Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Behandelingstechnieken om stress bij muizen te verminderen

Published: September 25, 2021 doi: 10.3791/62593
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 4, 5, 1,2,3, 1,2
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

Summary

Dit artikel beschrijft een hanteringstechniek bij muizen, de 3D-handlingtechniek, die routinematige behandeling vergemakkelijkt door angstachtig gedrag te verminderen en details presenteert over twee bestaande gerelateerde technieken (tunnel- en staartbehandeling).

Abstract

Proefdieren worden onderworpen aan meerdere manipulaties door wetenschappers of dierenverzorgers. De stress die dit veroorzaakt kan diepgaande effecten hebben op het welzijn van dieren en kan ook een verwarrende factor zijn voor experimentele variabelen zoals angstmaatregelen. In de loop der jaren zijn behandelingstechnieken ontwikkeld die handling-gerelateerde stress minimaliseren met een bijzondere focus op ratten en weinig aandacht voor muizen. Het is echter aangetoond dat muizen kunnen worden gewend aan manipulaties met behulp van behandelingstechnieken. Het gewennen van muizen aan het hanteren vermindert stress, vergemakkelijkt routinematige behandeling, verbetert het welzijn van dieren, vermindert de gegevensvariabiliteit en verbetert de experimentele betrouwbaarheid. Ondanks de gunstige effecten van de hantering, wordt de tail-pick-up-aanpak, die bijzonder stressvol is, nog steeds veel gebruikt. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving en demonstratie van een nieuw ontwikkelde muisbehandelingstechniek die bedoeld is om de stress die het dier tijdens menselijke interactie 2018 2018 2000 heeft ondervonden, tot een minimum te beperken. Deze handmatige techniek wordt gedurende 3 dagen uitgevoerd (3D-handling techniek) en richt zich op het vermogen van het dier om te habitueren aan de experimenteerder. Deze studie toont ook het effect aan van eerder vastgestelde tunnelbehandelingstechnieken (met behulp van een polycarbonaattunnel) en de tail-pick-up techniek. Specifiek bestudeerd zijn hun effecten op angstachtig gedrag, met behulp van gedragstests (Elevated-Plus Maze en Novelty Suppressed Feeding), vrijwillige interactie met experimenteerders en fysiologische meting (corticosteronniveaus). De 3D-handling techniek en de tunnel handling techniek verminderden angst-achtige fenotypes. In het eerste experiment, met behulp van 6 maanden oude mannelijke muizen, verbeterde de 3D-handling-techniek de interactie tussen experimenten aanzienlijk. In het tweede experiment, met behulp van 2,5 maanden oude vrouw, het verlaagde corticosteron niveaus. Als zodanig is de 3D-handling een nuttige aanpak in scenario's waarin interactie met de experimenteerder vereist of de voorkeur heeft, of waar tunnelafhandeling mogelijk niet mogelijk is tijdens het experiment.

Introduction

Muizen en ratten zijn essentiële troeven voor preklinische studies1,2 voor meerdere doeleinden, waaronder endocriene, fysiologische, farmacologische of gedragsstudies2. Uit het toenemende aantal studies met dieren is gestegen dat ongecontroleerde omgevingsvariabelen , waaronder menselijke interactie , verschillende uitkomsten in biomedisch onderzoek beïnvloeden3,4,5. Dit is verantwoordelijk voor significante variabiliteit waargenomen in experimenten en onderzoekslaboratoria4,5, wat een belangrijk voorbehoud vormt in dieronderzoek.

Er zijn verschillende benaderingen geïmplementeerd met als doel de impact van omgevingsstressoren te beperken en de reactiviteit op menselijke interactie te verminderen. Om bijvoorbeeld de impact van milieustressoren te beperken, zijn standaardisatie van huisvestingsomstandigheden en geautomatiseerde huisvestingssystemen6,7 geïmplementeerd in laboratoria. Wat de interactie met mensen betreft, hadden veelgebruikte benaderingen voor het hanteren en vervoeren van dieren weinig rekening met ongemak en stress bij dieren. Het oppakken van dieren bij hun staart of het gebruik van tang8 verhoogt bijvoorbeeld de angst bij aanvang9,10,11, vermindert exploratie9,12 en draagt sterk bij tot interpersoonlijkheidsvariabiliteit binnen en tussen studies13,14. Als gevolg hiervan werden andere benaderingen ontwikkeld, zoals de cup handling-techniek, die van toepassing is op muizen en ratten. In deze aanpak worden de dieren uit hun kooi "gecupt" en door de experimenteerders vastgehouden met hun handen die een kopje9,10,11vormen. Een ander nuttig alternatief voor staartbehandeling is het gebruik van een polycarbonaattunnel om muizen over te brengen9,10,15. Deze aanpak elimineert directe interactie tussen de muis en de experimenteerder. Zowel de cup- als tunnelbenaderingen toonden werkzaamheid bij het verminderen van angstachtig gedrag en angst voor de experimenteerder die kan worden overdreven door aversieve behandelingstechnieken, zoals staartoppakken / staartbehandeling9,10.

Daarom toont toenemend bewijs het nut aan van een goede muisbehandeling voor het verminderen van variabiliteit tussen individuen9,11en het verbeteren van dierenwelzijn10. De hierboven genoemde technieken worden echter nog steeds geconfronteerd met beperkingen. De cup handling techniek is geïmplementeerd met schema's variërend van 10 dagen (10 sessies over 2 weken16) tot 15 weken17, wat een aanzienlijke hoeveelheid tijd is voor facilitair personeel en experimenteerders. Bovendien varieert de effectiviteit van cup handling per stam9 en conventionele cup handling in open handen kan leiden tot naïeve muizen of bijzonder springerige stammen om uit de hand te springen9,18. Tunnelbehandeling resulteert in consistentere en over het algemeen snellere resultaten in gentling19. Tunnels worden ook gebruikt als verrijking van de thuiskooi. Ze helpen dieren om snel te kunnen omgaan en bieden de extra voordelen van verrijking. Tunnelbehandeling heeft echter beperkingen bij het overbrengen van dieren tussen apparaten. Interessant is dat Hurst en West9, en Henderson et al.20 hebben aangetoond dat het gebruik van zachte en korte handmatige behandeling om dieren van de tunnel naar het apparaat over te brengen geen invloed heeft op hun fenotype.

Om een alternatief te bieden voor bestaande methoden, met haalbare gewenging in een korte periode, beschrijft dit artikel een nieuwe techniek die zich uitbreidt op de cup handling-techniek, waardoor er geen specifieke apparatuur nodig is. Deze aanpak maakt gebruik van mijlpalen om het niveau van comfort te meten dat muizen hebben met het behandelingsproces. Het toont werkzaamheid bij het verminderen van de reactiviteit en stress van de muis (op het gedrags- en hormonale niveau), vergemakkelijkt routinematige behandeling en draagt bij aan het verminderen van variabiliteit tussen dieren. Details van deze techniek worden hier verstrekt, en de werkzaamheid ervan bij het verminderen van angstachtig gedrag, het verbeteren van de interactie met experimenteerders en het beperken van de afgifte van perifere stresshormoon (corticosteron) worden aangetoond in twee afzonderlijke studies (mannelijke en vrouwelijke muizen), in vergelijking met tunnelbehandeling (positieve controle) en staartbehandelingstechnieken (negatieve controle).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedures met betrekking tot dieronderwerpen werden goedgekeurd door de CAMH-commissie voor dierverzorging en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.

OPMERKING: De hierin beschreven behandelingsmethode kan worden gebruikt in verschillende muizenstammen, waaronder niet-transgene (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, enz.) en transgene lijnen. Het kan ook worden gebruikt met jonge of oude muizen, waarbij wordt opgemerkt dat jonge volwassen (4-6 weken oude) muizen de neiging hebben iets actiever te zijn dan volwassen of oude muizen, vooral op dag 1.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Vóór de start van het onderzoek, volgens ARRIVE-richtlijnen21,willekeurig muizen toewijzen aan elke behandelingsgroep (3D-handling, tunnel handling of tail handling).
  2. Identificeer de ruimte om de behandeling uit te voeren. Het kan worden uitgevoerd in de woonkamer of in een aparte kamer. Als de behandeling wordt uitgevoerd in een aparte ruimte, waarvoor de dieren op een bewegende kar moeten worden verplaatst, laat de dieren dan 20-30 minuten in de nieuwe kamer bewonen voordat het behandelingsprotocol wordt gestart.
  3. Gebruik voor groepshuisdieren een tijdelijke kooi om muizen na de behandeling te huisvesten, voordat u ze allemaal in hun eerste thuiskooi hergroepeert. Dit vermindert mogelijke gevechten tussen dieren voorafgaand aan de behandeling (vooral bij mannen).
  4. Werk aan een aanrecht (bij voorkeur een ontruimd aanrecht) of in een bioveiligheidskast, waarbij de kooi weg is van het dier dat wordt behandeld. De nabijheid van de woonkooi verhoogt het risico om te springen. Als dieren in groepshuisvesting zijn, kan het springen van de muis die in de thuiskooi wordt behandeld, stress veroorzaken voor kooigenoten.
    OPMERKING: Werken in een bioveiligheidskast beperkt het risico dat muizen op de vloer springen en kan in bepaalde faciliteiten nodig zijn. Deze techniek kan worden gebruikt in een bioveiligheidskast, waarbij ervoor wordt gezorgd dat altijd alle stappen in de bioveiligheidskast worden uitgevoerd en muizen op handler-onderarmen worden vermeden.

