Summary
Presentert her er sgRNA / CAS9 endonuclease og neste generasjons sekvenseringsprotokoll som kan brukes til å identifisere mutasjonene forbundet med dobbel strandbruddreparasjon nær CD4-promotoren.
Abstract
Dobbel strandbrudd (DSB) i DNA er den mest cytotoksiske typen DNA-skade. Fordi et utall fornærmelser kan føre til disse lesjonene (f.eks. replikeringsstress, ioniserende stråling, uopprettelig UV-skade), forekommer DSBer i de fleste celler hver dag. I tillegg til celledød reduserer ikke-reparerte DSBer genomintegritet, og de resulterende mutasjonene kan drive tumorigenesis. Disse risikoene og utbredelsen av DSBer motiverer undersøkelser av mekanismene som celler reparerer disse lesjonene. Neste generasjons sekvensering kan pares med induksjon av DSBer ved å ionisere stråling for å gi et kraftig verktøy for å nøyaktig definere mutasjonene forbundet med DSB-reparasjonsfeil. Denne tilnærmingen krever imidlertid beregningsmessig utfordrende og kostnadsoverkommelig hele genomsekvensering for å oppdage reparasjonen av de tilfeldig forekommende DSB-ene forbundet med ioniserende stråling. Sjeldne kutte endonucleases, som I-Sce1, gir muligheten til å generere en enkelt DSB, men deres anerkjennelsessteder må settes inn i genomet av interesse. Som et resultat er reparasjonsstedet iboende kunstig. Nylige fremskritt gjør det mulig for guide RNA (sgRNA) å lede en Cas9-endonuklease til ethvert genom locus av interesse. Dette kan brukes på studiet av DSB-reparasjon som gjør neste generasjons sekvensering mer kostnadseffektivt ved å la det fokuseres på DNA-flanken til den Cas9-induserte DSB. Målet med manuskriptet er å demonstrere muligheten for denne tilnærmingen ved å presentere en protokoll som kan definere mutasjoner som stammer fra reparasjon av en DSB oppstrøms for CD4-genet. Protokollen kan tilpasses for å bestemme endringer i det mutagene potensialet til DSB forbundet med eksogene faktorer, for eksempel reparasjonshemmere, viralt proteinuttrykk, mutasjoner og miljøeksponeringer med relativt begrensede beregningskrav. Når en organismes genom er sekvensert, kan denne metoden teoretisk brukes ved ethvert genomisk locus og i enhver cellekulturmodell av den organismen som kan transfekeres. Lignende tilpasninger av tilnærmingen kan tillate sammenligninger av reparasjonsgjengivelse mellom forskjellige loci i samme genetiske bakgrunn.
Introduction
Opprettholdelse av genomisk stabilitet er avgjørende for alle levende organismer. Nøyaktig DNA-replikasjon og en robust DNA-skaderespons (DDR) er nødvendig for å trofast forplante det genetiske materialet 1,2. DNA-skader forekommer regelmessig i de fleste celler 2,3. Når disse skadene registreres, stoppes cellesyklusprogresjonen, og DNA-reparasjonsmekanismer aktiveres. Doble trådbrudd i DNA eller DSB er den mest giftige og mutagene typen DNA-skade 3,4.
Mens flere DDR-signalveier kan reparere disse lesjonene, er de mest grundig studerte DSB-reparasjonsveiene homolog rekombinasjon (HR) og ikke-homolog endekobling (NHEJ). HR er en stort sett feilfri vei som reparerer en DSB ved hjelp av en søsterkromotid som en homolog mal. Dette har en tendens til å skje i S-fasen og G2-fasen av en cellesyklus 5,6,7. NHEJ er mer feilutsatt, men det kan skje gjennom hele cellesyklusen 8,9. Ulike reporteranalyser er utviklet for å måle effektiviteten til spesifikke reparasjonsmekanismer 10,11,12. Disse analysene har en tendens til å stole på strømningscytometri for en høy gjennomstrømningsmåling av DSB-reparasjonsveiaktivitet ved hjelp av GFP eller mCherry som en avlesning11,13. Selv om de er svært effektive, er de avhengige av kanonisk reparasjon som skjer ved en kunstig introdusert DSB.
