Summary
Bu yöntem makalesi, mitokondrinin termojenik kapasitesini incelemek için yeni bir yaklaşım olan yama-kelepçe tekniği ile iç mitokondriyal membran boyunca H + sızıntısını ölçmedeki ana adımları detaylandırmaktadır.
Abstract
Mitokondriyal termogenez (mitokondriyal ayrılma olarak da bilinir), metabolik sendromla mücadele etmek için enerji harcamasını artırmak için en umut verici hedeflerden biridir. Kahverengi ve bej yağlar gibi termojenik dokular, ısı üretimi için oldukça uzmanlaşmış mitokondri geliştirir. Öncelikle ATP üreten diğer dokuların mitokondrileri, toplam mitokondriyal enerji üretiminin% 25'ini ısıya dönüştürür ve bu nedenle tüm vücudun fizyolojisi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Mitokondriyal termojenez sadece vücut ısısını korumak için gerekli değildir, aynı zamanda diyete bağlı obeziteyi önler ve hücreleri oksidatif hasardan korumak için reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır. Mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın önemli bir düzenleyicisi olduğundan, bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Önemli olarak, mitokondride termojenezin akut aktivasyonunu kontrol eden hassas moleküler mekanizmalar zayıf bir şekilde tanımlanmıştır. Bu bilgi eksikliği, büyük ölçüde, ayrıştırıcı proteinlerin doğrudan ölçümü için yöntemlerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Mitokondriye uygulanan yama-kelepçe metodolojisinin son zamanlardaki gelişimi, ilk kez, mitokondriyal termogenezin kökenindeki fenomenin doğrudan incelenmesini, İBB'den H + sızıntısını ve bundan sorumlu mitokondriyal taşıyıcıların ilk biyofiziksel karakterizasyonunu, kahverengi ve bej yağlara özgü ayrışma proteini 1'i (UCP1) ve diğer tüm dokular için ADP / ATP taşıyıcısını (AAC) mümkün kılmıştır. Bu benzersiz yaklaşım, H + sızıntısını ve mitokondriyal termojenezi kontrol eden mekanizmalara ve metabolik sendromla mücadele için nasıl hedeflenebileceklerine dair yeni bilgiler sağlayacaktır. Bu makalede, İBB aracılığıyla H + akımlarını doğrudan ölçerek termojenik kapasitelerini incelemek için mitokondrilere uygulanan yama kelepçesi metodolojisi açıklanmaktadır.
Introduction
Mitokondri, hücrenin güç merkezi olmasıyla ünlüdür. Aslında, kimyasal enerjinin ana kaynağı olan ATP'dirler. Daha az bilinen şey, mitokondrinin de ısı ürettiğidir. Aslında, her mitokondri sürekli olarak iki tür enerji (ATP ve ısı) üretir ve iki enerji formu arasındaki ince bir denge metabolik hücre homeostazını tanımlar (Şekil 1). Mitokondrinin ATP ve ısı arasında enerjiyi nasıl dağıttığı, biyoenerjetik alanındaki en temel sorudur, ancak hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Mitokondriyal ısı üretimini arttırmanın (mitokondriyal termojenez olarak adlandırılır) ve sonuç olarak ATP üretimini azaltmanın enerji harcamasını artırdığını biliyoruz ve bu, metabolik sendromla mücadele etmenin en iyi yollarından biridir1.
Mitokondriyal termogenez, iç mitokondriyal membran (IMM) boyunca H + sızıntısından kaynaklanır ve substrat oksidasyonunun ve ATP sentezinin ısı üretimi ile ayrılmasına yol açar, bu nedenle "mitokondriyal ayrışma"1 adı verilir (Şekil 1). Bu H + sızıntısı, ayrışma proteinleri (UCP'ler) adı verilen mitokondriyal taşıyıcılara bağlıdır. UCP1, tanımlanan ilk UCP'dir. Sadece termojenik dokularda, kahverengi yağda ve mitokondrinin ısı üretimi için uzmanlaşmış olduğu bej yağda ifade edilir 2,3,4. İskelet kası, kalp ve karaciğer gibi yağ olmayan dokularda UCP'nin kimliği tartışmalı kalmıştır. Bu dokulardaki mitokondri, ısıya dönüştürülen toplam mitokondriyal enerjinin yaklaşık% 25'ine sahip olabilir ve bu da tüm vücudun fizyolojisini önemli ölçüde etkileyebilir1. Çekirdek vücut ısısını korumanın yanı sıra, mitokondriyal termogenez ayrıca kalorileri azaltarak diyete bağlı obeziteyi de önler. Ek olarak, hücreleri oksidatif hasardan korumak için mitokondri ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır1. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez normal yaşlanma, yaşa bağlı dejeneratif bozukluklar ve iskemi-reperfüzyon gibi oksidatif stres içeren diğer durumlarda rol oynar. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın güçlü bir düzenleyicisidir ve bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesini teşvik edecektir.
