Summary
نحن نقدم بروتوكولا لتقييم السلوك الحركي عن طريق بطارية اختبار سلوكية في الفئران بعد إصابة سحق العصب الوركي.
Abstract
تحريض إصابة العصب المحيطي هو طريقة تستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب لتقييم آليات الإصلاح والألم من بين أمور أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، في مجال أبحاث اضطرابات الحركة ، تم استخدام إصابة سحق الوركي لإثارة النمط الظاهري الشبيه بخلل التوتر في نماذج القوارض DYT-TOR1A المهيأة وراثيا من خلل التوتر. لتحقيق نتائج متسقة وقابلة للاستنساخ وقابلة للمقارنة بعد إصابة سحق العصب الوركي ، من الضروري استخدام طريقة موحدة لتحفيز سحق العصب ، بالإضافة إلى توصيف شكلي موحد. يجب إيلاء الاهتمام ليس فقط لل تشكيلة محددة من الاختبارات السلوكية، ولكن أيضا إلى المتطلبات التقنية والتنفيذ الصحيح وتحليل البيانات المتتالية. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إجراء إصابة سحق العصب الوركي ويوفر بطارية اختبار سلوكية لتقييم العجز الحركي في الفئران التي تشمل اختبار الحقل المفتوح ، وتحليل مشية CatWalk XT ، ومهمة المشي شعاع ، ومهمة المشي درجة السلم.
Introduction
القوارض هي كائنات نموذجية ممتازة لتعميق فهم الأمراض البشرية1،2 عن طريق اختبار الفرضيات على مستويات بيولوجية متعددة. أحد المستويات البيولوجية الأساسية لتوصيف نماذج القوارض هو مستوى النمط الظاهري ، الذي تقاس به التقييمات السلوكية. اعتمادا على نموذج الحيوان ومسألة البحث العلمي ، واختيار بطارية اختبار سلوكية قوية وموثوق بها أمر ضروري لتغطية مجموعة واسعة من الجوانب السلوكية مثل النماذج الحيوانية لمرض باركنسون وخلل التوتر3،4،5،6.
العصب الوركي هو أكبر عصب في جسم الإنسان مع الألياف الحركية وكذلك الحسية. إصابات العصب الوركي يمكن أن تنتج بسهولة من مجموعة متنوعة من الأحداث مثل حوادث المرور والعمليات الجراحية7،8. لذلك ، فإن الأنشطة البحثية باستخدام نماذج القوارض مع إصابات العصب الوركي ، ذات قيمة ذات صلة ترجمة. على الرغم من أن الجانب الترجمي لتجديد العصب من الفئران إلى الإنسان يجب أن ينظر إليه بشكل نقدي9، فإن إصابة سحق العصب الوركي (axonotmesis) في نماذج القوارض هي طريقة شائعة الاستخدام لتحليل عمليات الانحطاط والتجديد للأعصاب الطرفية10،11. في حالة إصابة سحق العصب لا يتم تحويلها تماما. فإنه يضر المحور، مما أدى إلى كتلة التوصيل مباشرة بعد سحق الإصابة تليها العمليات التجديدية 4،12،13.
وعلاوة على ذلك، في البحوث خلل التوتر، وإصابات سحق العصب الوركي من جانب واحد هو وسيلة راسخة لتحريك حركات تشبه خلل التوتر (DLM) في نماذج القوارض خلل التوتر الوراثي، والتي لا تظهر DLM في حد ذاتها4،14. ومن المفترض أن الصدمة العصبية الطرفية يزعج التكامل الحسي الحركي عن طريق التأثير على الألياف العصبية الوركية، والتي هي المسؤولة عن الوظائف الحركية والحسية15.
نحن هنا نقدم وصفا مفصلا لإصابة سحق موحدة للعصب الوركي وبطارية من تقييمات السلوك الحركي التي تتكون من اختبار المجال المفتوح (OFT) ، وتحليل مشية CatWalk XT ، ومهمة المشي شعاع وسلم درجة المشي المهمة في نوع البرية السذاجة (wt) الفئران (ن = 8-9) والجرذان wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب الوركي من جانب واحد (ن = 10). يوفر مكتب مراقبة الطبيعة معلومات حول النشاط الحركي العام، في حين يتم تحقيق تحليل مشية مفصل من خلال نظام تحليل المشي الآلي CatWalk XT. يتم استخدام مهمة المشي شعاع لتقييم التنسيق الحركي من خلال تقييم الوقت لعبور شعاع وعدد من الأخطاء موضع القدم. لتحليل أداء مشية سلم درجة المشي المهمة يعطي معلومات حول وضع القدم أو مخلب والأخطاء على جهاز درجة سلم أفقي مع نمط درجة ثابتة ولكن غير النظامية.
Protocol
وقد وافقت السلطات المحلية في ريجيرونغ فون أونترفرانكن (فورتسبورغ، ألمانيا) على جميع التجارب على الحيوانات، وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية والوطنية و/أو المؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. إصابة سحق العصب الوركي
ملاحظة: الحفاظ على بيئة معقمة أثناء العملية الجراحية بأكملها. إعداد طاولة الجراحة مع المعدات اللازمة.
- تخدير عميق الجرذ في خزانة مغلقة مع isoflurane 3.0٪ في O2 (2 L/min). أزل الجرذ من الخزانة حلق منطقة واسعة من الأطراف الخلفية اليمنى.
- وضع الفئران في قناع التخدير ومواصلة التخدير العميق مع isoflurane 2.0٪ في O2 (2 L/min). السيطرة على عمق التخدير عن طريق قرص البكاء بين الديجيتال من القدمين الخلفيتين. غياب ردود الفعل الانسحاب يشير إلى تخدير كافية.
- إصلاح الجذع وكلا hindlimbs من الفئران مع الشريط. ضع كلا من الأطراف الخلفية في وضع متناظر وممدود عن طريق تحويل مخلب مسطحة على طاولة الجراحة.
- تطبيق مرهم العيون على العينين لمنع جفاف العينين. تطهير الجلد من منطقة حلق مع مطهر.
- البحث عن درجة الوركية من الهيليوم.
- إجراء شق الجلد من الشق الوركي في اتجاه مخلب مع مشرط. يجب أن يكون شق الجلد صغيرا قدر الإمكان (حوالي 1 إلى 2 سم).
- إذا تم إصلاح الأطراف الخلفية ويتم إجراء شق الجلد بشكل صحيح ، يمكن رؤية تجويف في المستوى اللفافة بين عضلة الغلوتيوس مكسيموس وعضلات العضلة ذات الرأسين femoris التي تشبه "الخط الأبيض". إدراج ملقط الهيموساتيكية فائقة الغرامة مغلقة (رقم 5) في تجويف ونشر ملقط. يجب أن تفتح الطائرة اللفافة دون إصابة أي أنسجة عضلية.
- ضع متراجعات الشريط المطاطي تحت العضلات، للحفاظ على شق الجلد مفتوحا.