Det finnes en rekke andre metoder som brukes til å studere DSB-reparasjon. Mange av disse er avhengige av immunfluorescens (IF) mikroskopi 1,14. IF-mikroskopi oppdager diskret kjernefysisk foci-representant for reparasjonskomplekser etter at DSB-er er indusert ved eksponering for gentoksiske kjemikalier eller ioniserende stråling15,16. Sporing av dannelsen og oppløsningen av disse foci gir en indikasjon på reparasjonsinitiering og ferdigstillelse, henholdsvis14,17. Disse metodene for DSB-induksjon (dvs. kjemikalier eller ioniserende stråling) forårsaker imidlertid ikke DSB-er på definerte steder i genomet. Det er også funksjonelt umulig å bruke dem til konsekvent å indusere bare et lite antall (f.eks. 2-4) DSBer. Som et resultat forårsaker de mest brukte metodene for å indusere DSB-er en rekke lesjoner tilfeldig fordelt over hele genomet18. Et lite antall DSBer kan innføres ved å sette inn anerkjennelsesstedet for en sjeldent skjærende endonuclease og uttrykke den relevante endonuclease, for eksempel I-Sce119. Dessverre forhindrer den nødvendige integrasjonen av et målsted undersøkelse av DSB ved endogen genomisk loci.
Dette manuskriptet beskriver en metode for å oppdage mutasjoner knyttet til reparasjon av en DSB generert ved et brukerdefinert locus. Vi gir et representativt eksempel på tilnærmingen som brukes for å vurdere evnen til et viralt protein for å øke antall mutasjoner forbundet med en DSB. Spesielt beskriver dette manuskriptet bruken av en enkelt guide RNA (sgRNA) for å lede en CAS9-endonuclease for å indusere en DSB på menneskelig CD4 åpen leseramme i humane forhud keratinocytter som uttrykker vektorstyring (HFK LXSN) og HFK som uttrykker E6-proteinet til humant papillomavirus type 8 (HFK 8E6). Målrettet neste generasjons sekvensering (NGS) i regionen rundt pausen gjør at mutasjoner forbundet med reparasjon av lesjonen kan defineres grundig. Disse dataene viser at virusproteinet forårsaker en omtrent 20 ganger økning i mutasjoner under DSB-reparasjon. Det gir også en objektiv karakterisering av de mutagene konsekvensene av DSBer på et enkelt locus uten behov for sekvensering av hele genomet. I prinsippet kan protokollen lett tilpasses for å sammenligne den relative risikoen for mutasjoner mellom genom loci eller cellelinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celle plating
- Vokse HFK LXSN og HFK 8E6 celler i 10 cm plater i keratinocytt kulturmedier (10 ml / plate) med menneskelig keratinocytt vekst supplement (HKGS) og 1% penicillin / streptomycin. Voks celler til ca 80% samløp ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.
- Erstatt kulturmedier med 3 ml trypsin-EDTA (0,05%, etylendiamin tetraacetic acid). Inkuber ved 37 °C i 3 minutter. Nøytraliser trypsin med likt volum av foster bovint serum (FBS) supplert medier og overfør celler til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Resuspend celler med 10 ml keratinocytt kulturmedier med HKGS. Bestem konsentrasjonen av celler med et hemocytometer.
- Plate 4 x 105 celler/6 cm plater (frø to plater for HFK LXSN og to plater for HFK 8E6) i 4 ml keratinocyttkulturmedier med HKGS og 1% penicillin og streptomycin. Vokse ved 37 °C i en inkubator med 5 % CO2.
