Summary
Wir stellen ein Protokoll zur Beurteilung des motorischen Verhaltens über eine Verhaltenstestbatterie bei Ratten nach Ischiasnervenquetschverletzung zur Verfügung.
Abstract
Die Induktion einer peripheren Nervenverletzung ist eine in den Neurowissenschaften weit verbreitete Methode zur Beurteilung von Reparatur- und Schmerzmechanismen unter anderem. Darüber hinaus wurde im Forschungsgebiet der Bewegungsstörungen eine Ischiasquetschverletzung eingesetzt, um einen dystonieähnlichen Phänotyp in genetisch prädisponierten DYT-TOR1A-Nagetiermodellen der Dystonie auszulösen. Um konsistente, reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse nach einer Ischiasnervenquetschverletzung zu erzielen, ist neben einer standardisierten phänotypischen Charakterisierung eine standardisierte Methode zur Induktion der Nervenquetschung unerlässlich. Dabei muss nicht nur auf das spezifische Sortiment an Verhaltenstests geachtet werden, sondern auch auf die technischen Anforderungen, die korrekte Durchführung und die konsekutive Datenanalyse. Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie eine Ischiasnervenquetschverletzung durchgeführt wird, und stellt eine Verhaltenstestbatterie für die Beurteilung motorischer Defizite bei Ratten bereit, die den Freifeldtest, die CatWalk XT-Ganganalyse, die Strahllaufaufgabe und die Leitersprosselaufaufgabe umfasst.
Introduction
Nagetiere sind ausgezeichnete Modellorganismen, um das Verständnis menschlicher Krankheiten zu vertiefen1,2 durch das Testen von Hypothesen auf mehreren biologischen Ebenen. Eine grundlegende biologische Ebene für die Charakterisierung von Nagetiermodellen ist die Phänotypebene, gemessen durch Verhaltensbewertungen. Abhängig vom Tiermodell und der wissenschaftlichen Forschungsfrage ist die Auswahl einer leistungsfähigen und zuverlässigen Verhaltenstestbatterie unerlässlich, um ein breites Spektrum von Verhaltensaspekten abzudecken, z. B. für Tiermodelle der Parkinson-Krankheit und Dystonie3,4,5,6.
Der Ischiasnerv ist der größte Nerv im menschlichen Körper mit motorischen und sensorischen Fasern. Verletzungen des Ischiasnervs können leicht aus einer Vielzahl von Ereignissen wie Verkehrsunfällen und Operationenresultieren 7,8. Daher sind Forschungsaktivitäten mit Nagetiermodellen mit Ischiasnervenverletzungen von translational relevantem Wert. Auch wenn der translationale Aspekt der Nervenregeneration von Ratte zu Mensch kritisch zu sehen ist9, ist die Ischiasnervenquetschverletzung (Axonotmesis) in Nagetiermodellen eine häufig verwendete Methode zur Analyse von Degenerations- und Regenerationsprozessen peripherer Nerven10,11. Im Falle einer Quetschverletzung wird der Nerv nicht vollständig transektiert. Es schädigt das Axon, was direkt nach einer Quetschverletzung zu einem Leitungsblock führt, gefolgt von regenerativen Prozessen 4,12,13.
Darüber hinaus ist in der Dystonieforschung die einseitige Ischiasnervenquetschverletzung eine etablierte Methode, um dystonieähnliche Bewegungen (DLM) in genetisch prädisponierten Dystonie-Nagetiermodellen auszulösen, die keine DLM per se zeigen4,14. Es wird angenommen, dass das periphere Nerventrauma die sensomotorische Integration stört, indem es die Ischiasnervfasern beeinflusst, die für motorische und sensorische Funktionen verantwortlich sind15.
Wir bieten hier eine detaillierte Beschreibung für eine standardisierte Quetschverletzung des Ischiasnervs und eine Batterie von motorischen Verhaltensbewertungen, die sich aus dem Open-Field-Test (OFT), der CatWalk XT-Ganganalyse, der Strahl-Walking-Aufgabe und der Leiter-Sprossen-Walking-Aufgabe bei naiven Wildtyp-Ratten (n = 8-9) und Wt-Ratten fünf Wochen nach einseitiger Ischiasnervenquetschverletzung (n = 10) zusammensetzt. Das OFT gibt Auskunft über die allgemeine Bewegungsaktivität, während eine detaillierte Ganganalyse durch das automatisierte Ganganalysesystem CatWalk XT erreicht wird. Die Balkenlaufaufgabe wird verwendet, um die motorische Koordination zu bewerten, indem die Zeit bis zum Überqueren des Balkens und die Anzahl der Fußplatzierungsfehler bewertet werden. Für die Gangleistungsanalyse gibt die Leitersprosse-Gehaufgabe Aufschluss über die Platzierung von Fuß oder Pfoten und Fehler an einem horizontalen Leitersprossengerät mit einem konstanten, aber unregelmäßigen Sprossmuster.
Protocol
Alle Tierversuche wurden von den lokalen Behörden der Regierung von Unterfranken (Würzburg, Deutschland) genehmigt und nach den geltenden internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt.
1. Ischiasnerven-Crush-Verletzung
HINWEIS: Halten Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs eine sterile Umgebung aufrecht. Stellen Sie den Operationstisch mit der notwendigen Ausrüstung auf.
- Betäuben Sie die Ratte in einem geschlossenen Schrank mit Isofluran 3,0% inO2 (2 L/min) tief. Entfernen Sie die Ratte aus dem Schrank. Rasieren Sie einen ausgedehnten Bereich der rechten Hinterbeine.
- Positionieren Sie die Ratte in der Anästhesiemaske und setzen Sie die Tiefenanästhesie mit Isofluran 2,0% in O2 (2 L/min) fort. Kontrollieren Sie die Anästhesietiefe, indem Sie das interdigitale Gurtband der Hinterfüße einklemmen. Das Fehlen von Entzugsreflexen deutet auf eine ausreichende Anästhesie hin.
- Befestigen Sie den Oberkörper und beide Hinterbeine der Ratte mit Klebeband. Stellen Sie beide Hinterbeine in eine symmetrische und ausgestreckte Position, indem Sie die Pfote flach auf den Operationstisch drehen.
- Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen auf, um trockene Augen zu verhindern. Desinfizieren Sie die Haut des rasierten Bereichs mit einem Antiseptikum.
- Suchen Sie nach der Ischias-Notbe des Iliums.
- Machen Sie einen Hautschnitt von der Ischias-Notch in Richtung Der Pfote mit einem Skalpell. Der Hautschnitt sollte so klein wie möglich sein (ca. 1 bis 2 cm).
- Wenn die Hinterbeine fixiert sind und der Hautschnitt korrekt durchgeführt wird, kann ein Hohlraum in der Faszienebene zwischen dem Musculus gluteus maximus und dem Musculus biceps femoris gesehen werden, der einer "weißen Linie" ähnelt. Setzen Sie eine geschlossene superfeinheitliche hämostatische Stoßzette (Nr. 5) in den Hohlraum ein und verteilen Sie die Zette. Die Faszienebene sollte sich öffnen, ohne Muskelgewebe zu verletzen.
