Summary
Vi tilbyr en protokoll for vurdering av motorisk oppførsel via et atferdstestbatteri hos rotter etter isjias nerveknusingsskade.
Abstract
Induksjonen av en perifer nerveskade er en mye brukt metode i nevrovitenskap for vurdering av blant annet reparasjons- og smertemekanismer. I tillegg, innen bevegelsesforstyrrelser, har isjiasknusingsskade blitt brukt til å utløse en dystonilignende fenotype i genetisk disponerte DYT-TOR1A gnagermodeller av dystoni. For å oppnå konsistente, reproduserbare og sammenlignbare resultater etter en isjias nerveknusingsskade, er en standardisert metode for å indusere nerveknusingen viktig, i tillegg til en standardisert fenotypisk karakterisering. Det må ikke bare tas hensyn til det spesifikke sortimentet av atferdstester, men også til de tekniske kravene, riktig utførelse og påfølgende dataanalyse. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du utfører en isjias nerveknusingsskade og gir et atferdsmessig testbatteri for vurdering av motorunderskudd hos rotter som inkluderer den åpne felttesten, CatWalk XT-ganganalysen, strålevandringsoppgaven og stigen rung walking task.
Introduction
Gnagere er gode modellorganismer for å utdype forståelsen av menneskelige sykdommer1,2 ved å teste hypoteser på flere biologiske nivåer. Et grunnleggende biologisk nivå for karakterisering av gnagermodeller er fenotypenivået, målt ved atferdsmessige vurderinger. Avhengig av dyremodellen og det vitenskapelige forskningsspørsmålet, er valg av et kraftig og pålitelig atferdstestbatteri viktig for å dekke et bredt spekter av atferdsaspekter som for dyremodeller av Parkinsons sykdom og dystoni3,4,5,6.
Isjiasnerven er den største nerven i menneskekroppen med motor så vel som sensoriske fibre. Skader på isjiasnerven kan lett skyldes en rekke hendelser som trafikkulykker og operasjoner7,8. Derfor er forskningsaktiviteter som bruker gnagermodeller med isjiasnerveskader, av translasjonsmessig relevant verdi. Selv om det translasjonelle aspektet av nerveregenerering fra rotte til menneske må betraktes som kritisk9, er isjias nerveknusingsskaden (axonotmesis) i gnagermodeller en vanlig brukt metode for å analysere degenerasjons- og regenereringsprosesser for perifere nerver10,11. Ved en knuseskade er nerven ikke fullstendig transektert. Det skader axonen, noe som resulterer i ledningsblokk direkte etter knuseskade etterfulgt av regenerative prosesser 4,12,13.
Videre, i dystoni forskning, er den ensidige isjias nerveknusingsskaden en etablert metode for å utløse dystonilignende bevegelser (DLM) i genetisk disponerte dystoni gnagermodeller, som ikke viser DLM perse 4,14. Det antas at perifere nervetraumer forstyrrer den sensoriske integrasjonen ved å påvirke isjiasnervefibrene, som er ansvarlige for motoriske og sensoriske funksjoner15.
Vi gir her en detaljert beskrivelse for en standardisert knuseskade av isjiasnerven og et batteri av motoriske atferdsvurderinger som består av open field test (OFT), CatWalk XT ganganalyse, strålevandringsoppgave og stigeløpende oppgave i naiv vill type (wt) rotter (n = 8-9) og wt rotter fem uker etter ensidig isjias nerveknusing skade (n = 10). OFT gir informasjon om den generelle lokomotoriske aktiviteten, mens en detaljert ganganalyse oppnås av det automatiserte ganganalysesystemet CatWalk XT. Strålevandringsoppgaven brukes til å vurdere motorkoordineringen ved å evaluere tiden for å krysse bjelken og antall fotplasseringsfeil. For gangytelsesanalyse gir stigeløpoppgaven informasjon om plassering av fot eller pote og feil på et horisontalt stigeløpsapparat med et konstant, men uregelmessig rungmønster.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av lokale myndigheter ved Regierung von Unterfranken (Würzburg, Tyskland) og utført i henhold til gjeldende internasjonale, nasjonale og/eller institusjonelle retningslinjer for pleie og bruk av dyr.
1. Isjias nerveknusing skade
MERK: Oppretthold et sterilt miljø under hele den kirurgiske prosedyren. Sett opp operasjonsbordet med nødvendig utstyr.
- Bedøv rotten dypt i et lukket skap med isofluran 3,0% i O2 (2 L/min). Fjern rotten fra skapet. Barber et omfattende område av høyre bakben.
- Plasser rotten i anestesimasken og fortsett dypbedøvelse med isofluran 2,0% i O2 (2 L/min). Kontroller anestesidybden ved å klemme den interdigitale webbing av bakføttene. Fraværet av abstinensreflekser indikerer en tilstrekkelig anestesi.
- Fest torso og begge bakbenene på rotten med tape. Plasser begge bakbenene i symmetrisk og utstrakt stilling ved å dreie poten flatt på operasjonsbordet.
- Påfør oftalmisk salve på øynene for å forhindre tørre øyne. Desinfiser huden på det barberte området med et antiseptisk middel.
- Søk etter isjias-hakket til iliumet.
- Lag et hudinnsnitt fra isjias hakket inn i potens retning med en skalpell. Hudsnittet skal være så lite som mulig (ca. 1 til 2 cm).
- Hvis bakbenene er festet og hudinnsnittet utføres riktig, kan det ses et hulrom i fascialplanet mellom gluteus maximusmuskelen og biceps femorismuskelen som ligner en "hvit linje". Sett lukkede superfine hemostatiske tang (nr. 5) inn i hulrommet og spre pinsettene. Fascial flyet skal åpne seg uten å skade noe muskelvev.
