Summary
여기에 제시된 것은 CD4 프로모터 근처의 이중 가닥 파단 복구와 관련된 돌연변이를 확인하는 데 사용할 수있는 sgRNA/CAS9 엔도뉴클레아제 및 차세대 시퀀싱 프로토콜입니다.
Abstract
DNA의 이중 가닥 파단 (DSBs)은 DNA 손상의 가장 세포 독성 유형입니다. 무수한 모욕이 이러한 병변 (예 : 복제 스트레스, 이온화 방사선, 복구되지 않은 UV 손상)을 초래할 수 있기 때문에 DSB는 매일 대부분의 세포에서 발생합니다. 세포 사멸 이외에도, 복구되지 않은 DSB는 게놈 완전성을 감소시키고 생성된 돌연변이는 종양 발생을 유도할 수 있다. 이러한 위험과 DSB의 유병률은 세포가 이러한 병변을 복구하는 메커니즘에 대한 조사에 동기를 부여합니다. 차세대 시퀀싱은 이온화 방사선에 의한 DSB의 유도와 쌍을 이루어 DSB 수리 결함과 관련된 돌연변이를 정확하게 정의하는 강력한 도구를 제공합니다. 그러나 이러한 접근법은 이온화 방사선과 관련된 무작위로 발생하는 DSB의 복구를 검출하기 위해 계산적으로 어렵고 비용이 많이 드는 전체 게놈 시퀀싱이 필요합니다. I-Sce1과 같은 희귀 절단 엔도뉴클레아제는 단일 DSB를 생성하는 능력을 제공하지만, 이들의 인식 부위는 관심 게놈에 삽입되어야 한다. 결과적으로 수리 현장은 본질적으로 인위적입니다. 최근의 진보는 가이드 RNA (sgRNA)가 Cas9 엔도뉴클레아제를 관심있는 임의의 게놈 유전자좌로 향하게 할 수있게합니다. 이는 DSB 복구 연구에 적용될 수 있으며, Cas9 유도 DSB를 플랭킹하는 DNA에 초점을 맞출 수 있도록 함으로써 차세대 시퀀싱을 보다 비용 효율적으로 만들 수 있습니다. 원고의 목표는 CD4 유전자의 DSB 상류의 복구로부터 유래하는 돌연변이를 정의할 수 있는 프로토콜을 제시함으로써 이러한 접근법의 실현 가능성을 입증하는 것이다. 이 프로토콜은 비교적 제한된 계산 요구 사항을 가진 복구 억제제, 바이러스 단백질 발현, 돌연변이 및 환경 노출과 같은 외인성 인자와 관련된 DSB의 돌연변이 유발 잠재력의 변화를 결정하도록 적응될 수 있다. 일단 유기체의 게놈이 시퀀싱되면, 이 방법은 이론적으로 임의의 게놈 유전자좌 및 형질감염될 수 있는 그 유기체의 임의의 세포 배양 모델에서 사용될 수 있다. 접근법의 유사한 적응은 동일한 유전 적 배경에서 다른 유전자좌 사이의 복구 충실도의 비교를 허용 할 수 있습니다.
Introduction
게놈 안정성을 유지하는 것은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요합니다. 정확한 DNA 복제와 강력한 DNA 손상 반응(DDR)은 유전 물질 1,2를 충실하게 전파하는 데 필요합니다. DNA 손상은 대부분의 세포 2,3에서 정기적으로 발생합니다. 이러한 손상이 감지되면 세포 주기 진행이 중단되고 DNA 복구 메커니즘이 활성화됩니다. DNA 또는 DSB의 이중 가닥 파단은 가장 독성이 강하고 돌연변이 유발 유형의 DNA 손상 3,4입니다.
몇몇 DDR 신호전달 경로가 이러한 병변을 복구할 수 있지만, 가장 철저하게 연구된 DSB 복구 경로는 상동성 재조합(HR) 및 비상동성 말단 접합(NHEJ)이다. HR은 자매 크로마티드를 상동성 주형으로 사용하여 DSB를 수리하는 크게 오류가 없는 경로입니다. 이것은 세포 주기 5,6,7의 S 단계 및 G2 단계에서 일어나는 경향이 있다. NHEJ는 오류가 발생하기 쉽지만 세포 주기 8,9에 걸쳐 발생할 수 있습니다. 특정 수리 메커니즘(10,11,12)의 효율을 측정하기 위해 다양한 리포터 분석법이 개발되었다. 이들 검정은 판독값11,13으로서 GFP 또는 mCherry를 사용하는 DSB 복구 경로 활성의 높은 처리량 측정을 위해 유세포 분석기에 의존하는 경향이 있다. 매우 효율적이지만 인위적으로 도입 된 DSB에서 발생하는 정식 수리에 의존합니다.
