Summary
Qui viene presentata l'endonucleasi sgRNA/CAS9 e il protocollo di sequenziamento di nuova generazione che può essere utilizzato per identificare le mutazioni associate alla riparazione della rottura del doppio filamento vicino al promotore CD4.
Abstract
Le rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA sono il tipo più citotossico di danno al DNA. Poiché una miriade di insulti può causare queste lesioni (ad esempio, stress di replicazione, radiazioni ionizzanti, danni UV non riparati), i DSB si verificano nella maggior parte delle cellule ogni giorno. Oltre alla morte cellulare, i DSB non riparati riducono l'integrità del genoma e le mutazioni risultanti possono guidare la tumorigenesi. Questi rischi e la prevalenza di DSB motivano le indagini sui meccanismi con cui le cellule riparano queste lesioni. Il sequenziamento di nuova generazione può essere abbinato all'induzione di DSB mediante radiazioni ionizzanti per fornire un potente strumento per definire con precisione le mutazioni associate ai difetti di riparazione del DSB. Tuttavia, questo approccio richiede un sequenziamento dell'intero genoma computazionalmente impegnativo e proibitivo per rilevare la riparazione dei DSB che si verificano casualmente associati alle radiazioni ionizzanti. Rare endonucleasi da taglio, come I-Sce1, forniscono la capacità di generare un singolo DSB, ma i loro siti di riconoscimento devono essere inseriti nel genoma di interesse. Di conseguenza, il sito di riparazione è intrinsecamente artificiale. Recenti progressi consentono all'RNA guida (sgRNA) di dirigere un'endonucleasi Cas9 a qualsiasi locus del genoma di interesse. Questo potrebbe essere applicato allo studio della riparazione del DSB rendendo il sequenziamento di prossima generazione più conveniente consentendo di concentrarsi sul DNA che fiancheggia il DSB indotto da Cas9. L'obiettivo del manoscritto è dimostrare la fattibilità di questo approccio presentando un protocollo in grado di definire mutazioni che derivano dalla riparazione di un DSB a monte del gene CD4. Il protocollo può essere adattato per determinare i cambiamenti nel potenziale mutageno del DSB associati a fattori esogeni, come inibitori di riparazione, espressione proteica virale, mutazioni ed esposizioni ambientali con requisiti di calcolo relativamente limitati. Una volta che il genoma di un organismo è stato sequenziato, questo metodo può essere teoricamente impiegato in qualsiasi locus genomico e in qualsiasi modello di coltura cellulare di quell'organismo che può essere trasfettato. Adattamenti simili dell'approccio potrebbero consentire confronti di fedeltà di riparazione tra diversi loci nello stesso background genetico.
Introduction
Mantenere la stabilità genomica è fondamentale per tutti gli organismi viventi. Una replicazione accurata del DNA e una robusta risposta al danno del DNA (DDR) sono necessarie per propagare fedelmente il materiale genetico 1,2. I danni al DNA si verificano regolarmente nella maggior parte delle cellule 2,3. Quando questi danni vengono rilevati, la progressione del ciclo cellulare viene interrotta e vengono attivati i meccanismi di riparazione del DNA. Le rotture a doppio filamento nel DNA o nei DSB sono il tipo più tossico e mutageno di danno al DNA 3,4.
Mentre diverse vie di segnalazione DDR possono riparare queste lesioni, le vie di riparazione DSB più studiate sono la ricombinazione omologa (HR) e l'unione finale non omologa (NHEJ). HR è un percorso in gran parte privo di errori che ripara un DSB utilizzando un cromatide gemello come modello omologo. Questo tende ad accadere nella fase S e nella fase G2 di un ciclo cellulare 5,6,7. NHEJ è più soggetto a errori, ma può accadere durante il ciclo cellulare 8,9. Sono stati sviluppati vari saggi reporter per misurare l'efficienza di specifici meccanismi di riparazione 10,11,12. Questi saggi tendono a fare affidamento sulla citometria a flusso per una misurazione ad alto rendimento dell'attività del percorso di riparazione del DSB utilizzando GFP o mCherry come lettura11,13. Sebbene altamente efficienti, si basano sulla riparazione canonica che si verifica in un DSB introdotto artificialmente.