MERK: Analyse av HFK-celler ble valgt for denne protokollen av to grunner. For det første er HFK en vanskelig å transfekte cellelinje. Dermed, ved å demonstrere at protokollen fungerer i denne cellelinjen, er det forutsatt at det sannsynligvis vil fungere i mer brukte og lettere transfekterte celler. For det andre viser tidligere publiserte data at et viralt protein (8E6) hindrer reparasjon av dobbeltstrengsbrudd i DNA 20,21,22. Ved å sammenligne HFK LXSN og HFK 8E6 kan vi derfor demonstrere analysens evne til å oppdage økninger i mutasjoner forbundet med en reduksjon i cellulær reparasjonskapasitet.
2. Transfeksjon
- På transfeksjonsdagen (24 timer etter plating) erstatter du medier med 3 ml antibiotikafrie supplerte medier. Inkuber i 2 timer ved 37 °C i en inkubator.
- Transfektceller med passende lipidbaserte transfeksjonsreagenser i henhold til produsentens instruksjoner.
- Varme transfeksjonsreagenser til romtemperatur og pipette forsiktig før bruk.
- For hver cellelinje (HFK LXSN og HFK 8E6) plasserer du riktig mengde transfeksjonsbuffer (som anvist av produsenten) i et sterilt sentrifugerør på 1,5 ml (rør 1). Inkluder et annet rør med samme mengde transfeksjonsbuffer (mock transfection eller Tube 2).
- Tilsett 2 μg plasmid DNA som uttrykker CAS9/sgRNA rettet mot menneskelig CD4 (px330-CD4, 5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT) til rør 1 fra trinn 2.2.2. Pipette forsiktig for å blande helt. Tilsett like mye sterilt vann til rør 2.
- Inkluder en kontrollplate med transfeksjonsreagenser alene (ingen plasmid) for hver cellelinje.
MERK: Den andre platen fungerer som en negativ kontroll i eksperimentet, slik at brukeren kan bekrefte at transfeksjon med CAS9/sgRNA ikke er ansvarlig for mutasjoner. - Tilsett riktig mengde transfeksjonsreagens (som anvist av produsenten) til røret med DNA-blanding (rør 1) fra trinn 2.2.3 og mock-transfeksjonen (rør 2) fra trinn 2.2.2. Pipette forsiktig for å blande helt. Inkuber ved romtemperatur i 15-30 min for å gi tilstrekkelig tid til at komplekser kan dannes.
- Tilsett transfeksjonsblandingen dråpevis til platen. Rock kulturen forsiktig i 1 min for å fordele transfeksjonsblandingen jevnt.
- Inkuber i 48 timer etter transfeksjonen for å tillate CAS9-uttrykk.
- Høst celler ved trypsinisering.
- Erstatt kulturmedier med 1 ml trypsin-EDTA (0,05%, etylendiamin tetraacetic acid). Inkuber ved 37 °C i 3 minutter. Nøytraliser trypsin med likt volum av FBS-supplerte medier.
- For hver plate av celler, overfør cellefjæringen til to mikrocentrifugerør med like aliquots. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Resuspend cellepellet fra ett rør i trinn 2.4.2 i 1 ml fosfat bufret saltvann (PBS) for sekvensering. Resuspend det andre røret fra trinn 2.4.2 med iskald PBS for immunoblot.
- Høst hele cellen lyser for immunoblot.
- Sentrifuger røret på 300 x g i 5 min. Kast supernatanten.
- Tilsett 100 μL radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA lysis buffer) blandet med 1 % proteasehemmer og 1% fosfatasehemmer i røret, bland grundig med pipette og inkuber i 10 min på is.
MERK: RIPA lysis buffer inneholder 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0,1% natriumdeoksycholat; 0,1% SDS; 140 mM NaCl, og deionisert vann. - Sentrifuge lyser på 13.000 x g i 10 min. Samle supernatanter for immunoblot.
3. Måling av CAS9-uttrykk via immunoblot
- Bestem proteinkonsentrasjonen med en bicinkoninsyreanalyse (BCA) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Kjør 20 μg protein av hver prøve i brønnene til en 3%-8% Tris-acetatgel i 150 min og semidryoverføring (10 V i 30 min og deretter 25 V i 12 min) til polyvinylliddifluoridmembran.