Mitokondriyal solunum, mitokondriyal termogenezin hücresel metabolizmadaki önemli rolünü ortaya koyan ilk tekniktir ve hala toplumda en popüler olanıdır1. Bu teknik, mitokondriyal H + sızıntısı aktive edildiğinde artan mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) tarafından oksijen tüketiminin ölçülmesine dayanmaktadır. Bu teknik, enstrümantal olmasına rağmen, İBB1'deki mitokondriyal H + sızıntısını doğrudan inceleyemez, böylece özellikle ısı üretiminin ATP üretimine kıyasla ikincil olduğu yağ dışı dokularda, bundan sorumlu proteinlerin kesin olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu zorlaştırır. Son zamanlarda, mitokondriye uygulanan yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi, çeşitli dokularda tüm İBB'de H + sızıntısının ilk doğrudan çalışmasını sağlamıştır 5,6,7.
Tüm İBB'nin mitokondriyal yama kelepçesi ilk olarak Kirichok ve ark.8 tarafından tekrarlanabilir bir şekilde kurulmuştur. 2004 yılında mitokondriyal kalsiyum uniporter (MCU) akımlarının ilk doğrudan ölçümünü, COS-7 hücre hatlarından mitoplastlar kullanarak tanımladılar8. Daha sonra, Kirichok laboratuvarı, fare 9 ve Drosophila dokuları9'un IMM'lerinden kalsiyum akımları gösterdi. Diğer laboratuvarlar şimdi MCU10,11,12,13,14'ün biyofiziksel özelliklerini incelemek için bu tekniği rutin olarak kullanmaktadır. Potasyum ve klorür iletkenliğinin tüm İBB yama-kelepçe analizi de mümkündür ve birkaç makalede bahsedilmiştir, ancak henüz bir yayının ana konusu olmamıştır 6,7,9. İBB'deki H + akımlarının ilk ölçümü 2012 yılında fare kahverengi yağ mitokondrisi6'dan ve 2017'de fare bej yağ mitokondrisinden7 bildirilmiştir. Bu akım, termojenik dokuların spesifik ayrışma proteini UCP1 6,7'den kaynaklanmaktadır. 2019'da yayınlanan son çalışmalar, AAC'yi kalp ve iskelet kası gibi yağ dışı dokularda mitokondriyal H + sızıntısından sorumlu ana protein olarak nitelendirdi5.
Bu benzersiz yaklaşım şimdi mitokondriyal iyon kanallarının ve mitokondriyal termojenezden sorumlu taşıyıcıların doğrudan yüksek çözünürlüklü fonksiyonel analizine izin vermektedir. Yöntemin genişlemesini kolaylaştırmak ve mitokondriyal solunum gibi diğer çalışmaları tamamlamak için, UCP1 ve AAC tarafından taşınan H + akımlarını ölçmek için aşağıda ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Üç önemli adım açıklanmaktadır: 1) AAC'ye bağımlı H + akımını analiz etmek için fare kahverengi yağından mitokondriyal izolasyon ve AAC'ye bağımlı H + akımını analiz etmek için kalpten mitokondriyal izolasyon, 2) dış mitokondriyal membranın (OMM) mekanik rüptürü için bir Fransız Basını ile mitoplastların hazırlanması, 3) UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + akımlarının yama-kelepçe kayıtları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gerçekleştirilen tüm hayvan deney prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygundur ve Kaliforniya Üniversitesi Los Angeles Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Mitokondriyal izolasyon prosedürü diferansiyel santrifüjlemeye dayanır ve dokudan dokuya biraz değişir. Örneğin, kahverengi yağ dokusu lipitler bakımından son derece zengin olduğundan, mitokondri toplanmadan önce hücre kalıntılarını ve organelleri lipit fazından ayırmak için ek bir adım gerektirir. Karışıklığı önlemek için, iki mitokondriyal izolasyon prosedürü (biri kahverengi yağdan, diğeri kalpten) aşağıda detaylandırılmıştır.