- Legen Sie die Gummibandretraktoren unter die Muskeln, um den Hautschnitt offen zu halten.
- Entfernen Sie vorsichtig das umliegende Gewebe und die Blutgefäße aus dem Ischiasnerv, bis der Nerv vollständig freigelegt ist. Es ist wichtig, den Nerv während des gesamten Eingriffs nicht zu dehnen oder zu ziehen.
- Zerdrücken Sie den Ischiasnerv mit einer nicht gezackten Klemme (ultrafeiner Hämostat) mit konstantem und reproduzierbarem Druck. Öffnen Sie dazu die Klemme, legen Sie den Nerv auf den Unterkiefer der Klemme und schließen Sie die Klemme, indem Sie sie dreimal zehn Sekunden lang in die erste Position sperren. Die Position des Ischiasnervenquetschens befindet sich in der Nähe der Ischias-Notbe, proximal zur Teilungsstelle des Haupt-Ischiasnervenbündels. Öffnen Sie die Klemme nach der Quetschverletzung vorsichtig wieder. Die Quetschstelle des Ischiasnervs erscheint durchscheinend.
- Entfernen Sie die Gummibandretraktoren.
- Schließen Sie den Schnitt der Faszienebene mit resorbierbarer 4-0-Naht. Schließen Sie den Hautschnitt mit Körperhautklammern.
- Rimadyl gemäß den GV-SOLAS-Richtlinien (5 mg/kg Körpergewicht, subkutane Injektion) zur postoperativen Schmerzlinderung alle 24 Stunden nach der Operation für zwei Tage anwenden.
- Entfernen Sie die Ratte aus dem Operationsaufbau. Legen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig ohne Einstreu auf einer Heizplatte (37 °C), bis die Ratte wach ist. Bringen Sie die Ratte zurück in ihren sauberen Käfig.
- Entfernen Sie die Klammern der Körperhaut vier bis sechs Tage nach der Operation.
2. Offener Feldtest (OFT)
HINWEIS: Sowohl die Bewegungsaktivität als auch die Verhaltensaktivität können vom OFT analysiert werden.
- Einrichtung
- Richten Sie das OFT (Abbildung 1A) in einer dunklen und ruhigen Umgebung ein. Es besteht aus dem automatisierten Videotracking-System EthoVision XT (Computer, Software mit Lizenz) und einer Arena von 58,5 cm (Länge) x 58,5 cm (Breite) x 45 cm (Höhe) mit einer kratzfesten, reinigbaren schwarzen Oberfläche. Die schwarze Oberfläche ist wichtig, um den Kontrast bei der Verfolgung weißer Tiere zu erhöhen.
- Bewertung
- Platzieren Sie die Arena und die Kamera in die richtige Position. Stellen Sie die Kamera so ein, dass die gesamte Open-Field-Box mit der besten Auflösung aufgezeichnet wird. Führen Sie das Experiment in einer dunklen Umgebung durch. Wenn Licht für das Setup benötigt wird, verwenden Sie ein kleines und diffuses Licht, um Lichtflecken, Reflexionen und Schatten in der Arena zu vermeiden. Sorgen Sie für gleiche Lichtverhältnisse, indem Sie die Beleuchtungsstärke mit einem Luxmeter in verschiedenen Bereichen der Arena messen.
- Richten Sie die EthoVision XT-Software ein. Die wichtigsten Einstellungen sind im Folgenden aufgeführt. Wählen Sie in den Experimenteinstellungen Live-Tracking für die Videoquelle und die Mittelpunkterkennung für die verfolgten Features aus. Überprüfen Sie die Größe der Arena in den Arena-Einstellungen. Stellen Sie die Startbedingung für die Datenerfassung auf drei Sekunden nach dem Platz der Ratte in der Mitte der Arena und die Gesamtlaufzeit auf fünf Minuten in den Teststeuerungseinstellungen ein. Wählen Sie unter Erkennungseinstellungendie Option Statische Subtraktion für die Methode aus. Aktivieren Sie das Häkchen Video für Methode speichern in den Erfassungseinstellungen.
- Platzieren Sie die Ratte vorsichtig in der Mitte der Testarena (Abbildung 1B).
- Drücken Sie die Taste Test starten in der Erfassungssteuerung, um die Aufnahme zu starten.
- Halten Sie sich während der Aufnahme vom OFT-Setup fern, um die Ratte nicht abzulenken.
- Entfernen Sie die Ratte nach jedem Versuch vorsichtig aus der Testarena und reinigen Sie das Setup mit 0,1% Essigsäure, um ablenkungsgefechten durch den Geruch der zuvor aufgezeichneten Ratte zu vermeiden.
- Datenanalyse
- Für die Datenanalyse des OFT mit der EthoVision XT Software gehen Sie in den Abschnitt Analyse in der linken Seitenleiste und wählen Sie Track Visualization unter der Registerkarte Ergebnisse (Abbildung 1C). Exportieren Sie als Nächstes die erforderlichen Parameter nach Excel. Wählen Sie innerhalb der Software eine Reihe von Variablen aus verschiedenen Kategorien für die Datenanalyse aus. Wichtige Variablen für dieses spezifische wissenschaftliche Ziel sind "Bewegte Entfernung" und "Geschwindigkeit" unter der Kategorie "Entfernung und Zeit". Führen Sie eine statistische Analyse der ausgewählten Parameter durch (Abbildung 1D).
3. CatWalk XT Ganganalyse
HINWEIS: Eine Ganganalyse über das CatWalk XT-System kann helfen, viele verschiedene Parameter in Bezug auf Fußabdrücke, Haltung und Gang von Tiermodellen zu beurteilen. Ein Glassteg wird mit grünem Licht beleuchtet und das von den Fußabdrücken der Tiere gestreute Licht wird mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera eingefangen, die sich unter dem Gehweg befindet. Die Signale können mit der CatWalk XT Software analysiert werden.
- Einrichtung
- Für die Ganganalyse mit dem CatWalk XT verwenden Sie das CatWalk-System und die dazugehörige Software (Computer, Software mit Lizenz) (Abbildung 2A).
- Führen Sie das Experiment unter dunklen Bedingungen durch, da die Datenerfassung von der Beleuchtung des Gehwegs des CatWalk-Systems mit grünem LED-Licht abhängt. Um den experimentellen Ablauf unter dunklen Bedingungen zu erleichtern, beleuchten Sie den Experimentierraum mit rotem Licht.
- Verwenden Sie einen definierten Gehweg, der 65 cm lang und 7 cm breit ist. Die Größe des Gehwegs hängt jedoch von der Größe der Ratten ab. Stellen Sie den Gehweg so groß wie möglich ein, um so viele Fußabdrücke wie möglich für jede Pfote aufzuzeichnen.
- Erfassen Sie eine Mindestanzahl von drei Fußabdrücken pro Pfote für jeden Lauf. Berücksichtigen Sie bei der Definition der Länge des Gehwegs den Körper und den Schwanz der Ratte, da das Start- oder Stoppsignal möglicherweise nicht korrekt erkannt wird und die Läufe möglicherweise nicht als konform eingestuft werden, wenn der Körper / Schwanz vor oder nach Abschluss des Laufs in den definierten Gehweg eintritt oder auf diesem verbleibt.