- قم بإزالة أي أنسجة وأوعية دموية محيطة بلطف من العصب الوركي حتى يتعرض العصب تماما. من المهم عدم التمدد أو سحب العصب أثناء العملية بأكملها.
- سحق العصب الوركي مع المشبك غير مسننة (hemostat فائقة الغرامة) مع ضغط مستمر وقابل للاستنساخ. لهذا، افتح المشبك، وضع العصب على الفك السفلي للمشبك وإغلاق المشبك عن طريق قفله في المركز الأول لمدة ثلاث مرات عشر ثوان. يقع موضع سحق العصب الوركي بالقرب من الشق الوركي ، بالقرب من موقع تقسيم حزمة العصب الوركي الرئيسية. بعد إصابة سحق، إعادة فتح المشبك بعناية. يبدو موقع سحق العصب الوركي شفافا.
- إزالة المطاط الشريط الواجهات.
- أغلق شق الطائرة fascial مع خياطة قابلة لإعادة التنظيم 4-0. أغلق شق الجلد مع تدبيسات جلد الجسم.
- تطبيق ريماديل وفقا للمبادئ التوجيهية GV-SOLAS (5 ملغ / كغ وزن الجسم, حقن تحت الجلد) لتخفيف الألم بعد الجراحة كل 24 ساعة بعد الجراحة لمدة يومين.
- أزل الجرذ من إعداد الجراحة. ضع الجرذ في قفص نظيف دون فراش على طبق تدفئة (37 درجة مئوية) حتى يستيقظ الجرذ. حرك الجرذ إلى قفصهم المنزلي النظيف
- إزالة المواد الغذائية الجلد الجسم أربعة إلى ستة أيام بعد الجراحة.
2. فتح اختبار الميدان (OFT)
ملاحظة: يمكن تحليل النشاط الحركي وكذلك النشاط السلوكي من قبل OFT.
- اعداد
- إعداد OFT(الشكل 1A)في بيئة مظلمة وهادئة. وهو يتألف من نظام تتبع الفيديو الآلي EthoVision XT (الكمبيوتر، والبرمجيات مع ترخيص) وساحة قياس 58.5 سم (طول) × 58.5 سم (العرض) × 45 سم (ارتفاع) مع مقاومة للخدش، سطح أسود قابل للتنظيف. السطح الأسود مهم لزيادة التباين عند تتبع الحيوانات البيضاء.
- تقييم
- ضع الحلبة والكاميرا في الموضع الصحيح. ضبط الكاميرا التي يتم تسجيل مربع الحقل المفتوح بأكمله بأفضل دقة. قم بإجراء التجربة في بيئة مظلمة. إذا كان الضوء مطلوبا للإعداد، فاستخدم ضوءا صغيرا ومنتشرا لتجنب البقع الضوئية والانعكاسات والظلال في الحلبة. ضمان ظروف الإضاءة على قدم المساواة عن طريق قياس illuminance مع متر لوكس في مناطق مختلفة من الساحة.
- إعداد برنامج XT EthoVision. يتم سرد الإعدادات الأكثر أهمية في ما يلي. في إعدادات التجربة اختر تتبع مباشر لمصدر الفيديو واكتشاف نقطة المركز للميزات المتعقبة. التحقق من حجم الساحة في إعدادات الساحة. تعيين شرط البدء للحصول على البيانات إلى ثلاث ثوان بعد وضع الجرذ في منتصف الحلبة والوقت الإجمالي لتشغيل خمس دقائق في إعدادات التحكم التجريبي. اختر طرح ثابت للأسلوب في إعدادات الكشف. علامة الاختيار حفظ الفيديو للأسلوب في إعدادات الاستحواذ.
- ضع الجرذ برفق في منتصف ساحة الاختبار (الشكل 1B).
- اضغط الزر بدء الإصدار التجريبي في Acquisition Control لبدء التسجيل.
- أثناء التسجيل، ابتعد عن إعداد OFT لتجنب تشتيت انتباه الجرذ.
- بعد كل تجربة، قم بإزالة الجرذ برفق من حلبة الاختبار وانظف الإعداد بحمض الخليك بنسبة 0.1٪ لتجنب تشتيت الانتباه بسبب رائحة الجرذ المسجل سابقا.
- تحليل البيانات
- لتحليل البيانات OFT مع برنامج XT EthoVision، انتقل إلى قسم التحليل في شريط الجانب الأيسر واختر تتبع التصور تحت علامة التبويب النتائج (الشكل 1C). بعد ذلك، تصدير المعلمات المطلوبة إلى Excel. ضمن البرنامج، اختر عددا من المتغيرات من فئات مختلفة لتحليل البيانات. والمتغيرات الهامة لهذا الهدف العلمي المحدد هي "المسافة المنقولة" و "السرعة" تحت فئة "المسافة والوقت". إجراء تحليل إحصائي للمعلمات المختارة(الشكل 1D).
3. تحليل مشية CatWalk XT
ملاحظة: يمكن أن يساعد تحليل المشي عبر نظام CatWalk XT في تقييم العديد من المعلمات المختلفة المتعلقة بآثار أقدام النماذج الحيوانية وموقفها ومشيتها. ممشى زجاجي مضاء بالضوء الأخضر ويتم التقاط الضوء المتناثر من آثار أقدام الحيوانات بكاميرا فيديو عالية السرعة ، والتي تقع تحت الممشى. يمكن تحليل الإشارات باستخدام برنامج CatWalk XT.
- اعداد
- لتحليل مشية مع XT كات ووك، استخدم نظام كات ووك والبرامج المقابلة (الكمبيوتر، والبرمجيات مع ترخيص)(الشكل 2A).
- قم بإجراء التجربة في ظل ظروف مظلمة، لأن الحصول على البيانات يعتمد على إضاءة ممشى نظام CatWalk مع ضوء LED أخضر. لتسهيل الإجراء التجريبي في ظل ظروف مظلمة ، تضيء الغرفة التجريبية بالضوء الأحمر.
- استخدم ممشى محدد طوله 65 سم وعرضه 7 سم؛ ومع ذلك ، فإن حجم الممشى يعتمد على حجم الفئران. إعداد الممشى أكبر قدر ممكن لتسجيل أكبر عدد ممكن من آثار الأقدام لكل مخلب.
- التقط حدا أدنى من ثلاثة آثار أقدام لكل مخلب لكل شوط. عند تحديد طول الممشى، ضع في اعتبارك جسم الجرذ وذيله، حيث قد لا يتم اكتشاف إشارة البداية أو التوقف بشكل صحيح وقد لا يتم تصنيف الأشواط على أنها متوافقة، إذا دخل الجسم /الذيل أو بقي على الممشى المحدد قبل أو بعد الانتهاء من التشغيل.