1. Fare interskapuler kahverengi yağından mitokondriyal izolasyon (Bertholet ve ark. 2020'den modifiye edilmiştir)15
- Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Paneli ve IACUC Komitesi tarafından önerildiği gibi, CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık kullanarak C57BL / 6 erkek fareyi ötenazileştirin.
- Fareyi göbeği masaya bakacak şekilde konumlandırdıktan sonra, saçları temizlemek ve ıslatmak için alkol püskürtün (Mann ve ark., 2014'ten değiştirilmiştir)16.
- Cildi cımbızla kavradıktan sonra üst sırtta 2 cm'lik bir kesi yapın.
- Kelebek şeklinde16 olan iki loblu bir organa karşılık gelen farenin kahverengi interskapular yağını çıkarın.
- Kahverengi yağları, daha önce buz üzerine yerleştirilmiş 5 mL soğuk izolasyon tamponu (Tablo 1) ile doldurulmuş 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
- Kahverengi yağı dürbün altındaki beyaz yağdan temizleyin.
- Kahverengi yağı, ince parçalar halinde doğramak için 5 mL soğuk izolasyon tamponu (Tablo 1) ile 10 mL'lik bir behere aktarın. Buzda soğutulmuş 10 mL cam homojenizatöre (plastik malzeme politetrafloroetilen (PTFE) havane) aktarın.
- Önceden kesilmiş dokuyu buz üzerinde altı yumuşak vuruşla 275 rotasyon/dk kontrollü bir hızda homojenize etmek için bir baş üstü karıştırıcı kullanın.
- Homojenatı 8.500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15 mL buz gibi soğuk konik bir tüp içinde santrifüj edin. Lipid fazını içeren süpernatantı atın.
- Peleti 5 mL buz gibi soğuk izolasyon tamponunda (Tablo 1) yeniden askıya alın ve buz üzerindeki süspansiyonu ikinci kez 275 dönme / dak hızında altı yavaş vuruşla homojenize edin.
- Homojenatı 15 mL buz gibi soğuk konik bir tüpe aktarın ve tüm çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı taze bir 15 mL tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin.
- Mitokondri içeren bir pelet elde etmek için süpernatantı 8.500 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Mitokondri içeren peleti 3.8 mL buz gibi soğuk hipertonik-mannitol tamponunda (Tablo 2) yeniden askıya alın ve mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin.
2. Fare kalbinden mitokondriyal izolasyon (Garg ve ark. 2019'dan değiştirilmiştir)17
- Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Paneli ve IACUC Komitesi tarafından önerildiği gibi, CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık kullanarak C57BL / 6 erkek fareyi ötenazileştirin.
- Fareyi sırtına yerleştirdikten sonra, saçları temizlemek ve ıslatmak için alkol püskürtün. Daha sonra cildi cımbızla kavradıktan sonra toraks üzerinde 2 cm'lik bir kesi yapın.
- Kalbi hayvanın göğsünden disseke edin ve 5 mL soğuk izolasyon çözeltisi ile 10 mL'lik bir beherdeki tüm kanı çıkarmak için durulayın (Tablo 1).
- Kalp kan izlerinden temizlendikten sonra, ince parçalara ayırmak için 5 mL soğuk izolasyon tamponu içeren başka bir 10 mL beher'e aktarın (Tablo 1). Daha sonra, buzla soğutulmuş 10 mL cam homojenizatöre (PTFE havaneli) aktarın.
- Önceden kesilmiş dokuyu buz üzerinde altı yumuşak vuruşla 275 rotasyon/dk kontrollü bir hızda homojenize etmek için bir baş üstü karıştırıcı kullanın.
- Homojenatı 15 mL buz gibi soğuk konik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 700 x g'da santrifüj ederek pelet çekirdeklerine ve kırılmamış hücrelere aktarın.
- Süpernatantı taze bir 15 mL tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin.