- Plasser gummibåndets retraktorer under musklene, for å holde hudsnittet åpent.
- Fjern forsiktig omkringliggende vev og blodårer fra isjiasnerven til nerven er helt utsatt. Det er viktig å ikke strekke eller trekke nerven under hele prosedyren.
- Knus isjiasnerven med en ikke-serrated klemme (ultrafin hemostat) med konstant og reproduserbart trykk. For dette åpner du klemmen, plasserer nerven på klemmens underkjeve og lukker klemmen ved å låse den i første posisjon i tre ganger ti sekunder. Posisjonen til isjiasnervens forelskelse ligger nær isjias hakket, proksimal til divisjonsstedet til hovedisjiasnerven. Etter knuseskaden åpner du klemmen forsiktig igjen. Isjiasnervens knusested virker gjennomsiktig.
- Fjern gummibåndets retraktorer.
- Lukk fascialplanets snitt med resorberbar 4-0 sutur. Lukk hudsnittet med kroppshudstifter.
- Påfør Rimadyl i henhold til GV-SOLAS retningslinjer (5 mg/kg kroppsvekt, subkutan injeksjon) for postoperativ smertelindring hver 24 timer etter operasjonen i to dager.
- Fjern rotten fra operasjonsoppsettet. Plasser rotten i et rent bur uten sengetøy på en varmeplate (37 °C) til rotten er våken. Flytt rotten tilbake til sitt rene hjemmebur.
- Fjern kroppshud stifter fire til seks dager etter operasjonen.
2. Åpen felttest (OFT)
MERK: Lokomotorisk aktivitet samt atferdsaktivitet kan analyseres av OFT.
- Installasjonsprogrammet
- Sett opp OFT (figur 1A) i et mørkt og stille miljø. Den består av det automatiserte videosporingssystemet EthoVision XT (datamaskin, programvare med lisens) og en arena som måler 58,5 cm (lengde) x 58,5 cm (bredde) x 45 cm (høyde) med en ripebestandig, renbar svart overflate. Den svarte overflaten er viktig for å øke kontrasten når du sporer hvite dyr.
- vurdering
- Plasser arenaen og kameraet i riktig posisjon. Juster kameraet som hele den åpne feltboksen med best oppløsning er tatt opp. Utfør eksperimentet i et mørkt miljø. Hvis det er behov for lys for oppsettet, bruk et lite og diffust lys for å unngå lyspunkter, refleksjoner og nyanser i arenaen. Sikre like lette forhold ved å måle belysningen med en lux meter i ulike områder av arenaen.
- Sett opp EthoVision XT-programvaren. De viktigste innstillingene er oppført i følgende. I Eksperimenteringsinnstillinger velger du Direkte sporing for videokilden og gjenkjenning av midtpunkt for sporede funksjoner. Valider størrelsen på arenaen i Arenainnstillinger. Sett startbetingelsen for datainnsamling til tre sekunder etter at rotten ble plassert midt på arenaen og den totale kjøretiden til fem minutter i Trial Control Settings. Velg Statisk subtraksjon for metoden i søkeinnstillinger. Merk av for Lagre video for metode i anskaffelsesinnstillinger.
- Plasser rotten forsiktig midt på testarenaen (Figur 1B).
- Trykk på Start prøveversjon-knappen i Anskaffelseskontroll for å starte innspillingen.
- Hold deg unna OFT-oppsettet under innspillingen for å unngå å distrahere rotten.
- Etter hver prøve, fjern rotten forsiktig fra testarenaen og rengjør oppsettet med 0,1% eddiksyre for å unngå distraksjon av lukten av den tidligere registrerte rotten.
- Dataanalyse
- For dataanalyse av OFT med EthoVision XT-programvaren, gå til Analyse -delen i venstre sidelinje og velg Spor visualisering under kategorien Resultater (Figur 1C). Deretter eksporterer du de nødvendige parameterne til Excel. I programvaren velger du en rekke variabler fra forskjellige kategorier for dataanalyse. Viktige variabler for dette spesifikke vitenskapelige målet er "Avstand flyttet" og "Hastighet" under kategorien "Avstand og tid". Utføre en statistisk analyse av de valgte parameterne (Figur 1D).
3. CatWalk XT gang analyse
MERK: En ganganalyse via CatWalk XT-systemet kan bidra til å vurdere mange forskjellige parametere angående fotavtrykk, holdning og gang av dyremodeller. En glassgang er opplyst med grønt lys og lyset spredt av dyrenes fotavtrykk er fanget med et høyhastighets videokamera, som ligger under gangveien. Signalene kan analyseres med CatWalk XT-programvaren.
- Installasjonsprogrammet
- For ganganalyse med CatWalk XT, bruk CatWalk-systemet og tilsvarende programvare (datamaskin, programvare med lisens) (Figur 2A).
- Utfør eksperimentet under mørke forhold, fordi datainnsamling avhenger av belysningen av gangveien til CatWalk-systemet med grønt LED-lys. For å lette den eksperimentelle prosedyren under mørke forhold, belys det eksperimentelle rommet med rødt lys.
- Bruk en definert gangvei som måler 65 cm i lengde og 7 cm i bredde; Størrelsen på gangveien avhenger imidlertid av størrelsen på rottene. Sett opp gangveien så stor som mulig for å registrere så mange fotavtrykk som mulig for hver pote.
- Fang opp et minimum antall på tre fotavtrykk per pote for hver løpetur. Når du definerer lengden på gangveien, bør du vurdere rottens kropp og hale, da start- eller stoppsignalet kanskje ikke oppdages riktig, og løpene kan ikke klassifiseres som kompatible, hvis kroppen / halen kommer inn eller forblir på den definerte gangveien før eller etter fullføring av løpet.