- تدريب
ملاحظة: تدريب الفئران لنظام CatWalk ضروري لتعود الحيوانات على الإعداد والسماح لهم بتعلم عبور الممشى دون أي انقطاع. يوفر التدريب المناسب مزايا توفير الوقت أثناء التقييم التجريبي والحصول على نتائج أفضل. يتيح بدء الحصول على البيانات لنظام CatWalk أثناء الدورات التدريبية للفئران التعود على ظروف التقييم (الضوضاء / الضوء).- ابدأ بإعداد نظام CatWalk.
- تنظيف الممشى الزجاجي بالماء المقطر وقطعة قماش ناعمة خالية من الوبر. في بداية ونهاية التجربة، أو بينهما إذا كان الممشى الزجاجي قذرا، استخدم سائل تنظيف الزجاج والقماش الناعم الخالي من الوبر لتنظيف الممشى الزجاجي. بعد استخدام سائل تنظيف الزجاج، قم بإزالة الممشى من أي بقايا للسائل لتجنب تشتيت انتباه الحيوان.
- اختر الإعدادات التجريبية. معلمة هامة هي تشغيل المعايير. تعيين القيم المناسبة لمدة التشغيل الحد الأدنى، والحد الأقصى مدة التشغيل، والحد الأدنى لعدد من أشواط متوافقة للحصول على، والتي هي محددة لكل مشروع بحثي. حدد خانة الاختيار استخدام الحد الأقصى المسموح به لتباين السرعة، ثم قم بتعيين القيمة. يمكن تجاهل معايير التشغيل خلال الأيام الأربعة أو الخمسة الأولى من التدريب.
- ضع الكاميرا في موضعها وضبط التركيز. العثور على موقف الكاميرا الأمثل لتحقيق طول مناسب للممشى وأفضل قرار من الكفوف المسجلة في وقت واحد. قم بتسمية موضع الكاميرا على نظام CatWalk لضمان وضع الكاميرا المطابق بين التسجيلات.
- قم بإعداد إعدادات الكشف باستخدام الكشف التلقائي لتجربة جديدة. تأكد من أن جميع آثار الأقدام يمكن الكشف عنها مع الحد الأدنى من الضوضاء الخلفية. إذا لزم الأمر، قم بتحسين إعدادات الكشف يدويا وتغيير عتبة الكثافة الخضراء. استخدم نفس إعدادات الكشف للتجربة بأكملها.
- قم بإعداد جدران الممر لنظام CatWalk. يجب أن تكون جدران الممر أقرب ما يمكن إلى الجرذ. تأكد من أن جدران الممر تبقى موازية للممشى.
- تحديد طول الممشى: انقر على أيقونة تحديد الممشى. ضبط حجم المستطيل الأبيض في الطول والعرض، وفقا لمشروع بحثي محدد. انقر فوق موافق.
- معايرة الممشى: انقر على أيقونة معايرة الممشى. ضع ورقة معايرة مستطيلة قياس 20 × 10 سم في منتصف الممشى. قم بتكييف حجم المستطيل الأبيض مع ورقة المعايرة. انقر فوق موافق.
- بعد ذلك، التقط صورة خلفية: تحقق مسبقا من أن الممشى نظيف وفارغ. انقر فوق الزر "خلفية الانطباق" لإنشاء صورة خلفية.
- تدريب الحيوانات لمدة ثمانية أيام على الأقل قبل بدء التجربة الفعلية. ينصح بالتدريب في الأيام المتعاقبة.
- اليوم الأول من التدريب: لكي تعتاد الفئران على نظام CatWalk ، اسمح للحيوان باستكشاف الممشى وصندوق الأهداف بحرية. دع الفئران تتدرب على عبور الممشى وتدخل مربع الهدف. التقط الجرذ في نهاية الممشى أو في مربع الهدف واحضر الجرذ إلى نقطة البداية في الممشى. يوصى بخمسة أشواط لليوم الأول من التدريب دون الحاجة إلى الامتثال للإعدادات التجريبية.
- اليوم الثاني من التدريب: يمكن للفئران استكشاف الممشى وصندوق الأهداف بحرية. يوصى بخمسة أشواط دون الامتثال للإعدادات التجريبية.
- اليوم الثالث من التدريب: يوصى بثمانية أشواط دون الامتثال للإعدادات التجريبية.
- اليوم الرابع من التدريب: يوصى بإجراء عشرة أشواط دون الالتزام بالإعدادات التجريبية.
- اليوم الخامس من التدريب: يوصى بعشرة أشواط. يجب أن يتم مراعاة الإعدادات التجريبية. تحفيز الفئران لعبور الممشى دون أي انقطاع.
- اليوم السادس من التدريب: يوصى بعشرة أشواط. يجب أن يتم مراعاة الإعدادات التجريبية. تحفيز الفئران لعبور الممشى دون أي انقطاع.
- اليوم السابع من التدريب: يوصى بعشرة أشواط. وينبغي تحقيق ما لا يقل عن ثلاثة أشواط متوافقة. إضافة المزيد من أشواط للحيوانات، إذا لم يتمكنوا من الوصول إلى هذا الهدف.
- اليوم الثامن من التدريب: يوصى بعشرة أشواط. وينبغي تحقيق ما لا يقل عن ثلاثة أشواط متوافقة. إضافة المزيد من أشواط للحيوانات، إذا لم يتمكنوا من الوصول إلى هذا الهدف.
- ابدأ بإعداد نظام CatWalk.
- تقييم
- وفقا لمعايير التشغيل المحددة، قم بإجراء ثلاثة أشواط متوافقة لكل فأر لتحليل البيانات. وللتقييم، يرجى اتباع الخطوات 3-2-1. - 3.2.1.8. كما هو موضح في قسم التدريب. حتى لو وصل الجرذ إلى ثلاثة أشواط متوافقة في الأشواط الثلاثة الأولى ، نفذ ما لا يقل عن ستة أشواط لكل دورة / أسبوع لأغراض التدريب.
- قم بأداء دورة (تدريب) واحدة على الأقل مع ستة أشواط في الأسبوع لنمط مشية مستقر للتجارب مع نقاط زمنية متعددة. تبقى الإعدادات التجريبية والضبط متسقة مع التجربة بأكملها.
- تحليل البيانات
- لتحليل البيانات، فقط تقييم تشغيل متوافقة. حذف التشغيلات غير المتوافقة.
- تحقق من عتبة الكثافة الخضراء وزيادة أو إنقاص عتبة الكثافة الخضراء قبل تصنيف مطبوعات مخلب إذا لزم الأمر. يجب أن تكون عتبة الكثافة الخضراء متسقة لجميع الحيوانات وجميع الأشواط.
- تصنيف مخلب يطبع تلقائيا مع برنامج XT CatWalk (الشكل 2B).
