Summary
Vi tillhandahåller ett protokoll för bedömning av motoriskt beteende via ett beteendetestbatteri hos råttor efter ischias nervkross skada.
Abstract
Induktion av en perifer nerv skada är en allmänt använd metod i neurovetenskap för bedömning av reparation och smärta mekanismer bland andra. Inom forskningsområdet rörelsestörningar har dessutom ischiaskrossskada använts för att utlösa en dystoniliknande fenotyp i genetiskt predisponerade DYT-TOR1A-gnagarmodeller av dystoni. För att uppnå konsekventa, reproducerbara och jämförbara resultat efter en ischias nerv crush skada, är en standardiserad metod för att inducera nerv crush viktigt, utöver en standardiserad fenotypisk karakterisering. Uppmärksamhet måste ägnas inte bara åt det specifika sortimentet av beteendetester, utan också till de tekniska kraven, korrekt körning och på varandra följande dataanalys. Detta protokoll beskriver i detalj hur man utför en ischias nervkross skada och ger ett beteendetestbatteri för bedömning av motoriska underskott hos råttor som inkluderar det öppna fälttestet, CatWalk XT gånganalys, strålgångsuppgiften och stegen rung gånguppgift.
Introduction
Gnagare är utmärkta modellorganismer för att fördjupa förståelsen av mänskligasjukdomar 1,2 genom att testa hypoteser på flera biologiska nivåer. En grundläggande biologisk nivå för karakterisering av gnagare modeller är fenotyp nivå, mätt genom beteendemässiga bedömningar. Beroende på djurmodellen och den vetenskapliga forskningsfrågan är valet av ett kraftfullt och pålitligt beteendetestbatteri viktigt för att täcka ett brett spektrum av beteendeaspekter som för djurmodeller av Parkinsons sjukdom och dystoni3,4,5,6.
Ischiasnerven är den största nerven i människokroppen med motoriska såväl som sensoriska fibrer. Skador på ischiasnerven kan lätt uppstå från en mängd olika händelser som trafikolyckor och operationer7,8. Därför är forskningsaktiviteter med hjälp av gnagaremodeller med ischiasnervskador av translationellt relevant värde. Även om den translationella aspekten av nervregenerering från råtta till människa måste betraktas kritiskt9, är ischiasnervens krossskada (axonotmesis) i gnagaremodeller en vanlig metod för att analysera degeneration och regenereringsprocesser av perifera nerver10,11. Vid en krossskada är nerven inte helt transected. Det skadar axonen, vilket resulterar i ledningsblock direkt efter krossskada följt av regenerativa processer 4,12,13.
Dessutom, i dystoni forskning, är den ensidiga ischias nerv crush skada en etablerad metod för att utlösa dystoni-liknande rörelser (DLM) i genetiskt predisponerade dystoni gnagare modeller, som inte visar DLM i sig4,14. Det antas att perifera nerv trauma stör sensorimotor integration genom att påverka ischias nervfibrer, som är ansvariga för motoriska och sensoriska funktioner15.
Vi ger här en detaljerad beskrivning för en standardiserad kross skada av ischias nerv och ett batteri av motoriska beteende bedömningar som består av öppna fältet test (OFT), CatWalk XT gånganalys, balk gång uppgift och stege rung gång uppgift i naiva vilda typ (wt) råttor (n= 8-9) och wt råttor fem veckor efter ensidiga ischias nerv crush skada (n = 10). OFT ger information om den allmänna lokomotoriska aktiviteten, medan en detaljerad gånganalys uppnås av det automatiserade gånganalyssystemet CatWalk XT. Strålgångsuppgiften används för att bedöma motorkoordinering genom att utvärdera tiden för att korsa balken och antalet fotplaceringsfel. För gångprestandaanalys ger stege rung gånguppgift information om fot- eller tassplacering och fel på en horisontell stege rungapparatur med ett konstant men oregelbundet rungmönster.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av de lokala myndigheterna vid Regierung von Unterfranken (Würzburg, Tyskland) och utfördes i enlighet med tillämpliga internationella, nationella och/eller institutionella riktlinjer för vård och användning av djur.
1. Ischias nerv kross skada
OBS: Håll en steril miljö under hela kirurgiska ingreppet. Ställ upp operationsbordet med nödvändig utrustning.
- Bedöva råttan djupt i ett slutet skåp med isofluran 3,0% i O2 (2 L/min). Ta bort råttan från skåpet. Raka ett omfattande område av höger bakben.
- Placera råttan i anestesimasken och fortsätt djupbedövning med isofluran 2,0% i O2 (2 L/min). Kontrollera anestesidjupet genom att nypa bakfötternas interdigitala band. Avsaknaden av tillbakadragande reflexer indikerar en adekvat anestesi.
- Fixera bålen och båda bakbenen på råttan med tejp. Placera båda bakbenen i ett symmetriskt och utsträckt läge genom att vrida tassen platt på operationsbordet.
- Applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torra ögon. Desinficera huden i det rakade området med ett antiseptiskt medel.
- Sök efter ischiasen i iliumet.
- Gör ett hudsnitt från ischiasen i tassens riktning med en skalpell. Hudsnittet ska vara så litet som möjligt (ca 1 till 2 cm).
- Om bakbenen är fixerade och hudens snitt utförs korrekt, kan en hålighet i fascialplanet mellan gluteus maximusmuskeln och biceps femorismuskeln ses som liknar en "vit linje". Sätt in slutna superfina hemostatiska tångar (nr 5) i hålrummet och sprid tången. Fascialplanet bör öppnas utan att skada någon muskelvävnad.
- Placera gummibandsupprullningsdonen under musklerna för att hålla hudsnittet öppet.
- Ta försiktigt bort eventuell omgivande vävnad och blodkärl från ischiasnerven tills nerven är helt exponerad. Det är viktigt att inte sträcka eller dra nerven under hela proceduren.
- Krossa ischiasnerven med en icke-räffad klämma (ultrafin hemostat) med konstant och reproducerbart tryck. För detta, öppna klämman, placera nerven på klämmans nedre käke och stäng klämman genom att låsa den i det första läget i tre gånger tio sekunder. Positionen för ischiasnervens kross ligger nära ischiasskåran, proximal till delningsplatsen för huvudciciatiska nervbunten. Efter krossens skada, öppna klämman försiktigt igen. Ischiasnervens krossplats verkar genomskinlig.
- Ta bort gummibandsupprullningsdonen.
- Stäng fascialplanssnittet med resorbable 4-0 sutur. Stäng hudsnittet med kroppshudsklammer.
- Applicera Rimadyl enligt GV-SOLAS riktlinjer (5 mg/kg kroppsvikt, subkutan injektion) för postoperativ smärtlindring var 24: e timme efter operationen i två dagar.
- Ta bort råttan från operationsinställningen. Placera råttan i en ren bur utan sängkläder på en värmeplatta (37 °C) tills råttan är vaken. Flytta tillbaka råttan till deras rena hembur.
- Ta bort kroppshudklammer fyra till sex dagar efter operationen.
2. Öppet fälttest (OFT)
OBS: Locomotor aktivitet samt beteendeaktivitet kan analyseras av OFT.
- Installationen
- Ställ in OFT (Figur 1A) i en mörk och tyst miljö. Den består av det automatiserade videospårningssystemet EthoVision XT (dator, programvara med licens) och en arena som mäter 58,5 cm (längd) x 58,5 cm (bredd) x 45 cm (höjd) med en reptålig, renbar svart yta. Den svarta ytan är viktig för att öka kontrasten vid spårning av vita djur.
- bedömning
- Placera arenan och kameran i rätt läge. Justera kameran så att hela den öppna fältrutan med bästa upplösning spelas in. Utför experimentet i en mörk miljö. Om ljus behövs för installationen, använd ett litet och diffust ljus för att undvika ljusfläckar, reflektioner och nyanser i arenan. Säkerställ lika ljusförhållanden genom att mäta belysningspunkten med en luxmätare i olika delar av arenan.
- Konfigurera EthoVision XT-programvaran. De viktigaste inställningarna visas i följande. I experimentinställningarna väljer du Direktspårning för videokällan och centerpunktsidentifieringen för spårade funktioner. Validera storleken på arenan i arenainställningarna. Ställ in startvillkoret för datainsamling till tre sekunder efter att råttan placerats i mitten av arenan och den totala körtiden till fem minuter i Trial Control Settings. Välj Statisk subtraktion för metoden i identifieringsinställningar. Markera Spara video för metod i Förvärvsinställningar.
- Placera råttan försiktigt mitt på testarenan (figur 1B).
- Tryck på knappen Starta utvärderingsversion i Anskaffningskontroll för att starta inspelningen.
- Under inspelningen, håll dig borta från OFT-installationen för att undvika att distrahera råttan.
- Efter varje försök, ta försiktigt bort råttan från testarenan och rengör installationen med 0,1% ättiksyra för att undvika distraktion genom lukten av den tidigare registrerade råttan.
- Dataanalys
- För dataanalys av OFT med EthoVision XT-programvaran, gå till avsnittet Analys i vänster sidofält och välj Spåra visualisering under fliken Resultat (Bild 1C). Exportera sedan de nödvändiga parametrarna till Excel. Inom programvaran väljer du ett antal variabler från olika kategorier för dataanalys. Viktiga variabler för detta specifika vetenskapliga mål är "Avståndsförflyttning" och "Hastighet" under kategorin "Avstånd och tid". Gör en statistisk analys av de valda parametrarna (figur 1D).
3. CatWalk XT gånganalys
OBS: En gånganalys via CatWalk XT-systemet kan hjälpa till att bedöma många olika parametrar för fotavtryck, hållning och gång av djurmodeller. En glasgångväg är upplyst med grönt ljus och ljuset som sprids av djurens fotspår fångas med en höghastighetsvideokamera, som ligger under gångvägen. Signalerna kan analyseras med CatWalk XT-programvaran.
- Installationen
- För gånganalys med CatWalk XT, använd CatWalk-systemet och motsvarande programvara (dator, programvara med licens) (Figur 2A).
- Utför experimentet under mörka förhållanden, eftersom datainsamling beror på belysningen av CatWalk-systemets gångväg med grönt LED-ljus. För att underlätta experimentproceduren under mörka förhållanden, belysa experimentrummet med rött ljus.
- Använd en definierad gångväg som mäter 65 cm i längd och 7 cm i bredd; Storleken på gångvägen beror dock på råttornas storlek. Ställ in gångvägen så stor som möjligt för att spela in så många fotavtryck som möjligt för varje tass.
- Fånga minst tre fotavtryck per tass för varje körning. När du definierar gångvägens längd, tänk på råttans kropp och svans, eftersom start- eller stoppsignalen kanske inte upptäcks korrekt och körningarna kanske inte klassificeras som kompatibla, om kroppen / svansen kommer in eller förblir på den definierade gångvägen före eller efter avslutad körning.
- träning
OBS: Träning av råttorna för CatWalk-systemet är nödvändigt för att vana djuren till installationen och låta dem lära sig att korsa gångvägen utan avbrott. Korrekt utbildning ger fördelarna med att spara tid under experimentell bedömning och få bättre resultat. Genom att starta datainsamlingen av CatWalk-systemet under träningspass kan råttorna vänja sig vid bedömningsförhållandena (buller/ljus).- Börja konfigurera CatWalk-systemet.
- Rengör glasgången med destillerat vatten och en luddfri mjuk trasa. I början och i slutet av experimentet, eller däremellan om glasgången är smutsig, använd glasrengöringsvätska och luddfri mjuk trasa för att rengöra glasgången. Efter användning av glasrengöringsvätska, rensa gångvägen från eventuella rester av vätskan för att undvika att det distraherar djuret.
- Välj de experimentella inställningarna. En viktig parameter är Kör villkor. Ange lämpliga värden för minsta körnings varaktighet, Maximal kör varaktighetoch minsta antal kompatibla körningar som skahämtas , som är specifika för varje forskningsprojekt. Markera rutan Använd maximal tillåten hastighetsvariation och ange värdet. Kör-kriterierna kan ignoreras under de första fyra till fem träningsdagarna.
- Placera kameran på plats och justera fokus. Hitta den optimala kamerapositionen för att uppnå en lämplig längd på gångvägen och den bästa upplösningen på de inspelade tassarna samtidigt. Märk kamerapositionen på CatWalk-systemet för att säkerställa identisk kameraplacering mellan inspelningarna.
- Ställ in identifieringsinställningarna med hjälp av automatisk identifiering för ett nytt experiment. Se till att alla fotavtryck kan upptäckas med minimalt bakgrundsljud . Om det behövs optimerar du identifieringsinställningarna manuellt och ändrar tröskelvärdet för grön intensitet. Använd samma identifieringsinställningar för hela experimentet.
- Sätt upp korridorväggarna i CatWalk-systemet. Korridorväggarna ska vara så nära råttan som möjligt. Se till att korridorväggarna förblir parallella med gångvägen.
- Definiera gångvägens längd: Klicka på ikonen Definiera gångväg. Justera storleken på den vita rektangeln i längd och bredd, enligt det specifika forskningsprojektet. Klicka på OK.
- Kalibrera gångvägen: Klicka på ikonen Kalibrera gångväg. Placera ett rektangulärt kalibreringsark som mäter 20 x 10 cm i mitten av gångvägen. Anpassa storleken på den vita rektangeln till kalibreringsbladet. Klicka på OK.
- Fäst sedan en bakgrundsbild: Kontrollera i förväg att gångvägen är ren och tom. Klicka på knappen Fäst bakgrund för att skapa en bakgrundsbild.
- Träna djur i minst åtta dagar innan det faktiska försöket påbörjas. Träningen på på varandra följande dagar rekommenderas.
- Dag 1 av träning: För råttor att vänja sig vid CatWalk-systemet, låt djuret fritt utforska gångvägen och målrutan. Låt råttorna öva på att korsa gångvägen och gå in i målrutan. Plocka upp råttan i slutet av gångvägen eller i målrutan och ta råttan tillbaka till gångvägens startpunkt. Fem körningar rekommenderas för den första utbildningsdagen utan att behöva följa de experimentella inställningarna.
- Dag 2 av träning: Råttor kan fritt utforska gångvägen och mållådan. Fem körningar rekommenderas utan att de experimentella inställningarna följs.
- Dag 3 av träning: Åtta körningar rekommenderas utan att följa de experimentella inställningarna.
- Dag 4 av träning: Tio körningar rekommenderas utan att följa de experimentella inställningarna.
- Dag 5 av träning: Tio körningar rekommenderas. De experimentella inställningarna bör hållas i åtanke. Motivera råttorna att korsa gångvägen utan avbrott.
- Dag 6 av träning: Tio körningar rekommenderas. De experimentella inställningarna bör hållas i åtanke. Motivera råttorna att korsa gångvägen utan avbrott.
- Dag 7 av träning: Tio körningar rekommenderas. Minst tre kompatibla körningar bör uppnås. Lägg till fler körningar för djur, om de inte kunde nå detta mål.
- Dag 8 av träning: Tio körningar rekommenderas. Minst tre kompatibla körningar bör uppnås. Lägg till fler körningar för djur, om de inte kunde nå detta mål.
- Börja konfigurera CatWalk-systemet.
- bedömning
- Enligt de definierade körningskriterierna ska du utföra tre kompatibla körningar per råtta för dataanalys. För bedömning, följ steg 3.2.1. - 3.2.1.8. som beskrivs i utbildningsavsnittet. Även om råttan når tre kompatibla körningar inom de tre första körningarna, utför minst sex körningar per pass / vecka för träningsändamål.
- Utför minst ett (träningspass) med sex körningar per vecka för ett stabilt gångmönster för experiment med flera tidpunkter. Experimentella inställningar och identifieringsinställningar förblir konsekventa under hela experimentet.
- Dataanalys
- För data analys utvärderar du bara de kompatibla körningarna. Ta bort icke-kompatibla körningar.
- Kontrollera green intensity-tröskeln och öka eller minska grön intensitetströskel innan klassificeringen av tassen skrivs ut om det behövs. Green Intensity Threshold måste vara konsekvent för alla djur och alla körningar.
- Klassificera tassavtryck automatiskt med CatWalk XT-programvaran (Figur 2B).
- Granska tassutskriftsetiketter manuellt. Korrigera fel tassutskriftsetiketter, lägg till etiketter med icke-detekterat tassutskrifter och ta bort brus och fel etiketter manuellt. Flytta videon till en position som måste granskas manuellt. Om du vill korrigera felaktiga märkta tassutskrifter markerar du rektangeln för det specifika tassutskriften, klickar på Återställ, markerar samma rektangel igen och tilldelar rätt etikett i listan. Om du vill märka ej detekterande tassutskrifter ritar du en rektangel runt den icke-detekterande tassen, klickar på Lägg tillutskrift , markerar den nya genererade rektangeln och tilldelar rätt etikett i listan. Om den programmärkta nosen eller brödtexten skrivs ut automatiskt väljer du rektangeln på den specifika etiketten och klickar på Ta bort utskrift.
- Granska de numeriska resultaten. De numeriska resultaten visas i ett Excel-blad som visar ett antal grundläggande parametrar. Välj fördefinierade specifika parametrar, beroende på forskningsintresset och utför statistisk analys som vanligt (figur 2D).
- För mer detaljerad information om varje fotavtryck, klassificera tårna på bakpottarna. Den här analysen kräver modulen Interaktiva fotavtrycksmätningar.
- Anpassa green intensity-tröskeln för analys av interaktiva fotavtrycksmätningar om det behövs. Green Intensity Threshold måste vara konsekvent för alla djur och alla körningar.
- Ställ in markörerna för fotavtrycksanalysen manuellt. Analysera varje bakpotttryck i alla tre kompatibla körningar. Rita en linje från mitten av den första ttan till mitten av den femte t.ex. Rita en linje från mitten av den andra tärningen till mitten av den fjärde tärningen för att mäta "Mellanliggande tåspridning". Dra en linje från mitten av den tredje ttan till bakpotens häl för att mäta "Manuell utskriftslängd" (Bild 2C).
- Granska de numeriska resultaten av "Interaktiva fotavtrycksmätningar" som visas i ett separat blad. Välj specifika parametrar för "Interaktiva fotavtrycksmätningar" och utför statistisk analys som vanligt (figur 2E).
4. Strålvandring uppgift
OBS: Gångunderskott kan bestämmas av strålgångsuppgiften. Fokus för strålgångsuppgiften i detta specifika forskningsämne kommer att vara analys av motorisk koordination, definierad som förmågan att samordna muskelaktivering från flera kroppsdelar, och inte bedömning av motorisk balans, definierad som förmågan till postural kontroll under kroppsrörelser.
- Installationen
- För strålgångsuppgiften, använd balk, distans, bord, enhetlig bakgrund och videokamera (Figur 3A).
- Använd en träbalk på 90 cm lång, 1,7 cm bred och 2 cm i höjd. En plattform på 20,5 cm lång, 15 cm bred och 2 cm i höjd i båda ändarna av balken rekommenderas. Använd samma material för plattformarna och balken, undvik eventuella hinder mellan plattformarna och balken.
- Håll avståndet mellan balken och bordet minst 44 cm. En välbekant miljö som en hembur motiverar råttorna att korsa balken, som kan placeras i slutet av strålplattformen.
- träning
- Sätt upp balken med distans och hembur på bordet.
- Träna djur i sju dagar. Träningen på på varandra följande dagar rekommenderas.
- Dag 1 av träning
- Placera alla råttor från en hembur på strålens startplattform.
- Låt råttorna utforska miljön (plattform/balk).
- Håll försiktigt en råtta i svansen och led råttan till balken genom att trycka försiktigt råttan på balken.
- Hjälp råttan att korsa strålen genom att hålla råttan i svansen i minst två körningar.
- Låt råttan korsa strålen i ytterligare tre körningar utan hjälp. Observera råttan och ge hjälp vid behov. Om råttan inte korsar strålen, fånga upp fallet för att undvika skador och utvecklingen av rädsla för att korsa strålen.
- Fortsätt med denna procedur för alla råttor.
OBS: Ibland följer råttor varandra för att korsa strålen, i vilket fall ingen hjälp behövs. Det är dock viktigt att observera råttorna, fånga upp fall och ge hjälp om det behövs.
- Dag 2 av träning
- Placera alla råttor från en hembur på strålens startplattform.
- Låt råttorna korsa strålen sex gånger.
- Vid behov, ge hjälp och fånga upp fall.
- Dag 3 av träning
- Placera en råtta på strålens startplattform.
- Låt råttan korsa strålen sex gånger.
- Vid behov, ge hjälp och fånga upp fall.
- Dag 4-7 av träning
- Placera en råtta på strålens startplattform.
- Låt råttan korsa strålen tio gånger.
- Vid behov, ge hjälp och fånga upp fall.
- I slutet av träningen bör råttan korsa strålen utan avbrott i minst tre körningar. Det är tillåtet att försiktigt trycka råttan på startplattformen för att utlösa initiering av rörelse.
- Dag 1 av träning
- bedömning
- Sätt upp balken med distans och hembur på bordet.
- Placera videokameran på plats, i linje parallellt med balken med djuret i fokus. Videokamerans position bör vara så nära djuret som möjligt för att uppnå optimal upplösning av de registrerade rörelserna. Strålen och delar av båda plattformarna bör fångas av inspelningen.
- Starta inspelningen och identifiera först sessionen och djuret.
- Placera råttan på strålens startplattform.