Ci sono una varietà di altri metodi utilizzati per studiare la riparazione DSB. Molti di questi si basano sulla microscopia a immunofluorescenza (IF) 1,14. La microscopia IF rileva focolai nucleari discreti rappresentativi di complessi di riparazione dopo che i DSB sono indotti dall'esposizione a sostanze chimiche genotossiche o radiazioni ionizzanti15,16. Tracciare la formazione e la risoluzione di questi fuochi fornisce un'indicazione di inizio e completamento della riparazione, rispettivamente14,17. Tuttavia, questi metodi di induzione del DSB (cioè sostanze chimiche o radiazioni ionizzanti) non causano DSB in posizioni definite nel genoma. È anche funzionalmente impossibile usarli per indurre costantemente solo un piccolo numero (ad esempio, 2-4) di DSB. Di conseguenza, i metodi più comunemente usati per indurre i DSB causano una moltitudine di lesioni distribuite casualmente in tutto il genoma18. Un piccolo numero di DSB può essere introdotto inserendo il sito di riconoscimento per un'endonucleasi rara ed esprimendo l'endonucleasi pertinente, come I-Sce119. Sfortunatamente, l'integrazione richiesta di un sito target impedisce l'esame del DSB in loci genomici endogeni.
Questo manoscritto descrive un metodo per rilevare le mutazioni associate alla riparazione di un DSB generato in un luogo definito dall'utente. Forniamo un esempio rappresentativo dell'approccio applicato per valutare la capacità di una proteina virale di aumentare il numero di mutazioni associate a un DSB. In particolare, questo manoscritto descrive l'uso di un singolo RNA guida (sgRNA) per dirigere un'endonucleasi CAS9 per indurre un DSB al frame di lettura aperto CD4 umano nei cheratinociti del prepuzio umano che esprimono il controllo vettoriale (HFK LXSN) e HFK che esprime la proteina E6 del virus del papilloma umano di tipo 8 (HFK 8E6). Il sequenziamento mirato di nuova generazione (NGS) della regione circostante la rottura consente di definire rigorosamente le mutazioni associate alla riparazione della lesione. Questi dati dimostrano che la proteina virale provoca un aumento di circa 20 volte delle mutazioni durante la riparazione del DSB. Fornisce inoltre una caratterizzazione imparziale delle conseguenze mutagene dei DSB in un singolo locus senza la necessità di sequenziamento dell'intero genoma. In linea di principio, il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per confrontare il rischio relativo di mutazioni tra loci del genoma o linee cellulari.
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Protocol
1. Placcatura cellulare
- Coltiva cellule HFK LXSN e HFK 8E6 in piastre da 10 cm in terreni di coltura di cheratinociti (10 ml / piastra) con integratore di crescita dei cheratinociti umani (HKGS) e 1% di penicillina / streptomicina. Far crescere le cellule a circa l'80% di confluenza a 37 °C in un incubatore a camicia con il 5% di CO2.
- Sostituire i terreni di coltura con 3 ml di tripsina-EDTA (0,05%, acido tetraacetico etilendiammina). Incubare a 37 °C per 3 min. Neutralizzare la tripsina con uguale volume di siero bovino fetale (FBS) integrato nei mezzi e trasferire le cellule in un tubo centrifugo da 15 ml. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
- Risospese le cellule con 10 mL di terreno di coltura dei cheratinociti con HKGS. Determinare la concentrazione di cellule con un emocitometro.
- Piastra 4 x 105 cellule/piastre da 6 cm (seminare due piastre per HFK LXSN e due piastre per HFK 8E6) in 4mL di terreno di coltura di cheratinociti con HKGS e 1% di penicillina e streptomicina. Crescere a 37 °C in un incubatore a camicia con il 5% di CO2.