- مراجعة تسميات الطباعة مخلب يدويا. تصحيح تسميات الطباعة مخلب خاطئ، إضافة تسميات من بصمات مخلب غير المكتشفة، وحذف الضوضاء والتسميات خاطئ يدويا. نقل الفيديو إلى موضع، والذي يجب مراجعته يدويا. لتصحيح طباعة مخلب المسمى خاطئ، حدد مستطيل الطباعة مخلب محددة، انقر فوق إعادة تعيين،حدد نفس المستطيل مرة أخرى، وتعيين التسمية الصحيحة من القائمة. لوضع علامات على بصمات مخلب غير المكتشفة رسم مستطيل حول مخلب غير الكشف عنها انقر فوق إضافة طباعةوحدد مستطيل جديد تم إنشاؤه وتعيين التسمية الصحيحة من القائمة. في حالة طباعة البرنامج المسمى الأنف أو الجسم تلقائيا، حدد مستطيل التسمية المحددة، وانقر فوق إزالة الطباعة.
- مراجعة النتائج العددية. يتم عرض النتائج الرقمية في ورقة excel، تظهر عددا من المعلمات الأساسية. اختر محددات محددة مسبقا، اعتمادا على الاهتمام البحثي، وابحث عن التحليل الإحصائي كالمعتاد(الشكل 2D).
- للحصول على معلومات أكثر تفصيلا حول كل بصمة، قم بتصنيف أصابع القدم من الكفوف الخلفية. يتطلب هذا التحليل وحدة قياس البصمة التفاعلية.
- قم بتكييف عتبة الكثافة الخضراء لتحليل قياسات البصمة التفاعلية إذا لزم الأمر. يجب أن تكون عتبة الكثافة الخضراء متسقة لجميع الحيوانات وجميع الأشواط.
- قم بتعيين علامات تحليل البصمة يدويا. تحليل كل بصمة مخلب الخلفي في جميع أشواط متوافقة الثلاثة. رسم خط من مركز إصبع القدم الأول إلى مركز إصبع القدم الخامس لقياس "انتشار إصبع القدم". رسم خط من مركز إصبع القدم الثاني إلى مركز إصبع القدم الرابع لقياس "انتشار إصبع القدم المتوسط". رسم خط من وسط إصبع القدم الثالث إلى كعب مخلب الخلفي لقياس "طول الطباعة اليدوية" (الشكل 2C).
- راجع النتائج العددية ل "قياسات البصمة التفاعلية" المعروضة في ورقة منفصلة. حدد معلمات محددة من "قياسات البصمة التفاعلية" وإجراء التحليل الإحصائي كالمعتاد(الشكل 2E).
4. شعاع المشي المهمة
ملاحظة: يمكن تحديد العجز مشية بواسطة مهمة المشي شعاع. سيكون تركيز مهمة المشي الحزمة في هذا الموضوع البحثي المحدد هو تحليل التنسيق الحركي ، الذي يعرف بأنه القدرة على تنسيق تنشيط العضلات من أجزاء الجسم المتعددة ، وليس تقييم التوازن الحركي ، الذي يعرف بأنه القدرة على التحكم الوضعي أثناء حركات الجسم.
- اعداد
- لمهمة المشي شعاع، استخدم شعاع، فاصل، الجدول، خلفية موحدة وكاميرا فيديو(الشكل 3A).
- استخدم شعاع خشبي بطول 90 سم وعرض 1.7 سم وارتفاع 2 سم. ينصح منصة من 20.5 سم في الطول، 15 سم في العرض و 2 سم في الارتفاع في كلا طرفي شعاع. استخدام نفس المواد للمنصات والشعاع، وتجنب أي حواجز بين المنصات والشعاع.
- يكون المسافة بين شعاع والجدول لا يقل عن 44 سم. بيئة مألوفة مثل قفص المنزل يحفز الفئران لعبور شعاع، والتي يمكن وضعها في نهاية منصة شعاع.
- تدريب
- إعداد شعاع مع فاصل وقفص المنزل على الطاولة.
- تدريب الحيوانات لمدة سبعة أيام. ينصح بالتدريب في الأيام المتعاقبة.
- اليوم الأول من التدريب
- ضع جميع الفئران من قفص منزلي واحد على منصة بدء الشعاع.
- دع الفئران تستكشف البيئة (منصة / شعاع).
- عقد فأر واحد بعناية من الذيل وقيادة الفئران إلى شعاع عن طريق دفع الفئران بلطف على شعاع.
- مساعدة الفئران في عبور شعاع عن طريق عقد الفئران من ذيله لمدة شوطين على الأقل.
- دع الجرذ يجتاز الشعاع لثلاثة أشواط أخرى دون مساعدة. مراقبة الفئران وتقديم المساعدة إذا لزم الأمر. إذا فشل الجرذ في اجتياز الشعاع ، اعتراض السقوط من أجل تجنب الإصابات وتطور الخوف لاجتياز الشعاع.
- استمر في هذا الإجراء لجميع الفئران.
ملاحظة: أحيانا تتبع الفئران بعضها البعض لاجتياز الشعاع، وفي هذه الحالة لا حاجة إلى المساعدة. ومع ذلك، من المهم مراقبة الفئران، واعتراض السقوط وتقديم المساعدة إذا لزم الأمر.
- اليوم الثاني للتدريب
- ضع جميع الفئران من قفص منزلي واحد على منصة بدء الشعاع.
- دع الفئران تعبر الشعاع ست مرات
- إذا لزم الأمر، وتقديم المساعدة واعتراض السقوط.
- اليوم الثالث للتدريب
- ضع جرذا واحدا على منصة بدء الشعاع.
- دع الفأر يجتاز الشعاع ست مرات
- إذا لزم الأمر، وتقديم المساعدة واعتراض السقوط.
- اليوم 4-7 من التدريب
- ضع جرذا واحدا على منصة بدء الشعاع.
- دع الفأر يجتاز الشعاع عشر مرات
- إذا لزم الأمر، وتقديم المساعدة واعتراض السقوط.
- في نهاية التدريب ، يجب على الجرذ اجتياز الشعاع دون أي انقطاع لمدة ثلاثة أشواط على الأقل. يجوز دفع الجرذ برفق على منصة البداية لبدء الحركة.
- اليوم الأول من التدريب
- تقييم
- إعداد شعاع مع فاصل وقفص المنزل على الطاولة.
- ضع كاميرا الفيديو في موضعها، محاذاة بالتوازي مع شعاع مع الحيوان في التركيز. يجب أن يكون موضع كاميرا الفيديو أقرب ما يمكن إلى الحيوان لتحقيق الدقة المثلى للحركات المسجلة. يجب التقاط الحزمة وأجزاء من كلا النظامين الأساسيين بواسطة التسجيل.
- بدء التسجيل والتعرف أولا على الدورة والحيوان.
- ضع الجرذ على منصة بدء الشعاع.
- يجب على الجرذ عبور الشعاع ثلاث مرات دون أي انقطاع. حتى لو وصل الجرذ إلى ثلاثة أشواط متوافقة خلال الأشواط الثلاثة الأولى ، نفذ ما لا يقل عن ستة إلى عشرة أشواط لأداء المهمة المستمر.
- دائما، مراقبة الحيوان واعتراض السقوط، إذا لزم الأمر.