- Råttan ska korsa strålen tre gånger utan avbrott. Även om råttan når tre kompatibla körningar inom de tre första körningarna, utför minst sex till tio körningar för kontinuerlig aktivitetsprestanda.
- Observera alltid djuret och fånga upp fall, om det behövs.
- Efter uppgiften rengör du balken och bordet med 0,1% ättiksyra för att undvika distraktion genom lukten av den tidigare registrerade råttan.
OBS: Inom de första två veckorna efter nervkrossskadan kan råttorna inte korsa strålen utan hjälp. Därför måste hjälp ges för sex till åtta körningar under de första två veckorna efter nervkrossskada. Från vecka tre till vecka fem genomförs fem körningar med hjälp och ytterligare tio körningar genomfördes utan hjälp.
- Dataanalys
- Använd den kostnadsfria videoanalysprogramvaran Kinovea för dataanalys.
- Välj videosekvenser för tre kompatibla körningar från inspelningen. För detta väljer du de tre första kompatibla körningarna som utfördes utan hjälp av djuret. Var konsekvent i det kompatibla körningsvalet för alla råttor.
- Definiera starttidpunkten och slutpunkten för de valda tre kompatibla körningarna (Bild 3D-E). I den här inställningen var startpunkten märkt av en svart linje på balken och placeringen av den första bakbenet bakom den svarta linjen definierade starttiden för körningen. Placeringen av den första bakbenet på plattformen i slutet av strålen definierar sluttiden.
- Beräkna sedan den tid som behövs för att råttan ska kunna korsa strålen. Rapportera data som latenstid för att korsa strålen på några sekunder och utföra statistisk analys som vanligt (figur 3B).
- Poängs antal steg och fel från tre kompatibla körningar för båda bakbenen separat med hjälp av programvarans zoom- och slow motion-funktion. Fel inkluderar totala fotglidningar och halvfotsslips. En total fotglidning definieras som en fotplacering som följs av en djup glidning som orsakar förlust av kontakt med den drabbade tassen med balken (Figur 3F). En halv glidning definieras som en tass som glider från balkens sidovägg utan att förlora fullständig kontakt med balken (Figur 3G).
- Beräkna procentandelen fotglidningar i förhållande till antalet steg för att korsa strålen ((antalet fotglidningar i lemmen x 100%)/ antal steg i samma lem). Presentera data i procent och utför statistisk analys som vanligt (figur 3C).
5. Stege rung gånguppgift
OBS: Stege rung gånguppgiften kan bedöma motorisk funktion, placering av både fram- och bakben och interlimb samordning.
- Installationen
- Använd en stege rung apparatur, distans, bord, enhetlig bakgrund och videokamera för detta beteendetest (Figur 4A). Den horisontella stege rung apparaten består av metall pinnar och tydliga polykarbonat sidoväggar. Apparaten har en längd på 119,5 cm och bredden justeras till 7,4 cm. Gångvägen som ska analyseras har en längd på 100 cm.
- Märk start- och slutpunkten med en svart linje på sidoväggen. Placera platshållarna för pinnarna på apparaten med 1 cm mellanrum. Ordna ett oregelbundet mönster av pinnarna för den 100 cm långa gångvägen med ett avstånd mellan 1 och 5 cm mellan pinnarna. De första 10 cm i början och de sista 9,5 cm i slutet av apparaten, som är uteslutna från analys, har ett regelbundet mönster av pinnarna med ett avstånd av 1 cm.
- Använd ett avstånd mellan gångvägen och bordet på ca 30 cm (Bild 4A-B). En mållåda eller en välbekant miljö i slutet av apparaten, som en hembur, motiverar råttorna att korsa stegens rungapparat.
- träning
- Ställ upp stege rung apparaten med distans och mållåda på bordet.
- Träna djur i åtta dagar. Träningen på på varandra följande dagar rekommenderas.
- Dag 1 av träning
- Placera alla råttor från en hembur på stegens rungapparat.
- Låt råttorna utforska miljön (stege rung apparat/mållåda).
- Tryck försiktigt råttorna i målrutans riktning. Assistera råttorna in i målrutan. Låt råttorna utforska målrutan ett tag.
- När allt kommer in i målrutan. Ta den första råttan från mållådan och placera råttan på apparatens startzon igen. Fortsätt med samma procedur för alla råttor i en hembur. Tryck försiktigt råttorna i målrutans riktning och ge hjälp att komma in i målrutan om det behövs.
- Låt råttan korsa apparaten fyra gånger.
- Dag 2 av träning
- Utför samma protokoll som anges för första träningsdagen.
- Låt råttan korsa apparaten sex gånger.
- Dag 3 av träning
- Utför samma protokoll som anges för första träningsdagen.
- Låt råttan korsa apparaten åtta gånger.
- Dag 4 av träning
- Placera en råtta i början av stege rung apparaten.
- Om råttan inte korsar apparaten och går in i målrutan frivilligt, ge hjälp genom att försiktigt trycka råttan bakifrån.
- Låt råttan korsa apparaten åtta gånger.
- Dag 5-8 av träning
- Placera en råtta i början av stege rung apparaten.
- Om råttan inte korsar apparaten och går in i målrutan frivilligt, ge hjälp genom att försiktigt trycka råttan bakifrån.
- Låt råttan korsa apparaten tio gånger.
- I slutet av träningen bör råttan kunna korsa gångvägen utan avbrott och hjälp i minst tre körningar. Det är tillåtet att ge råttan en mild knuff i startzonen för att utlösa initiering av rörelse.