NOTA: L'analisi delle cellule HFK è stata scelta per questo protocollo per due motivi. Innanzitutto, HFK è una linea cellulare difficile da trasfettare. Pertanto, dimostrando che il protocollo funziona in questa linea cellulare, viene fornita la prova che probabilmente funzionerà in cellule più comunemente usate e più facilmente trasfettate. In secondo luogo, i dati pubblicati in precedenza dimostrano che una proteina virale (8E6) ostacola la riparazione delle rotture a doppio filamento nel DNA 20,21,22. Pertanto, il confronto tra HFK LXSN e HFK 8E6 ci consente di dimostrare la capacità del test di rilevare aumenti delle mutazioni associate a una riduzione della capacità di riparazione cellulare.
2. Trasfezione
- Il giorno della trasfezione (24 ore dopo la placcatura), sostituire il fluido con 3 ml di supporti integrati privi di antibiotici. Incubare per 2 ore a 37 °C in un'incubatrice a camicia.
- Trasfettare le cellule con reagenti di trasfezione a base lipidica appropriati secondo le istruzioni del produttore.
- Reagenti di trasfezione caldi a temperatura ambiente e pipettare delicatamente prima dell'uso.
- Per ogni linea cellulare (HFK LXSN e HFK 8E6), posizionare la quantità appropriata di tampone di trasfezione (come indicato dal produttore) in un tubo centrifugo sterile da 1,5 ml (tubo 1). Includere un altro tubo con la stessa quantità di tampone di trasfezione (trasfezione simulata o Tubo 2).
- Aggiungere 2 μg di DNA plasmidico che esprime CAS9/sgRNA mirato al CD4 umano (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) al Tubo 1 dal passo 2.2.2. Pipettare delicatamente per mescolare completamente. Aggiungere lo stesso volume di acqua sterile al tubo 2.
- Includere una piastra di controllo con reagenti di trasfezione da soli (senza plasmide) per ogni linea cellulare.
NOTA: La seconda piastra funge da controllo negativo nell'esperimento, consentendo all'utente di confermare che la trasfezione con CAS9/sgRNA non è responsabile di alcuna mutazione. - Aggiungere la quantità appropriata del reagente di trasfezione (come indicato dal produttore) al tubo con miscela di DNA (tubo 1) dal punto 2.2.3 e la trasfezione simulata (tubo 2) dal punto 2.2.2. Pipettare delicatamente per mescolare completamente. Incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti per consentire il tempo sufficiente per la formazione di complessi.
- Aggiungere la miscela di trasfezione a goccia al piatto. Scuotere delicatamente la coltura per 1 minuto per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione.
- Incubare per 48 ore dopo la trasfezione per consentire l'espressione di CAS9.
- Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione.
- Sostituire i terreni di coltura con 1 mL di tripsina-EDTA (0,05%, acido tetraacetico etilendiammina). Incubare a 37 °C per 3 min. Neutralizzare la tripsina con lo stesso volume di media integrati FBS.
- Per ogni piastra di cellule, trasferire la sospensione cellulare in due tubi microcentrifuga con aliquote uguali. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
- Risospendare il pellet cellulare da un tubo nella fase 2.4.2 in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per il sequenziamento. Sospendere l'altro tubo dal punto 2.4.2 con PBS ghiacciato per immunoblot.
- Raccogli i lisati cellulari interi per immunoblot.
- Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante.
- Aggiungere nel tubo un tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione da 100 μL (tampone di lisi RIPA) miscelato con inibitore della proteasi all'1 % e inibitore della fosfatasi all'1 %, mescolare accuratamente con una pipetta e incubare per 10 minuti sul ghiaccio.
NOTA: il tampone di lisi RIPA contiene 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% di sodio desossicolato; 0,1% SDS; 140 mM NaCl e acqua deionizzata. - Centrifuga lisati a 13.000 x g per 10 min. Raccogliere supernatanti per immunoblot.