- opplæring
MERK: Trening av rotter for CatWalk-systemet er nødvendig for å habituate dyrene til oppsettet og la dem lære å krysse gangveien uten avbrudd. Riktig opplæring gir fordelene ved å spare tid under eksperimentell vurdering og oppnå bedre resultater. Ved å starte datainnsamlingen av CatWalk-systemet under treningsøkter, kan rottene venne seg til vurderingsforholdene (støy/lys).- Begynn å sette opp CatWalk-systemet.
- Rengjør glassgangen med destillert vann og en lofri, myk klut. I begynnelsen og på slutten av eksperimentet, eller i mellom hvis glassgangen er skitten, bruk glassrengjøringsvæske og lofri myk klut for å rengjøre glassgangen. Etter bruk av glassrengjøringsvæske, fjern gangveien fra rester av væsken for å unngå at det distraherer dyret.
- Velg de eksperimentelle innstillingene. En viktig parameter er Kjør vilkår. Angi riktige verdier for Minimum kjørevarighet, Maksimal kjørevarighetog Minimum antall kompatible kjøringersom skal anskaffes , som er spesifikke for hvert forskningsprosjekt. Merk av for Bruk maksimal tillatt hastighetsvariasjon, og angi verdien. Kjør-kriteriene kan ignoreres for de første fire til fem dagene med trening.
- Plasser kameraet på plass og juster fokuset. Finn den optimale kameraposisjonen for å oppnå en passende lengde på gangveien og den beste oppløsningen til de innspilte potene samtidig. Merk kameraposisjonen på CatWalk-systemet for å sikre identisk kameraplassering mellom opptakene.
- Konfigurer gjenkjenningsinnstillingene ved hjelp av automatisk gjenkjenning for et nytt eksperiment. Forsikre deg om at alle fotavtrykk kan oppdages med minimal bakgrunnsstøy . Optimaliser om nødvendig gjenkjenningsinnstillingene manuelt og endre grønn intensitetsterskel. Bruk de samme gjenkjenningsinnstillingene for hele eksperimentet.
- Sett opp korridorveggene til CatWalk-systemet. Korridorveggene skal være så nært som mulig for rotten. Pass på at korridorveggene forblir parallelle med gangveien.
- Definer lengden på gangveien: Klikk på ikonet Definer gangvei. Juster størrelsen på det hvite rektangelet i lengde og bredde, i henhold til det spesifikke forskningsprosjektet. Klikk OK.
- Kalibrere gangveien: Klikk på ikonet Kalibrer gangvei. Plasser et rektangulært kalibreringsark som måler 20 x 10 cm midt på gangveien. Tilpass størrelsen på det hvite rektangelet til kalibreringsarket. Klikk OK.
- Deretter knipser du et bakgrunnsbilde: Kontroller på forhånd at gangveien er ren og tom. Klikk Fest bakgrunn for å generere et bakgrunnsbilde.
- Tren dyr i minst åtte dager før du starter selve eksperimentet. Opplæringen på etterfølgende dager anbefales.
- Dag 1 av trening: For rotter å bli vant til CatWalk-systemet, la dyret fritt utforske gangveien og målboksen. La rottene øve seg på å krysse gangveien og gå inn i målboksen. Plukk opp rotten på slutten av gangveien eller i målboksen og ta rotten tilbake til startpunktet for gangveien. Fem løp anbefales for den første treningsdagen uten behov for overholdelse av de eksperimentelle innstillingene.
- Dag 2 av trening: Rotter kan fritt utforske gangveien og målboksen. Fem kjøringer anbefales uten overholdelse av de eksperimentelle innstillingene.
- Opplæringsdag 3: Åtte løp anbefales uten å overholde de eksperimentelle innstillingene.
- Opplæringsdag 4: Ti løp anbefales uten overholdelse av de eksperimentelle innstillingene.
- Dag 5 av trening: Ti løp anbefales. De eksperimentelle innstillingene bør huskes. Motiver rottene til å krysse gangveien uten avbrudd.
- Treningsdag 6: Ti løp anbefales. De eksperimentelle innstillingene bør huskes. Motiver rottene til å krysse gangveien uten avbrudd.
- Treningsdag 7: Ti løp anbefales. Minst tre kompatible kjøringer bør oppnås. Legg til flere løp for dyr, hvis de ikke klarte å nå dette målet.
- Dag 8 av trening: Ti løp anbefales. Minst tre kompatible kjøringer bør oppnås. Legg til flere løp for dyr, hvis de ikke klarte å nå dette målet.
- Begynn å sette opp CatWalk-systemet.
- vurdering
- I henhold til de definerte kjørekriteriene utfører du tre kompatible kjøringer per rotte for dataanalyse. For vurderingen, følg trinn 3.2.1. - 3.2.1.8. som beskrevet i opplæringsdelen. Selv om rotten når tre kompatible løp i løpet av de tre første løpene, utfør minst seks løp per økt / per uke for treningsformål.
- Utfør minst én (treningsøkt) økt med seks løp per uke for et stabilt gangmønster for eksperimenter med flere tidspoeng. Eksperimentelle innstillinger og gjenkjenningsinnstillinger forblir konsekvente for hele eksperimentet.
- Dataanalyse
- For dataanalyse evaluerer du bare kompatible kjøringer. Slett ikke-kompatible kjøringer.
- Kontroller den grønne intensitetsterskelen og øk eller reduser grønn intensitetsterskel før klassifisering av poteutskriftene om nødvendig. Grønn intensitetsterskel må være konsekvent for alle dyr og alle løp.
- Kliturpotetrykk automatisk med CatWalk XT-programvaren (Figur 2B).