DSB 수리를 연구하는 데 사용되는 다양한 다른 방법이 있습니다. 이들 중 다수는 면역형광(IF) 현미경1,14에 의존한다. IF 현미경 검사는 DSB가 유전 독성 화학 물질 또는 이온화 방사선15,16에 노출되어 유도 된 후 수리 복합체를 대표하는 이산 핵 초점을 감지합니다. 이러한 초점의 형성 및 해결을 추적하는 것은 각각14,17 개의 수리 개시 및 완료의 표시를 제공한다. 그러나, DSB 유도의 이들 방법(즉, 화학물질 또는 이온화 방사선)은 게놈 내의 정의된 위치에서 DSB를 야기하지 않는다. 또한 DSB의 적은 수(예를 들어, 2-4개)만을 일관되게 유도하기 위해 이들을 사용하는 것도 기능적으로 불가능하다. 결과적으로, DSBs를 유도하는 가장 일반적으로 사용되는 방법은 게놈18 전체에 걸쳐 무작위로 분포된 다수의 병변을 야기한다. 소수의 DSB는 희귀 절단된 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 삽입하고 I-Sce119와 같은 관련 엔도뉴클레아제를 발현함으로써 도입될 수 있다. 불행하게도, 표적 부위의 요구되는 통합은 내인성 게놈 유전자좌에서 DSB의 검사를 방지한다.
이 원고는 사용자 정의 유전자좌에서 생성 된 DSB의 복구와 관련된 돌연변이를 탐지하는 방법을 설명합니다. 우리는 DSB와 관련된 돌연변이의 수를 증가시키는 바이러스 단백질의 능력을 평가하기 위해 적용된 접근법의 대표적인 예를 제공한다. 구체적으로, 본 원고는 인간 유두종 바이러스 유형 8(HFK 8E6)의 E6 단백질을 발현하는 벡터 조절(HFK LXSN) 및 HFK에서 인간 CD4 오픈 리딩 프레임에서 DSB를 유도하기 위해 CAS9 엔도뉴클레아제를 지시하기 위한 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 사용을 기술한다. 파단을 둘러싸는 영역의 표적화된 차세대 염기서열 분석(NGS)은 병변의 복구와 관련된 돌연변이가 엄격하게 정의될 수 있게 한다. 이들 데이터는 바이러스 단백질이 DSB 복구 동안 돌연변이의 약 20배 증가를 야기한다는 것을 입증한다. 또한 전체 게놈 시퀀싱이 필요 없이 단일 유전자좌에서 DSB의 돌연변이 유발 결과의 편향되지 않은 특성화를 제공한다. 원칙적으로, 프로토콜은 게놈 유전자좌 또는 세포주 사이의 돌연변이의 상대적 위험을 비교하기 위해 용이하게 적응될 수 있었다.
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Protocol
1. 셀 도금
- HFK LXSN 및 HFK 8E6 세포를 인간 각질세포 성장 보충제 (HKGS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 케라티노사이트 배양 배지 (10 mL/플레이트)의 10cm 플레이트에서 성장시킨다. 세포를 5%CO2를 갖는 재킷 인큐베이터에서 37°C에서 약 80% 합류로 성장시킨다.
- 배양 배지를 3mL의 트립신-EDTA(0.05%, 에틸렌디아민테트라아세트산)로 교체한다. 37°C에서 3분 동안 인큐베이션한다. 트립신을 동일한 부피의 태아 소 혈청 (FBS)이 보충된 배지로 중화시키고 세포를 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 세포를 HKGS로 10mL의 각질세포 배양 배지로 재현탁시킨다. 혈구계로 세포의 농도를 결정하십시오.
- 플레이트 4 x 105 세포/6-cm 플레이트 (HFK LXSN을 위한 시드 두 플레이트 및 HFK 8E6를 위한 두 개의 플레이트)를 HKGS 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 4mL의 각질세포 배양 배지에 넣는다. 5%CO2를 갖는 재킷 인큐베이터에서 37°C에서 성장시킨다.
참고: HFK 세포의 분석은 두 가지 이유로 이 프로토콜을 위해 선택되었다. 첫째, HFK는 세포주를 형질감염시키기가 어렵다. 따라서, 프로토콜이 이 세포주에서 작동한다는 것을 입증함으로써, 그것이 더 일반적으로 사용되고 더 쉽게 형질감염된 세포에서 작용할 가능성이 있다는 증거가 제공된다. 둘째, 이전에 발표 된 데이터는 바이러스 단백질 (8E6)이 DNA20,21,22에서 이중 가닥 파단의 복구를 방해한다는 것을 보여줍니다. 따라서, HFK LXSN과 HFK 8E6을 비교하는 것은 세포 복구 능력의 감소와 관련된 돌연변이의 증가를 검출하는 검정의 능력을 입증할 수 있게 한다.