- Etter å ha blokkert membranen i 5% ikke-fett tørr melk i PBS med 0,1% tween (PBST) i 1 time ved romtemperatur, tilsett anti-CAS9 (1:1000) og anti-GAPDH (1:1000) antistoffer. Inkuber ved 4 °C over natten.
- Etter å ha vasket membranen med PBST, inkuber membranen med sekundært antistoff i 5% ikke-fett tørr melk i PBST i 1 time ved romtemperatur.
- Bilde blottet og bestem CAS9-nivået ved densitometri23. Se figur 1 for en representativ flekk.
MERK: Detektering av fosforylatert H2AX (S139) focidannelse ved immunfluorescensmikroskopi kan brukes til å validere CAS9-aktivitet14. Et lavt antall distinkte foci (vanligvis 1-4 foci) forventes avhengig av cellesyklusposisjonen, om mutasjoner i CAS9-målstedet forhindrer ytterligere kutting, og hvor mange kopier av CAS9-skjærestedet som finnes i genomet av interesse. Et representativt bilde vises i figur 2.
4. Nukleinsyreutvinning og amplikongenerering
- Trekk ut DNA fra celleprøver fra trinn 2.4.3 ved hjelp av et DNA-ekstraksjonssett med høy molekylvekt, som spesifisert av produsenten.
- Resuspendprimere med indikert løsningsmiddel i henhold til dataarket. Fortynn med samme reagens til 20 μM og basseng 20 μM primere i de angitte bassengene.
MERK: Primer pool er oppført i Supplemental Table 1. - Lag en PCR Master-blanding ved hjelp av en lang forsterkning Taq-polymerase for hvert 20 μM primerbasseng som angitt i tabell 1.
- Tilsett 21 μL av mastermixene til separate PCR-rør.
- Tilsett 4 μL av målprøven (100 ng/μL) fra trinn 4.1 til PCR-analyserør som inneholder mastermix- og capanalyserør. Sørg for separate reaksjoner for hvert primerbasseng.
- Virvel for å blande PCR-analyserør og sentrifuge (raskt spinn) for å fjerne dråper fra rørlokkene.
- Plasser PCR-rørene på en konvensjonell termisk syklusmaskin.
- Program PCR-maskin som angitt i tabell 2.
- Kjør programmet på en termisk syklist.
5. PCR-opprydding
- Fjern primere fra PCR-reaksjoner ved hjelp av et perlebasert PCR-oppryddingssystem.
- Fjern opprydninger fra kjøleskapet 30 min før bruk.
- Vortex perler godt før bruk og sørg for at alle perler er resuspendert.
- Tilsett 30 μL (1,2x) resuspended perler til hver brønn av en dyp brønn 96-brønns plate.
- Tilsett 25 μL PCR-reaksjon på brønner som inneholder perler.
- Plasser platen på en tallerken shaker ved 2000 rpm i 2 min.
- La platen stå ved romtemperatur i 5 minutter etter risting.
- Plasser den dype brønnplaten på en 96-brønns platemagnet og inkuber i 2 min.
- Fjern og kast supernatanten uten forstyrrende perler.
- Mens platen forblir på magneten, tilsett 180 μL 80% etanol og inkuber i 30 s. Fjern og kast supernatanten.
- Gjenta trinn 5.1.9.
- Bruk en 10 μL pipette til å fjerne og kaste eventuell gjenværende væske fra brønnene.
- La perler tørke ved romtemperatur i 10 min.
- Tilsett 20 μL nukleasefritt vann til brønnene som inneholder perler og fjern platen fra magneten.
- Rist platen ved 2000 o/min i 2 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber platen ved romtemperatur i 5 min.
- Plasser platen på et magnetstativ og inkuber i 2 min ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten i en annen, merket PCR-plate. Dette inneholder det rensede DNA-et.
- Mål konsentrasjonen av hver reaksjon med et fluorometer.