- Dag 1 av träning
- bedömning
- Ställ upp stege rung apparaten med distans och mållåda på bordet.
- Placera videokameran på plats, i linje parallellt med apparaten med djuret i fokus. Placera videokameran så nära djuret som möjligt för att uppnå optimal upplösning av de inspelade rörelserna och se till att hela stegens rungapparat fångas i inspelningen.
- Starta inspelningen och identifiera först sessionen och djuret.
- Placera råttan på startzonen på stege rungapparaten.
- Råttan måste korsa stegens 100 cm gångväg tre gånger utan avbrott för att den ska kvalificera sig som en kompatibel körning. Även om råttan når tre kompatibla körningar inom de tre första körningarna bör minst tio körningar utföras för kontinuerlig aktivitetsprestanda.
- Efter uppgiften rengör du apparaten och bordet med 0,1% ättiksyra för att undvika distraktion genom lukten av den tidigare registrerade råttan.
- Dataanalys
- Använd den kostnadsfria videoanalysprogramvaran Kinovea för dataanalys.
- Välj videosekvenser för tre kompatibla körningar från inspelningen. Välj de tre första kompatibla körningarna för dataanalys.
- Definiera starttidpunkten och sluttidpunkten för de valda tre kompatibla körningarna. Placeringen av den första bakbenet bakom den första svarta linjen på apparatens sidovägg, som betecknar starttiden för den 100 cm långa gångvägen, definierar starttiden för körningen. Placeringen av den första frontlimben bakom den andra svarta linjen på apparatens sidovägg, som märker slutpunkten för den 100 cm långa gångvägen, definierar sluttidspunkten för körningen.
- Identifiera start- och sluttidspunkten. Beräkna sedan varaktigheten för körningen över gångvägen. Rapportera data som latenstid för att korsa gångvägen på några sekunder och utföra statistisk analys som vanligt (figur 4C).
- Poängsätt de tre kompatibla körningarna med 7-kategoriskalan från Metz et al. genom att använda programvarans slow motion- eller frame-by-frame-funktion (bild 5)16,17. Bestäm antalet steg och antalet fel i enlighet med skalornas kategorier för varje lem separat. Vågen skiljer mellan följande kategorier: (0) total miss (1) djup slip (2) liten slip (3) ersättning (4) korrigering (5) partiell placering och (6) korrekt placering. Endast felet i den initierande lemmen bedömdes. Ytterligare fel, som utlöses av det ursprungliga felet, bör inte klassas.
- Beräkna felen/steget genom att överväga följande krav. Kategorierna (0) totala miss (1) djup glidning (2) liten glidräkning som ett fel. Dividera antalet fel med antalet steg för varje bakben och var och en körs separat. Bestäm medelvärdet för alla tre kompatibla körningar för varje djur och varje bakben separat och utför statistisk analys som vanligt (figur 4D).
Representative Results
De representativa resultaten av de fem minuterna OFT visar att nervkrossskadan fem veckor efter operationen inte har någon effekt på den lokomotoriska aktiviteten (Figur 1).
Gånganalys med CatWalk XT-systemet (Figur 2) genererar många olika parametrar. Selektiva parametrar analyserades statistiskt genom att jämföra wt naiva råttor med nervskadade wt råttor fem veckor efter nervkross (Figur 2D). Betydande förändringar kunde detekteras för körningens genomsnittliga hastighet, steglängden och utskriftsområdet för den nervskadade (högra) bakpoten. En mer detaljerad analys av den nervskadade bakpoten utfördes med modulen "Interactive Footprint Measurements". En betydande minskning av parametrarna tå spridning, mellanliggande tå spridning och tryck längd observerades i nerv-skadade wt råttor jämfört med wt naiva råttor. Dessutom skiljer sig tassvinkelns kroppsaxel och tassvinkelns rörelsevektor avsevärt när man jämför nervskadade wt-råttor med wt naiva råttor (Figur 2E).
Figur 3 innehåller uppgifter om motorisk koordination som erhållits genom bedömning av strålgångsuppgifter. Nervskadade wt råttor visade en signifikant ökad latens tid att korsa strålen jämfört med wt naiva råttor fem veckor efter skada (Figur 3B). Som en extra läsning ur strålen gå uppgift, full slips och halv glider av nerv-skadade hindlimb räknades och betraktas som ett fel för statistisk analys. Andelen fel per steg av den nervskadade (högra) bakbenet ökade signifikant hos nervskadade wt råttor jämfört med wt naiva råttor.
Representativa uppgifter om stege rung gånguppgiften (figur 4) visar inte signifikanta förändringar i latenstiden för att korsa gångvägen på stege rungapparaturen (Figur 4C) eller i procentandelen fel per steg av den nervskadade (höger) bakbenet (Figur 4D). Analysen av felprocenten per steg av den nervskadade bakbenet ansåg endast poängen från 0 till 2 i 7-kategoriskalan från Metz et al. Fördelningen av alla poängkategorier per steg från 7-kategoriskalan för den nervskadade bakbenet och den icke-nervskadade (vänstra) bakbenet illustreras i figur 4E.