3. Misurazione dell'espressione di CAS9 tramite immunoblot
- Determinare la concentrazione proteica con un test dell'acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire 20 μg di proteine di ciascun campione nei pozzetti di un gel tris-acetato al 3%-8% per 150 minuti e trasferire semidry (10 V per 30 minuti e poi 25 V per 12 minuti) alla membrana di polivinilidene difluoruro.
- Dopo aver bloccato la membrana nel 5% di latte secco non grasso in PBS con interpolazione allo 0,1% (PBST) per 1 ora a temperatura ambiente, aggiungere anticorpi anti-CAS9 (1:1000) e anti-GAPDH (1:1000). Incubare a 4 °C durante la notte.
- Dopo aver lavato la membrana con PBST, incubare la membrana con anticorpo secondario in latte secco non grasso al 5% in PBST per 1 ora a temperatura ambiente.
- Immagine della macchia e determina il livello CAS9 mediante densitometria23. Vedere la Figura 1 per una macchia rappresentativa.
NOTA: Il rilevamento della formazione di focolai di H2AX fosforilato (S139) mediante microscopia a immunofluorescenza può essere utilizzato per convalidare l'attività di CAS914. Ci si aspetta un basso numero di focolai distinti (tipicamente 1-4 focolai) a seconda della posizione del ciclo cellulare, se le mutazioni nel sito bersaglio CAS9 impediscono ulteriori tagli e quante copie del sito di taglio CAS9 esistono nel genoma di interesse. Un'immagine rappresentativa è mostrata nella Figura 2.
4. Estrazione dell'acido nucleico e generazione di amplicon
- Estrarre il DNA dai campioni cellulari dal passaggio 2.4.3 utilizzando un kit di estrazione del DNA ad alto peso molecolare, come specificato dal produttore.
- Primer risospesi con solvente indicato secondo la scheda tecnica. Diluire con lo stesso reagente a 20 μM e raggruppare i primer da 20 μM nelle piscine indicate.
NOTA: il pool di primer è elencato nella Tabella supplementare 1. - Creare una miscela PCR Master utilizzando una lunga amplificazione Taq polimerasi per ogni pool di primer da 20 μM come specificato nella Tabella 1.
- Aggiungere 21 μL dei mastermix ai tubi PCR separati.
- Aggiungere 4 μL del campione target (100 ng/μL) dal punto 4.1 ai tubi di dosaggio PCR contenenti provette mastermix e cap. Garantire reazioni separate per ogni pool di primer.
- Vortice per miscelare tubi di analisi PCR e centrifuga (rotazione rapida) per rimuovere le goccioline dai coperchi dei tubi.
- Posizionare i tubi PCR su una macchina termociclatrice convenzionale.
- Programmare la macchina PCR come specificato nella Tabella 2.
- Eseguire il programma su un termociclatore.
5. Pulizia PCR
- Rimuovere i primer dalle reazioni PCR utilizzando un sistema di pulizia PCR basato su perline.
- Rimuovere le perline di pulizia dal frigorifero 30 minuti prima dell'uso.
- Le perle Vortex sono ben prima dell'uso e assicurano che tutte le perline siano risospese.
- Aggiungere 30 μL (1,2x) di perline risospese a ciascun pozzetto di una piastra profonda da 96 pozzetti.
- Aggiungere 25 μL di reazione PCR ai pozzetti contenenti perline.
- Posizionare la piastra su uno shaker a piastre a 2000 giri / min per 2 minuti.
- Lasciare che la piastra rimanga a temperatura ambiente per 5 minuti dopo l'agitazione.
- Posizionare la piastra del pozzo profondo su un magnete a piastra a 96 pozzetti e incubare per 2 minuti.
- Rimuovere e scartare il surnatante senza le perle disturbanti.
- Mentre la piastra rimane sul magnete, aggiungere 180 μL di etanolo all'80% e incubare per 30 s. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
- Ripetere il passaggio 5.1.9.
- Utilizzando una pipetta da 10 μL, rimuovere ed eliminare il liquido rimanente dai pozzetti.
