Summary
Siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonra sıçanlarda davranışsal test pili ile motor davranışın değerlendirilmesi için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Periferik sinir hasarının indüksiyonu, diğerleri arasında onarım ve ağrı mekanizmalarının değerlendirilmesi için nörobilimde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ek olarak, hareket bozuklukları araştırma alanında, siyatik ezilme yaralanması, distoninin genetik olarak yatkın DYT-TOR1A kemirgen modellerinde distoni benzeri bir fenotipi tetiklemek için almıştır. Siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonra tutarlı, tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, standartlaştırılmış fenotipik karakterizasyona ek olarak, sinir ezilmesini teşvik etmek için standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. Sadece belirli davranışsal test çeşitlerine değil, aynı zamanda teknik gereksinimlere, doğru yürütmeye ve ardışık veri analizine de dikkat edilmelidir. Bu protokol, siyatik sinir ezilme yaralanmasının nasıl gerçekleştirildiğini ayrıntılı olarak açıklar ve sıçanlarda motor açıklarının değerlendirilmesi için açık alan testi, CatWalk XT yürüyüş analizi, ışın yürüme görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevini içeren bir davranışsal test pili sağlar.
Introduction
Kemirgenler, birden fazla biyolojik düzeyde hipotezleri test ederek insan hastalıkları1,2'nin anlaşılmasını derinleştirmek için mükemmel model organizmalardır. Kemirgen modellerinin karakterizasyonu için temel biyolojik düzeylerden biri, davranışsal değerlendirmelerle ölçülen fenotip seviyesidir. Hayvan modeline ve bilimsel araştırma sorusuna bağlı olarak, güçlü ve güvenilir bir davranışsal test pilinin seçimi, Parkinson hastalığı ve distoni 3 ,4,5,6hayvan modelleri gibi çok çeşitli davranışsal yönleri kapsamak için gereklidir.
Siyatik sinir, duyusal liflerin yanı sıra motor ile insan vücudundaki en büyük sinirdir. Siyatik sinirinin yaralanmaları trafik kazaları ve ameliyatlar gibi çeşitli olaylardan kolayca sonuçlanabilir7,8. Bu nedenle, siyatik sinir yaralanmaları olan kemirgen modellerini kullanan araştırma faaliyetleri, çevirisel olarak ilgili değerdedir. Sinir yenilenmesinin sıçandan insana çevirisel yönü eleştirel olarak ele alınması gerekse de9Kemirgen modellerinde siyatik sinir ezilme yaralanması (axonotmesis), periferik sinirlerin dejenerasyon ve rejenerasyon süreçlerini analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir10,11. Ezilme yaralanması durumunda sinir tamamen transected değildir. Aksona zarar verir, ezilme yaralanmasından hemen sonra iletim bloğuna neden olur ve ardından rejeneratif süreçler 4,12,13.
Ayrıca, distoni araştırmalarında, tek taraflı siyatik sinir ezilme yaralanması, genetik olarak yatkın distoni kemirgen modellerinde distoni benzeri hareketleri (DLM) tetiklemek için yerleşik bir yöntemdir, bu da DLM'yi 4,14başına göstermez. Periferik sinir travmasının motor ve duyusal fonksiyonlardan sorumlu siyatik sinir liflerini etkileyerek sensorimotor entegrasyonunu bozduğ varsayılıyor15.
Burada, siyatik sinirin standartlaştırılmış bir ezilme yaralanması ve açık alan testi (OFT), CatWalk XT yürüyüş analizi, ışın yürüyüş görevi ve naif vahşi tip (wt) sıçanlarda (n= 8-9) ve wt sıçanlarında tek taraflı siyatik sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra (n= 10) oluşan bir motor davranış değerlendirmesi pili için ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz. OFT, genel lokomotor aktivitesi hakkında bilgi sağlarken, otomatik yürüyüş analiz sistemi CatWalk XT tarafından ayrıntılı bir yürüyüş analizi elde edilir. Kiriş yürüme görevi, kirişi geçme süresini ve ayak yerleştirme hatalarının sayısını değerlendirerek motor koordinasyonunu değerlendirmek için kullanılır. Yürüyüş performans analizi için merdiven basamak yürüyüş görevi, ayak veya pençe yerleşimi ve sabit ama düzensiz bir basamak desenli yatay merdiven basamak aparatındaki hatalar hakkında bilgi verir.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Regierung von Unterfranken'deki (Würzburg, Almanya) yerel makamlar tarafından onaylanmış ve hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergelere göre gerçek gerçekleştirildi.
1. Siyatik sinir ezilme yaralanması
NOT: Tüm cerrahi işlem sırasında steril bir ortam sağlayın. Ameliyat masasını gerekli ekipmanlarla kurun.
- O2'de (2 L/dk) % 3.0 izofluran ile kapalı bir dolapta sıçanı derinlemesine uyuşturun. Fareyi dolaptan çıkarın. Sağ arkalık geniş bir alanı tıraş edin.
- Sıçanı anestezi maskesine yerleştirin veO 2'de (2 L/dk) %2,0 izofluran ile derin anesteziye devam edin. Arka ayakların interdigital ağlarını sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin. Yoksunluk reflekslerinin olmaması yeterli anesteziye işaret eder.
- Gövdeyi ve sıçanın her iki arkasını bantla sabitleyin. Pençeyi düz bir şekilde ameliyat masasına çevirerek her iki arkalığı da simetrik ve uzanmış bir konuma yerleştirin.
- Göz kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın. Tıraş edilen bölgenin cildini bir antiseptik ile dezenfekte edin.
- İlyumun siyatik çentikini arayın.
- Siyatik çentiğinden neşterle pençe yönüne bir cilt kesisi yapın. Cilt kesisi mümkün olduğunca küçük olmalıdır (yaklaşık 1 ila 2 cm).
- Hindlimbler sabitlenir ve cilt kesisi doğru yapılırsa, gluteus maximus kası ile pazı femoris kası arasındaki fasyal düzlemde "beyaz çizgiye" benzeyen bir boşluk görülebilir. Kapalı süper ince hemostatik forsepsleri (No. 5) boşluğa yerleştirin ve forsepsleri yayın. Fasyal düzlem herhangi bir kas dokusunu yaralamadan açılmalıdır.
- Deri kesisini açık tutmak için lastik bant retraktörlerini kasların altına yerleştirin.
- Sinir tamamen açığa çıkarıncaya kadar çevredeki herhangi bir dokuyu ve kan damarlarını siyatik sinirden hafifçe çıkarın. Tüm işlem sırasında siniri germemek veya çekmemek önemlidir.
- Siyatik siniri tırtıksız bir kelepçe (ultra ince hemostat) ile sabit ve tekrarlanabilir basınçla ezin. Bunun için kelepçeyi açın, siniri kelepçenin alt çenesine yerleştirin ve kelepçeyi üç kez on saniye boyunca ilk konuma kilitleyerek kapatın. Siyatik sinir ezilme pozisyonu siyatik çentik yakın, ana siyatik sinir demetinin bölünme bölgesine proksimal bulunur. Ezilme yaralanmasından sonra, kelepçeyi dikkatlice yeniden açın. Siyatik sinirin ezilme bölgesi yarı saydam görünür.