Figur 1: Bedömning av lokomotorisk aktivitet under öppet fälttest. (A) Bild av den öppna fälttestinställningen. Markerad bild subtraherad från en inspelad video under öppet fälttest som visar en råtta på den öppna fältarenan utan (B) och med (C) spårning. D) Hastigheten under en fem minuter lång inspelning av öppna fältprov undersöktes hos wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nervkrossskada. Data visas som medelvärde ± SEM. Statistisk analys utfördes med hjälp av det oparerade t-testet av de normalt distribuerade uppgifterna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2:Gånganalys med CatWalk XT-systemet. (A) Bild av CatWalk XT-apparaten. B) Exempel på utskriftsvyn som visar de märkta tassutskrifterna i falskt färgläge och exempel på tidsvyn som visar tidsbaserat gångdiagram över wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nervkrossskada. c) Exempel på tåklassificering som visar tåspridningen (TS), mellanliggande tåspridning (ITS) och utskriftslängd (PL) samt exempel på kroppsaxelvyn som visar kroppsaxeln (vit linje) och rörelsevektorn (röd linje) hos wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nervkrossskada. D) Uppgifter om utvalda parametrar från standardklassificeringen som jämför wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nervkrossskada. (E) Data över utvalda parametrar från modulen "Interactive Footprint Measurements module" som jämför wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nervkrossskada. Data visas som genomsnittlig ± SEM. Statistisk analys utfördes med hjälp av det oparerade t-testet av de normalt distribuerade uppgifterna, oparterad t-test med Welchs korrigering av normalt distribuerade data med ojämn varians och Mann-Whitney U-test av icke-normala distribuerade data. P-värde < 0,05 definierades som statistiskt signifikant märkt som *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Gånganalys med strålgångsuppgiften. A) Bild- och schematritningar av bomns gånguppgiftsinställning. Latens tiden att korsa strålen (B) och den procentuella fot slip fel per steg av nerv-skadade hindlimb under strål walking uppgift (C) analyserades i wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nerv crush skada. Representativ bild för starttidspositionen (D) och sluttidspositionen (E) för balkens gånguppgift. Representativ bildsekvens av ett fullständigt glidfel (F) och ett halvt halkfel (G) i strålgångsuppgiften. Data visas som medelvärde ± SEM. Statistisk analys utfördes med mann-Whitney U-testet av icke-normala distribuerade data. P-värde < 0,05 definierades som statistiskt signifikant märkt som *p < 0,05, **p < 0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:Gånganalys med hjälp av stege rung gånguppgift. Bild (A) och schematiska ritningar (B) av stegen rung walking task setup. Latens tiden för att korsa stegen rung apparatur (C) och den procentuella fot slip fel per steg av nerv-skadade hindlimb under stegen rung walking uppgift (D) bedömdes i wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nerv crush skada. e) Den procentuella fördelningen av poängkategorin per steg enligt skalan med 7 kategorier från Metz m.fl. för vänster och höger bakben av wt naiva råttor och wt råttor fem veckor efter nerv crush skada. Data visas som genomsnittlig ± SEM. Statistisk analys utfördes med hjälp av det oparerade t-testet av normalt distribuerade data och Mann-Whitney U-testet av icke-normala distribuerade data. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Exemplarisk representation av varje kategori enligt 7-kategoriskalan från Metz et al. under stegen rung gånguppgift. Representativ bildsekvens från höger bakben i kategori 0 - total miss, kategori 1 - djup slip, kategori 2 - liten slip, kategori 3 - ersättning, kategori 4 - korrigering, under stegen rung walking task. Representativa bilder för kategori 5 - partiell placering och kategori 6 - korrekt placering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Detta beteendemässiga bedömningsprotokoll ger en översikt över fördelar och nackdelar samt möjliga avläsningar av det valda beteendetestbatteriet i en gnagaremodell efter ischiasnervkrossskada.
För att få ett jämförande resultat av ischiasnervens krossskada är en konsekvent krossteknik obligatorisk. Användningen av en icke-räffad klämma (Ultra Fine Hemostat) istället för tång kan förbättra krossens konsistens. Använd samma klämma samt samma krossposition för att garantera lika nervkompression. Exklusiv användning av klämman för krossskada och hantering av klämman med försiktighet förbättrar konsistensen. Utför också proceduren för krossskadan med försiktighet. Ytterligare skador på nerven under kirurgi såsom oönskad dragkraft i nerven kan leda till oönskade biverkningar som automutilation. Därför rekommenderas en noggrann nerv förberedelse samt en administrering av en smärtstillande medel i minst två dagar.
Multifaktoriell bedömning av motoriskt beteende kan karakterisera fenotypen efter nervkrossskada hos råttor på olika nivåer. Vi använde OFT, CatWalk XT gånganalys, balk gånguppgift och stege rung gånguppgift. Ett förblindat experimentellt förfarande och dataanalys för experimentella grupper är avgörande för dessa experiment. Före beteendebedömning acklimatiserades djuren i testrummet under testförhållanden i minst 30 minuter. Alla beteendetester som tillämpas häri har fördelen att mat- eller vattenbrist inte krävs. Samma grupp av djur användes i alla beskrivna beteendetester. Högst två olika beteendetester per dag utfördes för varje djur. Om beteendetester utförs med jämna mellanrum, var uppmärksam på ett jämförbart förfarande, som att utföra testet i samma djurordning och vid samma tid på dagen. En annan viktig aspekt för beteendeanalys är råttornas dag-natt-cykel. Överväg en omvänd dag-natt cykel för att få mer naturliga och högre nivåer av aktivitet vid dagcykeln (mörk cykel). Detta måste övervägas speciellt för mätning av spontant beteende, som OFT. I detta experiment kunde en omvänd dag-natt cykel inte genomföras, men en adekvat acklimatisering till test villkoren säkerställdes. En perfekt belysning är avgörande för högupplösta videor för strålvandringsuppgiften och stege rung gånguppgiften. Denna höga videokvalitet kan inte nås när du utför experiment i mörkret.