2. 형질감염
- 형질 감염 당일 (도금 후 24 시간)에 3 mL의 항생제가 보충 된 배지로 매체를 교체하십시오. 재킷 인큐베이터에서 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 세포를 제조자의 지시에 따라 적절한 지질 기반 형질감염 시약으로 형질감염시킨다.
- 트랜스펙션 시약을 실온으로 가온하고 사용하기 전에 피펫을 부드럽게 가온하십시오.
- 각 세포주(HFK LXSN 및 HFK 8E6)에 대해 적절한 양의 형질감염 완충액(제조사의 지시에 따라)을 멸균 1.5 mL 원심분리 튜브(튜브 1)에 넣는다. 동일한 양의 트랜스펙션 완충액(모의 트랜스펙션 또는 튜브 2)을 갖는 다른 튜브를 포함한다.
- 인간 CD4를 표적화하는 CAS9/sgRNA (px330-CD4, 5'-GGCGTATCTGTGTGAGGACT)를 발현하는 플라스미드 DNA 2 μg을 단계 2.2.2의 튜브 1에 첨가한다. 피펫을 부드럽게 혼합하여 완전히 혼합합니다. 튜브 2에 같은 양의 멸균수를 첨가하십시오.
- 각 세포주에 대해 트랜스펙션 시약 단독(플라스미드 없음)으로 대조군 플레이트를 포함시킨다.
참고: 두 번째 플레이트는 실험에서 음성 대조군 역할을 하여 사용자가 CAS9/sgRNA를 사용한 트랜스펙션이 돌연변이에 대해 책임이 없음을 확인할 수 있도록 합니다. - 적절한 양의 형질감염 시약(제조자의 지시에 따라)을 단계 2.2.3으로부터의 DNA 혼합물(튜브 1)과 단계 2.2.2로부터의 모의 트랜스펙션(튜브 2)으로 튜브에 첨가한다. 피펫을 부드럽게 혼합하여 완전히 혼합합니다. 복합체가 형성되기에 충분한 시간을 허용하기 위해 실온에서 15-30 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 형질감염 혼합물을 플레이트에 적가한다. 배양물을 1분 동안 부드럽게 흔들어 형질감염 혼합물을 고르게 분배한다.
- CAS9 발현을 허용하도록 형질감염 후 48시간 동안 인큐베이션한다.
- 트립신화에 의해 세포를 수확.
- 배양 배지를 트립신-EDTA 1mL(0.05%, 에틸렌디아민테트라아세트산)로 교체한다. 37°C에서 3분 동안 인큐베이션한다. 동일한 양의 FBS 보충 배지로 트립신을 중화하십시오.
- 세포의 각 플레이트에 대해, 세포 현탁액을 동일한 분취량을 갖는 두 개의 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 단계 2.4.2에서 하나의 튜브로부터 세포 펠릿을 시퀀싱을 위해 1 mL의 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킨다. 단계 2.4.2로부터의 다른 튜브를 면역블롯을 위해 빙냉 PBS로 재현탁시킨다.
- 면역블롯을 위해 전체 세포 용해물을 수확한다.
- 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
- 튜브에 1% 프로테아제 억제제 및 1% 포스파타제 억제제와 혼합된 100μL 방사선면역침전 분석 완충액(RIPA lysis buffer)을 첨가하고, 피펫으로 충분히 혼합하고 얼음 위에서 10분 동안 배양한다.
참고: RIPA 용해 완충액은 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0을 함유한다; 1 mM EDTA; 0.5 mM EGTA; 1% 트리톤 X-100; 0.1% 소듐 데옥시콜레이트; 0.1% SDS; 140 mM NaCl, 및 탈이온수. - 원심분리기는 13,000 x g 에서 10분 동안 용해된다. 면역 블롯을위한 상청액을 수집하십시오.
3. 면역블롯을 통한 CAS9 발현 측정
- 제조업체의 지침에 따라 비친코닌산(BCA) 분석법으로 단백질 농도를 확인합니다.
- 각 샘플의 단백질 20 μg을 3%-8% 트리스-아세테이트 겔의 웰에서 150분 동안 실행하고, 반건조 전사(10 V 동안 30분, 그 후 25 분 동안 12분 동안)를 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 옮긴다.
- 실온에서 1시간 동안 0.1% 트윈(PBST)으로 PBS 중의 5% 탈지분유에서 막을 차단한 후, 항-CAS9 (1:1000) 및 항-GAPDH (1:1000) 항체를 첨가한다. 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 멤브레인을 PBST로 세척한 후, 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 PBST의 5% 탈지분유 중의 이차 항체로 인큐베이션한다.