- Lastik bant retraktörlerini çıkarın.
- Fasyal düzlem kesisini resorbable 4-0 dikiş ile kapatın. Cilt kesisini vücut derisi zımbaları ile kapatın.
- İki gün boyunca ameliyattan sonra her 24 saatte bir ameliyat sonrası ağrı kesici için Rimadyl'i GV-SOLAS yönergelerine (5 mg/kg vücut ağırlığı, deri altı enjeksiyonu) göre uygulayın.
- Fareyi ameliyat kurulumundan çıkarın. Sıçan uyanana kadar bir ısıtma plakasına (37 °C) yatak yapmadan fareyi temiz bir kafese yerleştirin. Fareyi temiz ev kafeslerine geri götür.
- Ameliyattan dört ila altı gün sonra vücut derisi zımbalarını çıkarın.
2. Açık alan testi (OFT)
NOT: Lokomotor aktivite ve davranışsal aktivite OFT tarafından analiz edilebilir.
- Kurulum
- OFT'yi (Şekil 1A) karanlık ve sessiz bir ortamda ayarlayın. Otomatik video takip sistemi EthoVision XT (bilgisayar, lisanslı yazılım) ve çizilmeye dayanıklı, temizlenebilir siyah yüzeye sahip 58,5 cm (uzunluk) x 58,5 cm (genişlik) x 45 cm (yükseklik) ölçen bir arenadan oluşur. Siyah yüzey, beyaz hayvanları takip ederken kontrastı artırmak için önemlidir.
- değerlendirme
- Arenayı ve kamerayı doğru konuma getirin. Tüm açık alan kutusunun en iyi çözünürlüğe sahip kaydedilmesi için kamerayı ayarlayın. Denemeyi karanlık bir ortamda gerçekleştirin. Kurulum için ışığa ihtiyaç duyu ise, arenadaki ışık lekelerini, yansımaları ve tonları önlemek için küçük ve dağınık bir ışık kullanın. Arenanın farklı alanlarındaki lüks bir sayaçla aydınlatmayı ölçerek eşit ışık koşulları sağlayın.
- EthoVision XT yazılımını ayarlayın. En önemli ayarlar aşağıdakilerde listelenmiştir. Deneme Ayarları'nda Video Kaynağı için Canlı izleme'yi ve İzlenen Özellikleriçin Merkez noktası algılama 'yı seçin. Arena Ayarları'nda arenanın boyutunu doğrulayın. Veri toplama için başlangıç koşulunu, sıçan arenanın ortasına yerleştirildikten sonra üç saniyeye ve deneme kontrol ayarlarında toplam çalışma süresini beş dakikaya ayarlayın. Algılama Ayarları 'nda Yöntem için Statik çıkarma 'yı seçin. Onay İşareti Alma Ayarları'nda Yöntem için video kaydet .
- Sıçanı test arenasının ortasına hafifçe yerleştirin (Şekil 1B).
- Kaydı başlatmak için Edinme Denetimi'ndeki Deneme Sürümünü Başlat düğmesine basın.
- Kayıt sırasında, farenin dikkatini dağıtmamak için OFT kurulumundan uzak durun.
- Her denemeden sonra, sıçanı test arenasından nazikçe çıkarın ve daha önce kaydedilmiş sıçanın kokusuyla dikkat dağınıklığını önlemek için kurulumu% 0.1 asetik asitle temizleyin.
- Veri analizi
- ETHOVision XT yazılımı ile OFT'nin veri analizi için, sol taraftaki çubuktaki Analiz bölümüne gidin ve Sonuçlar sekmesinin(Şekil 1C)altında Görselleştirmeyi İzle 'yi seçin. Ardından, gerekli parametreleri Excel'e verin. Yazılım içinde, veri analizi için farklı kategorilerden bir dizi değişken seçin. Bu özel bilimsel amaç için önemli değişkenler "Mesafe ve Zaman" kategorisi altında "Taşınan mesafe" ve "Hız"dır. Seçili parametrelerin istatistiksel analizini gerçekleştirin (Şekil 1D).
3. CatWalk XT yürüyüş analizi
NOT: CatWalk XT sistemi aracılığıyla yapılan bir yürüyüş analizi, hayvan modellerinin ayak izleri, duruşu ve yürüyüşü ile ilgili birçok farklı parametreyi değerlendirmeye yardımcı olabilir. Cam bir yürüyüş yolu yeşil ışıkla aydınlatılıyor ve hayvanların ayak izlerinin saçtığı ışık, yürüyüş yolunun altında bulunan yüksek hızlı bir video kamera ile yakalanıyor. Sinyaller CatWalk XT yazılımı ile analiz edilebilir.
- Kurulum
- CatWalk XT ile yürüyüş analizi için, CatWalk sistemini ve ilgili yazılımı (bilgisayar, lisanslı yazılım) kullanın (Şekil 2A).
- Denemeyi karanlık koşullar altında gerçekleştirin, çünkü veri toplama, CatWalk sisteminin yürüyüş yolunun yeşil LED ışıkla aydınlatılmasına bağlıdır. Karanlık koşullar altında deneysel prosedürü kolaylaştırmak için deneysel odayı kırmızı ışıkla aydınlatın.
- 65 cm uzunluğunda ve 7 cm genişliğinde tanımlanmış bir yürüyüş yolu kullanın; ancak, yürüyüş yolunun büyüklüğü sıçanların büyüklüğüne bağlıdır. Her pençe için mümkün olduğunca çok ayak izi kaydetmek için yürüyüş yolunu mümkün olduğunca büyük kurun.
- Her koşu için pençe başına en az üç ayak izi yakalayın. Yürüyüş yolunun uzunluğunu tanımlarken, başlangıç veya durdurma sinyali doğru algılanmayabileceğinden ve gövde/kuyruk koşunun tamamlanmasından önce veya sonra tanımlanmış yürüyüş yoluna girer veya kalırsa, çalıştırmalar uyumlu olarak sınıflandırılamayabilir, sıçanın gövdesini ve kuyruğunu göz önünde bulundurun.
- antrenman
NOT: CatWalk sistemi için sıçanların eğitilmeleri, hayvanları kuruluma alışkanlık haline getirmek ve herhangi bir kesintiye uğramadan geçiti geçmeyi öğrenmelerine izin vermek için gereklidir. Doğru eğitim, deneysel değerlendirme sırasında zamandan tasarruf etmenin ve daha iyi sonuçlar elde etmenin avantajlarını sağlar. Eğitim oturumları sırasında CatWalk sisteminin veri alımını başlatmak, sıçanların değerlendirme koşullarına (gürültü/ ışık) alışmalarını sağlar.- CatWalk sistemini kurmaya başlayın.