- Se gjennom poteutskriftsetiketter manuelt. Korriger feil poteutskriftsetiketter, legg til etiketter med ikke-oppdagede poteutskrifter, og slett støy og feil etiketter manuelt. Flytt videoen til en posisjon, som må gjennomgås manuelt. Hvis du vil korrigere feil merkede poteutskrifter, merker du rektanglet for den bestemte poteutskriften, klikker Tilbakestill, merker det samme rektangelet på nytt og tilordner riktig etikett fra listen. Hvis du vil merke poteutskrifter som ikke oppdages, tegner du et rektangel rundt poten som ikke oppdages, klikker Legg til utskrift, merker det nye genererte rektangelet og tilordner riktig etikett fra listen. Hvis programvaren merket nese eller brødtekst skrives ut automatisk, merker du rektanglet for den bestemte etiketten og klikker Fjern utskrift.
- Se gjennom de numeriske resultatene. De numeriske resultatene vises i et Excel-ark, som viser en rekke grunnleggende parametere. Velg forhåndsdefinerte spesifikke parametere, avhengig av forskningsinteressen og utfør statistisk analyse som vanlig (Figur 2D).
- For mer detaljert informasjon om hvert fotavtrykk, klassifiser tåene på bakpotene. Denne analysen krever modulen Interaktive fotavtrykksmålinger.
- Tilpass grønn intensitetsterskel for analysen av interaktive fotavtrykksmålinger om nødvendig. Grønn intensitetsterskel må være konsekvent for alle dyr og alle løp.
- Angi markørene for fotavtrykksanalysen manuelt. Analyser hver bakpoteutskrift i alle tre kompatible kjøringer. Tegn en linje fra midten av den første tåen til midten av den femte tåen for å måle "Tåoppslag". Tegn en linje fra midten av den andre tåen til midten av den fjerde tåen for å måle "Mellomliggende tåoppslag". Tegn en linje fra midten av den tredje tåen til hælen på bakpoten for å måle "Manuell utskriftslengde" (Figur 2C).
- Se gjennom de numeriske resultatene av "Interaktive fotavtrykksmålinger" som vises i et eget ark. Velg spesifikke parametere for "Interaktive fotavtrykksmålinger" og utfør statistisk analyse som vanlig (Figur 2E).
4. Beam walking oppgave
MERK: Gangunderskudd kan bestemmes av strålevandringsoppgaven. Fokuset for strålevandringsoppgaven i dette spesifikke forskningstemaet vil være analyse av motorisk koordinering, definert som evnen til å koordinere muskelaktivering fra flere kroppsdeler, og ikke vurdering av motorbalanse, definert som evnen til postural kontroll under kroppsbevegelser.
- Installasjonsprogrammet
- For strålevandringsoppgaven bruker du bjelke, avstandsstykke, bord, ensartet bakgrunn og et videokamera (figur 3A).
- Bruk en trebjelke på 90 cm i lengde, 1,7 cm i bredde og 2 cm i høyden. En plattform på 20,5 cm i lengde, 15 cm i bredde og 2 cm i høyden i begge ender av bjelken anbefales. Bruk det samme materialet til plattformene og bjelken, unngå barrierer mellom plattformene og bjelken.
- Ha avstanden mellom bjelken og bordet være minst 44 cm. Et kjent miljø som et hjemmebur motiverer rottene til å krysse bjelken, som kan plasseres på enden av bjelkeplattformen.
- opplæring
- Sett opp bjelken med avstandsstykke og hjemmebur på bordet.
- Tren dyr i syv dager. Opplæringen på etterfølgende dager anbefales.
- Dag 1 av trening
- Plasser alle rotter fra ett hjemmebur på startplattformen til bjelken.
- La rottene utforske miljøet (plattform/stråle).
- Hold en rotte forsiktig ved halen og før rotten til strålen ved å skyve rotten forsiktig på strålen.
- Assister rotten i å krysse strålen ved å holde rotten ved halen i minst to løp.
- La rotten krysse strålen i tre løp til uten hjelp. Følg rotten og gi hjelp om nødvendig. Hvis rotten ikke klarer å krysse strålen, avskjærer du fallet for å unngå skader og utvikling av frykt for å krysse strålen.
- Fortsett med denne prosedyren for alle rotter.
MERK: Noen ganger følger rotter hverandre for å krysse strålen, i så fall er det ikke nødvendig med hjelp. Det er imidlertid viktig å observere rotter, avskjære fall og gi hjelp om nødvendig.
- Dag 2 av trening
- Plasser alle rotter fra ett hjemmebur på startplattformen til bjelken.
- La rottene krysse strålen seks ganger.
- Om nødvendig, gi hjelp og avskjære fall.
- Dag 3 av trening
- Plasser en rotte på startplattformen til bjelken.
- La rotten krysse strålen seks ganger.
- Om nødvendig, gi hjelp og avskjære fall.
- Dag 4-7 av trening
- Plasser en rotte på startplattformen til bjelken.
- La rotten krysse strålen ti ganger.
- Om nødvendig, gi hjelp og avskjære fall.
- På slutten av treningen skal rotten krysse strålen uten avbrudd i minst tre løp. Det er tillatt å forsiktig skyve rotten på startplattformen for å utløse initiering av bevegelse.
- Dag 1 av trening
- vurdering
- Sett opp bjelken med avstandsstykke og hjemmebur på bordet.
- Plasser videokameraet på plass, justert parallelt med strålen med dyret i fokus. Videokameraets posisjon bør være så nær som mulig for dyret for å oppnå optimal oppløsning av de registrerte bevegelsene. Bjelken og deler av begge plattformene skal fanges opp av innspillingen.