- Sørg for at dsDNA Fluorometer reagenser er ved romtemperatur.
- Sett opp fluormetriske analyserør pluss to ekstra rør for standarder.
- Tilsett 199 μL 1x dsDNA arbeidsløsning til alle unntatt to rør. Tilsett 190 μL av arbeidsløsningen til de to siste rørene.
- Tilsett 10 μL av de to standardene (inkludert i materialtabellen) for å skille analyserørene.
- Tilsett 1 μL av hver PCR-reaksjon på Fluorometer mastermix-rør.
- Virvelrør for å blande og inkubere ved romtemperatur i 2 min.
- På startskjermen til fluorometeret velger du knappen med analysesettet (1x dsDNA) og velger deretter Les standarder og kjør prøver.
- Sett inn standard 1 rør, velg Les-knappen og gjenta deretter for standard 2.
- Etter trinn 5.2.6, gjenta for en prøve, velg et prøvevolum på 1 μL og den resulterende konsentrasjonen vil bli gitt.
- Gjenta trinn 5.2.7 for de gjenværende prøvene.
- Beregn den projiserte molariteten til alle reaksjoner og samle like konsentrasjoner av reaksjoner fra hver enkelt prøve separat (ett siste utvalg per prøve) ved hjelp av ligningen nedenfor.
- Gjenta trinn 5.2.1 til 5.2.7 for å oppnå den endelige bassengkonsentrasjonen.
- Kontroller amfirbassenget på en kapillær elektroforesemaskin/agarosegel som spesifisert av produsenten.
- Forbered kapillære elektroforeserør for riktig antall prøver. Tilsett 7 μL av DNA-bufferen som spesifisert av produsenten.
- Tilsett 4 μL av amlikonbassenget i røret som inneholder DNA-buffer.
- Plasser rørene på elektroforesemaskinen og kjør maskinen som spesifisert av produsenten for dsDNA.
- Se elektroforesegelbildene som sikrer at båndene lokaliserer til ~ 5 kb (størrelse på amlikoner).
- Beregn den projiserte molariteten til alle reaksjoner og samle like konsentrasjoner av reaksjoner fra hver enkelt prøve separat (ett siste utvalg per prøve) ved hjelp av ligningen nedenfor.
6. Forberedelse av bibliotek
- Fortynn prøvebassenger fra trinn 5.3.1 til 0.2 ng / μL for bibliotekforberedelse.
- Bruk et bibliotek med lite inndata som er kompatibelt med korte sekvenser (300 bp), til å klargjøre biblioteker ved hjelp av unike indekskombinasjoner for hvert utvalg som ble opprettet i trinn 5.3, i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Følg produsentens instruksjoner for å velge indekssekvenser. Alle indekser som er mottagelige for bibliotekets klargjøringssett, fungerer for prøvene. - Etter bibliotekforberedelse, samle alle prøver i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Før du oppretter biblioteksutvalget, må du beregne antall lesninger som er nødvendige for 250x dekning av målsekvensen, og sikre at den valgte sekvenseringspatronen kan gi tilstrekkelig dekning for hver inkluderte prøve. For 0,5 Mb totalt vil dette tilsvare 1M-lesing.
- Bruk et bibliotek med lite inndata som er kompatibelt med korte sekvenser (300 bp), til å klargjøre biblioteker ved hjelp av unike indekskombinasjoner for hvert utvalg som ble opprettet i trinn 5.3, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Klargjør bibliotekutvalget for sekvensering.
- Tine og klargjør en 300-syklus patron og sekvensering reagenser.
- Denature og fortynne sekvenseringsbassenget opprettet i trinn 5.1.1 i henhold til sequencerens produsents instruksjoner.
- Legg til denaturert og fortynnet biblioteksbasseng i sekvenseringsreagenser og kjør sekvenseringsmaskinen som spesifisert av produsenten.
MERK: Se vedlagt tabell 3 for feilsøking.