- 블롯을 이미지화하고 치밀측정법(23)에 의해 CAS9 레벨을 결정한다. 대표적인 블롯에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
참고: 면역형광 현미경에 의한 인산화된 H2AX(S139) 초점 형성을 검출하는 것은 CAS9 활성(14)을 검증하는데 사용될 수 있다. 세포 주기 위치, CAS9 표적 부위의 돌연변이가 추가 절단을 방지하는지 여부 및 관심있는 게놈에 존재하는 CAS9 절단 부위의 얼마나 많은 카피에 따라 낮은 수의 뚜렷한 초점 (전형적으로 1-4 초점)이 예상된다. 대표적인 이미지는 그림 2에 나와 있습니다.
4. 핵산 추출 및 앰플리콘 생성
- 제조업체가 지정한 대로 고분자량 DNA 추출 키트를 사용하여 단계 2.4.3에서 세포 샘플로부터 DNA를 추출합니다.
- 데이터시트에 따라 프라이머를 지시된 용매로 재현탁시킨다. 동일한 시약을 20 μM 풀로 희석하고 20 μM 프라이머를 지시된 풀에 넣는다.
참고: 프라이머 풀은 보충 표 1에 나열되어 있습니다. - 표 1에 명시된 바와 같이 각 20 μM 프라이머 풀에 대해 긴 증폭 Taq 중합효소를 사용하여 PCR 마스터 믹스를 생성한다.
- 21 μL의 마스터믹스를 PCR 튜브에 첨가한다.
- 단계 4.1의 표적 샘플 4μL(100ng/μL)를 마스터믹스 및 캡 분석 튜브가 포함된 PCR 분석 튜브에 추가합니다. 각 프라이머 풀에 대해 별도의 반응을 확인하십시오.
- 소용돌이 PCR 분석 튜브와 원심분리기(quick spin)를 혼합하여 튜브 뚜껑에서 물방울을 제거한다.
- PCR 튜브를 기존의 열 사이클러 기계에 놓습니다.
- 표 2에 명시된 바와 같은 프로그램 PCR 기계.
- 열 순환기에서 프로그램을 실행하십시오.
5. PCR 정리
- 비드 기반 PCR 클린업 시스템을 사용하여 PCR 반응으로부터 프라이머를 제거한다.
- 사용 30분 전에 냉장고에서 클린업 비드를 제거하십시오.
- 사용하기 전에 볼텍스 비드를 잘 사용하고 모든 비드가 재현탁되도록하십시오.
- 30 μL (1.2x)의 재현탁된 비드를 깊은 웰 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다.
- 25 μL의 PCR 반응을 비드를 함유하는 웰에 첨가한다.
- 플레이트를 플레이트 진탕기 위에 2분 동안 2000 rpm으로 놓습니다.
- 진탕 후 플레이트를 실온에서 5 분 동안 유지하십시오.
- 깊은 웰 플레이트를 96-웰 플레이트 자석 위에 놓고 2분 동안 인큐베이션한다.
- 방해 구슬없이 상층액을 제거하고 버리십시오.
- 플레이트가 자석 상에 남아있는 동안, 180 μL의 80% 에탄올을 첨가하고, 30초 동안 인큐베이션한다. 상층액을 제거하고 버립니다.
- 5.1.9단계를 반복합니다.
- 10 μL 피펫을 사용하여 웰에서 남아있는 액체를 제거하고 버립니다.
- 구슬을 실온에서 10 분 동안 말리십시오.
- 20μL의 뉴클레아제 자유 물을 비드가 들어있는 웰에 첨가하고 자석에서 플레이트를 제거하십시오.
- 플레이트를 실온에서 2분 동안 2000 rpm으로 흔들었다.
- 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 플레이트를 자석 스탠드 위에 놓고 실온에서 2 분 동안 인큐베이션하십시오.
- 상청액을 두 번째로 표지된 PCR 플레이트에 넣었다. 여기에는 정리 된 DNA가 들어 있습니다.
- 각 반응의 농도를 형광계로 측정한다.
- dsDNA 형광계 시약이 실온에 있는지 확인하십시오.
- Fluorometric 분석 튜브와 표준을 위한 두 개의 추가 튜브를 설정합니다.
- 199μL의 1x dsDNA 작업 용액을 두 개의 튜브를 제외한 모든 튜브에 추가합니다. 작업 용액 190μL를 마지막 두 튜브에 첨가합니다.
- 두 표준물질 ( 물질 표에 포함됨) 중 10 μL를 첨가하여 분석 튜브를 분리하십시오.