- Ausbildung
HINWEIS: Das Training der Ratten für das CatWalk-System ist notwendig, um die Tiere an das Setup zu gewöhnen und ihnen zu ermöglichen, den Gehweg ohne Unterbrechung zu überqueren. Richtiges Training bietet die Vorteile, Zeit bei der experimentellen Bewertung zu sparen und bessere Ergebnisse zu erzielen. Durch das Starten der Datenerfassung des CatWalk-Systems während der Trainingseinheiten können sich die Ratten an die Beurteilungsbedingungen (Lärm/Licht) gewöhnen.- Beginnen Sie mit der Einrichtung des CatWalk-Systems.
- Reinigen Sie den Glasgang mit destilliertem Wasser und einem fusselfreien weichen Tuch. Verwenden Sie zu Beginn und am Ende des Experiments oder dazwischen, wenn der Glasweg schmutzig ist, glasreinigungsflüssigkeit und fusselfreies weiches Tuch, um den Glassteg zu reinigen. Nach der Verwendung von Glasreinigungsflüssigkeit entfernen Sie den Gehweg von Rückständen der Flüssigkeit, um zu vermeiden, dass sie das Tier ablenkt.
- Wählen Sie die experimentellen Einstellungen aus. Ein wichtiger Parameter ist Run Criteria. Legen Sie die entsprechenden Werte für Minimale Ausführungsdauer, Maximale Ausführungsdauerund Minimale Anzahl der zu erfassenskonformen Läufefest, die für jedes Forschungsprojekt spezifisch sind. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Maximal zulässige Geschwindigkeitsvariation verwenden und legen Sie den Wert fest. Die Run-Kriterien können für die ersten vier bis fünf Trainingstage ignoriert werden.
- Platzieren Sie die Kamera in Position und stellen Sie den Fokus ein. Finden Sie die optimale Kameraposition, um gleichzeitig eine angemessene Länge des Gehwegs und die beste Auflösung der aufgezeichneten Pfoten zu erreichen. Beschriften Sie die Kameraposition auf dem CatWalk-System, um eine identische Kameraplatzierung zwischen den Aufnahmen zu gewährleisten.
- Richten Sie die Erkennungseinstellungen mithilfe der automatischen Erkennung für ein neues Experiment ein. Stellen Sie sicher, dass alle Fußabdrücke mit minimalen Hintergrundgeräuschen erkannt werden können. Optimieren Sie bei Bedarf die Erkennungseinstellungen manuell und ändern Sie den Schwellenwert für die grüne Intensität. Verwenden Sie die gleichen Erkennungseinstellungen für das gesamte Experiment.
- Richten Sie die Korridorwände des CatWalk-Systems ein. Die Korridorwände sollten so nah wie möglich an der Ratte sein. Stellen Sie sicher, dass die Korridorwände parallel zum Gehweg bleiben.
- Definieren der Länge des Gehwegs: Klicken Sie auf das Symbol Gehweg definieren. Passen Sie die Größe des weißen Rechtecks in Länge und Breite entsprechend dem spezifischen Forschungsprojekt an. Klicken Sie auf OK.
- Gehweg kalibrieren: Klicken Sie auf das Symbol Gehweg kalibrieren. Positionieren Sie ein rechteckiges Kalibrierblatt mit den Maßen 20 x 10 cm in der Mitte des Gehwegs. Passen Sie die Größe des weißen Rechtecks an das Kalibrierblatt an. Klicken Sie auf OK.
- Als nächstes machen Sie ein Hintergrundbild: Überprüfen Sie vorher, ob der Gehweg sauber und leer ist. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hintergrund ausrichten, um ein Hintergrundbild zu generieren.
- Trainieren Sie die Tiere mindestens acht Tage lang, bevor Sie mit dem eigentlichen Experiment beginnen. Das Training an aufeinanderfolgenden Tagen wird empfohlen.
- Tag 1 des Trainings: Damit sich Ratten an das CatWalk-System gewöhnen können, erlauben Sie dem Tier, den Gehweg und die Zielbox frei zu erkunden. Lassen Sie die Ratten üben, den Gehweg zu überqueren und betreten Sie die Zielbox. Nimm die Ratte am Ende des Gehwegs oder im Torkasten auf und bringe die Ratte zurück zum Ausgangspunkt des Gehwegs. Für den ersten Trainingstag werden fünf Läufe empfohlen, ohne dass die experimentellen Einstellungen eingehalten werden müssen.
- Tag 2 des Trainings: Ratten können den Gehweg und den Torkasten frei erkunden. Fünf Durchläufe werden ohne Einhaltung der Versuchseinstellungen empfohlen.
- Tag 3 des Trainings: Acht Läufe werden ohne Einhaltung der Versuchseinstellungen empfohlen.
- Tag 4 des Trainings: Zehn Läufe werden ohne Einhaltung der Versuchseinstellungen empfohlen.
- Tag 5 des Trainings: Zehn Läufe werden empfohlen. Die experimentellen Einstellungen sollten im Auge behalten werden. Motivieren Sie die Ratten, den Gehweg ohne Unterbrechung zu überqueren.
- Tag 6 des Trainings: Zehn Läufe werden empfohlen. Die experimentellen Einstellungen sollten im Auge behalten werden. Motivieren Sie die Ratten, den Gehweg ohne Unterbrechung zu überqueren.
- Tag 7 des Trainings: Zehn Läufe werden empfohlen. Es sollten mindestens drei konforme Läufe erreicht werden. Fügen Sie weitere Läufe für Tiere hinzu, wenn sie dieses Ziel nicht erreichen konnten.
- Tag 8 des Trainings: Zehn Läufe werden empfohlen. Es sollten mindestens drei konforme Läufe erreicht werden. Fügen Sie weitere Läufe für Tiere hinzu, wenn sie dieses Ziel nicht erreichen konnten.
- Beginnen Sie mit der Einrichtung des CatWalk-Systems.
- Bewertung
- Führen Sie gemäß den definierten Laufkriterien drei konforme Läufe pro Ratte zur Datenanalyse durch. Für die Bewertung folgen Sie bitte den Schritten 3.2.1. - 3.2.1.8. wie im Schulungsabschnitt beschrieben. Selbst wenn die Ratte innerhalb der ersten drei Läufe drei konforme Läufe erreicht, führen Sie mindestens sechs Läufe pro Sitzung / pro Woche zu Trainingszwecken durch.
- Führen Sie mindestens eine (Trainings-) Einheit mit sechs Läufen pro Woche durch, um ein stabiles Gangmuster für Experimente mit mehreren Zeitpunkten zu erhalten. Die Versuchs- und Erkennungseinstellungen bleiben während des gesamten Experiments konsistent.
- Datenanalyse
- Für die Datenanalyse nur die konformen Läufe auswerten. Löschen Sie nicht konforme Läufe.
- Überprüfen Sie die Grüne Intensitätsschwelle und erhöhen oder verringern Sie die Grünintensitätsschwelle, bevor Sie die Pfotenabdrücke bei Bedarf klassifizieren. Die grüne Intensitätsschwelle muss für alle Tiere und alle Läufe konsistent sein.
- Klassifizieren Sie Pfotenabdrücke automatisch mit der CatWalk XT-Software (Abbildung 2B).