- Start opptaket og identifiser først økten og dyret.
- Plasser rotten på startplattformen til strålen.
- Rotten skal krysse strålen tre ganger uten avbrudd. Selv om rotten når tre kompatible løp i løpet av de tre første løpene, utfør minst seks til ti løp for kontinuerlig oppgaveytelse.
- Vær alltid oppmerksom på dyret og avskjære fall, om nødvendig.
- Etter oppgaven, rengjør strålen og bordet med 0,1% eddiksyre for å unngå distraksjon av lukten av den tidligere registrerte rotten.
MERK: I løpet av de to første ukene etter nervepisningsskaden kan ikke rottene krysse strålen uten hjelp. Derfor må det gis hjelp til seks til åtte løp de to første ukene etter nervepirningsskade. Fra uke tre til uke fem utføres fem løp med assistanse, og ytterligere ti løp ble utført uten hjelp.
- Dataanalyse
- Bruk den gratis videoanalyseprogramvaren Kinovea for dataanalyse.
- Velg videosekvensene for tre kompatible kjøringer fra innspillingen. For dette velger du de tre første kompatible løpene som ble utført uten hjelp av dyret. Vær konsekvent i det kompatible kjørevalget for alle rotter.
- Definer starttidspunktet og sluttidspunktet for de tre valgte kompatible kjøringene (Figur 3D-E). I dette oppsettet ble startpunktet merket med en svart linje på bjelken og plasseringen av den første bakbenet bak den svarte linjen definerte starttidspunktet for løpet. Plasseringen av det første bakbenet på plattformen på slutten av bjelken definerer sluttidspunktet.
- Deretter beregner du tiden som trengs for at rotten skal krysse strålen. Rapporter data som ventetid for å krysse strålen i sekunder og utføre statistisk analyse som vanlig (Figur 3B).
- Score antall trinn og feil fra tre kompatible kjøringer for begge hindlimbs separat ved hjelp av zoom og slow motion funksjon av programvaren. Feil inkluderer totalt antall fotslipper og halvfotslipper. En total fotglidning defineres som en fotplassering som etterfølges av en dyp sklie som forårsaker tap av kontakt med den berørte poten med bjelken (figur 3F). En halv slip er definert som en pote som glir av sideveggen på bjelken uten å miste fullstendig kontakt med bjelken (Figur 3G).
- Beregn prosentandelen av fotslipper i forhold til antall trinn for å krysse strålen ((antall fotslipper på lemmen x 100%)/ antall trinn i samme lem). Presentere data som prosentvis fotsklipp og utføre statistisk analyse som vanlig (Figur 3C).
5. Stige rung gå oppgave
MERK: Stigen rung walking oppgave kan vurdere motorisk funksjon, plassering av både frontlimbs og hindlimbs, og interlimb koordinering.
- Installasjonsprogrammet
- Bruk et stigeløpsapparat, avstandsstykke, bord, ensartet bakgrunn og videokamera til denne atferdstesten (Figur 4A). Det horisontale stigeløpeapparatet består av metallstøt og klare polykarbonat sidevegger. Apparatet har en lengde på 119,5 cm og bredden er justert til 7,4 cm. Gangveien som skal analyseres har en lengde på 100 cm.
- Merk start- og sluttpunktet med en svart linje på sideveggen. Plasser plassholdere for rungs på apparatet med 1 cm intervaller. Ordne et uregelmessig mønster av rungs for 100 cm gangvei med en avstand mellom 1 og 5 cm mellom trinnene. De første 10 cm i begynnelsen og de siste 9,5 cm på slutten av apparatet, som er utelukket fra analyse, har et vanlig mønster av rungs med en avstand på 1 cm.
- Bruk en avstand mellom gangveien og bordet på ca. 30 cm (Figur 4A-B). En målboks eller et kjent miljø på slutten av apparatet, som et hjemmebur, motiverer rottene til å krysse stigeløpsapparatet.
- opplæring
- Sett opp stigeløpsapparatet med avstandsstykke og målboks på bordet.
- Tren dyr i åtte dager. Opplæringen på etterfølgende dager anbefales.
- Dag 1 av trening
- Plasser alle rotter fra ett hjemmebur på stigeløpsapparatet.
- La rottene utforske miljøet (stigeløpsapparat/målboks).
- Skyv rottene forsiktig inn i retning av målboksen. Hjelp rottene med å komme inn i målboksen. La rottene utforske målboksen en stund.
- Etter at alle rotter kom inn i målboksen. Ta den første rotten fra målboksen og plasser rotten på apparatets startsone igjen. Fortsett med samme prosedyre for alle rotter i ett hjemmebur. Skyv rottene forsiktig inn i retning av målboksen og gi hjelp til å komme inn i målboksen om nødvendig.
- La rotten krysse apparatet fire ganger.
- Dag 2 av trening
- Utfør den samme protokollen som er oppført for første treningsdag.
- La rotten krysse apparatet seks ganger.
- Dag 3 av trening
- Utfør den samme protokollen som er oppført for første treningsdag.
- La rotten krysse apparatet åtte ganger.
- Dag 4 av trening
- Plasser en rotte på starten av stigeløpsapparatet.
- Hvis rotten ikke krysser apparatet og går frivillig inn i målboksen, gi hjelp ved å forsiktig skyve rotten bakfra.
- La rotten krysse apparatet åtte ganger.
- Dag 5-8 av trening
- Plasser en rotte på starten av stigeløpsapparatet.
- Hvis rotten ikke krysser apparatet og går frivillig inn i målboksen, gi hjelp ved å forsiktig skyve rotten bakfra.
- La rotten krysse apparatet ti ganger.
- På slutten av treningen skal rotten kunne krysse gangveien uten avbrudd og assistanse i minst tre løp. Det er tillatt å gi rotten et forsiktig trykk i startsonen for å utløse initiering av bevegelse.
- Dag 1 av trening
- vurdering
- Sett opp stigeløpsapparatet med avstandsstykke og målboks på bordet.
- Plasser videokameraet på plass, justert parallelt med apparatet med dyret i fokus. Plasser videokameraet så nært som mulig til dyret for å oppnå optimal oppløsning av de registrerte bevegelsene og sørg for at hele stigeløpsapparatet fanges opp i opptaket.
- Start opptaket og identifiser først økten og dyret.
- Plasser rotten på startsonen til stigeløpsapparatet.
- Rotten må krysse den 100 cm lange gangveien til stigeløpsapparatet tre ganger uten avbrudd for at den skal kvalifisere seg som et kompatibelt løp. Selv om rotten når tre kompatible løp i løpet av de tre første løpene, bør minst ti løp utføres for kontinuerlig oppgaveytelse.
- Etter oppgaven, rengjør apparatet og bordet med 0,1% eddiksyre for å unngå distraksjon av lukten av den tidligere registrerte rotten.
- Dataanalyse
- Bruk den gratis videoanalyseprogramvaren Kinovea for dataanalyse.
- Velg videosekvensene for tre kompatible kjøringer fra innspillingen. Velg de tre første kompatible kjøringene for dataanalyse.
- Definer starttidspunktet og sluttidspunktet for de valgte tre kompatible kjøringene. Plasseringen av den første bakbenet bak den første svarte linjen på sideveggen til apparatet, som merker starttidspunktet for 100 cm gangveien, definerer starttidspunktet for løpet. Plasseringen av den første frontlimben bak den andre svarte linjen på sideveggen til apparatet, som merker sluttpunktet på 100 cm gangveien, definerer sluttidspunktet for løpet.
- Identifiser start- og sluttidspunktet. Deretter beregner du varigheten av løpeturen over gangveien. Rapporter data som ventetid for å traversere gangveien i sekunder og utføre statistisk analyse som vanlig (Figur 4C).
- Skår de tre kompatible kjøringene med 7-kategoriskalaen fra Metz et al. ved å bruke sakte film eller ramme-for-ramme-funksjonen til programvaren (Figur 5)16,17. Bestem antall trinn og antall feil i samsvar med kategoriene av skalaen for hver lem separat. Vekten skiller mellom følgende kategorier: (0) total bom (1) dypslipp (2) liten glidebryter (3) utskifting (4) korreksjon (5) delvis plassering, og (6) riktig plassering. Bare feilen i den initierende lemmen ble vurdert. Ytterligere feil, utløst av den første feilen, bør ikke vurderes.
- Beregn feilene/trinnet ved å vurdere følgende krav. Kategoriene (0) total miss (1) deep slip (2) slight slip teller som en feil. Del antall feil med antall trinn for hvert bakben, og hver kjøring separat. Bestem gjennomsnittsverdien for alle tre kompatible løp for hvert dyr og hvert bakben separat og utfør statistisk analyse som vanlig (Figur 4D).
Representative Results
De representative resultatene fra de fem minuttene OFT viser at nerveknusingsskaden fem uker etter operasjonen ikke har noen effekt på den lokomotoriske aktiviteten (figur 1).
Ganganalyse med CatWalk XT-systemet (figur 2) genererer mange forskjellige parametere. Selektive parametere ble statistisk analysert ved å sammenligne wt naive rotter med nervesårne wt rotter fem uker etter nerveknusingen (Figur 2D). Betydelige endringer kan oppdages for løpet gjennomsnittlig hastighet, skrittlengden og utskriftsområdet til den nerve-skadede (høyre) bakpoten. En mer detaljert analyse av den nervesunge bakpoten ble utført med modulen "Interactive Footprint Measurements". En betydelig reduksjon av parametrene tåspredning, mellomliggende tåspredning og utskriftslengde ble observert hos nervesårne wtrotter sammenlignet med wt naive rotter. I tillegg varierer potevinkelens kroppsakse og potevinkelbevegelsesvektoren betydelig når man sammenligner nervesårne wtrotter med wt naive rotter (Figur 2E).
Figur 3 presenterer data om motorisk koordinering innhentet gjennom strålevandringsoppgavevurdering. Nerveskadede wt rotter viste en betydelig økt latenstid for å krysse strålen sammenlignet med wt naive rotter fem uker etter skade (Figur 3B). Som en ekstra lest ut av strålen walking oppgave, full slips og halv slips av nerve-skadet hindlimb ble regnet og betraktet som en feil for statistisk analyse. Prosentandelen feil per trinn i den nerveskarde (høyre) bakbenet ble betydelig økt hos nerveskarde wt rotter sammenlignet med wt naive rotter.
Representative data for stigen rung walking task (Figur 4) viser ikke signifikante endringer i latenstiden for å krysse gangveien til stigeløpsapparatet (figur 4C) eller i prosentandelen feil per trinn i nerveskarmet (høyre) bakben (figur 4D). Analysen av feilprosenten per trinn i det nerveskadde bakbenet vurderte bare poengsummen fra 0 til 2 av 7-kategoriskalaen fra Metz et al. Fordelingen av alle poengsumkategorier per trinn fra 7-kategoriskalaen til det nerveskadde bakbenet og det ikke-nerveskadde (venstre) bakbenet er illustrert i figur 4E.