- 각 PCR 반응의 1 μL를 플루오로미터 마스터믹스 튜브에 첨가한다.
- 소용돌이 튜브를 혼합하고 실온에서 2분 동안 인큐베이션한다.
- 형광계의 홈 화면에서 분석 키트 사용 버튼(1x dsDNA)을 선택한 다음 표준 읽기 및 샘플 실행을 선택합니다.
- 표준 1 튜브를 삽입하고 읽기 단추를 선택한 다음 표준 2에 대해 반복합니다.
- 단계 5.2.6에 이어서, 하나의 샘플에 대해 반복하고, 1 μL의 샘플 부피를 선택하고, 생성된 농도가 제공될 것이다.
- 나머지 샘플에 대해 5.2.7단계를 반복합니다.
- 아래 방정식을 사용하여 모든 반응의 예상 어금니를 계산하고 각 개별 샘플에서 동일한 농도의 반응을 개별적으로 풀링합니다 (샘플 당 하나의 최종 풀).
- 단계 5.2.1 내지 5.2.7을 반복하여 최종 풀 농도를 구한다.
- 모세관 전기 영동 기계 / 아가로스 젤의 앰플리콘 풀을 제조업체가 지정한대로 확인하십시오.
- 적절한 수의 샘플에 대해 모세관 전기영동 튜브를 준비합니다. 제조업체가 지정한 대로 7μL의 DNA 버퍼를 추가합니다.
- 4 μL의 앰플리콘 풀을 DNA 완충액을 함유하는 튜브에 첨가한다.
- 전기 영동 기계에 튜브를 놓고 dsDNA 제조업체가 지정한 대로 기계를 가동합니다.
- 밴드가 ~ 5kb (앰플리콘의 크기)로 국부화되도록하는 전기 영동 젤 사진을보십시오.
- 아래 방정식을 사용하여 모든 반응의 예상 어금니를 계산하고 각 개별 샘플에서 동일한 농도의 반응을 개별적으로 풀링합니다 (샘플 당 하나의 최종 풀).
6. 도서관 준비
- 라이브러리 준비를 위해 5.3.1단계에서 0.2ng/μL까지 샘플 풀을 희석합니다.
- 짧은 시퀀스(300bp)와 호환되는 저입력 라이브러리 준비 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 5.3단계에서 만든 각 샘플 풀에 대해 고유한 인덱스 조합을 사용하여 라이브러리를 준비합니다.
주: 제조업체의 지침에 따라 인덱스 시퀀스를 선택합니다. 라이브러리 준비 키트에 적합한 모든 인덱스는 샘플에 대해 작동합니다. - 라이브러리 준비 후 제조업체의 지침에 따라 모든 샘플을 풀링하십시오.
참고: 라이브러리 풀을 만들기 전에 대상 시퀀스의 250x 커버리지에 필요한 읽기 수를 계산하고 선택한 시퀀싱 카트리지가 포함된 각 샘플에 대해 적절한 커버리지를 제공할 수 있는지 확인하십시오. 총 0.5Mb의 경우 이는 1M 읽기와 동일합니다.
- 짧은 시퀀스(300bp)와 호환되는 저입력 라이브러리 준비 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 5.3단계에서 만든 각 샘플 풀에 대해 고유한 인덱스 조합을 사용하여 라이브러리를 준비합니다.
- 시퀀싱을 위해 라이브러리 풀을 준비합니다.
- 해동하고 300 사이클 카트리지 및 시퀀싱 시약을 준비한다.
- 시퀀서 제조업체의 지침에 따라 5.1.1단계에서 생성된 시퀀싱 풀을 변성시키고 희석합니다.
- 변성 및 희석된 라이브러리 풀을 시약 시퀀싱에 추가하고 제조업체가 지정한 대로 시퀀싱 머신을 실행합니다 .
참고: 문제 해결에 대해서는 첨부된 표 3 을 참조하십시오.
7. 데이터 분석
참고: 모든 데이터 단계는 게놈 데이터 분석 소프트웨어에서 수행됩니다. 괄호는 사용자 입력을 나타냅니다. 기호보다 큰 것은 주어진 단계(예: 1번째 마우스 클릭>2번째 마우스 클릭)에 대한 마우스 클릭 순서를 나타냅니다.
- 소프트웨어 열기 > Illumina로 가져오기를 클릭하여 읽기 > > 파일 선택 다음> 저장할 위치 선택> 마침> 가져옵니다. 이제 읽기가 소프트웨어에 나타납니다.
- 읽기를 트리밍하고 필터링합니다.
- 딥 시퀀스 데이터 분석 소프트웨어에서 원시 읽기 기본 매개 변수를 트리밍합니다.