- بعد المهمة، تنظيف شعاع والجدول مع حمض الخليك 0.1٪ لتجنب الهاء من رائحة الفئران المسجلة سابقا.
ملاحظة: خلال الأسبوعين الأولين بعد إصابة سحق العصب ، لا تستطيع الفئران اجتياز الشعاع دون مساعدة. لذلك ، يجب تقديم المساعدة لمدة ستة إلى ثمانية أشواط في الأسبوعين الأولين بعد إصابة سحق العصب. من الأسبوع الثالث إلى الأسبوع الخامس، يتم تنفيذ خمسة أشواط بمساعدة وأجريت عشرة أشواط أخرى دون مساعدة.
- تحليل البيانات
- استخدام برنامج تحليل الفيديو مجانا Kinovea لتحليل البيانات.
- حدد تسلسلات الفيديو لثلاثة أشواط متوافقة من التسجيل. لهذا، اختر أول ثلاثة أشواط متوافقة التي تم تنفيذها دون مساعدة من قبل الحيوان. كن متسقا في اختيار التشغيل المتوافق لجميع الفئران.
- حدد نقطة وقت البدء ونقطة وقت النهاية لثلاثة أشواط متوافقة(الشكل 3D-E). في هذا الإعداد، تم وضع علامة على نقطة البداية بواسطة خط أسود على الحزمة وتحديد موضع أول خط خلفي خلف الخط الأسود نقطة وقت بدء التشغيل. يحدد وضع أول طرف خلفية على المنصة في نهاية الشعاع نقطة وقت النهاية.
- بعد ذلك، حساب الوقت اللازم للجرذ لاجتياز شعاع. الإبلاغ عن البيانات كزمن زمن عبور الشعاع في ثوان وإجراء التحليل الإحصائي كالمعتاد(الشكل 3B).
- تسجيل عدد الخطوات والأخطاء من ثلاثة أشواط متوافقة لكلا hindlimbs بشكل منفصل باستخدام وظيفة التكبير والحركة البطيئة للبرنامج. تتضمن الأخطاء إجمالي زلات القدم وزلات نصف القدم. يتم تعريف زلة القدم الإجمالية على أنها موضع القدم الذي يتبعه زلة عميقة مما تسبب في فقدان الاتصال بالمخلب المصاب مع الحزمة(الشكل 3F). يتم تعريف نصف زلة كما مخلب الانزلاق قبالة الجدار الجانبي للشعاع دون أن تفقد الاتصال الكامل مع شعاع (الشكل 3G).
- حساب النسبة المئوية لزلات القدم فيما يتعلق بعدد الخطوات لعبور الحزمة ((عدد زلات القدم من الطرف × 100٪) / عدد الخطوات من نفس الطرف). تقديم البيانات كنسبة مئوية من زلات القدم وإجراء التحليل الإحصائي كالمعتاد(الشكل 3C).
5. سلم درجة المشي المهمة
ملاحظة: يمكن لمهمة المشي الدرجة سلم تقييم وظيفة المحرك، ووضع كل من الجبهات و hindlimbs، والتنسيق interlimb.
- اعداد
- استخدام جهاز درجة سلم، فاصل، الجدول، خلفية موحدة وكاميرا فيديو لهذا الاختبار السلوكي(الشكل 4A). يتكون جهاز الدرجات الأفقي من الدرجات المعدنية والجدران الجانبية البولي واضحة. الجهاز طوله 119.5 سم ويتم ضبط العرض إلى 7.4 سم. طول الممشى الذي سيتم تحليله هو 100 سم.
- تسمية نقطة البداية والنهاية بخط أسود على الجدار الجانبي. العناصر النائبة للرواية على الجهاز على فترات 1 سم. ترتيب نمط غير منتظم من الدرجات للممشى 100 سم مع مسافة بين 1 و 5 سم بين الدرجات. أول 10 سم في البداية وآخر 9.5 سم في نهاية الجهاز ، والتي يتم استبعادها من التحليل ، لديها نمط منتظم من الدرجات مع مسافة 1 سم.
- استخدم مسافة بين الممشى والجدول حوالي 30 سم(الشكل 4A-B). مربع الهدف أو بيئة مألوفة في نهاية الجهاز، مثل قفص المنزل، يحفز الفئران لعبور جهاز درجة سلم.
- تدريب
- إعداد جهاز درجة سلم مع فاصل ومربع الهدف على الطاولة.
- تدريب الحيوانات لمدة ثمانية أيام. ينصح بالتدريب في الأيام المتعاقبة.
- اليوم الأول من التدريب
- ضع جميع الفئران من قفص منزلي واحد على جهاز الدرجة سلم.
- السماح للفئران استكشاف البيئة (سلم الدرجة جهاز / مربع الهدف).
- دفع بلطف الفئران في اتجاه مربع الهدف. مساعدة الفئران في دخول مربع الهدف. دع الفئران تستكشف مربع الهدف لفترة من الوقت.
- بعد دخول جميع الفئران إلى مربع المرمى. خذ الجرذ الأول من مربع الهدف ووضع الجرذ على منطقة بداية الجهاز مرة أخرى. الاستمرار في نفس الإجراء لجميع الفئران من قفص منزل واحد. دفع بلطف الفئران في اتجاه مربع الهدف وتقديم المساعدة لدخول مربع الهدف، إذا لزم الأمر.
- دع الفأر يجتاز الجهاز أربع مرات
- اليوم الثاني للتدريب
- تنفيذ نفس البروتوكول كما هو مدرج في اليوم الأول من التدريب.
- دع الجرذ يجتاز الجهاز ست مرات
- اليوم الثالث للتدريب
- تنفيذ نفس البروتوكول كما هو مدرج في اليوم الأول من التدريب.
- دع الجرذ يجتاز الجهاز ثماني مرات
- اليوم الرابع للتدريب
- ضع فأر واحد في بداية جهاز الدرجة سلم.
- إذا كان الجرذ لا يجتاز الجهاز ويدخل مربع الهدف طوعا، وتقديم المساعدة عن طريق دفع بلطف الجرذ من الخلف.
- دع الجرذ يجتاز الجهاز ثماني مرات
- اليوم 5-8 من التدريب
- ضع فأر واحد على بداية جهاز درجة السلم.
- إذا كان الجرذ لا يجتاز الجهاز ويدخل مربع الهدف طوعا، وتقديم المساعدة عن طريق دفع بلطف الجرذ من الخلف.
- دع الجرذ يجتاز الجهاز عشر مرات
- في نهاية التدريب ، يجب أن يكون الجرذ قادرا على اجتياز الممشى دون أي انقطاع ومساعدة لمدة لا تقل عن ثلاثة أشواط. يجوز إعطاء الجرذ دفعة لطيفة في منطقة البداية لبدء الحركة.
- اليوم الأول من التدريب
- تقييم
- إعداد جهاز درجة سلم مع فاصل ومربع الهدف على الطاولة.
- ضع كاميرا الفيديو في موضعها، محاذاة بالتوازي مع الجهاز مع الحيوان في التركيز. ضع كاميرا الفيديو في أقرب مكان ممكن إلى الحيوان لتحقيق الدقة المثلى للحركات المسجلة وضمان التقاط جهاز درجة السلم بأكمله في التسجيل.
- بدء التسجيل والتعرف أولا على الدورة والحيوان.
- ضع الجرذ على منطقة البداية لجهاز الدرجة سلم.
- الجرذ لاجتياز ممشى 100 سم من جهاز درجة سلم ثلاث مرات دون أي انقطاع من أجل أن يتأهل كجري متوافقة. حتى لو وصل الجرذ إلى ثلاثة أشواط متوافقة خلال الأشواط الثلاثة الأولى ، فيجب إجراء ما لا يقل عن عشرة أشواط لأداء المهمة المستمر.
- بعد المهمة، تنظيف الجهاز والجدول مع حمض الخليك 0.1٪ لتجنب الهاء من رائحة الفئران المسجلة سابقا.
- تحليل البيانات
- استخدام برنامج تحليل الفيديو مجانا Kinovea لتحليل البيانات.
- حدد تسلسلات الفيديو لثلاثة أشواط متوافقة من التسجيل. اختر أول ثلاثة أشواط متوافقة لتحليل البيانات.
- حدد نقطة وقت البدء ونقطة وقت النهاية لأشواط الثلاثة المتوافقة المحددة. يحدد وضع أول خط خلفي خلف الخط الأسود الأول على الجدار الجانبي للجهاز ، والذي يحدد نقطة وقت البدء في الممشى الذي طوله 100 سم ، نقطة وقت البدء في التشغيل. يحدد وضع الخط الأمامي الأول خلف الخط الأسود الثاني على الجدار الجانبي للجهاز ، والذي يسمي نقطة النهاية للممشى 100 سم ، نقطة وقت النهاية للركض.
- تحديد نقطة وقت البدء والانتهاء. بعد ذلك، حساب مدة تشغيل عبر الممشى. الإبلاغ عن البيانات كزمن زمن الوصول لاجتياز الممشى في ثوان وإجراء التحليل الإحصائي كالمعتاد(الشكل 4C).
- تسجيل ثلاثة أشواط متوافقة مع مقياس 7 فئات من ميتز وآخرون باستخدام الحركة البطيئة أو وظيفة الإطار تلو الإطار من البرنامج (الشكل 5)16،17. تحديد عدد الخطوات وعدد الأخطاء وفقا لفئات المقياس لكل طرف على حدة. يميز المقياس بين الفئات التالية: (0) إجمالي الضياع (1) الانزلاق العميق (2) زلة طفيفة (3) استبدال (4) تصحيح (5) موضع جزئي، و (6) الموضع الصحيح. تم تقييم خطأ الطرف البادئ فقط. وينبغي عدم تصنيف الأخطاء الأخرى الناجمة عن الخطأ الأولي.
- حساب الأخطاء/الخطوة عن طريق النظر في المتطلبات التالية. الفئات (0) مجموع يغيب (1) زلة عميقة (2) طفيف زلة العد كخطأ. تقسيم عدد الأخطاء على عدد الخطوات لكل hindlimb ويتم تشغيل كل على حدة. تحديد القيمة المتوسطة لكل ثلاثة أشواط متوافقة لكل وكل من الأطراف الخلفية بشكل منفصل وإجراء التحليل الإحصائي كالمعتاد(الشكل 4D).
Representative Results
تظهر النتائج التمثيلية ل OFT خمس دقائق أن إصابة سحق العصب بعد خمسة أسابيع من الجراحة ليس لها أي تأثير على النشاط الحركي(الشكل 1).
تحليل مشية مع نظام XT كات ووك (الشكل 2) يولد العديد من المعلمات المختلفة. تم تحليل المعلمات الانتقائية إحصائيا من خلال مقارنة الفئران السذاجة wt مع الفئران wt المصابة بالأعصاب بعد خمسة أسابيع من سحق العصب(الشكل 2D). يمكن الكشف عن تعديلات كبيرة لمتوسط سرعة التشغيل وطول الخطوة ومنطقة الطباعة للمخلب الخلفي المصاب بالأعصاب (يمين). تم إجراء تحليل أكثر تفصيلا للمخلب الخلفي المصاب بالأعصاب باستخدام وحدة "قياسات البصمة التفاعلية". ولوحظ انخفاض كبير في انتشار البارامترات، وانتشار إصبع القدم المتوسط وطول الطباعة في فئران wt المصابة بالأعصاب مقارنة بالجرذان الساذجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن محور الجسم زاوية مخلب وزاوية مخلب حركة ناقلات تختلف اختلافا كبيرا عند مقارنة الفئران wt المصابة بالأعصاب مع الفئران ساذجة wt (الشكل 2E).
ويعرض الشكل 3 بيانات التنسيق الحركي التي تم الحصول عليها من خلال تقييم مهمة المشي بالشعاع. وأظهرت الفئران WT المصابين بالأعصاب وقت الكمون زيادة كبيرة لعبور شعاع مقارنة مع الفئران ساذجة wt خمسة أسابيع بعد الاصابة (الشكل 3B). كما قراءة إضافية من مهمة المشي شعاع، تم احتساب زلات كاملة ونصف زلات من الأطراف الخلفية المصابة بالأعصاب واعتبر خطأ للتحليل الإحصائي. زيادة كبيرة في نسبة الأخطاء في خطوة واحدة من الأعصاب المصابة (يمين) الخلفية في الفئران WT المصابة بالأعصاب مقارنة مع الفئران السذاجة wt.
البيانات التمثيلية لمهمة المشي درجة سلم (الشكل 4) لا تظهر تغييرات كبيرة في زمن الوصول لعبور ممشى جهاز درجة سلم (الشكل 4C) أو في النسبة المئوية للأخطاء في كل خطوة من الأعصاب المصابين (يمين) الخلفية(الشكل 4D). تحليل نسبة الخطأ في كل خطوة من الإصابة العصبية الخلفية النظر فقط في النتيجة من 0 إلى 2 من مقياس 7 فئات من ميتز وآخرون. يتم توضيح توزيع جميع فئات النقاط لكل خطوة من مقياس الفئات السبع للأطراف الخلفية المصابة بالأعصاب والأطراف الخلفية غير المصابة بالأعصاب (يسار) في الشكل 4E.
الشكل 1:تقييم النشاط الحركي أثناء الاختبار الميداني المفتوح. (أ) صورة لإعداد اختبار الحقل المفتوح. صورة مختارة مطروحة من فيديو مسجل أثناء اختبار الحقل المفتوح تظهر فأرا في ساحة الحقل المفتوح بدون (B) ومع تتبع (C). (د) تم التحقيق في السرعة خلال تسجيل اختبار ميداني مفتوح لمدة خمس دقائق في الفئران الساذجة والفئران wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب. وتظهر البيانات على أنها متوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المدفوع للبيانات الموزعة عادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تحليل المشي مع نظام CatWalk XT. (أ) صورة لجهاز CatWalk XT. (ب) أمثلة على طريقة عرض الطباعة التي تظهر بصمات مخلب المسمى في وضع اللون كاذبة وأمثلة على عرض توقيت تظهر الرسم البياني مشية على أساس الوقت من الفئران والسذاجة wt الفئران wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب. (ج) أمثلة لتصنيف إصبع القدم تبين انتشار إصبع القدم (TS) وانتشار إصبع القدم المتوسط (ITS) وطول الطباعة (PL) وكذلك أمثلة على عرض محور الجسم الذي يظهر محور الجسم (الخط الأبيض) وناقل الحركة (الخط الأحمر) للفئران الساذجة والفئران wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب. (د) بيانات المعلمات المختارة من التصنيف "القياسي" الذي يقارن الفئران الساذجة والفئران الساذجة بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق الأعصاب. (ه) بيانات المعلمات المختارة من "وحدة قياس البصمة التفاعلية" التي تقارن الفئران والسذاجة wt والجرذان wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب. وتظهر البيانات على أنها متوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المدفوع للبيانات الموزعة عادة ، واختبار t غير المدفوع مع تصحيح Welch للبيانات الموزعة عادة مع تباين غير متكافئ واختبار Mann-Whitney U للبيانات الموزعة غير العادية. تم تعريف < P-value 0.05 على أنه ذو دلالة إحصائية تم تصنيفه على أنه *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل مشية مع مهمة المشي شعاع. (أ) صورة ورسومات تخطيطية لإعداد مهمة المشي الحزمة. تم تحليل وقت الكمون لعبور الحزمة (B) ونسبة أخطاء زلة القدم لكل خطوة من الإصابة بالأعصاب الخلفية أثناء مهمة المشي الحزمة (C) في الفئران والسذاجة wt والجرذان wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب. صورة تمثيلية لموضع وقت البدء (D) وموضع وقت النهاية (E) لمهمة المشي بالشعاع. تسلسل صورة تمثيلية لخطأ في الانزلاق الكامل (F) وخطأ نصف زلة (G) لمهمة المشي الحزمة. وتظهر البيانات على أنها متوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار مان ويتني يو للبيانات الموزعة غير العادية. تم تعريف < القيمة P 0.05 على أنها ذات دلالة إحصائية وصفت بأنها *p < 0.05 و ** p < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل مشية باستخدام سلم درجة المشي المهمة. صورة (A) ورسومات تخطيطية (B) لإعداد مهمة المشي الدرج السلم. تم تقييم وقت الكمون لعبور جهاز درجة السلم (C) ونسبة أخطاء زلة القدم لكل خطوة من الحافة الخلفية المصابة بالأعصاب أثناء مهمة المشي الدرجة سلم (D) في الفئران ساذجة wt والجرذان wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب. (ه) توزيع نسبة فئة النقاط لكل خطوة وفقا لمقياس الفئات السبع من ميتز وآخرين. لليسار واليمين hindlimb من الفئران سذاجة wt والجرذان wt بعد خمسة أسابيع من إصابة سحق العصب. وتظهر البيانات على أنها متوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المدفوع للبيانات الموزعة عادة واختبار Mann-Whitney U للبيانات الموزعة غير العادية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:تمثيل مثالي لكل فئة وفقا لمقياس الفئات السبع من ميتز وآخرين. خلال سلم درجة المشي المهمة. تسلسل صورة تمثيلية من الخلفية اليمنى من الفئة 0 - إجمالي ملكة جمال، الفئة 1 - زلة عميقة، الفئة 2 - زلة طفيفة، الفئة 3 - استبدال، الفئة 4 - تصحيح، خلال مهمة المشي درجة سلم. صور تمثيلية للفئة 5 - الموضع الجزئي والفئة 6 - الموضع الصحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يوفر بروتوكول التقييم السلوكي هذا نظرة عامة على المزايا والعيوب بالإضافة إلى قراءات محتملة لبطارية الاختبار السلوكي المختارة في نموذج القوارض بعد إصابة سحق العصب الوركي.
للحصول على نتيجة مقارنة لإصابة سحق العصب الوركي ، فإن تقنية السحق الثابتة إلزامية. استخدام المشبك غير مسننة (الترا غرامة Hemostat) بدلا من ملقط يمكن تحسين اتساق سحق. استخدام المشبك نفسه وكذلك نفس الموقف سحق لضمان ضغط العصب على قدم المساواة. الاستخدام الحصري للمشبك لإصابة سحق والتعامل مع المشبك بعناية يحسن الاتساق. أيضا، إجراء إصابة سحق بعناية. يمكن أن يؤدي تلف إضافي للعصب أثناء الجراحة مثل الجر غير المرغوب فيه للعصب إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل التبدل التلقائي. لذلك ، يوصى بإعداد العصب بعناية بالإضافة إلى إدارة مسكن للألم لمدة يومين على الأقل.
تقييم متعدد العوامل للسلوك الحركي يمكن أن تميز النمط الظاهري بعد إصابة سحق الأعصاب في الفئران على مختلف المستويات. استخدمنا OFT، CatWalk XT تحليل مشية، شعاع المشي مهمة وسلم درجة المشي المهمة. إجراء تجريبي أعمى وتحليل البيانات للمجموعات التجريبية أمر ضروري لهذه التجارب. قبل تقييم السلوك، تم تأقلم الحيوانات في غرفة الاختبار تحت ظروف الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل. جميع الاختبارات السلوكية المطبقة هنا لها ميزة أن الحرمان من الطعام أو الماء غير مطلوب. تم استخدام نفس المجموعة من الحيوانات في جميع الاختبارات السلوكية الموصوفة. تم إجراء اختبارين سلوكيين مختلفين كحد أقصى لكل في اليوم. إذا تم إجراء الاختبارات السلوكية على فترات منتظمة، انتبه إلى إجراء مماثل، مثل إجراء الاختبار بنفس الترتيب الحيواني وفي نفس الوقت من اليوم. وثمة جانب آخر مهم للتحليل السلوكي هو دورة ليلا نهارا من الفئران. النظر في عكس دورة ليلا نهارا للحصول على مستويات أكثر طبيعية وأعلى من النشاط في دورة النهار (دورة الظلام). هذا يجب أن ينظر خصوصا لقياس السلوك العفوي، مثل OFT. وفي هذه التجربة، لم يكن من الممكن تنفيذ دورة نهارية معكوسة، ولكن تم ضمان التأقلم الكافي مع ظروف الاختبار. الإضاءة المثالية ضرورية لمقاطع الفيديو عالية الدقة لمهمة المشي الحزمة ومهمة المشي الدرجة السلم. لا يمكن الوصول إلى جودة الفيديو العالية هذه عند إجراء التجارب في الظلام.
يتطلب تقييم المشية أداء مهمة مستمرة. الجانب المهم الأول من أداء المهمة المستمر هو إقناع الحيوانات لعبور الإعداد. لزيادة الحافز، ضع حبيبات الطعام الصغيرة (45 ملغ) في نهاية الإعداد. من أجل الحصول على الحيوانات على دراية الكريات الغذائية، وينبغي تغذية الكريات لهم قبل الاختبار. أيضا، يمكن أن يكون مربع الهدف في نهاية الإعداد مفيدا. يتضمن إعداد CatWalk بالفعل مربع هدف ، ولكن الفئران تتردد أحيانا في دخول مربع الهدف. بدلا من ذلك، يمكنك إضافة قفص صغير في مربع الهدف، ولكن القفص المنزلي من الفئران لا يصلح في مربع الهدف. دع الفئران تعود في القفص لبضع دقائق قبل الاستحواذ. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم وضع فأر آخر من نفس القفص المنزلي في مربع المرمى أو في القفص داخل مربع المرمى. تأكد من أن الجرذ الثاني يبقى في منطقة الجزاء ولا يمنع مدخل مربع الهدف. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أيضا لإزالة مربع الهدف من نظام CatWalk ووضع قفص الفئران المنزل في نهاية الممشى، والذي يسمح للجرذ لدخول "أراضي الوطن" بعد كل شوط. لإعداد مهمة المشي شعاع وسلم درجة المشي المهمة، نوصي بإضافة مربع الهدف أو القفص المنزل في نهاية الإعداد. لضمان الاتساق ، يجب تنفيذ CatWalk ، ومهمة المشي الحزمة ، ومهمة المشي الدرجة السلم مرة واحدة على الأقل في الأسبوع مع ستة إلى عشرة أشواط.
على الرغم من أن ليس كل تحليل أسفر عن اختلافات كبيرة في هذه الدراسة، والنظر في أن إدراج الحيوانات المعدلة وراثيا أو مجموعات العلاج يمكن أن تنتج بيانات قيمة التي يمكن أن تميز بين مجموعات من نفس الاختبارات السلوكية.
لم يكن لإصابة سحق العصب أي تأثير على النشاط الحركي للجرذ ، والذي تم قياسه في خمس دقائق من OFT. Catwalk XT gait analysis هو أداة أكثر موضوعية وحساسية لتحليل المشية ومخلب وإيداع القدم. بعد تدريب مكثف ، تتعلم الفئران عبور ممشى جهاز CatWalk XT إلى الإعدادات الافتراضية. لا تقلل إصابة العصب من قدرة الفئران على عبور الممشى. الحساب التلقائي لمختلف المعلمات يعرض البيانات موضوعيا. ويمكن الحصول على معلومات إضافية باستخدام وحدة "قياسات البصمة التفاعلية" وبالفعل، أسفرت هذه التحليلات عن اختلافات كبيرة في مختلف المعلمات لانتشار إصبع القدم وطول الطباعة وزاوية مخلب لمحور الجسم مقارنة الفئران مع وبدون إصابة الأعصاب.
يمكن تدريب الفئران بسهولة لمهمة المشي شعاع. تم الكشف عن اختلافات في وقت الكمون لعبور الشعاع وفي عدد زلات القدم في كل خطوة من الأطراف الخلفية المصابة بالأعصاب من خلال مقارنة السذاجة مع الفئران المصابة بالسحق. عيب تحليل الفئران المصابة بالأعصاب مع مهمة المشي شعاع هو حجم شعاع. في غضون الأسبوعين الأولين بعد إصابة سحق العصب الوركي ، تحتاج الفئران إلى المساعدة لعبور الشعاع حيث يضعف توازنها. على الرغم من أن بعض الفئران قد تكون قادرة على عبور شعاع، وخطر الإصابات الناجمة عن السقوط مرتفعة. لذلك ينبغي مساعدة الحيوانات المسحوقة بالأعصاب على عبور الشعاع لأول أسبوعين بعد إصابة سحق العصب الوركي أو لفترة أطول ، إذا لزم الأمر. ومع ذلك، من الصعب مقارنة الركض مع وبدون مساعدة. أيضا، التوازن الحركي هو معلمة هامة تقييمها من قبل مهمة المشي شعاع. اعتبرنا هذه المعلمة لا تكون ذات صلة لنموذجنا الفئران سحق العصب. لذلك، تم استبعاد الدرجات التي وصفها Ohwatashi وآخرون ويوهانسون &؛ Ohlsson ويمكن استخدامها مع اجتياز شعاع غير مكتملة لتحليل البيانات18،19.
مقياس 7 فئات من ميتز وآخرون يمكن تحليل كل من الأمامية و hindlimbs والتمييز بين مستويات شدة مختلفة من الأخطاء من جميع الأطراف خلال سلم درجة المشي المهمة16،17. من خلال تحليل أبرز الأخطاء ، والتي تشمل الفئات من 0 إلى 2 ، لا يمكن اكتشاف أي اختلافات في الأخطاء في الخطوة الواحدة في الأطراف الخلفية عند مقارنة فئران wt المصابة بالأعصاب مع فئران wt السذاجة. وعلاوة على ذلك، فإن زمن الكمون من عبور جهاز درجة سلم لا تختلف بين الفئران WT المصابة بالأعصاب والجرذان السذاجة wt. يمكن لنماذج التعلم العميق تحسين وتسريع تحليل البيانات لمهمة المشي الدرجة سلم من خلال نهج الآلي.
من المهم أن نذكر أن إصابة سحق العصب وكذلك جميع الاختبارات السلوكية الموصوفة يمكن ترجمتها بسهولة إلى الفئران ، من خلال تكييف إعدادات وأحجام الاجهزة. استخدام الفئران ككائن حي نموذجي له تأثير مفيد أن النماذج المعدلة وراثيا لكثير من الأمراض البشرية موجودة.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل وزارة التعليم والبحوث الاتحادية الألمانية (BMBF DysTract to C.W.I.) والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في جامعة فورتسبورغ (N-362 إلى C.W.I.; Z2-CSP3 إلى L.R.). وبالإضافة إلى ذلك، تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 في إطار برنامج EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover to J.V.)، ومن مؤسسة VERUM. وعلاوة على ذلك، يتم تمويل C.W.I. من قبل دويتشه فورتشونجسجيمينشافت (DFG، مؤسسة ريسيتش الألمانية) مشروع معرف 424778381-TRR 295، من قبل دويتشه ستيفتونغ Neurologie وباركنسونفوندس. L.R. بالإضافة إلى ذلك بدعم من مؤسسة Dystonia الطبية Reseach.
يشكر المؤلفون كيالي روم وفيرونيكا سينغر وهيكي مينزيل ولويزا فريس على مساعدتهم التقنية وكذلك هيلغا برونر على رعاية الحيوانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 - laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease Models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
- Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson's disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108 (2016).
- Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
- Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226 (2015).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
- Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
- Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
- Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
- Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).
- Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
- Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).