- Cam yürüyüş yolunu damıtılmış su ve tüy bırakmayan yumuşak bir bezle temizleyin. Deneyin başında ve sonunda veya cam yürüyüş yolu kirliyse, cam yürüyüş yolunu temizlemek için cam temizleme sıvısı ve tüy bırakmayan yumuşak bez kullanın. Cam temizleme sıvısı kullandıktan sonra, hayvanın dikkatini dağıtmasını önlemek için yürüyüş yolunu sıvının herhangi bir kalıntısından temizleyin.
- Deneysel ayarları seçin. Önemli bir parametre Çalıştırma Ölçütü 'dür. Her araştırma projesi için özel olan Minimum çalışma süresi, Maksimum çalışma süresive Elde etmek üzere en az uyumlu çalıştırma sayısıiçin uygun değerleri ayarlayın. İzin verilen maksimum hız değişimini kullan kutusunu işaretleyin ve değeri ayarlayın. Çalıştırma ölçütleri, eğitimin ilk dört ila beş günü için yoksayılabilir.
- Kamerayı yerine yerleştirin ve odağı ayarlayın. Yürüyüş yolunun uygun uzunluğunu ve kaydedilen pençelerin aynı anda en iyi çözünürlüğünü elde etmek için en uygun kamera konumunu bulun. Kayıtlar arasında aynı kamera yerleşimini sağlamak için CatWalk sistemindeki kamera konumunu etiketle.
- Yeni bir deneme için otomatik algılamayı kullanarak algılama ayarlarını ayarlayın. Tüm ayak izlerinin minimum arka plan gürültüsü ile algılanabildiğinden emin olun. Gerekirse, algılama ayarlarını manuel olarak optimize edin ve Yeşil Yoğunluk Eşiği'ni değiştirin. Denemenin tamamı için aynı algılama ayarlarını kullanın.
- CatWalk sisteminin koridor duvarlarını kurun. Koridor duvarları sıçana mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Koridor duvarlarının yürüyüş yoluna paralel kaldığından emin olun.
- Yürüyüş yolunun uzunluğunu tanımlayın: Yürüyüş Yolunu Tanımla simgesini tıklatın. Belirli bir araştırma projesine göre beyaz dikdörtgenin boyutunu uzunluk ve genişlik olarak ayarlayın. Tamam 'ıtıklatın.
- Yürüyüş yolunu kalibre etme: Yürüyüş Yolunu Kalibre Edin simgesine tıklayın. 20 x 10 cm ölçülerindeki dikdörtgen kalibrasyon levhasını yürüyüş yolunun ortasına yerleştirin. Beyaz dikdörtgenin boyutunu kalibrasyon sayfasına uyarlayın. Tamam 'ıtıklatın.
- Ardından, bir arka plan görüntüsü çekin: Yürüyüş yolunun temiz ve boş olup olmadığını önceden kontrol edin. Arka plan görüntüsü oluşturmak için Arka Planı Yasla düğmesini tıklatın.
- Gerçek deneye başlamadan önce hayvanları en az sekiz gün eğitin. Ardışık günlerde eğitim önerilir.
- Eğitimin 1. günü: Sıçanların CatWalk sistemine alışması için, hayvanın yürüyüş yolunu ve kale kutusunu serbestçe keşfetmesine izin verin. Farelerin yürüyüş yolundan geçmeye çalışmasına izin verin ve kale kutusuna girin. Sıçanı yürüyüş yolunun sonundan veya kale kutusundan alın ve sıçanı yürüyüş yolunun başlangıç noktasına geri getirin. Eğitimin ilk günü için deneysel ayarlara uyulmasına gerek kalmadan beş koşu önerilir.
- Eğitimin 2. günü: Sıçanlar yürüyüş yolunu ve gol kutusunu serbestçe keşfedebilirler. Deneysel ayarlara uyulmadan beş çalıştırma önerilir.
- Eğitimin 3. günü: Deneysel ayarlara uyulmadan sekiz koşu önerilir.
- Eğitimin 4. günü: Deneysel ayarlara uyulmadan on koşu önerilir.
- Eğitimin 5. günü: On koşu önerilir. Deneysel ayarlar akılda tutulmalıdır. Sıçanları herhangi bir kesintiye uğramadan yürüyüş yolundan geçmeye motive edin.
- Eğitimin 6. günü: On koşu önerilir. Deneysel ayarlar akılda tutulmalıdır. Sıçanları herhangi bir kesintiye uğramadan yürüyüş yolundan geçmeye motive edin.
- Eğitimin 7. günü: On koşu önerilir. En az üç uyumlu çalıştırma elde edilmelidir. Bu hedefe ulaşamazlarsa, hayvanlar için daha fazla koşu ekleyin.
- Eğitimin 8. günü: On koşu önerilir. En az üç uyumlu çalıştırma elde edilmelidir. Bu hedefe ulaşamazlarsa, hayvanlar için daha fazla koşu ekleyin.
- CatWalk sistemini kurmaya başlayın.
- değerlendirme
- Tanımlanan çalışma ölçütlerine göre, veri analizi için sıçan başına üç uyumlu çalıştırma gerçekleştirin. Değerlendirme için lütfen 3.2.1 adımlarını izleyin. - 3.2.1.8. eğitim bölümünde açıklandığı gibi. Sıçan ilk üç koşuda üç uyumlu koşuya ulaşsa bile, eğitim amacıyla seans başına / haftada en az altı koşu gerçekleştirin.
- Birden çok zaman noktası olan denemeler için kararlı bir yürüyüş deseni için haftada altı koşuyla en az bir (eğitim) oturum gerçekleştirin. Deneysel ve algılama ayarları tüm deney için tutarlı kalır.
- Veri analizi
- Veri çözümlemesi için yalnızca uyumlu çalıştırmaları değerlendirin. Uyumlu olmayan çalıştırmaları silin.
- Yeşil Yoğunluk Eşiğini doğrulayın ve gerekirse pençe baskılarının sınıflandırılmasından önce Yeşil Yoğunluk Eşiği'ni artırın veya azaltın. Yeşil Yoğunluk Eşiği tüm hayvanlar ve tüm koşular için tutarlı olmalıdır.
- CatWalk XT yazılımı (Şekil 2B) ile pençe baskılarını otomatik olarak sınıflandırın.
- Pençe baskı etiketlerini manuel olarak gözden geçirin. Yanlış pençe baskı etiketlerini düzeltin, algılanmayan pençe baskılarının etiketlerini ekleyin ve gürültüyü ve yanlış etiketleri manuel olarak silin. Videoyu manuel olarak gözden geçirilmesi gereken bir konuma taşıyın. Yanlış etiketli pençe baskılarının düzeltilmesi için, belirli pençe baskısının dikdörtgenini seçin, Sıfırla 'yıtıklatın, aynı dikdörtgeni yeniden seçin ve listeden doğru etiketi atayın. Algılanmayan pençe baskılarını etiketlemek için, algılanmayan pençenin etrafına bir dikdörtgen çizin, Yazdırma Ekle 'yitıklatın, oluşturulan yeni dikdörtgeni seçin ve listeden doğru etiketi atayın. Burun veya gövde etiketli yazılımın otomatik olarak yazdırması durumunda, belirli bir etiketin dikdörtgenini seçin ve Yazdırmayı Kaldır 'ıtıklatın.