2. DAG 1: 5 min per muis

  1. Open voorzichtig de kooi en plaats het deksel op de zijkant, verwijder nestmateriaal en andere verrijking zoals loopwielen of schuilplaatsen.
  2. Breng een gehandschoende open hand naar de thuiskooi en plaats de hand langzaam langs één kant van de kooiwand (de muur die het dichtst bij de handler staat, figuur 1A).
    1. Probeer niet meteen de muis op te pakken.
  3. Blijf onbeweeglijk en laat het dier ongeveer 30 s gewennen aan de aanwezigheid van de hand in de kooi.
  4. Probeer de muis in de palm van de hand op te pakken (d.w.z. vermijd het dier bij zijn staart op te pakken).
    1. Als de muis na 3 pogingen niet gemakkelijk wordt opgepikt, leid de muis dan met beide handen naar een hoek en beker.
    2. Beweeg de gecupte handen voorzichtig naar de muis om te proberen het op te pakken.
    3. Als dit niet lukt na maximaal 3 pogingen met beide handen, pak dan de muis voorzichtig op bij de basis van zijn staart en breng deze over naar je onderarm of platte hand.
  5. Houd de hand met de muis in de hand zo plat en open mogelijk.
    OPMERKING: Dit biedt een plat platform waarop de muis kan stappen en beperkt het risico op beten.
  6. Houd de hand open en plat met de handpalm omhoog, plaats de andere hand naast de hand die de muis vasthoudt en laat de muis vrij van hand tot hand bewegen zonder enige terughoudendheid (figuur 1B).
  7. Laat de muis 1 minuut verkennen en tussen de handen bewegen.
    1. Op dit punt kunnen muizen proberen weg te springen. Plaats de handen zo dat als de muis springt, deze op een aanrecht zal landen in plaats van op de vloer.
    2. Als een muis eruit ziet alsof hij zich voorbereidt om te springen (naar de rand van de hand bewegen en op achterpoten opvoeden), plaats dan langzaam de andere hand ervoor en probeer hem te begeleiden om op deze hand te lopen. Vermijd plotselinge bewegingen omdat het hun risico op springen verhoogt.
    3. Als een muis springt, probeer deze dan op te pakken om staartafhandeling te vermijden en de behandelingssessie te hervatten. Als de muis langer dan 10 s op de grond of uit de handen blijft, voegt u extra tijd toe aan de verwerkingssessie om in te halen wanneer de muis uit handen was.
    4. Maak aantekeningen van de sprong. Het totale aantal sprongen kan worden gebruikt om de potentiële variabiliteit tussen dieren te beoordelen.
  8. Na 1 minuut hanteren met platte handen, ontspan de palm van de hand en kop de muis lichtjes in de hand, voordat u de muis voorzichtig tussen de handen rolt(figuur 1C).
    1. Om te "rollen", plaatst u de muis in de palm van de hand, op een platte hand, loodrecht op vingers.
    2. Sluit langzaam de hand en plaats de vingers op de achterkant van de muis.
    3. Plaats de vrije hand direct onder de hand die de muis vasthoudt.
    4. Draai/draai de hand langzaam met de muis om de muis voorzichtig naar de andere hand over te brengen (180° spiegelen).
    5. Herhaal dit heen en weer tussen de handen.
  9. Wissel af van zacht rollen tussen handen en vrije verkenning op open handen gedurende 60 s, afwisselend tussen technieken ongeveer elke 20 s.
  10. Voer een "shelter test" uit (Figuur 1D).
    1. Laat de muis naar de rand van de hand bewegen en breng de 2 handen samen.
    2. Heel langzaam, cup ze zodat de muis past in een "schuilplaats" gevormd door de handen. Laat een opening achter zodat de muis indien nodig kan ontsnappen.
    3. Probeer de muis 5-10 s in de schuilplaats te houden, zonder enige terughoudendheid.
    4. Wissel af tussen de shelter-test, rol tussen de handen en vrije verkenning van open handen voor nog eens 60 s, zorg ervoor dat je de shelter-stap 3 of meer keer uitvoert.
  11. Overhaast in alle in punt 2.10 beschreven procedures het proces niet. Als de muis gestrest lijkt (d.w.z. aarzelend om te ontsnappen, uit de handen springt, contact met handen vermijdt, enz.) door in de handen te worden opgesloten, ga dan 20 s verder met rollen tussen de handen en vrije verkenning en probeer het vervolgens opnieuw.
  12. Mijlpaal: Voer ten minste 1 succesvolle sheltertest van 10 s uit voor het voltooien van dag 1.
    1. Beschouw een sheltertest als succesvol wanneer de muis in de handen blijft. Als de muis zijn kop eruit steekt en terugkeert naar de schuilplaats, is het nog steeds een succesvolle test. Als het dier volledig uit het asiel komt, is het een mislukking.
  13. Laat vrije verkenning in handen gedurende 30 s.
  14. Vervang de muis voorzichtig in de kooi. Als de groep is gehuisvest, plaatst u de muis in de tijdelijke kooi totdat alle kooigenoten zijn behandeld. Breng de muizen terug naar hun oorspronkelijke kooi door ze op te pakken in de palm van de hand. Gebruik geen staartopraap.
  15. Reinig de bovenkant van de bank van potentiële uitwerpselen en urine met 70% ethanol.
  16. Spoel handschoenen grondig af met 70% ethanol (of de juiste reinigingsoplossing) of verwissel handschoenen voordat u de volgende muis gebruikt (het is mogelijk om dezelfde handschoenen voor kooigenoten te houden).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de behandeling uit te voeren met een redelijk aantal dieren om vermoeidheid van de handler te voorkomen. Het hanteren van 24 muizen duurt ongeveer 2 uur en het wordt aanbevolen om niet meer dan 24 muizen per handler te behandelen. Als er meer dieren moeten worden behandeld, wordt aanbevolen om meerdere handlers te hebben of om de behandelingsprocedures in subgroepen over meerdere dagen te splitsen.

3. DAG 2: 3 tot 5 min per muis

  1. Probeer de muis in de palm van de hand op te pakken. In dit stadium moet het al haalbaar zijn en mogen muizen niet uit de hand springen.
  2. Begin met palm open zoals op dag 1, zodat de muis 20 s vrij kan verkennen.
  3. Rol vervolgens de muis een paar keer tussen de handen (4-5 keer).
  4. Voer de "shelter test" gedurende 5 s uit.
  5. Herhaal de sheltertest meerdere keren (~5-6) gedurende een periode van 2 tot 3 minuten.
  6. Tijdens dezelfde periode van 2 tot 3 minuten, afwisselen met de rol tussen de handen en vrije verkenning van open handen stap vanaf dag 1 om gewenning te verbeteren.
    1. Raak de muis op zijn hoofd en rug aan(afbeelding 1E),5-6 keer. Een teken van gewenis is wanneer de muis je het laat aanraken zonder te proberen te ontsnappen.
    2. Voer een "Nose poke" uit: Probeer de snuit van de muis 2 tot 3 keer aan te raken(afbeelding 1F).
      1. Als de muis probeert te bijten of duidelijke tekenen van stress vertoont bij aanraking, probeer dan niet onmiddellijk de neus opnieuw te porren. Wissel in plaats daarvan af met platte handverkenning en rol. "Gewenis" wordt weerspiegeld door het dier dat niet wegloopt of zijn hoofd draait in gevallen van menselijk contact.
  7. In alle procedures beschreven in 3.4-3.6, haast u niet met het proces. Als de muis gestrest lijkt door in de handen te worden opgesloten of niet wil worden aangeraakt, gaat u 20-30 s tussen de handen rollen en probeert u het opnieuw.
  8. Mijlpalen: Voer ten minste 1 succesvolle neusplooi uit voor 2-3 s voor het voltooien van dag 2.
  9. Stop deze sessie na ongeveer 3 minuten hanteren als het dier goed reageert op het "asiel", "hoofd aaien", "neus porren", en als de muis bereid lijkt te zijn om de handen te verkennen zonder tekenen van stress.
  10. Als de muis tekenen van stress blijft vertonen of niet goed reageert op de "shelter test" of "nose poke" test, ga dan door met de sessie tot het bereiken van 5 minuten zoals op dag 1.
  11. Vervang de muis in de kooi, maak het tafelblad en de handschoenen schoon zoals op dag 1.