Bedömningen av gång kräver en kontinuerlig uppgift prestanda. Den första viktiga aspekten av en kontinuerlig uppgiftsprestanda är att övertyga djuren att korsa installationen. För att öka motivationen, placera små matpellets (45 mg) i slutet av installationen. För att djuren ska bekanta sig med matpelletsen bör pelletsen matas till dem före testning. Dessutom kan en målruta i slutet av installationen vara till hjälp. Installationen av CatWalk innehåller redan en mållåda, men råttor tvekar ibland att komma in i målrutan. Alternativt kan du lägga till en liten bur i målrutan, men hemmaburen från råttor passar inte in i målrutan. Låt råttan vana i buren i några minuter före förvärvet. Dessutom kan en annan råtta från samma hemmabur placeras i målrutan eller in i buren inne i målboxen. Se till att den andra råttan förblir i lådan och inte blockerar ingången till mållådan. Dessutom är det också möjligt att ta bort målrutan från CatWalk-systemet och placera råttan hemburen i slutet av gångvägen, vilket gör att råttan kan komma in i sitt "hemterritorium" efter varje körning. För installationen av balkens gånguppgift och stegen rung walking uppgift rekommenderar vi att du lägger till en mållåda eller hemmaburen i slutet av installationen. För att säkerställa konsekvens bör CatWalk, strålgångsuppgiften och stege rung gånguppgiften utföras minst en gång i veckan med sex till tio körningar.
Även om inte varje analys gav betydande skillnader i denna studie, bör man överväga att en inkludering av genetiskt modifierade djur eller behandlingsgrupper kan producera värdefulla data som kan skilja mellan grupper från samma beteendetester.
Nervkrossskadan hade ingen effekt på råttans lokomotoriska aktivitet, som mättes på fem minuter OFT. Catwalk XT gånganalys är ett mer objektivt och känsligt verktyg för att analysera gång-, tass- och tåplacering. Efter en intensiv träning lär sig råttorna att korsa gångvägen på CatWalk XT-apparaten till standardinställningarna. Nervskadan minskar inte råttornas förmåga att korsa gångvägen. Den automatiska beräkningen av olika parametrar presenterar uppgifterna objektivt. Ytterligare information kan vinnas genom att använda modulen "Interactive Footprint Measurements" och dessa analyser gav betydande skillnader i olika parametrar för tåspridning, utskriftslängd och tassvinkel med kroppsaxel som jämförde råttor med och utan nervskada.
Råttor kan enkelt tränas för strålvandringsuppgiften. Skillnader i latens tiden att korsa strålen och i antalet fot glider per steg av nerv-skadade hindlimb upptäcktes genom att jämföra naiva med crush-skadade råttor. En nackdel med att analysera nervskadade råttor med strålgångsuppgiften är strålens storlek. Inom de första två veckorna efter ischiasnervens krossskada behöver råttorna hjälp att korsa strålen eftersom deras balans försämras. Även om vissa råttor kan korsa strålen är risken för skador orsakade av ett fall hög. Nervkrossade djur bör därför hjälpas att korsa strålen under de första två veckorna efter ischiasnervens krossskada eller längre, om det behövs. Det är dock svårt att jämföra körningar med och utan hjälp. Dessutom är motorbalansen en viktig parameter som bedöms av strålgångsuppgiften. Vi ansåg att denna parameter inte var relevant för vår nervkross råtta modell. Därför kunde poäng som beskrevs av Ohwatashi m.fl. och Johansson & Ohlsson inte användas och körningar med ofullständig stråle travers uteslöts för dataanalys18,19.
7-kategoriskalan från Metz et al. kan analysera både fram- och bakben och skilja mellan olika allvarlighetsgrader av fel i alla lemmar under stegen rung gånguppgift16,17. Genom att analysera de mest framträdande felen, som inkluderar kategorierna från 0 till 2, kunde inga skillnader av fel per steg upptäckas i bakbenet när man jämför nervskadade wt råttor med naiva wt råttor. Dessutom skilde sig latenstiden för att korsa stege rung apparaten inte mellan nervskadade wt råttor och wt naiva råttor. Djupinlärningsmodeller kan förbättra och påskynda dataanalysen av stegen som går genom ett automatiserat tillvägagångssätt.
Det är viktigt att nämna att nervkrossskadan samt alla beskrivna beteendetester lätt kan översättas till möss, genom att anpassa inställningarna och storlekarna på installationerna. Användningen av möss som modellorganism har den fördelaktiga effekten att transgena modeller för många mänskliga sjukdomar finns.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF DysTract till C.W.I.) och av tvärvetenskapligt centrum för klinisk forskning (IZKF) vid universitetet i Würzburg (N-362 till C.W.I.; Z2-CSP3 till L.R.). Dessutom har detta projekt fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för det europeiska programmet för landsbygdsutveckling för landsbygdsutveckling, COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover till J.V.), och från VERUM-stiftelsen. Dessutom finansieras C.W.I. av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, av Deutsche Stiftung Neurologie och ParkinsonFonds. L.R. stöds dessutom av Dystonia Medical Reseach Foundation.
Författarna tackar Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel och Louisa Frieß för deras tekniska hjälp samt Helga Brünner för djuromsorg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 - laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J.
- Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
- Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson's disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108 (2016).
- Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
- Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226 (2015).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
- Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
- Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
- Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
- Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).
- Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
- Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).