- 읽기를 강조 표시하고 도구 상자를 클릭>여 시퀀싱 데이터 준비 > 트림 읽기 다음 > 다음 > 다음 > 다음 > 다음 >에 > 저장(저장할 위치 선택) > 마침> 완료
- 트리밍된 읽기를 참조하도록 매핑합니다.
- 맵 트리밍된 읽기는 매치 점수 2, 불일치 비용 3 및 삽입/삭제 비용 2를 사용하여 단계 4.1에서 사용된 참조 시퀀스로 읽습니다. 길이 분수가 0.7 이상이고 유사성 분수가 0.8 이상인지 확인하십시오.
- 트리밍된 읽기 파일을 강조 표시하고 분석 재시퀀싱 >> 읽기를 참조로 매핑 > 다음 >(참조 시퀀스 선택) > 다음 >(매개 변수가 위와 같이 표시되는지 확인) > 다음 > > 저장(저장할 위치 선택) > 마침을 클릭합니다.
- 추출물 변형과 indels.
- 적절한 indel 호출자를 사용하여 p-값 임계값 0.005 이하와 최대 불일치 수 3을 사용하여 인델을 추출합니다.
- 매핑된 읽기 파일을 강조 표시하고 다음 >> Indels 및 구조 변형> 변형 탐지를 > 재시퀀싱 분석> 도구 상자를 클릭합니다(필요한 유의성이 입력되었는지 확인> 다음 > > 저장(저장할 위치 선택) > 마침.
- 적절한 변형 호출자를 사용하여 읽기 매핑에서 변형을 호출하여 5%의 유의성을 사용합니다.
- 매핑된 읽기 파일을 강조 표시하고 다음 >> > 저주파수 변형 탐지를 > 재시퀀싱 분석 > 도구 상자를 클릭합니다(필요한 유의성이 입력되었는지 확인> 다음 > 다음 > > 저장(저장할 위치 선택) > 마침.
참고 : 인델 및 변형 호출자에서 숙주 게놈의 ploidy를 설명해야합니다. 5 % 미만의 돌연변이를 추출하지 마십시오. 이 역치는 분석과 관련된 PCR 및 시퀀싱 오류를 설명합니다. 정상화 (CAS9의 면역 블롯 검출 기준)는 시퀀싱 범위를 조정하여 수행되어야합니다. 예를 들어, 샘플 A가 샘플 B의 트랜스펙션 효율의 두 배를 갖는다면, 샘플 A로부터의 판독값의 50%가 분석에 사용되어야 한다. 이것은 무작위 샘플링으로 수행되어야하며 100x 미만의 샘플에 대한 적용 범위를 줄이지 않아야합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에 대한 세 가지 대표적인 결과가 제시됩니다. 도 1 은 HFK 대조군(LXSN) 및 HFK 발현 베타-HPV 8E6(8E6)에서 CAS9의 발현을 확인한 면역블랏이다. 형질감염 48시간 후, 전체 세포 용해물을 수확하고, 이어서 항-CAS9 항체 (또는 로딩 대조군으로서 GAPDH)로 프로빙하였다. 결과는 HFK LXSN 및 HFK 8E6이 유사한 양의 CAS9를 발현한다는 것을 보여주며, 이는 형질감염 효율이 두 세포주 사이에서 유사하다는 것을 나타낸다. 도 2 는 DSBs24에 대한 표준 마커인 pH2AX 포시를 사용하여 CAS9 유도 DSBs를 나타내는 면역형광 현미경 이미지이다. 이는 두 개의 DSB가 CAS9/sgRNA에 의해 유도됨을 나타내며, 따라서 DSB 유도가 예상대로 발생하고 있음을 확인시켜 준다. 도 3은 8E6이 CAS9 유도 DSB(22) 주위 200Kb내에서 게놈 변이를 증가시킨다는 것을 보여준다. 이것은 HPV8 E6이 DSB 복구를 억제하고 게놈 불안정을 증가시킨다는 가설과 일치합니다. 이 그림에서는 이 방법에서 가져온 데이터를 표시할 수 있는 한 가지 방법을 보여 줍니다.
도 1: 형질감염되지 않은 HFK 세포와 형질감염된 HFK 세포에서의 CAS9 발현을 비교하는 면역블롯의 대표적인 이미지. sgRNA/CAS9 플라스미드를 HFK 세포에 형질감염시키기 위해 사용하였다. 항-CAS9 항체는 CAS9 단백질을 검출하기 위해 사용되었다. GAPDH는 로딩 제어로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: sgRNA/CAS9 형질감염된 세포 및 비형질감염된 대조군에서 인산화된 히스톤 H2AX(S139)의 대표적인 면역형광 이미지. DAPI는 DNA(블루)를 염색하는데 사용되었다. pH2AX(적색)는 CAS9 유도된 DSB에 대한 마커이다. 이는 최적의 CAS9 발현이 오프 타겟 절단의 부재에 의해 달성되었다는 것을 입증한다. 표적화된 게놈 유전자좌의 수(세포의 ploidy의 변화, 표적 부위 카피 수 변이, 또는 세포 주기 위치에 의해 변경됨)에 따라, 초점의 수는 더 높을 수 있다. 그러나, 임의의 증가는 분석된 세포 유형 및 표적 부위에 기초하여 예측가능해야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 베타-HPV 8E6은 DSB 복구 중에 게놈 불안정성을 증가시킵니다. (a) 게놈의 서열화된 부분을 따라 DSB를 유도하는 CAS9의 배치의 개략도. (b) HFK LXSN 및 HFK 8E6에서의 돌연변이 사건의 유형별로 그룹화된 게놈 변이. 게놈 변이 및 총 변이의 각 그룹은 HFK LXSN과 HFK 8E6 사이에서 비교되었다. (c) HFK LXSN(오른쪽) 및 HFK 8E6 세포(왼쪽)에서의 DNA 돌연변이의 서커스 플롯. 검은색 화살표는 CAS9 절단 부위를 나타냅니다. 가장 안쪽의 원은 동일한 게놈 재배열 사이의 연결을 표시합니다. 게놈 변이의 유형에 의해 착색된 게놈 재배열의 위치는 다섯 개의 동심원으로 표시된다(파란색은 SNP를 나타내고, 녹색은 삽입을 나타내고, 적색은 결실을 나타내고, 자주색은 MNV를 나타내고, 검정은 대체를 나타냄). 가장 바깥쪽 원의 산점도는 중단점(검정), 탠덤 중복(빨간색) 및 점 인델(회색)을 표시하며, 여기서 외부 모서리에 대한 근접성은 높은 변형 비율을 나타냅니다. SNP, 단일 뉴클레오티드 다형성. MNV, 다중 뉴클레오티드 변이. 세포주 사이의 통계적 차이는 Students' t-test를 사용하여 측정하였다. 는 p< 0.001"을 나타낸다. 이것은 허가(22)를 갖는 이전에 공개된 참조로부터 적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: PCR 마스터 믹스 성분. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: PCR 프로그램 설정. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 문제 해결. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: PCR에 대한 프라이머 풀의 목록. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제공된 정보의 깊이 외에도이 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, DSB 복구는, 이론적으로, 관심있는 세포의 게놈을 변형시키지 않고 임의의 게놈 유전자좌에서 평가될 수 있다. 둘째, 수리에 대한 NGS 분석에 대한 액세스는 정의된 영역을 대상으로 하는 단일 DSB를 만들고 분석함으로써 제공되는 비용 절감 및 계산 노력으로 증가합니다. 마지막으로, 추가적인 유기체의 게놈이 일상적으로 이용가능해지고 다양한 포유동물 및 비포유류 세포주의 성공적인 형질감염을 입증하는 다수의 간행물이 이용가능하게 됨에 따라, 이 접근법의 유용성은 광범위한 10,23,24가 될 것으로 예상된다.
이 원고는 예시적인 예로서 인간 포피 각질세포에서 DSB 복구를 분석하였다. 형질감염 효율은 다른 조직 유형보다 각질세포에서 더 낮은 경향이 있다. 따라서, 이 프로토콜은 이들 트랜스펙션하기 어려운 세포에 최적화된 트랜스펙션 접근법을 사용하였다. 형질감염 접근법은 분석된 세포 유형에 대해 최적화되어야 한다. 이 프로토콜에 사용된 CAS9 유도 DSB의 능력은 골육종, 결장암, 폐암, 섬유아세포, 배아 신장 및 인간 각질세포 세포10,23에서 확인되었다. 그러나 차세대 시퀀싱을 수행하기 전에 CAS9 발현 및 활성을 확인하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 CAS9 형질감염 효율의 차이를 설명하기 위해 분석을 정규화하기 위해 서로 다른 샘플 간에 또는 서로 비교하는 경우입니다. 이를 위해서는 상대적 CAS9 단백질 수준을 면역블롯팅 및 치밀측정법으로 측정해야 한다(그림 1). 또한 IF 현미경(14 )에 의해 검출가능한 별개의 pH2AX(S139) 초점 형성에 의해 지시된 바와 같이 CAS9 절단의 특이성을 보장하는 것이 중요하다(도 3). 대안적으로, T7 엔도뉴클레아제 분석은 CRISPR/Cas9 활성 및 sgRNA 효율을 검사하는데 사용될 수 있다.