Figur 1: Vurdering av lokomotorisk aktivitet under åpen felttest. (A) Bilde av det åpne felttestoppsettet. Valgt bilde trukket fra en innspilt video under åpen felttest som viser en rotte i den åpne feltarenaen uten (B) og med (C) sporing. (D) Hastigheten i løpet av fem minutter åpne felt test opptak ble undersøkt i wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveknusing skade. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av den ikke-uparrede t-testen av de normalt distribuerte dataene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ganganalyse med CatWalk XT-systemet. (A) Bilde av CatWalk XT-apparatet. (B) Eksempler på utskriftsvisningen som viser de merkede poteutskriftene i falsk fargemodus og eksempler på tidsvisningen som viser tidsbasert gangdiagram over wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveforelskelsesskade. (C) Eksempler på tåklassifiseringen som viser tåspredningen (TS), mellomliggende tåspredning (ITS) og utskriftslengde (PL) samt eksempler på kroppsaksevisningen som viser kroppsaksen (hvit linje) og bevegelsesvektoren (rød linje) av wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveknusingsskade. (D) Data om utvalgte parametere fra "standard" klassifisering som sammenligner wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveknusing skade. (E) Data om utvalgte parametere fra modulen "Interactive Footprint Measurements" som sammenligner wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveknusingsskade. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av den ikke-uparrede t-testen av de normalt distribuerte dataene, uparret t-test med Welchs korrigering av normalt distribuerte data med ulik varians og Mann-Whitney U-test av de ikke-normale distribuerte dataene. P-verdi < 0,05 ble definert som statistisk signifikant merket som *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ganganalyse med strålevandringsoppgaven. (A) Bilde- og skjematiske tegninger av strålevandringsoppgaveoppsettet. Latenstiden for å krysse strålen (B) og de prosentvise fotslippfeilene per trinn i det nerveskadede bakbenet under strålevandringsoppgaven (C) ble analysert i wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveforelskelsesskade. Representativt bilde for starttidsstilling (D) og endetidsposisjonen (E) for strålevandringsoppgaven. Representativ bildesekvens av en full slip-feil (F) og en halv slip-feil (G) av strålevandringsoppgaven. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Mann-Whitney U-testen av de ikke-normale distribuerte dataene. P-verdi < 0,05 ble definert som statistisk signifikant merket som *p < 0,05, **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ganganalyse ved hjelp av stigen rung walking task. Bilde (A) og skjematiske tegninger (B) av stigen rung walking oppgaveoppsett. Latenstiden for å krysse stigeløpsapparatet (C) og de prosentvise fotslippfeilene per trinn i det nerveskadede bakbenet under stigen rung walking task (D) ble vurdert hos wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveknusingsskade. (E) Prosentfordelingen av poengsumkategorien per trinn i henhold til 7-kategoriskalaen fra Metz et al. for venstre og høyre bakben av wt naive rotter og wt rotter fem uker etter nerveknusing skade. Data vises som gjennomsnittlig ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av den uparrede t-testen av de normalt distribuerte dataene og Mann-Whitney U-testen av de ikke-normale distribuerte dataene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksemplarisk representasjon av hver kategori i henhold til 7-kategoriskalaen fra Metz et al. under stigen rung walking oppgave. Representativ bildesekvens fra høyre bakben i kategori 0 - total bom, kategori 1 - dyp slip, kategori 2 - liten slip, kategori 3 - erstatning, kategori 4 - korreksjon, under stigen rung walking oppgave. Representative bilder for kategori 5 - delvis plassering og kategori 6 - riktig plassering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne atferdsmessige vurderingsprotokollen gir en oversikt over fordeler og ulemper, samt mulige avlesninger av det valgte atferdstestbatteriet i en gnagermodell etter isjias nerveknusingsskade.
For å oppnå et komparativt utfall av isjias nerveknusingsskaden, er en konsekvent knuseteknikk obligatorisk. Bruk av en ikke-serrated klemme (Ultra Fine Hemostat) i stedet for tang kan forbedre konsistensen av forelskelsen. Bruk samme klemme så vel som samme knuseposisjon for å garantere lik nervekompresjon. Den eksklusive bruken av klemmen for knuseskade og håndtering av klemmen med forsiktighet forbedrer konsistensen. Utfør også prosedyren for forelskelsesskaden med forsiktighet. Ytterligere skade på nerven under operasjonen som uønsket trekkraft av nerven kan føre til uønskede bivirkninger som automutilation. Derfor anbefales en forsiktig nerveforberedelse samt administrering av en smertestillende i minst to dager.
Multifaktoriell vurdering av motorisk oppførsel kan karakterisere fenotypen etter nerveknusingsskade hos rotter på ulike nivåer. Vi brukte OFT, CatWalk XT ganganalyse, strålevandringsoppgave og stigeløpsoppgave. En blindet eksperimentell prosedyre og dataanalyse til eksperimentelle grupper er avgjørende for disse eksperimentene. Før atferdsvurdering ble dyr akklimatiserte i testrommet under testforhold i minst 30 minutter. Alle atferdstestene som brukes her, har fordelen at mat eller vannmangel ikke er nødvendig. Det samme gruppesettet med dyr ble brukt i alle beskrevne atferdstester. Maksimalt to forskjellige atferdstester per dag ble utført for hvert dyr. Hvis atferdstester utføres med jevne mellomrom, vær oppmerksom på en sammenlignbar prosedyre, som å utføre testen i samme dyrerekkefølge og samtidig på dagen. Et ytterligere viktig aspekt for atferdsanalyse er rotters dag-natt syklus. Vurder en omvendt dag-natt syklus for å oppnå mer naturlige og høyere nivåer av aktivitet på dagsyklusen (mørk syklus). Dette må vurderes spesielt for måling av spontan oppførsel, som OFT. I dette eksperimentet kunne ikke en omvendt dag-natt syklus implementeres, men en tilstrekkelig akklimatisering til testforholdene ble sikret. En perfekt belysning er avgjørende for høyoppløselige videoer for strålevandringsoppgaven og stigen rung walking oppgave. Denne høye videokvaliteten kan ikke nås når du utfører eksperimenter i mørket.