- Sayısal sonuçları gözden geçirin. Sayısal sonuçlar, bir dizi temel parametreyi gösteren bir excel sayfasında görüntülenir. Araştırma ilgisine bağlı olarak önceden tanımlanmış belirli parametreleri seçin ve her zamanki gibi istatistiksel analiz yapın (Şekil 2D).
- Her ayak izi hakkında daha ayrıntılı bilgi için arka pençelerin ayak izlerini sınıflandırın. Bu analiz, etkileşimli ayak izi ölçümleri modülünü gerektirir.
- Gerekirse İnteraktif Ayak İzi Ölçümleri analizi için Yeşil Yoğunluk Eşiği'ni uyarla. Yeşil Yoğunluk Eşiği tüm hayvanlar ve tüm koşular için tutarlı olmalıdır.
- Ayak izi analizi için işaretleyicileri manuel olarak ayarlayın. Üç uyumlu çalıştırmada da her arka pençe baskısını analiz edin. "Toe Spread" ölçmek için ilk başpenin ortasından beşinci başyapının ortasına bir çizgi çekin. "Orta Toe Spread" ölçmek için ikinci tonun ortasından dördüncü tonun ortasına bir çizgi çekin. "Manuel Baskı Uzunluğu" (Şekil 2C)ölçmek için üçüncü ayak parmağından arka pençenin topuğuna bir çizgi çizin.
- Ayrı bir sayfada görüntülenen "etkileşimli ayak izi ölçümlerinin" sayısal sonuçlarını gözden geçirin. "İnteraktif Ayak İzi Ölçümleri"nin belirli parametrelerini seçin ve her zamanki gibi istatistiksel analiz yapın (Şekil 2E).
4. Kiriş yürüyüş görevi
NOT: Yürüme açıkları kiriş yürüme görevi ile belirlenebilir. Bu özel araştırma başlığında ışın yürüme görevinin odak noktası, vücut hareketleri sırasında postural kontrol yeteneği olarak tanımlanan motor dengesinin değerlendirilmesi değil, birden fazla vücut parçasından kas aktivasyonunu koordine etme yeteneği olarak tanımlanan motor koordinasyonunun analizi olacaktır.
- Kurulum
- Kiriş yürüyüş görevi için bir kiriş, aralayıcı, masa, tekdüze arka plan ve bir video kamera kullanın (Şekil 3A).
- 90 cm uzunluğunda, 1,7 cm genişliğinde ve 2 cm yüksekliğinde ahşap bir kiriş kullanın. Işın her iki ucunda 20,5 cm uzunluğunda, 15 cm genişliğinde ve 2 cm yüksekliğinde bir platform önerilir. Platformlar ve kiriş için aynı malzemeyi kullanın, platformlar ve kiriş arasında herhangi bir engelden kaçının.
- Kiriş ve masa arasındaki mesafenin en az 44 cm olmasını uzadır. Ev kafesi gibi tanıdık bir ortam, sıçanları kiriş platformunun sonuna yerleştirilebilen kirişi geçmeye motive eder.
- antrenman
- Kirişi masada aralayıcı ve ev kafesi ile ayarlayın.
- Hayvanları yedi gün boyunca eğitin. Ardışık günlerde eğitim önerilir.
- Eğitimin 1.
- Bir ev kafesinden gelen tüm sıçanları kirişin başlangıç platformuna yerleştirin.
- Sıçanların çevreyi keşfetmesine izin verin (platform / kiriş).
- Bir sıçanı kuyruğundan dikkatlice tutun ve sıçanı hafifçe kirişe iterek ışına yönlendirin.
- Sıçanı kuyruğundan en az iki tur boyunca tutarak ışından geçmesine yardımcı olmak.
- Farenin yardım almadan üç tur daha ışından geçmesine izin verin. Sıçanı gözlemleyin ve gerekirse yardım sağlayın. Sıçan kirişten geçemezse, yaralanmaları ve kirişi geçmek için korku gelişimini önlemek için düşüşü önler.
- Tüm sıçanlar için bu prosedüre devam edin.
NOT: Bazen sıçanlar kirişi geçmek için birbirlerini takip eder, bu durumda yardıma gerek yoktur. Bununla birlikte, sıçanları gözlemlemek, düşmeleri durdurmak ve gerekirse yardım sağlamak önemlidir.
- Eğitimin 2.
- Bir ev kafesinden gelen tüm sıçanları kirişin başlangıç platformuna yerleştirin.
- Farelerin ışından altı kez geçmesine izin verin.
- Gerekirse, yardım sağlayın ve düşmeleri engelleyin.
- Eğitimin 3.
- Işın başlangıç platformuna bir sıçan yerleştirin.
- Farenin ışından altı kez geçmesine izin ver.
- Gerekirse, yardım sağlayın ve düşmeleri engelleyin.
- Eğitimin 4-7 günü
- Işın başlangıç platformuna bir sıçan yerleştirin.
- Farenin kirişi 10 kez geçmesine izin ver.
- Gerekirse, yardım sağlayın ve düşmeleri engelleyin.
- Eğitimin sonunda, sıçan en az üç koşu boyunca herhangi bir kesintiye uğramadan kirişi geçmelidir. Hareketin başlatılmasını tetiklemek için sıçanı başlangıç platformunda hafifçe itmek caizdir.
- Eğitimin 1.
- değerlendirme
- Kirişi masada aralayıcı ve ev kafesi ile ayarlayın.
- Video kamerayı, odaktaki hayvanla kirişe paralel olarak hizalanmış olarak yerleştirin. Kaydedilen hareketlerin en iyi çözünürlüğünü elde etmek için video kameranın konumu hayvana mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Işın ve her iki platformun parçaları kayıt tarafından yakalanmalıdır.
- Kaydı başlatın ve önce oturumu ve hayvanı tanımlayın.
- Sıçanı kirişin başlangıç platformuna yerleştirin.
- Sıçan herhangi bir kesinti olmadan kirişi üç kez geçmelidir. Sıçan ilk üç koşuda üç uyumlu koşuya ulaşsa bile, sürekli görev performansı için en az altı ila on çalıştırma gerçekleştirin.
- Her zaman, hayvanı gözlemleyin ve gerekirse düşmeleri engelleyin.
- Görevden sonra, daha önce kaydedilmiş sıçanın kokusuyla dikkat dağınıklığını önlemek için kirişi ve tabloyu% 0.1 asetik asitle temizleyin.
NOT: Sinir ezilme yaralanmasından sonraki ilk iki hafta içinde, sıçanlar yardım almadan kirişi geçemezler. Bu nedenle, sinir ezilme yaralanmasından sonraki ilk iki haftada altı ila sekiz koşu için yardım sağlanmalıdır. Üçüncü haftadan beşinci haftaya kadar beş koşu yardımla, on koşu daha yardım almadan gerçekleştirildi.
- Veri analizi
- Veri analizi için ücretsiz video analiz yazılımı Kinovea'yı kullanın.
- Kayıttan üç uyumlu çalıştırmanın video dizilerini seçin. Bunun için, hayvan tarafından yardım almadan gerçekleştirilen ilk üç uyumlu çalıştırmayı seçin. Tüm sıçanlar için uyumlu koşu seçiminde tutarlı olun.
- Seçili üç uyumlu çalıştırmanın başlangıç ve bitiş saati noktasını tanımlayın (Şekil 3D-E). Bu kurulumda, başlangıç noktası kiriş üzerindeki siyah bir çizgi ile etiketlendi ve ilk arka engelin siyah çizginin arkasına yerleştirilmesi koşunun başlangıç zaman noktasını tanımladı. Kirişin sonundaki platforma ilk arka engelin yerleştirilmesi bitiş zaman noktasını tanımlar.
- Daha sonra, sıçanın kirişi geçmesi için gereken süreyi hesaplayın. Verileri saniyeler içinde kirişi geçmek ve her zamanki gibi istatistiksel analiz yapmak için gecikme süresi olarak bildirin (Şekil 3B).
- Yazılımın yakınlaştırma ve ağır çekim işlevini kullanarak her iki arka plan için de ayrı ayrı üç uyumlu çalıştırmadan adım ve hata sayısını puanla. Hatalar toplam ayak kaymalarını ve yarım ayak kaymalarını içerir. Toplam ayak kayması, etkilenen pençenin kirişle temasının kaybına neden olan derin bir kayma ile takip edilen bir ayak yerleşimi olarak tanımlanır (Şekil 3F). Yarım kayma, kirişle tam temasını kaybetmeden kirişin yan duvarından kayan bir pençe olarak tanımlanır (Şekil 3G).
- Kirişi geçecek adım sayısına ((uzvun ayak kaymalarının sayısı x %100)/ aynı uzvun adım sayısına göre ayak kaymalarının yüzdesini hesaplayın. Verileri yüzde ayak kaymaları olarak sanın ve her zamanki gibi istatistiksel analiz yapın (Şekil 3C).
5. Merdiven basamak yürüyüş görevi
NOT: Merdiven basamak yürüyüş görevi motor fonksiyonunu, hem frontlimblerin hem de hindlimblerin yerleştirilmesini ve interlimb koordinasyonunu değerlendirebilir.
- Kurulum
- Bu davranış testi için merdiven basamak aparatı, aralayıcı, tablo, tekdüze arka plan ve video kamera kullanın (Şekil 4A). Yatay merdiven basamak aparatı metal basamaklardan ve şeffaf polikarbonat yan duvarlardan oluşur. Cihaz 119,5 cm uzunluğa sahiptir ve genişlik 7,4 cm'ye ayarlanır. Analiz edilecek yürüyüş yolu 100 cm uzunluğa sahiptir.
- Başlangıç ve bitiş noktasını yan duvardaki siyah çizgiyle etiketle. Basamaklar için yer tutucuları 1 cm aralıklarla cihazın üzerine yerleştirin. Basamaklar arasında 1 ila 5 cm arasında bir mesafeye sahip 100 cm'lik yürüyüş yolu için basamakların düzensiz bir desenini yerleştirin. Analizden çıkarılan aparatın başındaki ilk 10 cm ve ucundaki son 9,5 cm, 1 cm mesafeli basamakların düzenli bir desenine sahiptir.
- Yürüyüş yolu ile yaklaşık 30 cm'lik tablo arasında bir mesafe kullanın (Şekil 4A-B). Bir kale kutusu veya cihazın sonundaki tanıdık bir ortam, bir ev kafesi gibi, sıçanları merdiven basamak aparatını geçmeye motive eder.
- antrenman
- Merdiven basamak aparatını masada aralayıcı ve hedef kutusu ile ayarlayın.
- Hayvanları sekiz gün eğitin. Ardışık günlerde eğitim önerilir.
- Eğitimin 1.
- Bir ev kafesinden gelen tüm sıçanları merdiven basamak aparatına yerleştirin.
- Sıçanların çevreyi keşfetmesine izin verin (merdiven basamak aparatı / gol kutusu).
- Sıçanları yavaşça kale kutusunun yönüne itin. Kale kutusuna girerken farelere yardım edin. Farelerin bir süre gol kutusunu keşfetmesine izin verin.
- Tüm sıçanlar kale kutusuna girdikten sonra. İlk sıçanı kale kutusundan alın ve sıçanı tekrar cihazın başlangıç bölgesine yerleştirin. Bir ev kafesinin tüm sıçanları için aynı prosedüre devam edin. Sıçanları yavaşça kale kutusunun yönüne itin ve gerekirse kale kutusuna girmek için yardım verin.
- Farenin cihazı dört kez geçmesine izin verin.
- Eğitimin 2.
- Eğitimin ilk günü için listelenen iletişim kuralının aynısını gerçekleştirin.
- Farenin cihazı altı kez geçmesine izin verin.
- Eğitimin 3.
- Eğitimin ilk günü için listelenen iletişim kuralının aynısını gerçekleştirin.
- Farenin cihazı sekiz kez geçmesine izin verin.
- Eğitimin 4.
- Merdiven basamak aparatının başına bir sıçan yerleştirin.
- Sıçan cihazı geçmezse ve kale kutusuna gönüllü olarak girerse, sıçanı arkadan hafifçe iterek yardım edin.
- Farenin cihazı sekiz kez geçmesine izin verin.
- Eğitimin 5-8.
- Merdiven basamak aparatının başına bir sıçan yerleştirin.
- Sıçan cihazı geçmezse ve kale kutusuna gönüllü olarak girerse, sıçanı arkadan hafifçe iterek yardım edin.
- Farenin cihazı on kez geçmesine izin verin.
- Eğitimin sonunda, sıçan en az üç koşu için herhangi bir kesinti ve yardım olmadan yürüyüş yolundan geçebilmelidir. Hareketin başlatılmasını tetiklemek için sıçana başlangıç bölgesinde hafif bir itme vermek caizdir.
- Eğitimin 1.
- değerlendirme
- Merdiven basamak aparatını masada aralayıcı ve hedef kutusu ile ayarlayın.
- Video kamerayı, odaktaki hayvanla birlikte cihaza paralel olarak hizalanmış olarak yerleştirin. Kaydedilen hareketlerin en iyi çözünürlüğünü elde etmek ve tüm merdiven basamak aparatının kayıtta yakalanmasını sağlamak için video kamerayı hayvana mümkün olduğunca yakın yerleştirin.
- Kaydı başlatın ve önce oturumu ve hayvanı tanımlayın.
- Sıçanı merdiven basamak aparatının başlangıç bölgesine yerleştirin.
- Sıçan, uyumlu bir koşu olarak nitelendirmesi için merdiven basamak aparatının 100 cm'lik yürüyüş yolundan üç kez kesintisiz geçmek zorundadır. Sıçan ilk üç koşu içinde üç uyumlu koşuya ulaşsa bile, sürekli görev performansı için en az on çalıştırma yapılmalıdır.
- Görevden sonra, daha önce kaydedilmiş sıçanın kokusuyla dikkat dağınıklığını önlemek için cihazı ve tabloyu% 0.1 asetik asitle temizleyin.
- Veri analizi
- Veri analizi için ücretsiz video analiz yazılımı Kinovea'yı kullanın.
- Kayıttan üç uyumlu çalıştırmanın video dizilerini seçin. Veri analizi için ilk üç uyumlu çalıştırmayı seçin.
- Seçili üç uyumlu çalıştırmanın başlangıç zaman noktasını ve bitiş zaman noktasını tanımlayın. 100 cm'lik yürüyüş yolunun başlangıç zaman noktasını etiketleyen cihazın yan duvarındaki ilk siyah çizginin arkasındaki ilk arka engelin yerleştirilmesi, koşunun başlangıç zaman noktasını tanımlar. 100 cm'lik yürüyüş yolunun bitiş noktasını etiketleyen cihazın yan duvarındaki ikinci siyah çizginin arkasına ilk ön şeridin yerleştirilmesi, koşunun bitiş zaman noktasını tanımlar.
- Başlangıç ve bitiş zaman noktasını tanımlayın. Ardından, yürüyüş yolundaki koşunun süresini hesaplayın. Verileri saniyeler içinde geçitte geçiş yapmak ve her zamanki gibi istatistiksel analiz yapmak için gecikme süresi olarak bildirin (Şekil 4C).
- Yazılımın ağır çekim veya kare kare işlevini kullanarak Metz ve ark. Her uzuv için ölçek kategorilerine göre adım sayısını ve hata sayısını ayrı ayrı belirleyin. Ölçek aşağıdaki kategoriler arasında ayrım yapar: (0) toplam ıskalama (1) derin kayma (2) hafif kayma (3) değiştirme (4) düzeltme (5) kısmi yerleştirme ve (6) doğru yerleştirme. Sadece başlatan uzvun hatası derecelendirildi. İlk hata tarafından tetiklenen diğer hatalar derecelendirilmemelidir.
- Aşağıdaki gereksinimleri göz önünde bulundurarak hataları/adımı hesaplayın. Kategoriler (0) toplam ıskalama (1) derin kayma (2) hafif kayma hata olarak sayılır. Hata sayısını her arka plan için adım sayısına bölün ve her biri ayrı ayrı çalıştırın. Her hayvan ve her hindlimb için üç uyumlu çalıştırmanın ortalama değerini ayrı ayrı belirleyin ve her zamanki gibi istatistiksel analiz yapın (Şekil 4D).
Representative Results
Beş dakikalık OFT'nin temsili sonuçları, ameliyattan beş hafta sonra sinir ezilme yaralanmasının lokomotor aktivitesi üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir(Şekil 1).
CatWalk XT sistemi ile yürüyüş analizi (Şekil 2) birçok farklı parametre oluşturur. Seçici parametreler, wt naif sıçanlar sinir ezilme işleminden beş hafta sonra sinirden yaralanmış wt sıçanlarla karşılaştırılarak istatistiksel olarak analiz edilmiştir (Şekil 2D). Koşu ortalama hızı, adım uzunluğu ve sinir yaralanması (sağ) arka pençenin baskı alanı için önemli değişiklikler tespit edilebilir. "İnteraktif Ayak İzi Ölçümleri" modülü ile sinirden yaralanan arka pençenin daha detaylı analizi yapıldı. Sinirden yaralanan wt sıçanlarında wt naif sıçanlara kıyasla parametrelerin ayak parmak yayılımı, orta ayak izi yayılımı ve baskı uzunluğunda önemli bir azalma gözlendi. Ek olarak, pençe açısı vücut ekseni ve pençe açısı hareket vektörü, sinirden yaralanan wt sıçanlarını wt naif sıçanlarla karşılaştırırken önemli ölçüde farklılık gösterir (Şekil 2E).
Şekil 3, ışın yürüme görev değerlendirmesi ile elde edilen motor koordinasyon verilerini sunar. Sinir yaralı wt sıçanlar, yaralanmadan beş hafta sonra wt naif sıçanlara kıyasla kirişi geçmek için önemli ölçüde artan bir gecikme süresi gösterdi (Şekil 3B). Işın yürüme görevinden ek bir okuma olarak, sinir yaralı hindlimb'in tam kaymaları ve yarım kaymaları sayıldı ve istatistiksel analiz için bir hata olarak kabul edildi. Sinirden yaralanan (sağ) hindlimb'in adım başına hata yüzdesi, sinirden yaralanan wt sıçanlarında wt naif sıçanlara kıyasla önemli ölçüde artmıştır.
Merdiven basamak yürüyüş görevinin temsili verileri (Şekil 4) merdiven basamak aparatının yürüyüş yolundan geçmek için gecikme süresinde (Şekil 4C) veya sinir yaralı (sağ) hindlimb adım başına hata yüzdesinde önemli değişiklikler göstermez (Şekil 4D). Sinir yaralanması olan hindlimb'in adım başına hata yüzdesinin analizi, Metz ve ark.'dan7 kategori ölçeğinin sadece 0'dan 2'ye kadar olan puanını dikkate aldı. Sinir yaralanması olan hindlimb ve sinir yaralanması olmayan (sol) arka sarmalın 7 kategori ölçeğinden adım başına tüm puan kategorilerinin dağılımı Şekil 4E'degösterilmiştir.