4. DAG 3: Ongeveer 3 min per muis

  1. Op de derde dag doorloopt u dezelfde stappen als op dag 2, gedurende 2 tot 3 minuten.
    1. Pak de muis in de palm van de hand.
    2. Breng de muis over en rol deze tussen de handen
    3. Voer een shelter test uit.
    4. Probeer de muis op de rug en het hoofd te aaien.
  2. Wissel deze stappen af over ongeveer 1 tot 2 minuten.
  3. Ga door met de procedure totdat de muis ontspannen genoeg is om in de palm van de hand te zitten zonder te proberen te ontsnappen.
  4. Herhaal voor het einde van dag 3 de sheltertest en de neusplooitest als een test van gewenting.
    1. Als beide tests bij hun eerste poging kunnen worden voltooid, is het gewentsproces voltooid. Blijf de muis 30 s tot een minuut zachtjes hanteren.
    2. Als de muis in eerste instantie bestand is tegen een van beide tests, herhaalt u stap 4.1-4.3 gedurende 20-30 s voordat u de neusplooi- en sheltertest opnieuw beopt.
    3. Als de muis na 3 minuten resistent blijft tegen deze tests, kan de derde dag worden herhaald.
  5. Mijlpalen: Voer ten minste 2 succesvolle sheltertests van elk 10 s uit en 2 succesvolle neuscorrectietests voor voltooiing van dag 3 en voltooiing van de volledige 3D-behandelingsprocedure.
  6. Breng de muis terug naar zijn kooi, maak het tafelblad en de handschoenen schoon.

5. Facultatieve aanpak voor dieren die moeten worden onderworpen aan beperkingen voor injectie of gavage

OPMERKING: Op dag 3, als het dier voor experimentele doeleinden wordt vastgehouden (orale gavage, intra-peritoneale injectie, enz.), kunnen de muizen worden onderworpen aan de nekknijptest.

  1. Pak de nek van de nek tussen duim en wijsvinger vast (figuur 1G).
  2. Til de muis 3-5 cm boven de hand gedurende 2-3 s.
    OPMERKING: Dit is normaal gesproken een niet-natuurlijke positie voor volwassen muizen, en als de muizen in de buurt van immobile blijven, zijn ze goed gewend aan hantering en zullen ze gemakkelijk te beperken zijn voor experimentele doeleinden.
  3. Plaats de muis terug in de platte hand, of als de muis reactief is op de nekknijper, overweeg dan om deze op de mouw, het kooideksel of het aanrecht van de experimenteerder te plaatsen
    OPMERKING: Als u in een bioveiligheidskast werkt, plaats de muis dan niet op de huls, anders kan deze omhoog lopen en de bioveiligheidskast verlaten. Plaats de muis het liefst op het aanrecht in de bioveiligheidskast.
  4. Laat de muis om de hand van de experimenteerder vrij te verkennen gedurende 1 minuut.

6. Optionele aanpak voor extra dagen behandeling

  1. Voeg in het begin van een sterk gestreste muislijn extra dagen toe om de reactiviteit en het stressniveau van de dieren te verminderen, met behulp van de methoden die worden beschreven in dag 2/3.
    OPMERKING: Veel factoren kunnen van invloed zijn op de stress bij aanvang van de dieren, waaronder stam, aanwezigheid van transgene modificatie, leeftijd, geslacht en huisvestingsomstandigheden. Indien deze factoren niet consistent zijn tussen groepen zoals oudere dieren die worden getest op jonge controles of transgene dieren die worden getest aan de hand van controles van het wilde type, wordt aanbevolen om voor elke groep hetzelfde aantal gewenisdagen te gebruiken.

7. Tunnelafhandeling

OPMERKING: Deze techniek is alleen van toepassing op muizen met tunnelhandhandel. Tunnels zijn polycarbonaat buizen van ongeveer 13 cm lang en 5 cm in diameter.

  1. Plaats de tunnel in de kooi van de muis.
  2. Laat de tunnel 7 dagen in de kooi staan voordat u de tunnel in gebruik heeft.
  3. Open de kooi en plaats het deksel aan de zijkant.
  4. Leid de muis voorzichtig in de polycarbonaattunnel (al in de kooi).
  5. Til de tunnel horizontaal uit de kooi. Bedek indien nodig de uiteinden van de tunnel losjes om te voorkomen dat het dier uit de tunnel springt/valt en mogelijk terugvalt in zijn kooi of op de grond.
  6. Verplaats het dier in de tunnel uit de buurt van de thuiskooi en houd het 30 s uit de buurt van oppervlakken.
  7. Plaats de tunnel terug in de thuiskooi, zodat de muis de buis kan verlaten.
  8. Wacht 60 s en herhaal stap 7.4-7.7 één keer.
  9. Spoel handschoenen grondig af met 70% ethanol of verwissel handschoenen voordat u de volgende muis gaat gebruiken.
  10. Herhaal deze procedure gedurende 10 opeenvolgende dagen.

8. Staartafhandeling

OPMERKING: Deze techniek is alleen van toepassing op muizen met staart. Het wordt gebruikt om muizen van hun kooi naar een apparaat over te brengen, en vice versa.

  1. Open de kooi en plaats het deksel aan de zijkant.
  2. Grijp de muizen bij de basis van de staart tussen duim en wijsvinger.
  3. Til de muis uit de kooi.
  4. Breng in 2-3 s de muis over naar de tegenoverliggende onderarm van de experimenteerder terwijl u grip op de staart behoudt om te voorkomen dat de muis bungelt.
  5. Wanneer bij de uitvoering van dit experiment staartbehandeling vereist is (bijv. voordat bloed wordt afgenomen voor cortisoltests), worden dieren door staartbehandeling naar de onderarm van de experimenteerder overgebracht en gedurende 15 s vastgehouden voordat ze in hun kooi worden teruggebracht.

9. Verhoogd Plus Doolhof

  1. Kameropstelling
    1. Plaats het doolhof in het midden van de kamer, onder een digitale camera uitgerust met een geheugenkaart.
    2. Stel het licht van de kamer in op ~ 60 Lux met behulp van 2 staande lampen die achter het doolhof zijn geplaatst.
    3. Schakel alle bovenlicht uit om direct licht op het doolhof te voorkomen dat reflectie creëert en de detectie van de dieren in het doolhof verstoort.
    4. Zodra alle apparatuur is ingesteld, brengt u de dieren naar de kamer en laat u ze gedurende 30 minuten wennen aan de lichtinstellingen en de nieuwe omgeving.
  2. Testing
    1. Reinig het doolhof met 70% ethanol om te voorkomen dat er geurtjes ontstaan door stof of door het dier dat eerder is getest.
    2. Start de camera.
    3. Gebruik een stuk papier met de dieren-ID om de ID op de video op te nemen, voordat u het dier in het doolhof plaatst (dit vergemakkelijkt de juiste identificatie van welke muis op elke video wordt gefilmd).
    4. Gebruik de juiste hanteringstechniek voor elk dier om het naar het doolhof over te brengen.
    5. Plaats de muis op het centrale platform, met uitzicht op een open arm.
    6. Laat de muis het apparaat 10 minuten ongestoord verkennen.
    7. Stop na 10 minuten de camera.
    8. Haal de muis uit het doolhof en stop hem terug in zijn kooi.
    9. Reinig uitwerpselen en urine uit het doolhof met 70% ethanol.
    10. Zodra het testen is voltooid met alle muizen, zet u video's over van de geheugenkaart naar een computer voor videotracking.
    11. Volg met behulp van geautomatiseerde software voor het volgen van dieren het aantal ingangen in de open en gesloten armen en de tijd die in open of gesloten armen wordt doorgebracht (hier Ethovision XT 14).