- Lasciare asciugare le perline a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aggiungere 20 μL di acqua priva di nucleasi ai pozzetti contenenti perline e rimuovere la piastra dal magnete.
- Agitare la piastra a 2000 giri /min per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare la piastra su un supporto magnetico e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante in una seconda piastra PCR etichettata. Questo contiene il DNA ripulito.
- Misurare la concentrazione di ogni reazione con un fluorometro.
- Assicurarsi che i reagenti del fluorometro dsDNA siano a temperatura ambiente.
- Impostare tubi di analisi fluorometrici più due tubi aggiuntivi per gli standard.
- Aggiungere 199 μL di 1x soluzione di lavoro dsDNA a tutti i tubi tranne due. Aggiungere 190 μL della soluzione di lavoro agli ultimi due tubi.
- Aggiungere 10 μL dei due standard (inclusi nella Tabella dei materiali) per separare i tubi di analisi.
- Aggiungere 1 μL di ogni reazione PCR ai tubi mastermix del fluorometro.
- Tubi a vortice da miscelare e incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Nella schermata iniziale del fluorometro, selezionare il pulsante con il kitin di analisi (1x dsDNA), quindi selezionare Leggi standard ed esegui campioni.
- Inserire 1 tubo standard, selezionare il pulsante Leggi e quindi ripetere per lo standard 2.
- Dopo il passaggio 5.2.6, ripetere per un campione, selezionare un volume di campione di 1 μL e verrà fornita la concentrazione risultante.
- Ripetere il passaggio 5.2.7 per i campioni rimanenti.
- Calcolare la molarità proiettata di tutte le reazioni e raggruppare concentrazioni uguali di reazioni da ogni singolo campione separatamente (un pool finale per campione) utilizzando l'equazione seguente.
- Ripetere i passaggi da 5.2.1 a 5.2.7 per ottenere la concentrazione finale del pool.
- Controllare il pool di amplicon su una macchina per elettroforesi capillare / gel di agarosio come specificato dal produttore.
- Preparare i tubi di elettroforesi capillare per il numero appropriato di campioni. Aggiungere 7 μL del tampone DNA come specificato dal produttore.
- Aggiungere 4 μL del pool di ampliconi al tubo contenente il tampone del DNA.
- Posizionare i tubi sulla macchina per elettroforesi ed eseguire la macchina come specificato dal produttore per il dsDNA.
- Visualizza le immagini del gel di elettroforesi assicurandoti che le bande si localizzino a ~ 5 kb (dimensione degli ampliconi).
- Calcolare la molarità proiettata di tutte le reazioni e raggruppare concentrazioni uguali di reazioni da ogni singolo campione separatamente (un pool finale per campione) utilizzando l'equazione seguente.
6. Preparazione della biblioteca
- Diluire i pool di campioni dai livelli 5.3.1 a 0,2 ng/μL per la preparazione della libreria.
- Utilizzando un kit di preparazione della libreria a basso input compatibile con sequenze brevi (300bp) preparare le librerie utilizzando combinazioni di indici univoche per ogni pool di campioni creato nel passaggio 5.3 seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: seguire le istruzioni del produttore per selezionare le sequenze di indice. Tutti gli indici suscettibili al kit di preparazione della libreria funzioneranno per i campioni. - Dopo la preparazione della libreria, raggruppare tutti i campioni secondo le istruzioni del produttore.
NOTA: prima di creare il pool di librerie, calcolare il numero di letture necessarie per una copertura 250x della sequenza di destinazione e assicurarsi che la cartuccia di sequenziamento selezionata possa fornire una copertura adeguata per ciascun campione incluso. Per un totale di 0,5 Mb, ciò equivarrà a 1 milione di letture.
- Utilizzando un kit di preparazione della libreria a basso input compatibile con sequenze brevi (300bp) preparare le librerie utilizzando combinazioni di indici univoche per ogni pool di campioni creato nel passaggio 5.3 seguendo le istruzioni del produttore.
- Preparare il pool di librerie per la sequenziazione.
- Scongelare e preparare una cartuccia a 300 cicli e reagenti di sequenziamento.
- Denaturare e diluire il pool di sequenziamento creato nel punto 5.1.1 secondo le istruzioni del produttore del sequencer.
- Aggiungere il pool di librerie denaturate e diluite ai reagenti di sequenziamento ed eseguire la macchina di sequenziazione come specificato dal produttore.
NOTA: vedere allegata la tabella 3 per le procedure di risoluzione dei problemi.
7. Analisi dei dati
NOTA: tutti i passaggi dei dati vengono eseguiti nel software di analisi dei dati genomici. Le parentesi indicano l'input dell'utente. Maggiore del segno indica l'ordine dei clic del mouse per un dato passaggio (ad esempio, 1° clic del mouse>2° clic del mouse)
- Importare le letture facendo clic su Apri software > Importa > Illumina > Seleziona file > Avanti > Seleziona posizione > fine. Le letture appariranno ora nel software.
- Tagliare e filtrare le letture.
- Nel software di analisi dei dati di sequenza profonda, tagliare i parametri predefiniti delle letture non elaborate.
- Evidenziare le letture e fare clic su Casella degli strumenti > Prepara i dati di sequenziazione > Taglia le letture > > Successiva > Avanti > Avanti > Salva > > successivo (Seleziona percorso da salvare) > Fine
- Mappare le letture tagliate al riferimento.
- La mappa tagliata legge la sequenza di riferimento utilizzata nel passaggio 4.1 utilizzando un punteggio di corrispondenza di 2, un costo di mancata corrispondenza di 3 e costi di inserimento/eliminazione di 2. Assicurarsi che la frazione di lunghezza sia superiore a 0,7 e che la frazione di somiglianza sia pari o superiore a 0,8.
- Evidenziare il file di lettura tagliato e fare clic su Casella degli strumenti > Risequencing Analysis > Map Reads to Reference > Next > (Select reference sequence) > Next > (Assicurarsi che i parametri siano indicati come sopra) > Next > Save > (Select location to save) > Finish.
- Estrarre varianti e indels.
- Utilizzando un chiamante indel appropriato, estrarre indels utilizzando una soglia di valore p pari o inferiore a 0,005 e un numero massimo di mancate corrispondenze pari a 3.
- Evidenziare il file di lettura mappato e fare clic su Toolbox > Analisi di risequenziamento > Rilevamento varianti > Varianti indels e strutturali > > successiva (Assicurarsi che la significatività richiesta sia immessa > > Successivo Salva > (Selezionare la posizione da salvare) > Fine.
- Utilizzando un chiamante di variante appropriato, chiamare le varianti dal mapping di lettura utilizzando una significatività del 5%.
- Evidenziare il file di lettura mappato e fare clic su Toolbox > Analisi di risequenziamento > Rilevamento varianti > Rilevamento varianti a bassa frequenza > > successiva (Assicurarsi che la significatività richiesta sia immessa > > > Successiva > Salva > (Selezionare il percorso da salvare) > Fine.
NOTA: Assicurarsi di tenere conto della ploidia del genoma dell'ospite nei chiamanti indel e variant. Non estrarre mutanti al di sotto del 5%. Questa soglia tiene conto degli errori di PCR e sequenziamento associati al test. La normalizzazione (basata sul rilevamento immunoblot di CAS9) deve essere effettuata regolando la copertura del sequenziamento. Ad esempio, se il campione A ha il doppio dell'efficienza di trasfezione del campione B, il 50% delle letture del campione A deve essere utilizzato per l'analisi. Questo dovrebbe essere fatto con un campionamento casuale e non ridurre la copertura per qualsiasi campione inferiore a 100x.
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Representative Results
Per questo protocollo vengono presentati tre risultati rappresentativi. La Figura 1 è un immunoblot che conferma l'espressione di CAS9 nel controllo HFK (LXSN) e HFK che esprime beta-HPV 8E6 (8E6). 48 ore dopo la trasfezione, i lisati a cellule intere sono stati raccolti e successivamente sondati con un anticorpo anti-CAS9 (o GAPDH come controllo del carico). Il risultato mostra che HFK LXSN e HFK 8E6 esprimono una quantità simile di CAS9, indicando che l'efficienza di trasfezione è simile tra due linee cellulari. La Figura 2 è un'immagine al microscopio a immunofluorescenza che mostra i DSB indotti da CAS9 utilizzando focolai di pH2AX, un marcatore standard per i DSB24. Ciò indica che due DSB sono indotti da CAS9/sgRNA e quindi conferma che l'induzione di DSB si sta verificando come previsto. La Figura 3 mostra che 8E6 aumenta le variazioni genomiche entro 200 Kb intorno al DSB22 indotto da CAS9. Ciò è coerente con l'ipotesi che l'HPV8 E6 deregola la riparazione del DSB e aumenti l'instabilità genomica. Questa figura mostra un modo in cui i dati ottenuti da questo approccio possono essere visualizzati.
Figura 1: Immagine rappresentativa di immunoblot che confronta l'espressione di CAS9 in cellule HFK non trasfettate e trasfettate. i plasmidi sgRNA/CAS9 sono stati utilizzati per trasfettare le cellule HFK. L'anticorpo anti-CAS9 è stato utilizzato per rilevare la proteina CAS9. GAPDH viene utilizzato come controllo del carico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine rappresentativa di immunofluorescenza dell'istone fosforilato H2AX (S139) in cellule trasfettate sgRNA/CAS9 e controllo non trasfettato. DAPI è stato usato per macchiare il DNA (blu). pH2AX (Rosso) è un marcatore per il DSB indotto da CAS9. Ciò dimostra che l'espressione ottimale di CAS9 è stata raggiunta dall'assenza di scissione fuori bersaglio. A seconda del numero di loci del genoma mirati (alterati da cambiamenti nella ploidia della cellula, variazioni del numero di copie del sito target o posizione del ciclo cellulare), il numero di focolai potrebbe essere più alto. Tuttavia, qualsiasi aumento dovrebbe essere prevedibile in base al tipo di cella e al sito di destinazione analizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Beta-HPV 8E6 aumenta l'instabilità genomica durante la riparazione del DSB. (A) Schema del posizionamento di CAS9 indotto DSB lungo la porzione sequenziata del genoma. (B) Variazioni genomiche raggruppate per tipi di eventi mutazionali in HFK LXSN e HFK 8E6. Ogni gruppo di variazioni genomiche e il numero totale di variazioni sono stati confrontati tra HFK LXSN e HFK 8E6. (C) Diagramma circos delle mutazioni del DNA nelle cellule HFK LXSN (lato destro) e HFK 8E6 (lato sinistro). Le frecce nere indicano i siti di taglio CAS9. Il cerchio più interno mostra connessioni tra riarrangiamenti genomici identici. La posizione dei riarrangiamenti genomici colorati dai tipi di variazioni genomiche sono mostrati in cinque cerchi concentrici (il blu rappresenta SNP, il verde rappresenta l'inserzione, il rosso rappresenta la delezione, il viola rappresenta MNV e il nero rappresenta la sostituzione). Il grafico a dispersione nel cerchio più esterno visualizza i punti di interruzione (nero), le duplicazioni in tandem (rosso) e gli indel di punti (grigio), in cui la vicinanza allo spigolo esterno rappresenta un rapporto di variante elevato. SNP, polimorfismo a singolo nucleotide. MNV, variazione multi-nucleotidica. Le differenze statistiche tra le linee cellulari sono state misurate utilizzando un t-test degli studenti. indica p < 0,001". Questo è adattato da un riferimento precedentemente pubblicato con il permesso22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Componenti del mix master PCR. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Impostazioni del programma PCR. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Risoluzione dei problemi. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 1: Elenco dei pool di primer per PCR. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Oltre alla profondità delle informazioni fornite, ci sono diversi vantaggi in questo metodo. In primo luogo, la riparazione DSB, in teoria, può essere valutata in qualsiasi loci genomico senza modificare il genoma della cellula di interesse. In secondo luogo, l'accesso all'analisi NGS della riparazione è aumentato dal costo ridotto e dallo sforzo computazionale offerto dalla creazione e dall'analisi di un singolo DSB mirato a un'area definita. Infine, con i genomi di altri organismi che diventano regolarmente disponibili e molteplici pubblicazioni che dimostrano il successo della trasfezione di diverse linee cellulari di mammiferi e non mammiferi, l'utilità di questo approccio dovrebbe essere ampia 10,23,24.
Questo manoscritto ha analizzato la riparazione DSB nei cheratinociti del prepuzio umano come esempio illustrativo. L'efficienza di trasfezione tende ad essere inferiore nei cheratinociti rispetto ad altri tipi di tessuto. Pertanto, questo protocollo ha utilizzato un approccio di trasfezione ottimizzato per queste cellule difficili da trasfettare. L'approccio di trasfezione dovrebbe essere ottimizzato per il tipo di cellula analizzato. La capacità del DSB indotto da CAS9 utilizzato in questo protocollo è stata confermata nell'osteosarcoma, nel cancro del colon, nel cancro del polmone, nei fibroblasti, nel rene embrionale e nelle cellule dei cheratinociti umani10,23. Tuttavia, prima di eseguire il sequenziamento di nuova generazione, si raccomanda di confermare l'espressione e l'attività di CAS9.
Un passo critico in questo protocollo è quando si confronta tra o tra diversi campioni per normalizzare l'analisi per tenere conto delle differenze nell'efficienza di trasfezione CAS9. Per fare ciò, il livello relativo della proteina CAS9 deve essere misurato mediante immunoblotting e densitometria (Figura 1). È anche importante garantire la specificità della scissione CAS9 come indicato dalla distinta formazione di focolai pH2AX (S139), rilevabile dalla microscopia IF14 (Figura 3). In alternativa, il test dell'endonucleasi T7 può essere utilizzato per esaminare l'attività di CRISPR/Cas9 e l'efficienza di sgRNA.
Una notevole limitazione di questo approccio è che il DSB indotto da CAS9 tende ad essere "più pulito" del DSB causato da radiazioni o danni fisiologici simili. Pertanto, il metodo qui descritto può sottostimare il numero o la gravità delle mutazioni associate alla riparazione delle lesioni naturali. L'uso di altre nucleasi specifiche della sequenza che inducono DSB con sporgenze più lunghe può aiutare a superare questa limitazione26. Inoltre, non è del tutto chiaro se la regione della cromatina (ad esempio, eterocromatina ed eucromatina) influenzi l'attività di CAS9. Pertanto, l'utente deve fare attenzione a confermare l'attività equivalente di CAS9 quando confronta le mutazioni in siti diversi.
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per definire le conseguenze mutagene relative della riparazione dei DSB in una varietà di contesti. Ad esempio, potrebbe facilitare l'esame di nuovi inibitori della riparazione del DNA di piccole molecole. Ciò consentirebbe agli inibitori che sono più mutageni nelle cellule trasformate (rispetto a quelle non trasformate) di essere prioritari per lo sviluppo come agenti chemioterapici. Questo approccio può anche essere utile per confrontare all'interno dello stesso background genomico per determinare la frequenza delle mutazioni associate alla riparazione del DSB in diversi contesti genici (ad esempio, vicino a un promotore, enhancer o repressore), tra cellule con mutazioni diverse (ad esempio, geni di segnalazione che sono costitutivamente attivi o mutazioni missenso) o altre permutazioni simili. La flessibilità e la convenienza dell'approccio forniscono un potente strumento per le analisi future.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW e RP); National Cancer Institute del National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center presso la Kansas State University; e il Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Apprezziamo KSU-CVM Confocal Core e Joel Sanneman per la nostra microscopia a immunofluorescenza. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di queste agenzie di finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
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