Şekil 1: Açık alan testi sırasında lokomotor aktivitesinin değerlendirilmesi. (A) Açık alan testi kurulumunun resmi. Açık alan testi sırasında kaydedilen bir videodan çıkarılan ve açık alan arenasında (B) ve (C) izleme olmadan bir sıçanı gösteren seçili resim. (D) Beş dakikalık açık alan testi kaydı sırasındaki hız, sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra wt naif sıçanlarda ve wt sıçanlarında araştırıldı. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CatWalk XT sistemi ile yürüyüş analizi. (A) CatWalk XT cihazının resmi. (B) Etiketli pençe baskılarını yanlış renk modunda gösteren baskı görünümü örnekleri ve sinir ezme yaralanmasından beş hafta sonra wt naif sıçanların ve wt sıçanlarının zamana dayalı yürüyüş diyagramını gösteren zamanlama görünümü örnekleri. (C) Ayak izi yayılımını (TS), orta ayak toz yayılımını (ITS) ve baskı uzunluğunu (PL) gösteren ayak izi sınıflandırmasının yanı sıra, sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra vücut eksenini (beyaz çizgi) ve wt naif sıçanların ve wt sıçanlarının hareket vektörünü (kırmızı çizgi) gösteren vücut ekseni görünümünün örnekleri. (D) Sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra wt naif sıçanları ve wt sıçanlarını karşılaştıran "standart" sınıflandırmadan seçilen parametrelerin verileri. (E) Sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra wt naif sıçanları ve wt sıçanlarını karşılaştıran "İnteraktif Ayak İzi Ölçümleri modülünden" seçilen parametrelerin verileri. Veriler ortalama olarak SEM ± gösterilmiştir. İstatistiksel analiz, normalde dağıtılmış verilerin eşleşmeyen t testi, Welch'in normalde dağıtılmış verileri eşit olmayan varyansla düzeltmesi ve normal olmayan dağıtılmış verilerin Mann-Whitney U testi kullanılarak gerçekleşmiştir. P değeri < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı olarak *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 olarak tanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kiriş yürüyüş görevi ile yürüyüş analizi. (A) Kiriş yürüyüş görev kurulumunun resim ve şematik çizimleri. Işın yürüme görevi (C) sırasında ışın (B) ve sinir yaralanması arkalığının adım başına yüzde ayak kayması hatalarını geçme süresi, sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra wt naif sıçanlarda ve wt sıçanlarında analiz edildi. Kiriş yürüme görevinin başlangıç saati konumu (D) ve bitiş saati konumu (E) için temsili resim. Işın yürüme görevinin tam kayma hatası (F) ve yarım kayma hatasının (G) temsili görüntü sırası. Veriler SEM± ortalama olarak gösterilmektedir. İstatistiksel analiz, normal olmayan dağıtılmış verilerin Mann-Whitney U testi kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. P değeri < 0.05 istatistiksel olarak *p < 0.05, **p < 0.01 olarak tanımlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Merdiven basamak yürüyüş görevini kullanarak yürüyüş analizi. Merdiven basamak yürüyüş görev kurulumunun resmi (A) ve şematik çizimleri (B). Merdiven basamak aparatını (C) geçmenin gecikme süresi ve merdiven basamak yürüme görevi (D) sırasında sinir yaralanması olan hindlimb'in adım başına yüzde ayak kayması hataları, sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra wt naif sıçanlarda ve wt sıçanlarında değerlendirildi. (E) Metz ve ark.'dan 7 kategori ölçeğine göre adım başına puan kategorisinin yüzde dağılımı. sinir ezilme yaralanmasından beş hafta sonra wt naif sıçanların ve wt sıçanlarının sol ve sağ arka kısmı için. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilmektedir. İstatistiksel analiz, normal dağıtılmış verilerin eşleşmeyen t testi ve normal olmayan dağıtılmış verilerin Mann-Whitney U testi kullanılarak gerçekleşmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Metz ve ark.'dan 7 kategori ölçeğine göre her kategorinin örnek temsili. merdiven rung yürüyüş görevi sırasında. Kategori 0'ın sağ arka engelinden temsili görüntü dizisi - toplam ıskalama, kategori 1 - derin kayma, kategori 2 - hafif kayma, kategori 3 - değiştirme, kategori 4 - düzeltme, merdiven basamak yürüyüş görevi sırasında. Kategori 5 için temsili resimler - kısmi yerleştirme ve kategori 6 - doğru yerleştirme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu davranışsal değerlendirme protokolü, siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonra kemirgen modelinde seçilen davranışsal test pilinin olası okumalarının yanı sıra avantajlara ve dezavantajlara genel bir bakış sağlar.
Siyatik sinir ezilme yaralanmasının karşılaştırmalı bir sonucunu elde etmek için tutarlı bir ezme tekniği zorunludur. Tırtıksız kelepçe (Ultra İnce Hemostat) yerine uzun tırtıklı kelepçe kullanılması ezilmenin kıvamını artırabilir. Eşit sinir sıkışmasını garanti etmek için aynı kelepçeyi ve aynı ezilme pozisyonunu kullanın. Kelepçenin ezilme yaralanması ve kelepçenin özenle işlenmesi için özel kullanımı tutarlılığı artırır. Ayrıca, ezilme yaralanması prosedürünü dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Ameliyat sırasında sinirin istenmeyen çekişi gibi ek hasarlar otomutilasyon gibi istenmeyen yan etkilere yol açabilir. Bu nedenle, dikkatli bir sinir hazırlığının yanı sıra en az iki gün boyunca bir ağrı kesicinin kullanılması önerilir.
Motor davranışın multifaktöriyel değerlendirmesi, çeşitli seviyelerdeki sıçanlarda sinir ezilme yaralanmasından sonra fenotipi karakterize edebilir. OFT, CatWalk XT yürüyüş analizi, ışın yürüyüşü görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevini kullandık. Bu deneyler için kör bir deneysel prosedür ve deneysel gruplara veri analizi şarttır. Davranış değerlendirmesinden önce, hayvanlar test odasında en az 30 dakika boyunca test koşulları altında alıştırıldı. Burada uygulanan tüm davranış testleri, yiyecek veya su yoksunluğunun gerekli olmadığı avantajına sahiptir. Açıklanan tüm davranış testlerinde aynı hayvan grubu kullanılmıştır. Her hayvan için günde en fazla iki farklı davranış testi yapıldı. Davranış testleri düzenli aralıklarla yapılırsa, testin aynı hayvan düzeninde ve günün aynı saatinde yapılması gibi karşılaştırılabilir bir prosedüre dikkat edin. Davranış analizi için bir diğer önemli husus da sıçanların gece-gündüz döngüsüdür. Gün döngüsünde (karanlık döngü) daha doğal ve daha yüksek aktivite seviyeleri elde etmek için ters bir gündüz-gece döngüsü düşünün. Bu, özellikle OFT gibi spontan davranışların ölçümü için düşünülmalıdır. Bu deneyde, tersine çevrilmiş bir gündüz-gece döngüsü uygulanamadı, ancak test koşullarına yeterli bir iklimlendirme sağlandı. Kiriş yürüyüşü görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevi için yüksek çözünürlüklü videolar için mükemmel bir aydınlatma gereklidir. Karanlıkta deneyler yapılırken bu yüksek video kalitesine ulaşılamıyor.
Yürüyüşün değerlendirilmesi sürekli bir görev performansı gerektirir. Sürekli bir görev performansının ilk önemli yönü, hayvanları kurulumu geçmeye ikna etmektir. Motivasyonunu artırmak için, kurulumun sonuna küçük gıda peletleri (45 mg) yerleştirin. Hayvanların yiyecek peletlerine aşina olmaları için, peletler testten önce onlara beslenmelidir. Ayrıca, kurulumun sonundaki bir gol kutusu yardımcı olabilir. CatWalk'un kurulumu zaten bir gol kutusu içeriyor, ancak sıçanlar bazen gol kutusuna girmekte tereddüt ediyor. Alternatif olarak, kale kutusuna küçük bir kafes ekleyebilirsiniz, ancak sıçanlardan gelen ev kafesi kale kutusuna sığmaz. Sıçanın elde etmeden önce birkaç dakika kafeste alışkanlık haline getirin. Ayrıca, aynı ev kafesinden başka bir sıçan kale kutusuna veya gol kutusunun içindeki kafese yerlenebilir. İkinci sıçanın kutuda kaldığından ve kale kutusuna girişi engellemediğinden emin olun. Ayrıca, gol kutusunu CatWalk sisteminden çıkarmak ve sıçanın her koşudan sonra "ev bölgelerine" girmesini sağlayan sıçan ev kafesini yürüyüş yolunun sonuna yerleştirmek de mümkündür. Kiriş yürüyüş görevinin kurulumu ve merdiven basamak yürüyüş görevi için, kurulumun sonuna bir gol kutusu veya ev kafesi eklemenizi öneririz. Tutarlılık sağlamak için, CatWalk, kiriş yürüyüş görevi ve merdiven basamak yürüyüş görevi haftada en az bir kez altı ila on koşu ile yapılmalıdır.
Her analiz bu çalışmada önemli farklılıklar yaratmasa da, genetiği değiştirilmiş hayvanların veya tedavi gruplarının dahil edilmesinin, grupları aynı davranış testlerinden ayırt edebilecek değerli veriler üretebileceğini düşünün.
Sinir ezilme yaralanmasının, beş dakikalık bir OFT ile ölçülen sıçanın lokomotor aktivitesi üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Catwalk XT yürüyüş analizi, yürüyüş, pençe ve burun yerleşimini analiz etmek için daha objektif ve hassas bir araçtır. Yoğun bir eğitimden sonra, sıçanlar CatWalk XT cihazının yürüyüş yolundan varsayılan ayarlara geçmeyi öğrenirler. Sinir hasarı, sıçanların geçiti geçme yeteneğini azaltmaz. Çeşitli parametrelerin otomatik hesaplanması verileri objektif olarak sunar. "İnteraktif Ayak İzi Ölçümleri" modülü kullanılarak ek bilgiler elde edilebilir ve gerçekten de bu analizler, sinir hasarı olan ve olmayan sıçanları karşılaştırarak vücut eksenine ayak izi yayılımı, baskı uzunluğu ve pençe açısının çeşitli parametrelerinde önemli farklılıklar sağladı.
Sıçanlar ışın yürüyüşü görevi için kolayca eğitilebilir. Işını geçmek için gecikme süresindeki ve sinir yaralı hindlimb'in adım başına ayak kayması sayısındaki farklılıklar, naif ile ezilmiş sıçanlar karşılaştırılarak tespit edildi. Işın yürüme görevi ile sinir yaralı sıçanları analiz etmenin bir dezavantajı kirişin büyüklüğüdür. Siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonraki ilk iki hafta içinde, sıçanların dengeleri bozuldukça kirişi geçmek için yardıma ihtiyaçları vardır. Bazı sıçanlar kirişi geçebilse de, düşmenin neden olduğu yaralanma riski yüksektir. Bu nedenle sinir ezilmiş hayvanlar, siyatik sinir ezilme yaralanmasından sonraki ilk iki hafta veya gerekirse daha uzun süre kirişi geçmelerine yardımcı olmalıdır. Ancak, yardımlı ve yardımsız çalıştırmaları karşılaştırmak zordur. Ayrıca, motor dengesi ışın yürüme görevi tarafından değerlendirilen önemli bir parametredir. Bu parametrenin sinir ezilme sıçanı modelimizle ilgili olmadığını düşündük. Bu nedenle, Ohwatashi ve arkadaşları tarafından açıklanan puanlar kullanılamadı ve tamamlanmamış bir ışın geçişi ile çalıştırmalar veri analizi için hariç tutuldu18,19.
Metz ve ark.'dan 7 kategorili ölçek, hem ön hem de arka ayakları analiz edebilir ve merdiven basamak yürüyüş görevi16 , 17sırasında tüm uzuvların hatalarının farklı önem düzeylerini ayırt edebilir. 0'dan 2'ye kategorileri içeren en belirgin hataları analiz ederek, sinirden yaralanan wt sıçanlarını naif wt sıçanlarla karşılaştırırken arka planda adım başına hata farkı tespit edilemedi. Ayrıca, merdiven basamak aparatını geçmenin gecikme süresi sinirden yaralanmış wt sıçanları ve wt naif sıçanlar arasında farklılık göstermedi. Derin öğrenme modelleri, otomatik bir yaklaşımla merdiven basamak yürüyüş görevinin veri analizini geliştirebilir ve hızlandırabilir.
Sinir ezilme yaralanmasının yanı sıra açıklanan tüm davranış testlerinin, kurulumların ayarlarını ve boyutlarını uyarlayarak farelere kolayca çevrilebileceğini belirtmek önemlidir. Farelerin model organizma olarak kullanılması, birçok insan hastalığı için transgenik modellerin var olduğu yararlı etkiye sahiptir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF DysTract to C.W.I.) ve Würzburg Üniversitesi Disiplinlerarası Klinik Araştırmalar Merkezi (IZKF) (N-362 ila C.W.I.; Z2-CSP3'den L.R.'ye). Buna ek olarak, bu proje Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından EJP RD COFUND-EJP N° 825575 (EurDyscover'dan J.V.'ye) ve VERUM Vakfı'ndan fon almıştır. Ayrıca C.W.I., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Reseach Foundation) Project-ID 424778381-TRR 295, Deutsche Stiftung Neurologie ve ParkinsonFonds tarafından finanse edilmektedir. L.R. ayrıca Dystonia Medical Reseach Foundation tarafından desteklenmektedir.
Yazarlar Keali Röhm, Veronika Senger, Heike Menzel ve Louisa Frieß'e teknik yardımları için ve hayvan bakımı için Helga Brünner'e teşekkür ediyorlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 33209-1L | |
| Appose ULC skin stapler 35W | Covidien | 8886803712 | |
| Beam | self made | ||
| Bepanthen eye cream | Bayer Vital GmbH | 81552983 | |
| Box for OFT | self made | ||
| Camcorder GC-PX100 | JVC | ||
| Catwalk XT | Noldus | setup and software | |
| Chamber for isofluran | GT-Labortechnik | custom made | |
| Disposable scalpel No. 11 | Feather | 20.001.30.011 | |
| Dräger Vapor 19.3 isoflurane system | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Dumont #2 - laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | super-fine |
| Dustless precision pellets 45 mg | Bio-Serv | F0021 | |
| EthoVision XT | Noldus | setup and software | |
| Forceps 160 mm | Hartenstein | PZ09 | |
| Gas anesthesia mask, rat | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
| Goal box for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Hair clipper Magnum 5000 | Wahl GmbH | ||
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Heating table | MEDAX | 13801 | |
| Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
| Kinovea | www.kinovea.org | ||
| Ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Needleholder | KLS Martin | 20-526-14-07 | |
| Octeniderm | Schülke | 118211 | |
| Rimadyl 50 mg/ml, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
| Rubber band retractors | self made | ||
| Spacer for beam | self made | ||
| Spacer for ladder rung walking task apparatus | self made | ||
| Suture Silkam 4/0 DS 19 | B. Braun | C0762202 | |
| Ultra fine hemostats (non-serrated clamp) | Fine Science Tools | 13020-12 |
References
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J.
- Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
- Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson's disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
- Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108 (2016).
- Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).
- Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
- Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
- Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
- Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226 (2015).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606 (2012).
- Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
- Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
- Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
- Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337 (2021).
- Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
- Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).