- Überprüfen Sie die Etiketten mit dem Pfotendruck manuell. Korrigieren Sie falsche Pfotendrucketiketten, fügen Sie Etiketten von nicht erkannten Pfotenabdrücken hinzu und löschen Sie Rauschen und falsche Etiketten manuell. Verschieben Sie das Video an eine Position, die manuell überprüft werden muss. Um falsch beschriftete Pfotenabdrücke zu korrigieren, wählen Sie das Rechteck des jeweiligen Pfotendrucks aus, klicken Sie auf Zurücksetzen, wählen Sie dasselbe Rechteck erneut aus und weisen Sie das richtige Etikett aus der Liste zu. Um nicht erkannte Pfotenabdrücke zu beschriften, zeichnen Sie ein Rechteck um die nicht erkannte Pfote, klicken Sie auf Druck hinzufügen, wählen Sie das neu generierte Rechteck aus, und weisen Sie das richtige Etikett aus der Liste zu. Falls die Software mit Nase oder Körper automatisch druckt, wählen Sie das Rechteck des jeweiligen Etiketts aus und klicken Sie auf Drucken entfernen.
- Überprüfen Sie die numerischen Ergebnisse. Die numerischen Ergebnisse werden in einer Excel-Tabelle angezeigt, die eine Reihe grundlegender Parameter anzeigt. Wählen Sie je nach Forschungsinteresse vordefinierte spezifische Parameter und führen Sie wie gewohnt statistische Analysen durch (Abbildung 2D).
- Für detailliertere Informationen über jeden Fußabdruck klassifizieren Sie die Zehen der Hinterpfoten. Diese Analyse erfordert das Modul Interactive Footprint Measurements.
- Passen Sie bei Bedarf die Grüne Intensitätsschwelle für die Analyse der interaktiven Fußabdruckmessungen an. Die grüne Intensitätsschwelle muss für alle Tiere und alle Läufe konsistent sein.
- Legen Sie die Marker für die Footprint-Analyse manuell fest. Analysieren Sie jeden Hinterpfotenabdruck in allen drei konformen Durchläufen. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des ersten Zeichnes bis zur Mitte des fünften Zeichzeichnes, um "Zehenausbreitung" zu messen. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des zweiten Zeichnzes zur Mitte des vierten Zeichzeichnes, um "Intermediate Toe Spread" zu messen. Zeichnen Sie eine Linie von der Mitte des dritten Zehs bis zur Ferse der Hinterpfote, um die "manuelle Drucklänge" zu messen (Abbildung 2C).
- Überprüfen Sie die numerischen Ergebnisse der "Interaktiven Fußabdruckmessungen", die in einem separaten Blatt angezeigt werden. Wählen Sie bestimmte Parameter der "Interactive Footprint Measurements" aus und führen Sie wie gewohnt statistische Analysen durch (Abbildung 2E).
4. Beam Walking Aufgabe
HINWEIS: Gangdefizite können durch die Balkenlaufaufgabe bestimmt werden. Der Schwerpunkt der Beam-Walking-Aufgabe in diesem spezifischen Forschungsthema wird die Analyse der motorischen Koordination sein, definiert als die Fähigkeit, die Muskelaktivierung von mehreren Körperteilen zu koordinieren, und nicht die Bewertung des motorischen Gleichgewichts, definiert als die Fähigkeit zur Haltungskontrolle während Körperbewegungen.
- Einrichtung
- Verwenden Sie für die Strahllaufaufgabe einen Balken, einen Abstandhalter, einen Tisch, einen einheitlichen Hintergrund und einen Camcorder (Abbildung 3A).
- Verwenden Sie einen Holzbalken von 90 cm Länge, 1,7 cm Breite und 2 cm Höhe. Eine Plattform von 20,5 cm Länge, 15 cm Breite und 2 cm Höhe an beiden Enden des Balkens wird empfohlen. Verwenden Sie das gleiche Material für die Plattformen und den Balken, vermeiden Sie Barrieren zwischen den Plattformen und dem Balken.
- Muss der Abstand zwischen dem Balken und dem Tisch mindestens 44 cm beträgt. Eine vertraute Umgebung wie ein Heimkäfig motiviert die Ratten, den Balken zu überqueren, der am Ende der Balkenplattform platziert werden kann.
- Ausbildung
- Stellen Sie den Balken mit Abstandhalter und Hauskäfig auf dem Tisch auf.
- Trainiere Tiere für sieben Tage. Das Training an aufeinanderfolgenden Tagen wird empfohlen.
- Tag 1 des Trainings
- Platzieren Sie alle Ratten aus einem Heimkäfig auf der Startplattform des Balkens.
- Lassen Sie die Ratten die Umgebung erkunden (Plattform/Strahl).
- Halten Sie eine Ratte vorsichtig am Schwanz und führen Sie die Ratte zum Strahl, indem Sie die Ratte sanft auf den Balken drücken.
- Unterstützen Sie die Ratte beim Durchqueren des Strahls, indem Sie die Ratte mindestens zwei Läufe lang an ihrem Schwanz halten.
- Lassen Sie die Ratte den Strahl für drei weitere Läufe ohne Hilfe durchqueren. Beobachten Sie die Ratte und leisten Sie bei Bedarf Hilfe. Wenn die Ratte den Strahl nicht durchquert, fangen Sie den Sturz ab, um Verletzungen und die Entwicklung von Angst zu vermeiden, den Strahl zu durchqueren.
- Fahren Sie mit diesem Verfahren für alle Ratten fort.
HINWEIS: Manchmal folgen Ratten einander, um den Strahl zu durchqueren, in diesem Fall ist keine Hilfe erforderlich. Es ist jedoch wichtig, die Ratten zu beobachten, Stürze abzufangen und bei Bedarf Hilfe zu leisten.
- Tag 2 des Trainings
- Platzieren Sie alle Ratten aus einem Heimkäfig auf der Startplattform des Balkens.
- Lassen Sie die Ratten den Strahl sechsmal durchqueren.
- Leisten Sie bei Bedarf Hilfe und fangen Sie Stürze ab.
- Tag 3 des Trainings
- Legen Sie eine Ratte auf die Startplattform des Balkens.
- Lassen Sie die Ratte den Strahl sechsmal durchqueren.
- Leisten Sie bei Bedarf Hilfe und fangen Sie Stürze ab.
- Tag 4-7 des Trainings
- Legen Sie eine Ratte auf die Startplattform des Balkens.
- Lassen Sie die Ratte den Strahl zehnmal durchqueren.
- Leisten Sie bei Bedarf Hilfe und fangen Sie Stürze ab.
- Am Ende des Trainings sollte die Ratte den Strahl ohne Unterbrechung für mindestens drei Läufe durchqueren. Es ist zulässig, die Ratte sanft auf die Startplattform zu drücken, um die Bewegungseinleitung auszulösen.
- Tag 1 des Trainings
- Bewertung
- Stellen Sie den Balken mit Abstandhalter und Hauskäfig auf dem Tisch auf.
- Platzieren Sie den Camcorder in Position, parallel zum Strahl ausgerichtet, wobei das Tier im Fokus ist. Die Position des Camcorders sollte so nah wie möglich am Tier sein, um eine optimale Auflösung der aufgezeichneten Bewegungen zu erreichen. Der Strahl und Teile beider Plattformen sollten von der Aufnahme erfasst werden.
- Starten Sie die Aufzeichnung und identifizieren Sie zuerst die Sitzung und das Tier.
- Legen Sie die Ratte auf die Startplattform des Balkens.
- Die Ratte sollte den Strahl dreimal ohne Unterbrechung überqueren. Selbst wenn die Ratte innerhalb der ersten drei Läufe drei konforme Läufe erreicht, führen Sie mindestens sechs bis zehn Läufe durch, um eine kontinuierliche Aufgabenleistung zu gewährleisten.
- Beobachten Sie immer das Tier und fangen Sie stürze ab, wenn nötig.
- Reinigen Sie nach der Aufgabe den Strahl und den Tisch mit 0,1% Essigsäure, um ablenkungsgefecht durch den Geruch der zuvor aufgezeichneten Ratte zu vermeiden.
HINWEIS: Innerhalb der ersten zwei Wochen nach der Nervenquetschverletzung sind die Ratten nicht in der Lage, den Strahl ohne Hilfe zu durchqueren. Daher muss in den ersten zwei Wochen nach einer Nervenquetschverletzung sechs bis acht Läufe gedrückt werden. Von Woche drei bis Woche fünf werden fünf Läufe mit Hilfe und zehn weitere Läufe ohne Hilfe durchgeführt.
- Datenanalyse
- Nutzen Sie die kostenlose Videoanalysesoftware Kinovea zur Datenanalyse.
- Wählen Sie die Videosequenzen von drei kompatiblen Läufen aus der Aufnahme aus. Wählen Sie dazu die ersten drei konformen Läufe aus, die ohne Hilfe des Tieres durchgeführt wurden. Seien Sie konsistent in der konformen Laufauswahl für alle Ratten.
- Definieren Sie den Startzeitpunkt und den Endzeitpunkt der ausgewählten drei kompatiblen Durchläufe (Abbildung 3D-E). In diesem Setup wurde der Startpunkt durch eine schwarze Linie auf dem Balken markiert und die Platzierung der ersten Hinterbeine hinter der schwarzen Linie definierte den Startzeitpunkt des Laufs. Die Platzierung des ersten Hinterbeins auf der Plattform am Ende des Balkens definiert den Endzeitpunkt.
- Als nächstes berechnen Sie die Zeit, die die Ratte benötigt, um den Strahl zu durchqueren. Melden Sie Daten als Latenzzeit, um den Strahl in Sekunden zu überqueren und führen Sie wie gewohnt statistische Analysen durch (Abbildung 3B).
- Bewerten Sie die Anzahl der Schritte und Fehler aus drei konformen Läufen für beide Hinterbeine separat, indem Sie die Zoom- und Zeitlupenfunktion der Software verwenden. Zu den Fehlern gehören totale Fußrutsche und halbe Fußrutschen. Ein totaler Fußschlupf ist definiert als eine Fußplatzierung, der ein tiefer Rutsch folgt, der einen Kontaktverlust der betroffenen Pfote mit dem Balken verursacht (Abbildung 3F). Ein halber Schlupf ist definiert als eine Pfote, die von der Seitenwand des Balkens abrutscht, ohne den vollständigen Kontakt mit dem Balken zu verlieren (Abbildung 3G).
- Berechnen Sie den Prozentsatz der Fußrutsche im Verhältnis zur Anzahl der Schritte, die den Balken überqueren sollen ((Anzahl der Fußrutschen der Extremität x 100%) / Anzahl der Schritte derselben Extremität). Präsentieren Sie die Daten als prozentuale Fußrutsche und führen Sie wie gewohnt statistische Analysen durch (Abbildung 3C).
5. Leiter-Sprossen-Gehaufgabe
HINWEIS: Die Leitersprosse-Walking-Aufgabe kann die motorische Funktion, die Platzierung von Vorder- und Hinterbeine und die Interlimb-Koordination beurteilen.
- Einrichtung
- Verwenden Sie für diesen Verhaltenstest ein Leitersprossengerät, einen Abstandhalter, einen Tisch, einen einheitlichen Hintergrund und einen Camcorder (Abbildung 4A). Die horizontale Leitersprossenvorrichtung besteht aus Metallsprossen und klaren Polycarbonat-Seitenwänden. Das Gerät hat eine Länge von 119,5 cm und die Breite ist auf 7,4 cm eingestellt. Der zu analysierende Gehweg hat eine Länge von 100 cm.
- Beschriften Sie den Start- und Endpunkt mit einer schwarzen Linie an der Seitenwand. Platzieren Sie Platzhalter für die Sprossen im Abstand von 1 cm auf dem Gerät. Ordnen Sie ein unregelmäßiges Muster der Sprossen für den 100 cm gehweg mit einem Abstand zwischen 1 und 5 cm zwischen den Sprossen an. Die ersten 10 cm am Anfang und die letzten 9,5 cm am Ende der Apparatur, die von der Analyse ausgeschlossen sind, haben ein regelmäßiges Muster der Sprossen mit einem Abstand von 1 cm.
- Verwenden Sie einen Abstand zwischen dem Gehweg und dem Tisch von ca. 30 cm (Abbildung 4A-B). Ein Torkasten oder eine vertraute Umgebung am Ende des Apparates, wie ein Heimkäfig, motiviert die Ratten, den Leitersprossenapparat zu überqueren.
- Ausbildung
- Stellen Sie die Leitersprosse mit Abstandhalter und Torkasten auf dem Tisch auf.
- Trainiere Tiere für acht Tage. Das Training an aufeinanderfolgenden Tagen wird empfohlen.
- Tag 1 des Trainings
- Legen Sie alle Ratten aus einem Heimkäfig auf den Leitersprossenapparat.
- Lassen Sie die Ratten die Umgebung erkunden (Leitersprossengerät/Torkasten).
- Drücken Sie die Ratten vorsichtig in Richtung des Tores. Helfen Sie den Ratten beim Betreten des Torkastens. Lassen Sie die Ratten den Zielkasten für eine Weile erkunden.
- Immerhin betraten Ratten den Torkasten. Nimm die erste Ratte aus dem Torkasten und lege die Ratte wieder auf die Startzone des Geräts. Fahren Sie mit dem gleichen Verfahren für alle Ratten eines Heimkäfigs fort. Drücken Sie die Ratten vorsichtig in Richtung des Torkastens und geben Sie bei Bedarf Hilfe beim Betreten des Torkastens.
- Lassen Sie die Ratte den Apparat viermal durchqueren.
- Tag 2 des Trainings
- Führen Sie das gleiche Protokoll aus, das für den ersten Tag des Trainings aufgeführt ist.
- Lassen Sie die Ratte den Apparat sechsmal durchqueren.
- Tag 3 des Trainings
- Führen Sie das gleiche Protokoll aus, das für den ersten Tag des Trainings aufgeführt ist.
- Lassen Sie die Ratte den Apparat achtmal durchqueren.
- Tag 4 des Trainings
- Legen Sie eine Ratte auf den Anfang des Leitersprossenapparates.