7. Dataanalyse
MERK: Alle datatrinn utføres i den genomiske dataanalyseprogramvaren. Parenteser angir brukerinndata. Større enn-tegn angir rekkefølgen på museklikk for et gitt trinn (f.eks. 1m museklikk>2museklikk )
- Importer lesningene ved å klikke på Åpne programvare > Importer > Illumina > Velg filer > Neste > Velg plassering for å lagre > fullfør. Lesingene vises nå i programvaren.
- Trim og filtrer lesningene.
- I dypsekvensdataanalyseprogramvaren trimmer du standardparametrene for rålesing.
- Merk leseoperasjoner, og klikk Verktøykasse > Klargjør sekvenseringsdata > Trim leser > Neste > Neste > Neste > Neste > Lagre > Neste > (Velg plassering som skal lagres) > Fullfør
- Tilordne trimmede leseoperasjoner til referanse.
- Karttrimmet leser til referansesekvensen som ble brukt i trinn 4.1 ved hjelp av en samsvarspoengsum på 2, uoverensstemmende kostnader på 3 og innsettings-/slettingskostnader på 2. Kontroller at lengdefraksjonen er over 0,7 og likhetsfraksjonen er på eller over 0,8.
- Merk den trimmede lesefilen, og klikk Verktøykasse > resequencing Analyse > Tilordne leseoperasjoner til referanse > Neste > (Velg referansesekvens) > Neste > (Kontroller at parameterne er angitt som ovenfor) > Neste > Lagre > (Velg plassering for lagring) > Fullfør.
- Trekk ut varianter og indels.
- Bruk en passende indel-oppkaller til å trekke ut indels ved hjelp av en p-verditerskel på 0,005 eller lavere, og et maksimalt antall uoverensstemmelser på 3.
- Uthev tilordnet lesefil, og klikk Verktøykasse > resequencing Analyse > Variant-gjenkjenning > Innsendelser og strukturelle varianter > Neste > (Kontroller at nødvendig signifikans er lagt inn > Neste > Lagre > (Velg plassering som skal lagres) > Fullfør.
- Ved hjelp av en passende variantoppkaller, kaller du varianter fra lesetilordningen med en signifikans på 5 %.
- Uthev tilordnet lesefil, og klikk Verktøykasse > resequencing Analyse > Variant detection > Lavfrekvent variantdeteksjon > Neste > (Kontroller at nødvendig signifikans er lagt inn > Neste > Neste > Lagre > (Velg plassering for lagring) > Fullfør.
MERK: Sørg for å gjøre rede for ploidy av vertsgenomet i innsneverings- og variantoppringerne. Ikke trekk ut mutanter under 5%. Denne terskelen står for PCR- og sekvenseringsfeil knyttet til analysen. Normalisering (basert på immunoblotdeteksjon av CAS9) bør gjøres ved å justere sekvenseringsdekningen. Hvis for eksempel prøve A har dobbelt så stor transfeksjonseffektivitet som prøve B, bør 50 % av avlesningene fra prøve A brukes til analyse. Dette bør gjøres ved tilfeldig prøvetaking og ikke redusere dekningen for noen prøve under 100x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre representative resultater presenteres for denne protokollen. Figur 1 er en immunoblot som bekrefter uttrykk for CAS9 i HFK-kontroll (LXSN) og HFK som uttrykker beta-HPV 8E6 (8E6). 48 timer etter transfeksjon ble hele cellelysater høstet og deretter undersøkt med et anti-CAS9 antistoff (eller GAPDH som lastekontroll). Resultatet viser at HFK LXSN og HFK 8E6 uttrykker tilsvarende mengde CAS9 som indikerer at transfeksjonseffektiviteten er lik mellom to cellelinjer. Figur 2 er et mikroskopibilde av immunfluorescens som viser CAS9-induserte DSBer ved hjelp av pH2AX foci, en standardmarkør for DSB24. Dette indikerer at to DSBer er indusert av CAS9/sgRNA og bekrefter dermed at DSB-induksjon skjer som forventet. Figur 3 viser at 8E6 øker genomiske variasjoner innen 200 kB rundt cas9 indusert DSB22. Dette er i samsvar med hypotesen om at HPV8 E6 deregulerer DSB-reparasjon og øker genomisk ustabilitet. Denne illustrasjonen viser én måte data hentet fra denne fremgangsmåten kan vises på.