이 접근법의 주목할만한 한계는 CAS9 유도 DSB가 방사선 또는 유사한 생리학적 손상에 의해 야기된 DSB보다 "깨끗한" 경향이 있다는 것이다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 자연 발생 병변의 복구와 관련된 돌연변이의 수 또는 중증도를 과소평가할 수 있다. 더 긴 오버행으로 DSB를 유도하는 다른 서열 특이적 뉴클레아제의 사용은 이러한 제한(26)을 극복하는 데 도움이 될 수 있다. 더욱이, 크로마틴 영역(예를 들어, 헤테로크로마틴 및 유크로마틴)이 CAS9 활성에 영향을 미치는지 여부는 완전히 이해되지 않는다. 따라서, 사용자는 상이한 부위에서의 돌연변이를 비교할 때 동등한 CAS9 활성을 확인하도록 주의해야 한다.
여기에 설명된 방법은 다양한 맥락에서 DSB를 복구하는 상대적 돌연변이유발 결과를 정의하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 신규한 소분자 DNA 복구 억제제의 검사를 용이하게 할 수 있다. 이것은 형질전환 된 (변형되지 않은 세포에 비해) 돌연변이 유발성 억제제가 화학 요법제로서의 개발을 위해 우선 순위를 매길 수있게 해줍니다. 이러한 접근법은 또한 상이한 유전자 맥락 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 리프레서 근처), 상이한 돌연변이를 갖는 세포 간 (예를 들어, 구성적으로 활성이거나 오센스 돌연변이인 신호전달 유전자), 또는 다른 유사한 순열에서 DSB 복구와 관련된 돌연변이의 빈도를 결정하기 위해 동일한 게놈 배경 내에서 비교하는데 유용할 수 있다. 접근 방식의 유연성과 경제성은 향후 분석을위한 강력한 도구를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 원고에보고 된 연구는 국립 보건원 (P20GM130448)의 국립 일반 의료 과학 연구소 (NAW 및 RP)의 지원을 받았다. 국립 보건원 국립 암 연구소 (NCI R15 CA242057 01A1); 캔자스 주립 대학의 존슨 암 연구 센터; 및 미국 국방부 (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). 우리는 우리의 면역 형광 현미경 검사에 대한 KSU-CVM 공초점 코어와 조엘 산네만에게 감사드립니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 이러한 자금 조달 기관의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 Well Tissue Culture Plate | Celltreat | 229106 | Cell culture plate |
| BCA Kit | VWR | 89167-794 | BCA assay kit |
| Centrifuge 5910 R | Eppendorf | 2231000772 | Tabletop Centrifuge |
| CLC Genomic Workbench | Qiagen | 832001 | deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller |
| Digital Microplate Genie pulse | Scientific industries | SI-400A | Plate shaker |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | ThermoFisher Scientific | MA191878 | Anti-FLAG antibody |
| Epilife CF Kit | ThermoFisher Scientific | MEPICF500 | Cell cultrue media and supplements |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | Cell culture supplement |
| Goat anti-Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Secondary antibody |
| HighPrep PCR Clean-up system | MagBio | AC-60005 | Bead-based PCR cleanup kit |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2600 | PCR mastermix/PCR assay |
| MagAttract HMW DNA kit | Qiagen | 67563 | High Molecular Weight DNA extraction kit |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | 96-Well Magnetic Rack |
| MiniAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A37834 | Thermal Cycler |
| Miseq | Illumina | SY-410-1003 | Sequencer |
| Miseq v2 300 cycle reagent kit | Illumina | MS-102-2002 | 300-cycle cartridge/sequencing reagents |
| Nextera XT DNA Library Prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Library preparation kit |
| Nextera XT Kit v2 Set A | Illumina | 20027215 | Indexes |
| Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | deep well 96-well plates |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100X) | Calsson Labs | PSL02-6X100ML | Antibiotics for cell culture |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | PBS |
| px330-CD4 | Addgen | 136938 | SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT |
| QIAxcel Advanced System | Qiagen | 9001941 | capillary electrophersis machine |
| QIAxcel DNA screening kit | Qiagen | 929004 | DNA buffer/ capillary electrophersis tubes |
| Qubit 1x ds HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q23851 | Fluorometer reagents/1x dsDNA solution |
| Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | Fluorometer assay tubes |
| RIPA Lysis Buffer | VWR | VWRVN653-100ML | Lysis buffer for protein extraction |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300054 | Trypsin |
| Vortex-Genie 2 | Scientific industries | SI-0236 | Vortex |
| Xfect Transfection Reagent | Takara Bio | 631318 | Transfection reagent |
| genomic data analysis software | QIAGEN | CLC Workbench v21.0. | Data analysis software |
References
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