10. Experimenter Interaction (afgeleid van Hurst en West9)

  1. Kameropstelling
    1. Plaats een tafel in het midden van de testruimte onder een digitale camera die is uitgerust met een geheugenkaart.
    2. Zet het licht op 50-70 Lux met 4 lampen geplaatst in de hoek van de kamer met uitzicht op het plafond. Schakel bovengrondse verlichting uit om direct licht op het doolhof te voorkomen dat reflectie creëert en de detectie van de dieren in de arena verstoort.
    3. Breng de dieren naar de kamer.
    4. Laat ze 30 minuten wennen aan de kamer.
  2. Experiment
    1. Plaats de thuiskooi onder de digitale camera.
    2. Verwijder het deksel.
    3. Verwijder nestmateriaal en andere verrijking die het volgen van dieren kunnen verstoren.
    4. Start de camera.
    5. Gebruik de kooikaart met het dieren-ID om het dier op de video te identificeren.
    6. Plaats een hand in de huiskooi langs de muur van de kooi aan de rechterkant.
      1. Zorg ervoor dat de kop van de handler de camera niet blokkeert om de muis te filmen.
    7. Start een timer.
    8. Houd de hand 2 minuten onbeweeglijk en laat de muis de hand verkennen.
    9. Haal de hand 15 s uit de kooi.
    10. Probeer de muis op te pakken met gecupte handen en leg vast of de muis vlucht.
    11. Herhaal de laatste stap tot vijf keer, elke 5 seconden of totdat de muis zichzelf toestaat om te worden opgepikt.
    12. Noteer het aantal pogingen dat nodig is om de muis op te pakken.
    13. Breng nestmateriaal en verrijking terug naar de kooi.
    14. Reinig handschoenen met 70% ethanol of verwissel handschoenen voordat u doorgaat naar het volgende dier.
    15. Breng na het testen video's over van de geheugenkaart naar een computer.
    16. Verdeel de kooi met behulp van geautomatiseerde videotrackingsoftware in vier gelijke kwadranten en noteer de tijd die de muis in elk kwadrant doorbrengt (hier Ethovision XT 14).

11. Nieuwigheid Onderdrukte voeding

  1. Voedseltekort
    1. Voer 3 dagen voorafgaand aan de test een volledige kooiwissel uit en voer de dieren één huis uit (één behuizing heeft de voorkeur om de thuiskooitests uit te voeren).
      OPMERKING: Door vers beddengoed te verstrekken, verwijdert u mogelijk stof of kleine stukjes voedsel die zich sinds de laatste kooiwissel in het beddengoed ophopen.
    2. Weeg de dag voor het testen alle dieren rond 18.00 uur.
    3. Haal al het voedsel uit de voedseltrechter en zorg ervoor dat er geen stukjes voedsel in de kooi of in het beddengoed zitten.
  2. Kameropstelling
    1. Leg de NSF-kamer op een tafel.
    2. Vul de kamer met een dun laagje maïsbedden (of ander beddengoed dat verschilt van beddengoed dat wordt gebruikt in de thuiskooi van dieren).
    3. Zet het licht op 70 Lux met 4 lampen geplaatst in de hoek van de tafel waar de kamer staat, met uitzicht op het plafond. Schakel bovenlichten uit om de verlichting in de kamer laag te houden.
    4. Plaats een pellet standaard chow gebruikt in de faciliteit, aan de zijkant van de kamer tegenover de experimenteerder (≈10 cm van de muur).
  3. Testing
    1. Breng de dieren 's ochtends na voedseltekort 30 minuten voor het testen naar de kamer om ze te laten wennen aan de lichtinstellingen en de nieuwe omgeving.
    2. Weeg alle dieren om hun gewichtsverlies te meten op basis van het gewicht dat de vorige dag is gemeten. Dieren moeten 's nachts 8-12% verliezen om de taak goed te kunnen uitvoeren.
    3. Sorteer de dieren op gewichtsverlies en screen ze vanaf de muis die het meest verloor aan de muis die het minste gewicht verloor.
    4. Zorg ervoor dat de kamer is gevuld met beddengoed en met een enkele pellet.
    5. Plaats het dier aan de andere kant van de kamer, uit de buurt van de voedselkorrel.
    6. Start de timer onmiddellijk.
    7. Laat de muis de kamer maximaal 12 minuten verkennen.
    8. Meet de latentie om te naderen en te voeden (dier moet bijten en eten) op de voedselkorrel.
      1. Beschouw het als een aanpak wanneer het dier in de buurt van de pellet komt, het ruikt en niet bijt.
      2. Definieer een beet als wanneer het dier de pellet begint te consumeren.
    9. Registreer de latentie om de pellet binnen enkele seconden te benaderen en te voeden.
    10. Zodra de muis zich heeft gevoed met de voedselkorrel, verwijdert u de muis uit de kamer.
    11. Gooi het beddengoed weg, maar bewaar de pellet die zal worden gebruikt voor het testen van de eetlustaandrijving in de thuiskooi van de muis.
    12. Reset de kamer voor het volgende dier en ga verder met het volgende dier.
    13. 15 minuten na voltooiing van de test in de kamer, laat u de pellet die tijdens de test is gebruikt, in de thuiskooi van de muis tegen de muur aan de voorkant van de kooi vallen.
    14. Meet de latentie om zich te voeden met de pellet wanneer de pellet zich in de thuiskooi bevindt. Dit is een maatregel voor eetlustaandrijving.
      1. Het verdient de voorkeur om het nestmateriaal te verwijderen om ervoor te zorgen dat de muis ziet dat de pellet in zijn kooi wordt gedropt.

12. Serumverzameling en Corticosteronmeting

  1. Behandel dieren gedurende 1 min met behulp van de toegewezen techniek, 15 minuten voorafgaand aan de bloedafname (dit kan worden gedaan met groepshuisveste of enkele gehuisveste dieren, rekening houdend met het risico op gevechten bij het hergroeperen van muizen).
    1. Voor de muizen met de tunnel, leid ze naar de tunnel, til de tunnel 1 minuut uit de kooi en vervang de muis in de kooi.
    2. Voor muizen met staarthandhandel, pak de staartbasis van de muis en verwijder de muis uit zijn kooi. Breng de muis gedurende 1 minuut over naar de huls van de experimenteerder en breng de muis terug naar zijn kooi door middel van staartbehandeling.
    3. Gebruik voor muizen met 3D-handvat gecupte handen om de muis uit zijn kooi te verwijderen. Houd de muis 1 minuut in gecupte handen en breng hem terug naar zijn kooi.
  2. 15 min na behandeling, ga verder met bloedafname uit de submandibulaire ader22.
  3. Sla de muis stevig vast zodat het hoofd van de muis stevig geïmmobiliseerd is.
  4. Zoek de plaats van de punctie.
    1. Er is een klein haarloos kuiltje langs de onderkaak van het gezicht dat kan worden gebruikt als een oriëntatiepunt om de punctieplaats te lokaliseren. Het trekken van een lijn tussen de basis van de kaak en dit kuiltje de punctieplaats ligt achter dit kuiltje naar het oor met ongeveer 5 mm, net achter het scharnier van de kaak.
  5. Houd een schone naald van 23 G loodrecht op de punctieplaats en gebruik een snelle stevige lancingbeweging. De punt van de naald moet doordringen tot een diepte tussen 1-2 mm, bloed zal onmiddellijk stromen zodra de ader wordt doorboord.
  6. Verzamel ~150 μL bloed in EDTA gecoate opvangbuizen en bewaar op ijs.
  7. Oefen gedurende 5 s of meer lichte druk uit met een steriel gaasje op de punctieplaats om het bloed te laten stollen.
  8. Zodra het bloed is gestold, keert u de muis terug naar zijn thuiskooi.
  9. Centrifugeer bloed bij 4 °C 3.500 x g gedurende 10 min.
  10. Decanteer de supernatant.
  11. Bewaar het supernatant bij -20 °C voor downstream analyses.
  12. Meet de corticosteronspiegels met behulp van een corticosteron ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
  13. Gebruik een spectrofotometer om de ELISA-resultaten te lezen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Er werden twee afzonderlijke studies uitgevoerd met C57BL/6 muizen. Studie #1 omvatte 6 maanden oude mannen en studie #2 2,5 maanden oude vrouwtjes (N = 36 / studie) van Jackson Laboratories (Cat #000664) omvatte. Muizen arriveerden in de faciliteit op de leeftijd van 2 maanden. Terwijl studie #2 vrouwtjes twee weken na aankomst werden behandeld en getest, werden studie #1 mannetjes pas behandeld en getest op de leeftijd van 6 maanden (vertraging als gevolg van wereldwijde pandemie-shutdown). Gedurende deze tijd stierf een muis van Studie #2, voordat hij begon met het omgaan met experimenten. De studie #1 mannelijke muizen werden verzorgd door personeel van de dierenfaciliteit. Alle muizen werden onderhouden op een 12 uur durende licht / donker cyclus (7:00 ON, 19:00 OFF), kregen toegang tot voedsel en water ad libitum. Hun huiskooi was gevuld met gerecyclede kranten als strooiselmateriaal en nestmateriaal. Muizen werden individueel gehuisvest, om mogelijk agonistisch gedrag bij in groepen gehuisveste mannetjes te beperken tijdens de behandelingssessie of na procedures zoals bloedafname of gedragstests. Muizen werden gerandomiseerd in drie groepen: staartbehandeling, tunnelbehandeling en 3D-handling, en behandeld in de open ruimte volgens het ontwerp van hun respectieve groep (figuur 2). De tunnel-behandelde groep ontving de tunnel als verrijking gedurende 1 week voorafgaand aan de behandelingssessie. Ze werden vervolgens gedurende tien (10) opeenvolgende dagen behandeld, voorafgaand aan gedragstests. Een week na afloop van de verschillende handling sessies begon het gedragstesten. Op dag 16 werden muizen getest in de EPM en vervolgens in de experimenteerinteractietest. Twee dagen later werden muizen getest in het NSF. Ten slotte werd op dag 24 15 minuten na een behandelingssessie van één minuut van hetzelfde type als de eerste behandeling bloed afgenomen.