Vurderingen av gang krever en kontinuerlig oppgaveytelse. Det første viktige aspektet ved en kontinuerlig oppgaveytelse er å overbevise dyrene om å krysse oppsettet. For å øke motivasjonen, plasser små matpellets (45 mg) på slutten av oppsettet. For at dyr skal bli kjent med matpellets, bør pelletsene mates til dem før testing. Det kan også være nyttig med en målboks på slutten av oppsettet. Oppsettet av CatWalk inkluderer allerede en målboks, men rotter nøler noen ganger med å gå inn i målboksen. Alternativt kan du legge til et lite bur i målboksen, men hjemmeburet fra rotter passer ikke inn i målboksen. La rotten habituate i buret i noen minutter før oppkjøpet. I tillegg kan en annen rotte fra samme hjemmebur plasseres i målboksen eller inn i buret inne i målboksen. Pass på at den andre rotten forblir i esken og ikke blokkerer inngangen til målboksen. Videre er det også mulig å fjerne målboksen fra CatWalk-systemet og plassere rottehjemburet på slutten av gangveien, noe som gjør at rotten kan komme inn i sitt "hjemmeområde" etter hvert løp. For oppsett av strålevandringsoppgaven og stigen rung walking oppgave, anbefaler vi å legge til en målboks eller hjemmeburet på slutten av oppsettet. For å sikre konsistens, bør CatWalk, strålevandringsoppgaven og stigen rung walking oppgave utføres minst en gang i uken med seks til ti løp.
Selv om ikke alle analyser ga signifikante forskjeller i denne studien, bør du vurdere at en inkludering av genmodifiserte dyr eller behandlingsgrupper kan produsere verdifulle data som kan skille mellom grupper fra de samme atferdstestene.
Nerveknusingsskaden hadde ingen effekt på rottens lokomotoriske aktivitet, som ble målt i en fem minutters OFT. Catwalk XT ganganalyse er et mer objektivt og følsomt verktøy for å analysere gang-, pote- og tåplassering. Etter en intensiv trening lærer rottene å krysse gangveien til CatWalk XT-apparatet til standardinnstillingene. Nerveskaden reduserer ikke rottens evne til å krysse gangveien. Den automatiske beregningen av ulike parametere presenterer dataene objektivt. Ytterligere informasjon kan oppnås ved å bruke modulen "Interactive Footprint Measurements", og disse analysene ga faktisk betydelige forskjeller i ulike parametere for tåspredning, utskriftslengde og potevinkel med kroppsakse som sammenlignet rotter med og uten nerveskade.
Rotter kan enkelt trenes for strålevandringsoppgaven. Forskjeller i latenstiden for å krysse strålen og i antall fotslipper per trinn i det nerveskarpede bakbenet ble oppdaget ved å sammenligne naiv med knuse-skadede rotter. En ulempe med å analysere nervesårne rotter med strålevandringsoppgaven er størrelsen på strålen. I løpet av de to første ukene etter isjiasnervekningsskaden trenger rottene hjelp til å krysse strålen da balansen er svekket. Selv om noen rotter kan være i stand til å krysse bjelken, er risikoen for skader forårsaket av et fall høy. Nerveknuste dyr bør derfor assisteres til å krysse strålen de første to ukene etter isjias nerveknusingsskade eller lenger, om nødvendig. Det er imidlertid vanskelig å sammenligne løp med og uten hjelp. Motorbalansen er også en viktig parameter vurdert av strålevandringsoppgaven. Vi anså denne parameteren for ikke å være relevant for vår nerveknusing rotte modell. Derfor kunne ikke score beskrevet av Ohwatashi et al. og Johansson &Ohlsson brukes, og løp med ufullstendig stråletravers ble utelukket for dataanalyse18,19.
Skalaen i 7-kategorien fra Metz et al. kan analysere både for- og bakben og skille mellom forskjellige alvorlighetsgrader av feil i alle lemmer under stigen rung walking oppgave16,17. Ved å analysere de mest fremtredende feilene, som inkluderer kategoriene fra 0 til 2, kan det ikke oppdages noen forskjeller i feil per trinn i bakbenet når man sammenligner nerveskarde wt rotter med naive wt rotter. Videre var ventetiden for å krysse stigeløpsapparatet ikke forskjellig mellom nervesårne wt rotter og wt naive rotter. Dyplæringsmodeller kan forbedre og fremskynde dataanalyse av stigen rung walking oppgave gjennom en automatisert tilnærming.
Det er viktig å nevne at nerveknusingsskaden så vel som alle beskrevne atferdstester lett kan oversettes til mus, ved å tilpasse innstillingene og størrelsene på oppsettene. Bruken av mus som modellorganisme har den gunstige effekten som transgene modeller for mange menneskelige sykdommer eksisterer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (BMBF DysTract til C.W.I.) og av Det tverrfaglige senter for klinisk forskning (IZKF) ved Universitetet i Würzburg (N-362 til C.W.I.; Z2-CSP3 til L.R.). I tillegg har dette prosjektet fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover til J.V.), og fra VERUM Foundation. Videre er C.W.I. finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, av Deutsche Stiftung Neurologie og ParkinsonFonds. L.R. støttes i tillegg av Dystonia Medical Reseach Foundation.
Forfatterne takker Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel og Louisa Frieß for deres tekniske assistanse samt Helga Brünner for dyrepleien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 - laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J.
- Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
- Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson's disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108 (2016).
- Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
- Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226 (2015).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
- Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
- Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
- Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
- Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).
- Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
- Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).