- Wenn die Ratte den Apparat nicht durchquert und freiwillig in den Torkasten eindringt, helfen Sie, indem Sie die Ratte sanft von hinten drücken.
- Lassen Sie die Ratte den Apparat achtmal durchqueren.
- Tag 5-8 des Trainings
- Legen Sie eine Ratte auf den Anfang des Leitersprossenapparates.
- Wenn die Ratte den Apparat nicht durchquert und freiwillig in den Torkasten eindringt, helfen Sie, indem Sie die Ratte sanft von hinten drücken.
- Lassen Sie die Ratte den Apparat zehnmal durchqueren.
- Am Ende des Trainings sollte die Ratte in der Lage sein, den Gehweg ohne Unterbrechung und Unterstützung für mindestens drei Läufe zu überqueren. Es ist zulässig, der Ratte einen sanften Schubs in der Startzone zu geben, um die Bewegungseinleitung auszulösen.
- Tag 1 des Trainings
- Bewertung
- Stellen Sie die Leitersprosse mit Abstandhalter und Torkasten auf dem Tisch auf.
- Platzieren Sie den Camcorder in Position, parallel zum Gerät ausgerichtet, wobei das Tier im Fokus ist. Positionieren Sie den Camcorder so nah wie möglich am Tier, um eine optimale Auflösung der aufgezeichneten Bewegungen zu erreichen und sicherzustellen, dass die gesamte Leitersprosse in der Aufnahme erfasst wird.
- Starten Sie die Aufzeichnung und identifizieren Sie zuerst die Sitzung und das Tier.
- Legen Sie die Ratte auf die Startzone des Leitersprossenapparates.
- Die Ratte muss den 100 cm großen Gehweg des Leitersprossengeräts dreimal ohne Unterbrechung durchqueren, damit sie als konformer Lauf gilt. Selbst wenn die Ratte innerhalb der ersten drei Läufe drei konforme Läufe erreicht, sollten mindestens zehn Läufe für eine kontinuierliche Aufgabenerfüllung durchgeführt werden.
- Reinigen Sie nach der Aufgabe das Gerät und den Tisch mit 0,1% Essigsäure, um ablenkungsgefecht durch den Geruch der zuvor aufgezeichneten Ratte zu vermeiden.
- Datenanalyse
- Nutzen Sie die kostenlose Videoanalysesoftware Kinovea zur Datenanalyse.
- Wählen Sie die Videosequenzen von drei kompatiblen Läufen aus der Aufnahme aus. Wählen Sie die ersten drei kompatiblen Läufe für die Datenanalyse aus.
- Definieren Sie den Startzeitpunkt und den Endzeitpunkt der ausgewählten drei kompatiblen Durchläufe. Die Platzierung der ersten Hinterbeine hinter der ersten schwarzen Linie an der Seitenwand des Geräts, die den Startzeitpunkt des 100 cm Gehwegs kennzeichnet, definiert den Startzeitpunkt des Laufs. Die Platzierung des ersten Frontlimbs hinter der zweiten schwarzen Linie an der Seitenwand des Geräts, die den Endpunkt des 100 cm gehwegs beschriftet, definiert den Endzeitpunkt des Laufs.
- Identifizieren Sie den Start- und Endzeitpunkt. Berechnen Sie als Nächstes die Dauer des Laufs über den Gehweg. Melden Sie Daten als Latenzzeit, um den Gehweg in Sekunden zu durchlaufen und wie gewohnt statistische Analysen durchzuführen (Abbildung 4C).
- Bewerten Sie die drei konformen Läufe mit der 7-Kategorie-Skala von Metz et al. mit der Zeitlupen- oder der Frame-by-Frame-Funktion der Software (Abbildung 5)16,17. Bestimmen Sie die Anzahl der Schritte und die Anzahl der Fehler gemäß den Kategorien der Skala für jedes Glied separat. Die Skala unterscheidet zwischen folgenden Kategorien: (0) Gesamtflaz (1) Tiefer Schlupf (2) leichter Schlupf (3) Ersatz (4) Korrektur (5) Teilplatzierung und (6) korrekte Platzierung. Nur der Fehler der initiierenden Extremität wurde bewertet. Weitere Fehler, die durch den Anfangsfehler ausgelöst werden, sollten nicht bewertet werden.
- Berechnen Sie die Fehler/Schritte unter Berücksichtigung der folgenden Anforderungen. Die Kategorien (0) Gesamtfräulein (1) Tiefer Schlupf (2) Leichter Schlupf zählen als Fehler. Teilen Sie die Anzahl der Fehler durch die Anzahl der Schritte für jeden Hinterbeine und jede Ausführung separat. Ermitteln Sie den Mittelwert aller drei konformen Läufe für jedes Tier und jede Hinterbeine separat und führen Sie wie gewohnt statistische Analysen durch (Abbildung 4D).
Representative Results
Die repräsentativen Ergebnisse des fünf Minuten OFT zeigen, dass die Nervenquetschverletzung fünf Wochen nach der Operation keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität hat (Abbildung 1).
Die Ganganalyse mit dem CatWalk XT System (Abbildung 2) generiert viele verschiedene Parameter. Selektive Parameter wurden statistisch analysiert, indem naive Ratten fünf Wochen nach dem Nervenquetschen mit nervenverletzten Ratten verglichen wurden (Abbildung 2D). Signifikante Veränderungen konnten für die Laufdurchschnittsgeschwindigkeit, die Schrittlänge und den Druckbereich der nervenverletzten (rechts) Hinterpfote festgestellt werden. Eine detailliertere Analyse der nervenverletzten Hinterpfote wurde mit dem Modul "Interactive Footprint Measurements" durchgeführt. Eine signifikante Reduktion der Parameter Zehenausbreitung, Zwischenkeheausbreitung und Drucklänge wurde bei nervenverletzten Wt Ratten im Vergleich zu wt naiven Ratten beobachtet. Darüber hinaus unterscheiden sich die Pfotenwinkelkörperachse und der Pfotenwinkelbewegungsvektor signifikant beim Vergleich von nervenverletzten Wt-Ratten mit wt naiven Ratten (Abbildung 2E).
Abbildung 3 zeigt Daten zur motorischen Koordination, die durch die Bewertung von Balkenlaufaufgaben erhalten wurden. Nervenverletzte Wt-Ratten zeigten eine signifikant erhöhte Latenzzeit, um den Strahl zu überqueren, verglichen mit wt naiven Ratten fünf Wochen nach der Verletzung (Abbildung 3B). Als zusätzliches Auslesen der Beam-Walking-Aufgabe wurden Voll- und Halbrutsche der nervenverletzten Hinterbeine gezählt und als Fehler für die statistische Analyse betrachtet. Der Prozentsatz der Fehler pro Schritt des nervenverletzten (rechten) Hinterbeins war bei nervenverletzten Wt-Ratten im Vergleich zu wt naiven Ratten signifikant erhöht.
Repräsentative Daten der Leitersprosselaufaufgabe (Abbildung 4) zeigen keine signifikanten Veränderungen in der Latenzzeit zum Überqueren des Gehwegs der Leitersprosse (Abbildung 4C) oder im Prozentsatz der Fehler pro Schritt des nervenverletzten (rechts) Hinterbeins (Abbildung 4D). Die Analyse des Fehlerprozentsatzes pro Schritt des nervenverletzten Hinterbeins berücksichtigte nur die Punktzahl von 0 bis 2 der 7-Kategorien-Skala von Metz et al. Die Verteilung aller Score-Kategorien pro Schritt aus der 7-Kategorie-Skala der nervenverletzten Hinterbeine und der nicht nervenverletzten (links) Hinterbeine ist in Abbildung 4Edargestellt.
Abbildung 1: Beurteilung der Bewegungsaktivität während des Freifeldtests. (A) Bild des Offenfeld-Testaufbaus. Ausgewähltes Bild, das von einem aufgezeichneten Video während des Freifeldtests abgezogen wurde und eine Ratte in der Freifeldarena ohne (B) und mit (C) Tracking zeigt. (D) Die Geschwindigkeit während einer fünfmonatigen Open-Field-Testaufzeichnung wurde bei naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach einer Nervenquetschverletzung untersucht. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test der normalverteilten Daten durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ganganalyse mit dem CatWalk XT-System. (A) Bild des CatWalk XT-Geräts. (B) Beispiele für die Druckansicht, die die beschrifteten Pfotenabdrücke im Falschfarbenmodus zeigt, und Beispiele für die Timing-Ansicht, die ein zeitbasiertes Gangdiagramm von naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach nervenquetschernder Verletzung zeigt. (C) Beispiele für die Zehenklassifikation mit Zehenausbreitung (TS), Zwischenzehenausbreitung (ITS) und Drucklänge (PL) sowie Beispiele für die Körperachsenansicht, die die Körperachse (weiße Linie) und den Bewegungsvektor (rote Linie) von naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung zeigt. (D) Daten ausgewählter Parameter aus der "Standard"-Klassifikation zum Vergleich von naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung. (E) Daten ausgewählter Parameter aus dem Modul "Interactive Footprint Measurements", die fünf Wochen nach einer Nervenquetschverletzung mit naiven Ratten und Ratten verglichen werden. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test der normalverteilten Daten, dem ungepaarten t-Test mit Welchs Korrektur normalverteilter Daten mit ungleicher Varianz und dem Mann-Whitney-U-Test der nicht normalverteilten Daten durchgeführt. ± Der P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert und als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 bezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ganganalyse mit der Strahllaufaufgabe. (A) Bild und schematische Zeichnungen der Einrichtung der Balkenlaufaufgabe. Die Latenzzeit bis zum Überqueren des Strahls (B) und die prozentualen Fußschlupffehler pro Schritt der nervenverletzten Hinterbeine während der Strahllaufaufgabe (C) wurden bei wt naiven Ratten und wt Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung analysiert. Repräsentatives Bild für die Startzeitposition (D) und die Endzeitposition (E) der Strahllaufaufgabe. Repräsentative Bildsequenz eines Vollschlupffehlers (F) und eines Halbschlupffehlers (G) der Strahllaufaufgabe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit dem Mann-Whitney-U-Test der nicht normalverteilten Daten durchgeführt. Der P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert und als *p < 0,05, **p < 0,01 gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ganganalyse mit der Leitersprosse. Bild (A) und schematische Zeichnungen (B) der Leitersprosse Walking Task Setup. Die Latenzzeit beim Durchlaufen des Leitersprossenapparates (C) und der prozentuale Fußschlupffehler pro Schritt der nervenverletzten Hinterbeine während der Leitersprosse-Gehaufgabe (D) wurden bei naiven Ratten und Ratten fünf Wochen nach nervenquetschungsverletzungen untersucht. (E) Die prozentuale Verteilung der Score-Kategorie pro Schritt nach der 7-Kategorie-Skala von Metz et al. für den linken und rechten Hinterbein von wt naiven Ratten und wt Ratten fünf Wochen nach Nervenquetschverletzung. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test der normalverteilten Daten und dem Mann-Whitney-U-Test der nicht-normalverteilten Daten durchgeführt. ± Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispielhafte Darstellung jeder Kategorie nach der 7-Kategorien-Skala von Metz et al. während der Leiter sprossen Gehaufgabe. Repräsentative Bildsequenz von der rechten Hinterbeine der Kategorie 0 - Totalflaz, Kategorie 1 - tiefer Schlupf, Kategorie 2 - leichter Schlupf, Kategorie 3 - Ersatz, Kategorie 4 - Korrektur, während der Leitersprosse Gehaufgabe. Repräsentative Bilder für Kategorie 5 - Teilplatzierung und Kategorie 6 - korrekte Platzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Dieses Verhaltensbewertungsprotokoll bietet einen Überblick über Vor- und Nachteile sowie mögliche Auslesungen der ausgewählten Verhaltenstestbatterie in einem Nagetiermodell nach Ischiasnervenquetschverletzung.
Um ein vergleichendes Ergebnis der Ischiasnervenquetschverletzung zu erhalten, ist eine konsistente Quetschtechnik erforderlich. Die Verwendung einer nicht gezackten Klemme (Ultra Fine Hemostat) anstelle einer Zange kann die Konsistenz des Quetschs verbessern. Verwenden Sie die gleiche Klemme sowie die gleiche Quetschposition, um eine gleichmäßige Nervenkompression zu gewährleisten. Die ausschließliche Verwendung der Klemme für die Quetschverletzung und die pflegevolle Handhabung der Klemme verbessert die Konsistenz. Führen Sie auch das Verfahren der Quetschverletzung mit Vorsicht durch. Zusätzliche Schäden am Nerv während der Operation wie unerwünschte Traktion des Nervs können zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Autoverstümmelung führen. Daher empfiehlt sich eine sorgfältige Nervenvorbereitung sowie die Gabe eines Schmerzmittels für mindestens zwei Tage.
Die multifaktorielle Beurteilung des motorischen Verhaltens kann den Phänotyp nach Nervenquetschverletzungen bei Ratten auf verschiedenen Ebenen charakterisieren. Wir verwendeten die OFT, CatWalk XT Ganganalyse, Beam Walking Task und Ladder Rung Walking Task. Ein verblindetes experimentelles Verfahren und die Datenanalyse zu experimentellen Gruppen ist für diese Experimente unerlässlich. Vor der Verhaltensbewertung wurden die Tiere im Testraum unter Testbedingungen für mindestens 30 Minuten akklimatiert. Alle hier angewandten Verhaltenstests haben den Vorteil, dass Nahrungs- oder Wasserentzug nicht erforderlich ist. In allen beschriebenen Verhaltenstests wurde die gleiche Gruppe von Tieren verwendet. Für jedes Tier wurden maximal zwei verschiedene Verhaltenstests pro Tag durchgeführt. Wenn Verhaltenstests in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden, achten Sie auf ein vergleichbares Verfahren, z. B. die Durchführung des Tests in der gleichen Tierreihenfolge und zur gleichen Tageszeit. Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Verhaltensanalyse ist der Tag-Nacht-Zyklus von Ratten. Betrachten Sie einen umgekehrten Tag-Nacht-Zyklus, um natürlichere und höhere Aktivitätsniveaus im Tageszyklus (dunkler Zyklus) zu erhalten. Dies muss insbesondere bei der Messung von spontanem Verhalten, wie dem OFT, berücksichtigt werden. In diesem Experiment konnte ein umgekehrter Tag-Nacht-Zyklus nicht implementiert werden, sondern eine ausreichende Akklimatisierung an die Testbedingungen wurde sichergestellt. Eine perfekte Ausleuchtung ist für hochauflösende Videos für die Beam Walking Task und die Ladder Rung Walking Task unerlässlich. Diese hohe Videoqualität kann bei Experimenten im Dunkeln nicht erreicht werden.
Die Beurteilung des Ganges erfordert eine kontinuierliche Aufgabenerfüllung. Der erste wichtige Aspekt einer kontinuierlichen Aufgabenerfüllung besteht darin, die Tiere davon zu überzeugen, das Setup zu überqueren. Um die Motivation zu erhöhen, legen Sie kleine Futterpellets (45 mg) am Ende des Setups. Damit sich die Tiere mit den Futterpellets vertraut machen können, sollten die Pellets vor dem Test an sie verfüttert werden. Auch eine Zielbox am Ende des Setups kann hilfreich sein. Das Setup des CatWalk beinhaltet bereits einen Torkasten, aber Ratten zögern manchmal, den Torkasten zu betreten. Alternativ können Sie einen kleinen Käfig in den Torkasten einfügen, aber der Heimkäfig von Ratten passt nicht in den Torkasten. Lassen Sie die Ratte vor dem Erwerb einige Minuten im Käfig gewöhnungshalber. Zusätzlich kann eine weitere Ratte aus demselben Heimkäfig in den Torkasten oder in den Käfig im Torkasten gelegt werden. Achten Sie darauf, dass die zweite Ratte in der Box bleibt und den Eingang zum Torkasten nicht blockiert. Darüber hinaus ist es auch möglich, den Zielkasten aus dem CatWalk-System zu entfernen und den Rattenheimkäfig am Ende des Gehwegs zu platzieren, wodurch die Ratte nach jedem Lauf ihr "Heimatgebiet" betreten kann. Für die Einrichtung der Balkenlaufaufgabe und der Leitersprosselaufaufgabe empfehlen wir, am Ende des Aufbaus einen Torkasten oder den Heimkäfig hinzuzufügen. Um die Konsistenz zu gewährleisten, sollten der CatWalk, die Balkenlaufaufgabe und die Leitersprosse mindestens einmal pro Woche mit sechs bis zehn Läufen durchgeführt werden.
Obwohl nicht jede Analyse signifikante Unterschiede in dieser Studie ergab, bedenken Sie, dass eine Einbeziehung von genetisch veränderten Tieren oder Behandlungsgruppen wertvolle Daten liefern könnte, die zwischen Gruppen aus den gleichen Verhaltenstests unterscheiden können.
Die Nervenquetschverletzung hatte keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität der Ratte, die in einem fünf Minuten OFT gemessen wurde. Die Catwalk XT-Ganganalyse ist ein objektiveres und empfindlicheres Werkzeug zur Analyse der Gang-, Pfoten- und Zehenpositionierung. Nach einem intensiven Training lernen die Ratten, den Gehweg des CatWalk XT-Geräts zu den Standardeinstellungen zu überqueren. Die Nervenverletzung verringert nicht die Fähigkeit der Ratten, den Gehweg zu überqueren. Die automatische Berechnung verschiedener Parameter stellt die Daten objektiv dar. Zusätzliche Informationen können mit dem Modul "Interactive Footprint Measurements" gewonnen werden, und in der Tat ergaben diese Analysen signifikante Unterschiede in verschiedenen Parametern der Zehenspreizung, der Drucklänge und des Pfotenwinkels zur Körperachse im Vergleich von Ratten mit und ohne Nervenverletzung.
Ratten können leicht für die Strahllaufaufgabe trainiert werden. Unterschiede in der Latenzzeit bis zum Überqueren des Strahls und in der Anzahl der Fußrutsche pro Schritt der nervenverletzten Hinterbeine wurden durch den Vergleich von Naiven mit quetschverletzten Ratten festgestellt. Ein Nachteil der Analyse von nervenverletzten Ratten mit der Beam Walking Task ist die Größe des Strahls. Innerhalb der ersten zwei Wochen nach der Ischiasnervenquetschverletzung benötigen die Ratten Hilfe, um den Strahl zu überqueren, da ihr Gleichgewicht beeinträchtigt ist. Obwohl einige Ratten in der Lage sein können, den Strahl zu überqueren, ist das Risiko von Verletzungen, die durch einen Sturz verursacht werden, hoch. Nervenzerkleinerte Tiere sollten daher in den ersten zwei Wochen nach einer Ischiasnervenquetschverletzung oder gegebenenfalls länger dabei unterstützt werden, den Strahl zu überqueren. Es ist jedoch schwierig, Läufe mit und ohne Hilfe zu vergleichen. Auch die Motorbalance ist ein wichtiger Parameter, der durch die Balkenlaufaufgabe beurteilt wird. Wir hielten diesen Parameter für nicht relevant für unser Nervenquetschrattenmodell. Daher konnten die von Ohwatashi et al. und Johansson & Ohlsson beschriebenen Scores nicht verwendet werden und Läufe mit einer unvollständigen Strahltraverse wurden für die Datenanalyseausgeschlossen 18,19.
Die 7-Kategorien-Skala von Metz et al. kann sowohl Vor- als auch Hinterbeine analysieren und zwischen unterschiedlichen Schweregraden von Fehlern aller Gliedmaßen während der Leitersprosse Gehen Aufgabe16,17unterscheiden. Durch die Analyse der prominentesten Fehler, zu denen die Kategorien von 0 bis 2 gehören, konnten beim Vergleich von nervenverletzten Wt-Ratten mit naiven Wt-Ratten keine Unterschiede der Fehler pro Schritt im Hinterbeine festgestellt werden. Darüber hinaus unterschied sich die Latenzzeit beim Durchlaufen des Leitersprossenapparates nicht zwischen nervenverletzten Ratten und naiven Ratten. Deep-Learning-Modelle könnten die Datenanalyse der Leitersprosse durch einen automatisierten Ansatz verbessern und beschleunigen.
Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Nervenquetschverletzung sowie alle beschriebenen Verhaltenstests leicht auf Mäuse übertragen werden können, indem die Einstellungen und Größen der Setups angepasst werden. Die Verwendung von Mäusen als Modellorganismus hat den positiven Effekt, dass transgene Modelle für viele menschliche Krankheiten existieren.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF DysTract bis C.W.I.) und vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) der Universität Würzburg (N-362 bis C.W.I.; Z2-CSP3 bis L.R.). Darüber hinaus wurde dieses Projekt aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover to J.V.) und von der VERUM Foundation finanziert. Darüber hinaus wird C.W.I. gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Projekt-ID 424778381-TRR 295, durch die Deutsche Stiftung Neurologie und ParkinsonFonds. L.R. wird zusätzlich von der Dystonia Medical Reseach Foundation unterstützt.
Die Autoren danken Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel und Louisa Frieß für die technische Unterstützung sowie Helga Brünner für die Tierpflege.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 - laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
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