- Mitokondri içeren bir pelet elde etmek için süpernatantı 8.500 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Mitokondriyal peleti 3.8 mL buz gibi soğuk hipertonik-mannitol tamponunda (Tablo 2) yeniden askıya alın ve mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin.
3. OMM'nin mekanik rüptürü için bir Fransız Presi ile mitoplastların hazırlanması.
NOT: Fransız basın prosedürü, İBB'nin matris ve crista dahil olmak üzere bütünlüğü korunarak OMM'den serbest bırakılmasına izin verir (Şekil 2)18. Mitokondri, hipertonik-mannitol tamponunda (Tablo 2) önceden inkübe edilir ve OMM yırtıldığında İBB'nin sert bir şekilde gerilmesini önlemek için Fransız pres prosedürü sırasında daha düşük bir basınca tabi tutulur.
- Mitokondriyal-hipertonik-mannitol süspansiyonunu Fransız presinin soğutulmuş bir mini basınç hücresine (piston çapı 3/8") doldurun (Şekil 3A).
- French Press'in Orta modunu seçin ve süspansiyonu, kahverengi yağ mitokondrisi için French Press kadranındaki 110'da ve kalp mitokondrisi için 140'ta (~ 2.000 psi) mini basınç hücresinden sıkıştırın. Süspansiyonun mini basınç hücresinden yaklaşık 1 damla / s oranında çıktığından emin olun.
- Damlaları 15 mL buz soğutmalı konik bir tüpte toplayın.
- Süspansiyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.500 x g'de santrifüj yapın.
- Mitoplast peletini 0.5-2 mL buz gibi soğuk Hypertonic-KCl tamponunda (Tablo 3) yeniden askıya alın ve süspansiyonu buz üzerinde saklayın.
NOT: Kahverengi yağ ve kalp mitoplastları yama kelepçeli kayıtlar için hazırdır ve yaklaşık 3-6 saat boyunca kullanılabilir durumda kalmalıdır.
4. UCP1 ve AAC 5,7,15 üzerinden H + sızıntısının elektrofizyolojik kayıtları
NOT: Aşağıdaki elektrofizyolojik kurulumu kullanın (Şekil 3B): diferansiyel girişim kontrastlı (DIC) ters mikroskop, 60x suya daldırma hedefi, titreşim izolasyon tablosu ve Faraday kafesi, düşük gürültülü kayıtları destekleyen standart bir amplifikatör, elektrofizyolojik kurulum için kullanılan standart bir sayısallaştırıcı, pClamp 10, bir mikromanipülatör, banyo referans elektrodu (kalıplanmış gümüş/gümüş klorür pelet içeren bir mikroelektrot tutucu içine yerleştirilmiş 3 M KCl-agar tuz köprüsü) tutucu gövdeye (Liu et al. 2021'de tanımlanmıştır)19, yerçekimi ile beslenen bir perfüzyon sistemine bağlı, 0.13 mm cam kapaklı bir tabana sahip perfüzyon odası.
- Borosilikat cam filamentleri kayıt gününde bir mikropipet çektirici kullanarak çekin. Yüksek derecede tekrarlanabilirliğe sahip pipetler üretmek için kullanılan çektirme makinesine bir program yerleştirin20.
NOT: Bu program tasarımı, IMM yama kelepçesi için optimize edilmiş pipetler elde etmek için birkaç deneme gerektirir. Standart bir pipet, progresif konik şekle sahip ince uçlara sahiptir. - Çektirme makinesinin içine bir cam filaman yerleştirin ve bir borosilikat filamentten neredeyse iki özdeş yama pipeti elde etmek için çekin.
- Pipetler, çektirmenin ısıtma kutusu filamentinin eskimesi nedeniyle çekme döngüleri arasında tutarsız hale geldiğinde programı ayarlayın.
- Pipetleri pipet parlatıcısının içine yerleştirin ve ateşle parlatmak için ucu filamentin yanına 100x büyütmenin altına yerleştirin.
- Filamenti tıkanmadan veya uç eğrisine zarar vermeden ısıtmak için ayak pedalına birkaç kez basın.
- TMA bazlı pipet çözeltisi ile doldurulduğunda 25 ila 35 MΩ arasında bir dirence sahip pipetler elde edilene kadar cilalanır (tetrametilamonyum hidroksit için TMA, Tablo 4).
- Mitoplast yapışmasını azaltmak için %0,1 jelatinli ön inkübasyon kapakları (5 mm çap, 0,1 mm kalınlık) ve mitoplast süspansiyonunu biriktirmeden önce KCl banyo çözeltisi (Tablo 5) ile durulayın.
- Konsantre mitoplast süspansiyonun ~35 μL'sini 500 μL KCl banyo çözeltisi (Tablo 5) ile karıştırarak ham bir seyreltme hazırlayın ve daha önce 4 delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirilmiş kapaklara yerleştirin.
- Mitoplastların kapak kayması üzerindeki tortuya neden olması için 15 ila 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Banyo odasını tamamen ~ 50 μL KCl banyo çözeltisi ile doldurun (Tablo 5).
- Bükülmüş uçlu ince mikrodiseksiyon cımbızları kullanarak hazne içinde mitoplastlı bir kapak kayması aktarın.
- Kapak kapağını odanın dibinde düzenleyin. Mitoplastları kapak kayması üzerinde sabit tutmak için odacığı delmeyin.
- Mikroskop altındaki kapak kaymasını 60x hedefle tarayarak 8 şeklinde ayrı bir yapışkan olmayan mitoplast seçin.
- Pipete pipet çözeltisi (~50 μL) yükleyin ve pipet tutucuya yerleştirin.
- Pipetleri bir mikromanipülatörle banyo çözeltisine getirin ve IMM'ye yaklaşmak için seçilen mitoplastın hemen üstüne yaklaşın. Amplifikatör programı, pipetin banyo çözeltisine girdikten sonra direncini verir. Membran potansiyelini 0 mV'de tutun ve amplifikatör programındaki membran test komutunu kullanarak 10 mV darbeler uygulayın.
- İBB ile hızlı bir şekilde gigaseal oluşturmak için hafif negatif basınç uygulayın (Şekil 2B).
- Deney sırasında pipetin sürüklenmesi nedeniyle conta kırılmasını önlemek için pipeti kapak kaymasından uzak tutmak için mitoplast takılı olarak yükseltin.
- Kopma sonrası mitoplast membranı için doğru bir kapasitans (Cm) ölçümü elde etmek için tüm mitoplast konfigürasyonunu test etmeden önce amplifikatör programındaki "membran testi" komutu ile başıboş kapasitans geçicilerini telafi edin.
- Cam pipetin altındaki membran yamasını yırtmak ve tüm mitoplast konfigürasyonunu elde etmek için amplifikatör programı ile kısa süreli (5-15 ms) voltaj darbeleri (250-600 mV) uygulayın (Şekil 2C). Başarılı bir mola, kapasitans geçicilerinin yeniden ortaya çıkmasıyla yansıtılır.
- Kırılmadan sonra, membran kapasitansını (mitoplastın boyutunu yansıtan) ve erişim direnci Ra'yı (tüm mitoplast konfigürasyonunun kalitesini yansıtan) değerlendirmek için amplifikatör programının membran test seçeneğiyle kapasitans geçicilerini takın. Kırılmadan sonra, Ra 40 ila 80 MΩ arasında olmalıdır. Yama-kelepçe deneyleri için kullanılan mitoplastlar (2-6 μm boyutunda) tipik olarak 0.5-1.1 pF'lik membran kapasitanslarına sahiptir.
- Kırılmadan hemen sonra, perfüzyonu başlatarak KCl banyo çözeltisini (Tablo 5) HEPES banyo çözeltisi (Tablo 6) ile değiştirin.
- Mitoplastı 0 mV'de tutarken, amplifikatör programı ile tasarlanmış 850 ms rampa protokolünü -160 mV'den +100 mV'a 5 s aralıklarla uygulayın. Bu protokol UCP1 6,7,15 ve AAC 5 çalışmaları için geçerlidir (Şekil 4 ve Şekil 5).
NOT: UCP1 ve AAC'ye bağımlı H+ akım ölçümlerinin tüm elektrofizyolojik verileri 10 kHz'de elde etmesi ve amplifikatörü ve sayısallaştırıcıyı çalıştıran yeterli yazılımı kullanarak 1 kHz'de filtrelemesi önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondriye uygulanan yama kelepçesi metodolojisinin geliştirilmesi, İBB ve bundan sorumlu olan mitokondriyal taşıyıcılar, UCP1 ve AAC yoluyla H + sızıntısının ilk doğrudan çalışmasını sağlamıştır. UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + sızıntılarının elektrofizyolojik analizi, mitokondrinin termojenik kapasitesine ilk bakışı sağlayabilir. Sonuçlar bölümünde, UCP1 ve AAC aracılığıyla H + sızıntısını ölçmek için standart prosedürler açıklanmaktadır.
UCP1'e bağlı H+ akım ölçümü (Şekil 4)6,7,15
Voltaj rampası protokolünün uygulanması, UCP'lerin gerekli aktivatörleri olan eksojen yağ asitleri (FA) ilavesi olmadan kahverengi yağın IMM'si boyunca büyük genlikli bir H + akımını indükler (Şekil 4A). Bu, membranla ilişkili bir fosfolipaz aktivitesi ile FA'nın lokal üretimi nedeniyle kahverengi ve bej yağ IMM'nin spesifik bir özelliğidir. Rampa protokolüne yanıt olarak H + akımı geliştiğinde, akım genliğinin stabilize olmasını beklemek önemlidir. H + akım genliğinin UCP1 ile ölçülmesi, sıfır UCP1 akımına karşılık gelen taban çizgisinin belirlenmesini gerektirir. H + akım genliğinin stabilitesine ulaşıldıktan sonra, endojen membran FA ekstraksiyonu için UCP1 inhibitörü Guanozin difosfat (GDP - 1 mM, Şekil 4A) veya bir FA şelatör (% 0.5 FA içermeyen sığır serum albümini, gösterilmemiştir) veya 10 mM Metil Beta Siklodekstrin (MβCD) perfüze edilmesi önerilir. Artık akım, UCP1 akımlarının genliğinin belirleneceği akımdır. Farklı mitoplastlardaki UCP1 akımlarının genliklerinin karşılaştırılmasına yardımcı olmak için, her bir mitoplastın akım yoğunluğu (pA / pF), UCP1 akımlarının mitoplast kapasitansı (Cm) 5,7 ile normalleştirilmesiyle hesaplanır. Akım, arakidonik asit (AA) veya oleik asit (OA) (1-2 μM) kullanılarak eksojen uzun zincirli FA ilavesiyle yeniden aktive edilebilir. Hem kahverengi hem de bej yağ IMM'leri PLA2 aktivitesine sahip olduğundan, endojen membran FA'ları, MβCD / albümini banyodan yıkadıktan sonraki birkaç dakika içinde kısmen yenilenir ve UCP1 6,7 aracılığıyla H + akımının yeniden aktivasyonuna yol açar. Beklendiği gibi, bu akım UCP1-/- farelerin İBB'sinde tamamen kaybolur (Şekil 4A)6,7.
Aynı dokunun farklı mitoplastlarının veya farklı dokulardan (kahverengi ve bej yağ) mitoplastların UCP1'in yoğunluğunu ve aktivitesini karşılaştırmanın daha kesin bir yolu, IMM 6,7'nin yüzeyindeki FA konsantrasyonunu kontrol etmektir. Gerçekten de, H + akım genliği, İBB başına UCP1 protein miktarı nedeniyle mitoplastlar arasında değişebilir, aynı zamanda endojen FA üretimi nedeniyle de değişebilir. Bu nedenle, endojen FA'nın İBB'den çıkarılması ve bilinen bir konsantrasyonda eksojen FA ekleyerek UCP1'e bağımlı H + akımının yeniden etkinleştirilmesi önerilir. Bunu yapmak için, endojen FA'lar önce 10 mM MβCD içeren bir HEPES banyo çözeltisi (Tablo 6) perfüze edilerek İBB'den ekstrakte edilmelidir. Daha sonra, H + akımının UCP1 aracılığıyla sadece eksojen FA'ların kesin bir konsantrasyonu ile yeniden etkinleştirilmesine izin vermek için, ikincisi IMM'den üretilen FA'ları sürekli olarak çıkarmak için bir HEPES / MβCD arka planına perfüze edilecektir.
UCP1'e bağlanmak için pürin nükleotid ve FA arasındaki rekabetin incelenmesi, yama-kelepçe tekniği 6,7,15 ile de mümkündür. UCP1'in pürin nükleotidler (örneğin, Mg2 + içermeyen ATP) tarafından inhibisyonu, iki farklı FA konsantrasyonu (ideal olarak 10 kat) ile karşılaştırılabilir. Bu amaçla endojen membran FA ilk olarak 10 mM MβCD uygulanarak çıkarılır (Şekil 4B, siyah iz). 10 mM MβCD'lik bir arka plan üzerine uygulanan eksojen FA'ların uygulanması (örneğin, burada, sadece 0.5 mM FA'lar gösterilmiştir), aktive edici FA'ların konsantrasyonunun hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar, çünkü yerel olarak üretilen FA'lar membrandan hemen çıkarılır. Bu durumda, eksojen FA'lar öncelikle H + akımının gelişiminden sorumludur. Test edilen her FA konsantrasyonu için IC50 ATP'yi değerlendirmek ve böylece FA'nın UCP1'e bağlanmak için pürin nükleotidlerle rekabet edip etmediğini belirlemek için OA / MβCD çözeltisine farklıATP konsantrasyonları eklenir.
AAC'ye bağımlı H+ akım ölçümü (Şekil 5)5
Kahverengi yağın aksine, iskelet kası ve kalp gibi yağ olmayan dokuların İBB'si, kırılmadan hemen sonra ölçülebilir bir H + geliştirmez (Şekil 5, siyah izler). AAC yoluyla ölçülebilir bir H+ akımını indüklemek için, 1-2 μM eksojen FA içeren HEPES banyo çözeltisinin (Tablo 6) uygulanması esastır (AA, Şekil 5A, kırmızı iz). Bu, yağ olmayan dokuların İBB'sinin, kahverengi ve bej yağların İBB'sinde bulunduğu gibi İBB'ye bir FA üretim makinesine sahip olmadığını gösterebilir.
AAC aracılığıyla H + akım genliğinin nicelleştirilmesi için taban çizgisi (veya sıfır akım), FA ilavesinden önce İBB'nin yüzeyinde perfüze edilen HEPES banyo çözeltisine (Tablo 6) karşılık gelir. Ölçülen H+ akımının AAC tarafından taşındığını doğrulamak için, FA'ya eklenen spesifik AAC inhibitörleri, 1 μM karboksiyatractilosid (CATR, Şekil 5A) veya 4 μM bonkgrekik asit (BKA, gösterilmemiştir)5, H + akımını neredeyse tamamen inhibe eder. Bu akım, AAC1-/- farelerin IMM'sinde tamamen kaybolur (Şekil 5A), AAC1 kalpteki baskın izoform5'tir.
AAC5 ile FA'ya bağımlı H+ sızıntısı ve nükleotidler arasındaki etkileşimin yama-kelepçe analizi de mümkündür. Bununla birlikte, AAC ve UCP1 arasında önemli bir fark vardır: AAC sadece H + taşımakla kalmaz, aynı zamanda ana işlevi adenin nükleotidleri ADP ve ATP21'i taşımaktır. Adenin nükleotid değişiminin FA'ya bağımlı H+ sızıntısını nasıl etkilediğini incelemek için, pipet çözeltisine 1 mM Mg2+-free ADP eklenir. Daha sonra, AAC üzerinden H + akımını etkinleştirmek için FA perfüze edilir. Yalnızca pipet çözeltisindeki ADP, H+ akım5'i etkilemez. Kararlı bir H + akım genliğine ulaşıldığında, ADP FA ile aynı anda perfüze edilir. Sadece AAC yoluyla aktif bir nükleotid değişimi oluşturmak için membranın her iki tarafında ADP mevcut olduğunda, elde edilen H + sızıntısının sabit ancak asla tam bir inhibisyonu elde edilmez (Şekil 5B). Bu, AAC'nin iki taşıma modunun (FA-H + akım ve ADP / ATP değişimi) rekabet ettiğini ve aynı translokasyon yolu üzerinden gerçekleşmesinin muhtemel olduğunu gösterebilir. ADP/ADP homoexchange, fizyolojik ADP/ATP heteroexchange5 ile ilişkili ek akımdan kaçınmak için seçildi.
Resim 1: Isı ve ATP üretimi arasındaki mitokondriyal enerji dağılımı. Mitokondriyal ATP ve ısı üretiminin mekanizmaları. