software.
- Trim en filter de reads.
- In de deep sequence data-analysesoftware kunt u de standaardparameters van raw reads bijsnijden.
- Markeer de reads en klik op Toolbox > Prepare Sequencing Data > Trim Reads > Next > Next > Next > Next > Save > Next > (Selecteer locatie om op te slaan) > Finish
- Breng de bijgesneden reads in kaart om naar te verwijzen.
- Kaart bijgesneden leest naar de referentievolgorde die wordt gebruikt in stap 4.1 met behulp van een matchscore van 2, mismatch-kosten van 3 en invoeg- / verwijderingskosten van 2. Zorg ervoor dat de lengtefractie hoger is dan 0,7 en de gelijkenisfractie op of boven 0,8.
- Markeer het bijgesneden leesbestand en klik op Toolbox > Resequencing Analysis > Map Reads to Reference > Next > (Select reference sequence) > Next > (Zorg ervoor dat parameters worden aangegeven zoals hierboven) > Next > Save > (Select location to save) > Finish.
- Extract varianten en indels.
- Gebruik een geschikte indel caller om indels te extraheren met behulp van een p-waarde drempel van 0,005 of lager en een maximum aantal mismatches van 3.
- Markeer het toegewezen leesbestand en klik op Toolbox > Analyse voor het opnieuw rangschikken > variantdetectie > indels en structurele varianten > Volgende > (Zorg ervoor dat de vereiste betekenis wordt ingevoerd > Volgende > Sla > op (Selecteer locatie om op te slaan) > Voltooid.
- Met behulp van een geschikte variant beller, bel varianten van de leestoewijzing met een significantie van 5%.
- Markeer het toegewezen leesbestand en klik op Toolbox > Resequencing Analysis > Variant Detection > Low frequency variant detection > Next > (Zorg ervoor dat de vereiste significantie invoer is > Volgende > Volgende > Sla > op (Selecteer locatie om op te slaan) > Finish.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u rekening houdt met de ploïdie van het gastheergenoom in de indel- en variantbellers. Extraheer geen mutanten onder de 5%. Deze drempel houdt rekening met PCR- en sequencingfouten die aan de test zijn gekoppeld. Normalisatie (op basis van immunoblotdetectie van CAS9) moet worden uitgevoerd door de sequencingdekking aan te passen. Als monster A bijvoorbeeld tweemaal de transfectie-efficiëntie van monster B heeft, moet 50% van de aflezingen van monster A voor analyse worden gebruikt. Dit moet worden gedaan door middel van aselecte bemonstering en mag de dekking voor een monster niet verminderen tot minder dan 100x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor dit protocol worden drie representatieve resultaten gepresenteerd. Figuur 1 is een immunoblot dat de expressie van CAS9 bevestigt in HFK-controle (LXSN) en HFK-expressie van bèta-HPV 8E6 (8E6). 48 uur na transfectie werden hele cellysaten geoogst en vervolgens gesondeerd met een anti-CAS9-antilichaam (of GAPDH als belastingscontrole). Het resultaat laat zien dat HFK LXSN en HFK 8E6 een vergelijkbare hoeveelheid CAS9 uitdrukken, wat aangeeft dat de transfectie-efficiëntie vergelijkbaar is tussen twee cellijnen. Figuur 2 is een immunofluorescentiemicroscopiebeeld van CAS9-geïnduceerde DSB's met pH2AX-foci, een standaardmarker voor DSB's24. Dit geeft aan dat twee DSB's worden geïnduceerd door CAS9/sgRNA en bevestigt dus dat DSB-inductie plaatsvindt zoals verwacht. Figuur 3 laat zien dat 8E6 de genomische variaties binnen 200 Kb rond de DOOR CAS9 geïnduceerde DSB22 verhoogt. Dit komt overeen met de hypothese dat HPV8 E6 DSB-reparatie dereguleert en de genomische instabiliteit verhoogt. Deze figuur toont een manier waarop gegevens die uit deze benadering zijn verkregen, kunnen worden weergegeven.
Figuur 1: Representatief beeld van immunoblot waarin CAS9-expressie in niet-getransfecteerde en getransfecteerde HFK-cellen wordt vergeleken. sgRNA/CAS9-plasmiden werden gebruikt om HFK-cellen te transfecteren. Anti-CAS9-antilichaam werd gebruikt om het CAS9-eiwit te detecteren. GAPDH wordt gebruikt als laadregeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatief immunofluorescentiebeeld van gefosforyleerd histon H2AX (S139) in sgRNA/CAS9 getransfecteerde cel en niet-getransfecteerde controle. DAPI werd gebruikt om DNA (Blauw) te kleuren. pH2AX (Rood) is een marker voor CAS9-geïnduceerde DSB. Dit toont aan dat optimale CAS9-expressie is bereikt door de afwezigheid van off-target decolleté. Afhankelijk van het aantal beoogde genoomloci (veranderd door veranderingen in de ploïdie van de cel, variaties in het aantal kopieën van de doellocatie of de positie van de celcyclus), kan het aantal foci hoger zijn. Elke toename moet echter voorspelbaar zijn op basis van het celtype en de geanalyseerde doellocatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bèta-HPV 8E6 verhoogt de genomische instabiliteit tijdens DSB-reparatie. (A) Schema van de plaatsing van CAS9 geïnduceerde DSB langs het gesequencede deel van het genoom. (B) Genomische variaties gegroepeerd naar soorten mutatiegebeurtenissen in HFK LXSN en HFK 8E6. Elke groep genomische variaties en het totale aantal variaties werden vergeleken tussen HFK LXSN en HFK 8E6. (C) Circos plot van DNA mutaties in HFK LXSN (rechterkant) en HFK 8E6 cellen (linkerkant). Zwarte pijlen geven CAS9-snijplaatsen aan. De binnenste cirkel toont verbindingen tussen identieke genomische herschikkingen. De locatie van genomische herschikkingen gekleurd door soorten genomische variaties worden weergegeven in vijf concentrische cirkels (blauw staat voor SNP, groen voor insertie, rood voor deletie, paars voor MNV en zwart voor vervanging). Spreidingsdiagram in de buitenste cirkel toont breekpunten (zwart), tandemduplicaties (rood) en puntindels (grijs), waarbij de nabijheid van de buitenrand een hoge variantverhouding vertegenwoordigt. SNP, single nucleotide polymorfisme. MNV, multi-nucleotide variatie. Statistische verschillen tussen cellijnen werden gemeten met behulp van een Studenten t-toets. geeft p < 0,001" aan. Dit is aangepast van een eerder gepubliceerde referentie met toestemming22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: PCR Master mix componenten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: PCR-programma-instellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Trouble shootings. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Lijst van primerpool voor PCR. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Naast de diepte van de verstrekte informatie, zijn er verschillende voordelen aan deze methode. Ten eerste kan DSB-reparatie in theorie worden beoordeeld op elke genomische loci zonder het genoom van de cel van belang te wijzigen. Ten tweede wordt de toegang tot NGS-analyse van reparatie vergroot door de lagere kosten en rekeninspanning die wordt geboden door het maken en analyseren van een enkele DSB gericht op een bepaald gebied. Ten slotte, nu de genomen van extra organismen routinematig beschikbaar komen en meerdere publicaties succesvolle transfectie van diverse zoogdier- en niet-zoogdiercellijnen aantonen, wordt verwacht dat het nut van deze aanpak breed zal zijn 10,23,24.
Dit manuscript analyseerde DSB-reparatie in menselijke voorhuidkertinocyten als een illustratief voorbeeld. Transfectie-efficiëntie heeft de neiging om lager te zijn in keratinocyten dan andere weefseltypen. Daarom gebruikte dit protocol een transfectiebenadering die was geoptimaliseerd voor deze moeilijk te transfecteren cellen. De transfectiebenadering moet worden geoptimaliseerd voor het geanalyseerde celtype. Het vermogen van CAS9-geïnduceerde DSB die in dit protocol wordt gebruikt, is bevestigd bij osteosarcoom, darmkanker, longkanker, fibroblast, embryonale nier en menselijke keratinocytcellen10,23. Voordat u echter sequencing van de volgende generatie uitvoert, wordt aanbevolen dat cas9-expressie en -activiteit worden bevestigd.
Een cruciale stap in dit protocol is het vergelijken tussen of tussen verschillende monsters om de analyse te normaliseren om rekening te houden met verschillen in CAS9-transfectie-efficiëntie. Om dat te doen, moet het relatieve CAS9-eiwitgehalte worden gemeten door immunoblotting en densitometrie (figuur 1). Het is ook belangrijk om de specificiteit van CAS9-splitsing te waarborgen, zoals aangegeven door verschillende pH2AX (S139) focivorming, detecteerbaar door IF-microscopie14 (figuur 3). Als alternatief kan de T7-endonucleasetest worden gebruikt om CRISPR / Cas9-activiteit en sgRNA-efficiëntie te onderzoeken.
Een opmerkelijke beperking van deze benadering is dat CAS9-geïnduceerde DSB de neiging heeft om "schoner" te zijn dan DSB veroorzaakt door straling of soortgelijke fysiologische schade. Daarom kan de hier beschreven methode het aantal of de ernst van de mutaties die verband houden met het herstel van natuurlijk voorkomende laesies onderschatten. Het gebruik van andere sequentiespecifieke nucleasen die DSB induceren met langere overhangen kan helpen deze beperking te overwinnen26. Bovendien is het niet volledig duidelijk of chromatinegebied (bijv. Heterochromatine en euchromatine) de CAS9-activiteit beïnvloedt. De gebruiker moet dus voorzichtig zijn om equivalente CAS9-activiteit te bevestigen bij het vergelijken van mutaties op verschillende locaties.
De hier beschreven methode kan worden gebruikt om de relatieve mutagene gevolgen van het repareren van DSB's in verschillende contexten te definiëren. Het zou bijvoorbeeld het onderzoek van nieuwe DNA-reparatieremmers met kleine moleculen kunnen vergemakkelijken. Hierdoor zouden remmers die meer mutageen zijn in getransformeerde (in vergelijking met niet-getransformeerde) cellen prioriteit kunnen krijgen voor ontwikkeling als chemotherapeutische middelen. Deze benadering kan ook nuttig zijn om binnen dezelfde genomische achtergrond te vergelijken om de frequentie van mutaties geassocieerd met DSB-reparatie te bepalen in verschillende gencontexten (bijvoorbeeld in de buurt van een promotor, versterker of repressor), tussen cellen met verschillende mutaties (bijvoorbeeld signaleringsgenen die constitutief actief zijn of missense-mutaties), of andere vergelijkbare permutaties. De flexibiliteit en betaalbaarheid van de aanpak biedt een krachtig instrument voor toekomstige analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek gerapporteerd in dit manuscript werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW en RP); Nationaal Kankerinstituut van de National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center in Kansas State University; en het Amerikaanse ministerie van Defensie (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). We waarderen KSU-CVM Confocal Core en Joel Sanneman voor onze immunofluorescentiemicroscopie. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van deze financieringsagentschappen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W.
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