Voor gedragstests werden tunneldieren zoveel mogelijk van hun kooi naar het apparaat overgebracht met behulp van de tunnel. Voor het Elevated-Plus Maze-experiment maakten de afmetingen van het doolhof het echter moeilijk om dieren in het doolhof te verwijderen of te plaatsen met behulp van de tunnel. In dit geval werden dieren overgebracht van tunnels naar gecupte handen en naar het doolhof vervoerd. Muizen met 3D-behandeling werden gedurende de drie dagen behandeld, gelijktijdig met dag 8-10 van tunnelbehandeling (figuur 2). Staart behandelde muizen waren niet gewend aan hantering, maar werden staart behandeld tijdens interacties met experimenteerders. Tijdens het onderzoek werd kooiwissel uitgevoerd door de experimenteerder om ervoor te zorgen dat voor elke groep de juiste hanteringstechniek werd gebruikt.

In de interactietest voor experimenteerders werden dieren getest op hun bereidheid om vrijwillig met de experimenteerder te communiceren en het gebruiksgemak in een experimentele context (figuur 3). ANOVA uitgevoerd op het aantal pogingen om de muis uit de kooi te halen toonde een significant effect van de behandelingsbenadering in studie #1 mannetjes (F(2,31)= 6,36, p = 0,004) en in studie #2 vrouwtjes (F(2,33)= 12,21, p = 0,0001). Scheffe's post hoc analyses toonden aan dat het aantal pogingen om de muizen op te pikken significant werd verminderd met zowel 3D (p=0,0061 in Studie #1 mannetjes, als p=0,0002 in Studie #2 vrouwtjes) als tunnelbehandeling (p=0,04 in Studie #1 mannetjes, en p=0,003 in Studie #2 vrouwtjes), in vergelijking met de staart behandelde groep ( Figuur3A). ANOVA uitgevoerd op de tijd doorgebracht in hetzelfde kwadrant als de hand toonde een significant effect van de behandeling in studie #1 mannen (F(2,31)=5,38, p =0,009), en in studie #2 vrouwtjes (F(2,33)=3,5, p=0,04; Figuur 3B). Scheffe's post hoc analyses toonden aan dat studie #1 mannelijke muizen behandeld met de 3D-handling techniek aanzienlijk meer tijd doorbrachten in hetzelfde kwadrant dan de hand van de experimenteerder, vergeleken met muizen met staartbehandeling (p=0,012). Er waren geen significante verschillen tussen behandelingsgroepen in Studie #2, 2.5 maand-oude wijfjes. De mate van interactie met de experimenteerder wordt verder aangetoond door de gecombineerde warmtekaarten van de middelpunten van de muizen(figuur 3C-E). Deze illustreren hoe de 3D-behandelde mannelijke muizen uit Studie #1 meer tijd proximaal aan de hand besteedden, inclusief gebieden in de buurt van de hand, terwijl muizen met staarthandhandel de minste algehele interactie met de hand hadden.

De effecten van de 3D- en tunnelbehandeling werden vergeleken met staartbehandeling in twee tests van angstachtig gedrag, de nieuwigheid onderdrukte voeding (NSF) test en de verhoogde plus doolhof (EPM). In de NSF-test toonde ANOVA op de latentie om te benaderen een effect van de hanteringstechniek die werd gebruikt in studie #1 mannen (F(2,31)= 3,5, p = 0,04). Scheffe's post-hocanalyses in studie #1 mannetjes vertoonden trends van muizen met 3D-behandeling (p=0,08) en van de muizen met tunnelhandhandel (p=0,08), met verminderde latentie om te naderen in vergelijking met muizen met staarthandel (figuur 4A). Er werden geen effecten waargenomen in studie #2. ANOVA uitgevoerd op de latentie om te naderen in de thuiskooi van de muis (gegevens niet getoond) toonde geen effect van de behandeling (p = 0,88 in studie #1 mannen en p = 0,16 in studie #2 vrouwtjes). ANOVA uitgevoerd op de procentuele tijd in de open armen in de EPM toonde een significant effect van de behandeling in studie #2 vrouwen (F(2,33)=3,5, p =0,04). Er werden geen effecten waargenomen in studie #1 mannen (F(2,31)=2,1, p=0,1; Figuur 4B). Scheffe's post hoc analyses toonden alleen een trend aan naar meer tijd doorgebracht in de open armen in tunnel behandelde muizen uit Studie #2, vergeleken met staart behandelde muizen (p=0,07). Wat betreft de procentuele vermeldingen in de open armen (figuur 4C), toonde ANOVA geen effect van behandeling, noch in studie #1 mannen, noch in studie #2 vrouwen (F(2,31)= 1,12, p = 0,33; en F(2,33)= 1,3, p = 0,26, respectievelijk). Gedragsscores werden samengevat in een z-score, zoals in Guilloux et al.23, informerend over mogelijke vermindering van angstachtig gedrag in vergelijking met muizen met staarthandel (Figuur 4D). ANOVA op de z-scores toonde een significant effect van de behandeling in studie #1 mannen (F(2,31)=5,6, p=0,008) maar niet in studie #2 vrouwtjes (F(2,33)=1,07, p=0,35). Scheffe's post hoc analyses toonden aan dat 3D-handling en tunnel handling de z-score (respectievelijk p=0,04 en 0,01) significant verlaagden in vergelijking met staartbehandeling, wat suggereert dat beide benaderingen angstachtig gedrag verminderen in Studie #1 mannen.

Corticosteronspiegels na behandeling werden ook beoordeeld 15 minuten na een korte behandelingssessie (figuur 5). ANOVA vond een significant effect van de behandeling in studie #2 vrouwen (F(2,33)=4,44, p=0,01), maar niet in studie #1 mannen (F(1,31)=0,53, p=0,59). In studie #2 vrouwtjes toonden post-hocanalyses een significante daling van het corticosterongehalte bij muizen uit de 3D-handlinggroep aan in vergelijking met de staartbehandelingsgroep (p=0,02).

Om te bepalen of de behandelingstechnieken een significante invloed hadden op de variabiliteit van de verkregen gegevens, pasten we Bartlett's test van homogeniteit van variantie toe. Onze resultaten vonden geen significant verschil in variabiliteit in de studie #2 vrouwelijke muizen in verschillende metingen (% tijd EPM B(2,33)=4,95, p=0,087; % vermeldingen EPM B(2, 33)=3,68, p=0,16; NSF B(2, 33)=0,20, p=0,91; CORT B(2, 33)=1,69, p=0,42). In studie #1 mannelijke muizen was er echter een significante heterogeniteit van variantie in de NSF-test (B(2,31)=8,08, p=0,0175) en in gemeten CORT-niveaus (B(2,32)=11,63, p=0,0029), maar niet in een van de maatregelen voor EPM (% tijd EPM B(2,32)=1,16, p=0,56; % vermeldingen EPM B(2,32)=2,79, p=2,79. Het gebruik van de F-test om twee afwijkingen te vergelijken toonde aan dat in de NSF-test de variantie voor studie #1 mannen significant werd verminderd door zowel de 3D (F(1,21)=4,22, p=0,04) als tunnelbehandelingstechnieken (F(1,22)=4,01;p=0,03) in vergelijking met staartafhandeling. Voor de concentratie CORT na behandeling verminderde alleen 3D-handling significant de variabiliteit (F(1,20)=9,65, p=0,0019) in vergelijking met staartbehandeling.

Figure 1
Figuur 1. Representatieve beelden van de 3D-Handling Procedure.  De afbeeldingen illustreren de 3D-verwerkingsprocedure. A) Hand in kooi: De hand van de experimenteerder wordt in de kooi geplaatst en stilgehouden, waardoor de muis kan gewenten aan de aanwezigheid van de hand in de kooi. B) Platte hand: bij de eerste verwijdering uit de kooi wordt de muis op de platte palm van de hand geplaatst. De muis kan vrij rondlopen rond de handpalm en bewegen tussen aangrenzende platte handen. C) Rol: Ontspan de palm van de hand om een losse "beker" rond de muis te vormen. Kantel de beker voorzichtig in de tegenovergestelde hand, de muis moet vrij naar deze hand bewegen, zo niet voorzichtig naar de andere hand leiden. D) Schuilplaats: plaats de muis aan de rand van de hand en breng vervolgens beide handen samen en vorm heel langzaam een kopje rond de muis. De muis mag niet worden vastgehouden en er moet een opening worden achtergelaten zodat de muis kan ontsnappen. Houd ~5-10 s vast en open dan voor platte handen. E) Hoofd/rug aaien: Terwijl de muis de platte palm van de hand verkent, aait u de muis voorzichtig op het hoofd en de rug. Dit gewent de muis aan de benadering van de experimenteerder van bovenaf. F) Nose Poke: Wanneer de muis gewend lijkt te zijn aan het hanteren, probeer dan de muis voorzichtig direct op de snuit aan te raken. Als de muis zijn hoofd niet weg beweegt, is hij goed gewend aan het hanteren. G) Het is mogelijk om op de laatste dag een korte (2-3 s) nekknuif uit te voeren, om de gewennis van de dieren te meten in het geval van toekomstige interventies die twist vereisen. Wanneer ze gewend zijn aan hantering, blijven muizen onbeweeglijk tijdens het nekknijpen, terwijl niet-gewennende muizen zullen proberen te ontsnappen door hun staart te draaien om bevrijd te worden van de stelling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Experimenteel ontwerp.  Na aankomst in de faciliteit kregen muizen met staarthandhandel geen gewenis. Muizen met tunnelbehandeling werden een week voor het begin van de behandeling gewend aan de tunnels in hun thuiskooi. Tunnel behandelde muizen werden gedurende 10 dagen behandeld met de tunnelbehandelingstechniek (eerste dag van behandeling = dag 1), terwijl 3D-behandelde muizen gedurende drie dagen werden gewennerijd (dag 8-10). Muizen werden vervolgens onderworpen aan het verhoogde plusdoolhof (EPM) (dag 16), experimenteerinteractietest (dag 19), nieuwigheid onderdrukte voeding (dag 21) en een korte behandelingssessie gevolgd door serumverzameling voor CORT-meting (dag 24). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Impact van de drie handling technieken op het gebruiksgemak en de bereidheid om te communiceren met experimenteerder. A) Gemiddeld aantal ophaalpogingen dat nodig is om een muis uit de kooi te verwijderen. Studie #1 Male (linkerpaneel, Tail Handling N= 12, Tunnel Handling N=12 en 3D handling N=11) en Study #2 vrouwelijke (rechterpaneel, N=12 per groep) muizen uit zowel tunnel- als 3D-behandelde groepen vertoonden een significante vermindering van het aantal pogingen dat nodig was om ze uit de kooi te verwijderen in vergelijking met muizen met staartbehandeling. B) Gemiddelde hoeveelheid tijd die een dier doorbrengt in hetzelfde kwadrant van de kooi als de hand van de experimenteerder. Studie #1 mannelijke muizen behandeld met de 3D-techniek toonde een aanzienlijke toename van de tijd doorgebracht in hetzelfde kwadrant als de hand van de experimenteerder. C-E) Gemiddelde heat-maps van muis center-point door tijd weergegeven in Ethovision XT 14, visueel aangetoond de toegenomen exploratie en interactie met experimenteerder van de Studie #1 3D-behandelde mannelijke muizen. Foutbalken geven SEM aan. *p<0,05, **p<0,01 in vergelijking met tail handled group. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 

Figure 4
Figuur 4. Impact van de drie behandelingstechnieken op angstachtig gedrag. A) Latentie om de pellet te benaderen en te voeden in de nieuwigheid onderdrukte voedingskamer in studie #1 mannelijke muizen (Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 en 3D handling N = 11) en in studie #2 vrouwelijke muizen (N = 12 / groep). Gegevens uit de studie #1 mannelijke muizen in de 3D-handling- en tunnelbehandelingsgroepen een trend lieten zien naar een significante vermindering van de latentie om de pellet te benaderen. B) Middelen van % van de tijd doorgebracht in de open armen van de verhoogde plus doolhof. Er waren geen significante verschillen tussen groepen in Studie #1 mannetjes, en een tendens naar meer tijd in open wapens door Studie #2 wijfjes in de tunnel-behandelingsgroep. C) Vermeldingen in de open armen: Er waren geen significante verschillen tussen groepen in studie #1 mannen, noch in studie #2 vrouwen. D) Z-score die het angstachtige gedrag samenvat. Met behulp van de gegevens in A, B en C werd een z-score berekend met behulp van de met staart behandelde muizen als referentie. Afname van de z-score suggereert een afname van angstachtig gedrag gemeten door de NSF- en EPM-tests. Studie #1 mannelijke muizen behandeld met behulp van de 3D- of tunneltechniek toonde een verminderd angstachtig fenotype in vergelijking met muizen met staart. Foutbalken geven SEM. *p<0,05 vergelijking met tail-handled group aan. t geeft een trending significantieniveau weer (p<0,1) in vergelijking met de staartgroep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 

Figure 5
Figuur 5. Niveaus van corticosteron na behandeling.  Serum werd 15 minuten na een korte behandelingssessie verzameld en vervolgens werden cort-niveaus gemeten door ELISA in zowel studie #1 man (Tail Handling N = 12, Tunnel Handling N = 12 en 3D handling N = 11) als in studie #2 vrouwelijke muizen (N = 12 / groep). Onderzoek #2 vrouwelijke muizen die via de 3D-handlingtechniek werden behandeld, toonde verminderde corticosteronniveaus in vergelijking met muizen die door de staart werden behandeld. ANOVA in studie #1 mannelijke muizen geen significantie bereikten voor verschillen tussen groepen (p=0,5). Foutbalken geven SEM. *p<0,05 aan in vergelijking met tail handled group. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Table 1
Tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze studie en methodeontwikkeling zijn gebaseerd op de observatie dat behandelingstechnieken bij muizen nog steeds over het hoofd worden gezien door de wetenschappelijke gemeenschap, en dat sommige laboratoria nog steeds terughoudend zijn om gewennijt- of hanteringstechnieken te implementeren om stress en reactiviteit van hun dieren voorafgaand aan experimenten te verminderen. Hoewel het een tijdsbesteding vertegenwoordigt, biedt de behandeling van dieren gunstige effecten voor de dieren die kunnen bijdragen aan het succes van de uit te voeren experimenten en voorkomt dat experimenten meerdere keren moeten worden uitgevoerd als gevolg van gegevensvariabiliteit of overreactiviteit van dieren. Het gebruik van de 3D-handling techniek verminderde ontsnappingspogingen bij muizen. Het verhoogde ook de interactie met de experimenteerder en verminderde angstachtige fenotypes bij onze 6 maanden oude mannelijke muizen. Verder verminderde 3D-behandeling de gegevensvariabiliteit en verlaagde het corticosterongehalte bij 2,5 maand oude vrouwelijke muizen na slechts 3 eerste dagen behandeling. Deze aanpak is gebaseerd op zachte manipulaties om de muis te laten bewonen aan de behandeling door de experimenteerder, wat een soepeler transport en gemakkelijker ingrijpen vergemakkelijkt.

Iets dat de moeite waard is om te benadrukken van de 3D-handling-techniek is dat de progressie van behandelingsmethoden optreedt als reactie op de reactiviteit van de muis, afhankelijk van het bereiken van de hierboven beschreven mijlpalen en in tabel 1. Dieren moeten de reactiviteit tot één verwerkingsstap hebben teruggebracht voordat ze doorgaan naar de volgende stappen. Een poging om te snel door te gaan naar de "shelter" of "nose-poke" stappen op dieren die niet voldoende gewennschapen zijn, zou waarschijnlijk leiden tot verhoogde stress en mogelijk de effectiviteit van de procedure verminderen. Evenzo moet de reactiviteit van het dier op elke dag van behandeling worden gecontroleerd en moet worden overwogen bij de beslissing of extra verwerkingsdagen vereist zijn. Als dieren op de eerste dag niet goed reageren op de asieltest en niet voldoen aan de criteria om de eerste mijlpaal te bereiken, kan de eerste dag van behandeling worden herhaald tot de mijlpaal is voltooid. Evenzo, als dieren niet reageren op de neusplooitest op de tweede dag, kan de tweede dag ook worden herhaald. Een ander voorbehoud om op te merken met deze aanpak is dat het risico dat muizen wegspringen groter is op de eerste dag van behandeling, met name bij springerige stammen zoals C57BL6. Het volgen van de hierboven beschreven richtlijnen moet het risico op springen verminderen en manieren bieden om dergelijk gedrag te beperken. De duur van de behandeling en progressie door de stappen kan variëren afhankelijk van de stammen, vooral als het werken met transgene modellen waarvan bekend is dat ze angstige fenotypes vertonen.

Verschillende factoren kunnen bijdragen aan het verminderen van de effectiviteit van de gepresenteerde 3D-handling techniek. Een dergelijke factor is de potentiële angst of aarzeling van de experimenteerder, in het geval dat de experimenteerder niet bekend is met muizenbehandeling of bang is voor muizen. Daarom is het effect op de handler ook iets om te overwegen. De geleidelijke toename van het niveau van interactie met de muizen stelt beginnende experimenteerders echter in staat om vertrouwen en grotere vaardigheden te ontwikkelen bij het uitvoeren van de handlingtechniek terwijl ze de behandelingsstappen doorlopen. De voorgestelde stappen/mijlpalen (de shelter- en nose poke-tests) kunnen helpen potentiële menselijke variabiliteit bij beginnende handlers tegen te gaan, zodat dieren vergelijkbare gewentingsniveaus bereiken. Er is gemeld dat het bevorderen van positieve mens-dier interacties met dieren had geleid tot een hogere kwaliteit van leven en compassietevredenheid bij het personeel van de dierenverzorging24. Als zodanig biedt de gentling van behandeling voordelen voor zowel de handler als het dier tijdens een algemene interactie of interventie.

Met zijn impact op het verminderen van het aantal pogingen om de muis op te pikken, bij zowel 6 maanden oude mannetjes als 2,5 maanden oude vrouwtjes, biedt de 3D-handling een alternatief voor tunnelbehandeling of andere technieken, waardoor de overdracht van dieren van hun kooi naar experimentele apparaten gemakkelijker wordt vergemakkelijkt. De 3D-handling techniek verhoogde ook de interactie van 6 maanden oude mannelijke muizen met de experimenteerder. Dit werd niet waargenomen bij 2,5 maand oude vrouwelijke muizen, maar vrouwelijke muizen bleven gemakkelijker op te pikken, in vergelijking met muizen met staart. Dit suggereert dat de 3D-handlingtechniek mogelijk geschikter is voor experimenten die directe interacties tussen het dier en de experimenteerder vereisen, zoals het Morris-waterdoolhof (ondanks mogelijke factoren die het geslacht/ de leeftijd verstoren die later worden besproken). Anderen hebben handmatige hanteringstechnieken ontwikkeld en gebruikt, bestaande uit het oppakken van de dieren met gecupte handen, zonder extra manipulatie10. Hoewel deze technieken gunstige effecten vertoonden , presenteren gegevens in de literatuur vaak behandelingsprotocollen met gewen gewentijde periodes van meer dan 10 dagen9,16. Bovendien is cupped-handling zonder de verfijnde interactie van 3D-handling mogelijk niet geschikt voor springerige soorten die uit en uit de handen blijven springen. Hoewel we in deze studie geen directe vergelijking hebben gemaakt met de cupmethode, pakt de 3D-handling dit aan en vertrouwt het op verfijnde bewegingen om de interactie tussen de muis en de handler te bevorderen. De studie van Ghosal et al.16 gebruikte een cup-handling techniek gecombineerd met massage gedurende 5 dagen, en toonde aan dat deze techniek de impact van stress op metabole eindpunten beperkt, wat de noodzaak benadrukt van verfijnde bewegingen en interactie tijdens het hanteren voor een betere werkzaamheid. Op basis van deze cup-massage techniek maakt de 3D-handling gebruik van extra interactie om muizen te habitueren. Met behulp van de 3D-handling-aanpak zorgen handlers ervoor dat alle muizen een vergelijkbaar gewendheidsniveau bereiken door gestandaardiseerde bewegingen uit te voeren en door de duur van de procedure aan elk dier aan te passen aan de behoefte ervan (in de huidige studie hebben alle muizen de mijlpalen gehaald en het 3D-handlingprotocol in 3 dagen voltooid). Deze aanpak kan worden beschouwd als "gepersonaliseerd" voor elke muis, zodat alle dieren het gewenste gewend worden op elke dag van behandeling. Zoals eerder vermeld, kan deze techniek worden aangepast door het aantal dagen te verhogen als dieren de mijlpalen die in het protocol zijn beschreven niet bereiken. Deze techniek toonde gunstige effecten voor het verminderen van variabiliteit tussen dieren in gedragsstudies en fysiologische meting (CORT-niveaus), wat suggereert dat deze aanpak kan bijdragen aan de vermindering van de variabiliteit binnen de studie en de impact van experimentele fouten kan verminderen die mogelijk bevooroordeelde resultaten in preklinische studies stimuleren.

Ondersteunende resultaten suggereerden dat muizen die werden onderworpen aan 3D- en tunnelbehandeling minder angst vertoonden in de nieuwigheid onderdrukte voedingstest, in vergelijking met muizen met staartbehandeling. Gezien de gecombineerde gegevens van het NSF en de EPM, toonden beide benaderingen significante effecten op het verminderen van angst bij 6 maanden oude mannelijke muizen. Dit repliceert de bevindingen dat dieren die gewend waren aan tunnelbehandeling betere prestaties hadden in tests voor angst9,15 na meer dan 10 dagen hanteren, en toont verder het potentieel aan van de 3D-behandeling om vergelijkbare effecten te vertonen. Dit toonde ook aan dat 3D-behandelde 6 maanden oude mannelijke muizen naderen en vrijwillig meer interactie hebben met hun experimenteerder dan 6 maanden oude mannelijke muizen die worden onderworpen aan tunnel- en staartbehandeling. Belangrijk is dat 2,5 maanden oude vrouwelijke muizen die aan 3D-behandeling werden onderworpen, een verlaagd CORT-gehalte hadden, wat in overeenstemming is met eerder gepubliceerde resultaten9. De twee studies (Studie #1 bij 6 maanden oude mannen en Studie #2 bij 2,5 maand oude vrouwen) bevestigden, op twee verschillende manieren dat de behandeling gunstige invloed heeft op angstachtige fenotypes (hetzij op gedragsresultaten in studie #1, of op CORT-niveaus in studie #2).

Een mogelijke factor die bijdraagt aan het effect is het geslacht van de experimenteerder, in dit geval mannelijk. Het is aangetoond door Sorge et al.25 dat de aanwezigheid van mannelijke experimenteerders kan leiden tot een toename van CORT en angst zoals gedrag bij mannelijke maar niet vrouwelijke muizen. Dit in tegenstelling tot de resultaten van deze studie. Het grote verschil tussen deze studie en de studie van Sorge et al.25 is dat de hier beschreven benadering bestaat uit het gewennen van de muizen aan het hanteren, door positieve (niet-versterkte) interactie met de experimenteerder te bevorderen, terwijl Sorge et al.25 naïeve knaagdieren gebruikten die nooit interactie hadden met mensen. Men kan verwachten dat naïeve muizen een sterke reactie kunnen hebben tegen menselijke experimenteerders als ze niet leren dat de experimenteerder geen bedreiging vormt. De huidige studie werd echter alleen uitgevoerd met een mannelijke experimenteerder en toekomstige studies zouden moeten onderzoeken of dergelijke effecten reproduceerbaar zijn met een vrouwelijke experimenteerder. Hoewel het isoleren van deze factoren buiten het toepassingsgebied van dit document valt, is het de moeite waard om het belang te benadrukken van het identificeren van dergelijke bronnen van variabiliteit bij het implementeren van handling gewenis, of in experimenteel ontwerp in het algemeen.