Figur 1: Representativt bilde av immunoblot som sammenligner CAS9-uttrykk i utransfected og transfected HFK-celler. sgRNA/CAS9-plasmider ble brukt til å transfektere HFK-celler. Anti-CAS9 antistoff ble brukt til å oppdage CAS9-proteinet. GAPDH brukes som en lastekontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativt immunfluorescensbilde av fosforylatert histone H2AX (S139) i sgRNA/CAS9 transfektert celle og uoversatt kontroll. DAPI ble brukt til å flekke DNA (Blå). pH2AX (rød) er en markør for CAS9-indusert DSB. Dette viser at optimalt CAS9-uttrykk har blitt oppnådd ved fravær av off-target spalting. Avhengig av antall målrettede genom loci (endret av endringer i ploidy av cellen, målområdet kopi nummer variasjoner, eller celle syklus posisjon), antall foci kan være høyere. Enhver økning bør imidlertid være forutsigbar basert på celletypen og målområdet som analyseres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Beta-HPV 8E6 øker genomisk ustabilitet under DSB-reparasjon. (A) Skjematisk for plassering av CAS9 indusert DSB langs den sekvenserte delen av genomet. (B) Genomiske variasjoner gruppert etter typer mutasjonshendelser i HFK LXSN og HFK 8E6. Hver gruppe genomiske variasjoner og totalt antall variasjoner ble sammenlignet mellom HFK LXSN og HFK 8E6. (C) Circos plott av DNA-mutasjoner i HFK LXSN (høyre side) og HFK 8E6 celler (venstre side). Svarte piler angir CAS9-skjæreplasser. Den innerste sirkelen viser koblinger mellom identiske genomiske omorganiseringer. Plasseringen av genomiske omorganiseringer farget av typer genomiske variasjoner vises i fem konsentriske sirkler (blå representerer SNP, grønn representerer innsetting, rød representerer sletting, lilla representerer MNV, og svart representerer erstatning). Punkttegning i den ytterste sirkelen viser avbruddspunkter (svart), tandemdupliseringer (rød) og punkt indels (grå), der nærheten til ytterkanten representerer høyt variantforhold. SNP, enkelt nukleotid polymorfisme. MNV, variasjon av multi nukleotid. Statistiske forskjeller mellom cellelinjer ble målt ved hjelp av en Students t-test. indikerer p < 0,001". Dette er tilpasset fra en tidligere publisert referanse med tillatelse22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: PCR Master mix-komponenter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: PCR-programinnstillinger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Feilsøking. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 1: Liste over primerbasseng for PCR. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tillegg til dybden av informasjon som er gitt, er det flere fordeler med denne metoden. For det første kan DSB-reparasjon i teorien vurderes ved enhver genomisk loci uten å endre genomet til interessecellen. For det andre økes tilgangen til NGS-analyse av reparasjon av reduserte kostnader og beregningsinnsats ved å lage og analysere en enkelt DSB rettet mot et definert område. Til slutt, med genomene til flere organismer som rutinemessig blir tilgjengelige og flere publikasjoner som demonstrerer vellykket transfeksjon av forskjellige pattedyr og ikke-pattedyrcellelinjer, forventes nytten av denne tilnærmingen å være bred 10,23,24.
Dette manuskriptet analyserte DSB-reparasjon i humane forhud keratinocytter som et illustrerende eksempel. Transfeksjonseffektivitet har en tendens til å være lavere i keratinocytter enn andre vevstyper. Derfor brukte denne protokollen en transfeksjonstilnærming optimalisert for disse vanskelig å transfekte cellene. Transfeksjonsmetoden bør optimaliseres for celletypen som analyseres. Evnen til CAS9-indusert DSB som brukes i denne protokollen er bekreftet i osteosarkom, tykktarmskreft, lungekreft, fibroblast, embryonal nyre og humane keratinocyttceller 10,23. Før neste generasjons sekvensering utføres, anbefales det imidlertid at CAS9-uttrykk og -aktivitet bekreftes.
Et kritisk trinn i denne protokollen er når man sammenligner mellom eller mellom forskjellige prøver for å normalisere analysen for å ta høyde for forskjeller i CAS9-transfeksjonseffektivitet. For å gjøre dette bør relativ CAS9-proteinnivå måles ved immunoblotting og densitometri (figur 1). Det er også viktig å sikre spesifisiteten til CAS9-spalting som angitt av distinkt pH2AX (S139) fociformasjon, detekterbar ved IF mikroskopi14 (figur 3). Alternativt kan T7 endonuclease-analysen brukes til å undersøke CRISPR/Cas9-aktivitet og sgRNA-effektivitet.
En bemerkelsesverdig begrensning av denne tilnærmingen er at CAS9-indusert DSB pleier å være "renere" enn DSB forårsaket av stråling eller lignende fysiologisk skade. Derfor kan metoden beskrevet her undervurdere antall eller alvorlighetsgraden av mutasjonene forbundet med reparasjon av naturlig forekommende lesjoner. Bruk av andre sekvensspesifikke nukleaser som induserer DSB med lengre overheng, kan bidra til å overvinne denne begrensningen26. Videre er det ikke fullt ut forstått om kromatinregion (f.eks. heterokromatin og eukromatin) påvirker CAS9-aktiviteten. Dermed bør brukeren være forsiktig med å bekrefte tilsvarende CAS9-aktivitet når man sammenligner mutasjoner på forskjellige steder.
Metoden som er beskrevet her, kan brukes til å definere de relative mutagene konsekvensene av å reparere DSBer i en rekke sammenhenger. For eksempel kan det lette undersøkelsen av nye små molekyl DNA-reparasjonshemmere. Dette vil tillate at hemmere som er mer mutagene i transformerte (sammenlignet med utransformerte) celler, prioriteres for utvikling som kjemoterapeutiske midler. Denne tilnærmingen kan også være nyttig å sammenligne innenfor samme genomiske bakgrunn for å bestemme frekvensen av mutasjoner forbundet med DSB-reparasjon ved forskjellige genkontekster (f.eks. i nærheten av en promotor, forsterker eller repressor), mellom celler med forskjellige mutasjoner (f.eks. signalgener som er konstituert aktive eller missense mutasjoner), eller andre lignende permutasjoner. Fleksibiliteten og overkommeligheten i tilnærmingen gir et kraftig verktøy for fremtidige analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i dette manuskriptet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (P20GM130448) (NAW og RP); National Cancer Institute of the National Institutes of Health (NCI R15 CA242057 01A1); Johnson Cancer Research Center i Kansas State University; og det amerikanske forsvarsdepartementet (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). Vi setter pris på KSU-CVM Confocal Core og Joel Sanneman for vår immunfluorescensmikroskopi. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til disse finansieringsbyråene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).
- Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W.
- Khanna, K. K., Jackson, S. P. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
- vanden Berg, J. G., et al. A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression. Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication. Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).
- Jette, N., Lees-Miller, S. P. The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).
- Weterings, E., van Gent, D. C. The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis. DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).
- Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells. Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).
- Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).
- Certo, M. T., et al. Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints. Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).
- Murthy, V., et al. Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy. JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653 (2018).
- Wang, J. L., et al. Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).
- Kuo, L. J., Yang, L. -X. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 5, (2008).
- Sanders, J. T., et al. Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization. Nature Communications. 11 (1), 6178 (2020).
- Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation. PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687 (2015).
- Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity. Cancers. 12 (9), 2356 (2020).
- Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors. PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275 (2022).
- Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures. BioMed Research International. 2019, 5214821 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Ghezraoui, H., et al. Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining. Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).