De huidige studie bevestigde ook de werkzaamheid van de tunnelbehandelingstechniek bij het verminderen van angstachtig gedrag en CORT-niveaus bij muizen9,10,11. Een bijkomend voordeel van deze aanpak is dat de tunnel als verrijking26in de kooi kan worden achtergelaten , wat ook kan bijdragen tot een verminderde stress /angstreactie , wat in totaal kan bijdragen tot een beter welzijn10,11. In dit geval is de rol van de experimenteerder om de tunnel slechts één minuut te manipuleren, met elk dier. Zoals beschreven door Gouveia et al19, hoeft de tunnel echter niet noodzakelijkerwijs in de thuiskooi te blijven en kan in plaats daarvan alleen aan de dieren worden gepresenteerd wanneer het nodig is om het dier over te brengen, zonder extra stress te veroorzaken. Beide benaderingen, de tunnel- en 3D-handlingtechnieken, bieden voordelen die door het lab en de experimenteerders moeten worden beoordeeld om te bepalen welke aanpak het meest geschikt is voor hun behoeften. In de huidige studie werd de tunnel in de kooi achtergelaten en de effecten die we waarnamen op angstachtig gedrag kunnen te wijten zijn aan een combinatie van tunnelbehandeling en verrijking.

Hoewel beide gunstige effecten bieden, zijn de 3D- en tunnelbehandelingstechnieken niet zonder beperkingen. Een gedeelde beperking is dat het tijdrovend en mogelijk ontmoedigend kan zijn voor dierenfaciliteiten om dergelijke procedures toe te passen. De toegevoegde voordelen zijn echter van onschatbare waarde, het verbeteren van het dierenwelzijn door stress te verminderen en de interactie met experimenteerders en dierenverzorgers te verbeteren (zoals beschreven in Spangenberg en Kelling27),en onderzoeksbetrouwbaarheid en reproduceerbaarheid. Bewijs van onze faciliteit suggereert dat deze techniek de interacties tussen dieren en veeteeltpersoneel verbetert, waardoor kooiverandering en gezondheidsmonitoring worden vergemakkelijkt. Van andere gebruikers in onze faciliteit worden twist en algehele manipulatie gerapporteerd als aanzienlijk gemakkelijker met behandelde muizen, in overeenstemming met onze bevindingen dat muizen die met de 3D-techniek worden behandeld, minder kans hebben om te vluchten wanneer ze worden opgehaald en in ons voorbeeld zijn 6 maanden oude mannetjes meer geneigd om te communiceren met hun experimenteerder. Vervolgstudies zouden dergelijke effecten kunnen kwantificeren om het nut van de techniek verder aan te tonen. Al met al draagt deze 3D-handling-aanpak, evenals de tunnelbenadering, bij aan de regel van de 3R's, met name door routinematige dierinteracties te verfijnen om de stress als reactie op de hantering te minimaliseren. Gezien de waargenomen vermindering van de variabiliteit van de gegevens, kan dit ook het aantal dieren verminderen dat nodig is om consistente resultaten te verkrijgen en de aanpak verfijnen die wordt gebruikt om de variabiliteit te beperken.

Een ander discussiepunt op basis van de gepresenteerde gegevens is dat deze studie is uitgevoerd met dieren die eengezinswoningen hebben. Enkelvoudige huisvesting had de voorkeur omdat het het potentiële agonistische gedrag beperkt (met name bij mannelijke muizen), dat kan bijdragen aan inter-individuele variabiliteit28,29. Voor consistentie tussen groepen waren alle dieren alleen gehuisvest. Het is ook interessant op te merken dat positieve interacties tussen experimenteerders en dieren bij ratten in de vorm van kietelende ratten in staat waren om enkele effecten van sociaal isolement bij enkele gehuisveste ratten30,31te verzachten . Het is mogelijk dat hanteringstechnieken waarbij direct contact tussen dier en experimenteerder betrokken is, zoals de 3D-handlingtechniek of de cupmassagetechniek beschreven door Ghosal et al.11, een vergelijkbaar effect kunnen hebben. Toekomstige studies zouden deze vraag kunnen onderzoeken door de effecten van behandelingstechnieken bij individuele en groepshuisveste dieren te vergelijken. Eerdere studies onderzochten de impact van cup- en tunnelbehandelingsbenaderingen met muizen in een groepshuisvesting en behaalden vergelijkbare resultaten7,8. Dit bevestigt dat het mogelijk is om de hier beschreven behandelingsprotocollen te gebruiken met dieren die in eenpersoons- of groepshuisomstandigheden worden gehouden, rekening houdend met de mogelijkheid van agonistisch gedrag bij het uit de kooi halen van een dier en het terug plaatsen ervan (met name bij mannelijke muizen of in agressieve muislijnen). In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om een tijdelijke kooi te gebruiken voordat alle dieren worden gegroepeerd.

Tot slot draagt de voorgestelde 3D-handling aanpak bij aan het verminderen van reactiviteit en stress bij muizen. Het verhoogt ook de betrouwbaarheid van gegevens door de variabiliteit na 3 dagen verwerking te verminderen. Vergelijkbare resultaten zijn waarneembaar met de tunnelafhandeling, in ons geval na 10 dagen tunnelafhandeling. In vergelijking met de tunnelbehandelingstechniek bood de 3D-handlingtechniek het voordeel van toenemende interactie met een experimenteerder bij onze 6 maanden oude mannelijke muizen, die in sommige gevallen kritiek kunnen zijn. Als de 3D- of tunnelbehandelingstechniek in alle dierenfaciliteiten zou worden toegepast, zou dat een grote verbetering betekenen voor de gegevensgeneratie en zou het in hoge mate bijdragen aan de vermindering van het gebruik van dieren in onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs danken de Animal Care Committee van CAMH voor hun steun aan dit werk, evenals de dierenverzorgers van CAMH die uitgebreide feedback gaven over het nut van de procedure, het motiveren van de uitvoering van de beschreven experimenten en het indienen van het gedetailleerde protocol voor andere gebruikers. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door CAMH BreakThrough Challenge, toegekend aan TP, en door interne fondsen van CAMH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide general use sterile hypodermic needle. Regular wall type and regular bevel. BD 2546-CABD305145 Needles for Blood collection
BD Vacutainer® Venous Blood Collection EDTA Tubes with Lavender BD Hemogard™ closure, 2.0ml (13x75mm), 100/pk BD 367841 EDTA Coated tubes for blood collection
Bed’o cobs ¼” Corn cob laboratory animal bedding Bed-O-Cobs BEDO1/4 Novel bedding for novelty suppressed feeding
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5424 R For centrifugation of blood.
Corticosterone ELISA Kit Arbor Assays K003-H1W
Digital Camera Panasonic HC-V770 Camera to record EPM/Experimenter interactions
Elevated Plus Maze Home Made n/a Custom Maze made of four black Plexiglas arms (two open arms (29cm long by 7 cm wide) and two enclosed arms (29 cm long x7 cm wide with 16 cm tall walls)) that form a cross shape with the two open arms opposite to each other held 55 cm above the floor
Ethanol Medstore House Brand 39753-P016-EA95 Dilute to 70% with Distilled water, for cleaning
Ethovision XT 15 Noldus n/a Automated animal tracking software
Laboratory Rodent Diet LabDiet Rodent Diet 5001 Standard Rodent diet
Memory Card Kingstone Technology SDA3/64GB For video recording and file transfer
Novelty Suppressed Feeding Chamber Home Made n/a Custom test plexiglass test chamber with clear floors and walls 62cm long, by 31cm wide by 40cm tall .
Parlycarbonate tubes Home Made n/a 13 cm in length and 5cm in diameter
Purina Yesterday’s news recycled newspaper bedding Purina n/a Standard Bedding
Spectrophotometer Biotek Epoch Microplate Reader

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936 (2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26 (2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751 (2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305 (2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999 (2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075 (2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281 (2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718 (2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401 (2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454 (2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410 (2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649 (2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Tags

Gedrag Probleem 175
Behandelingstechnieken om stress bij muizen te verminderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga,… More

Marcotte, M., Bernardo, A., Linga, N., Pérez-Romero, C. A., Guillou, J. L., Sibille, E., Prevot, T. D. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J. Vis. Exp. (175), e62593, doi:10.3791/62593 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter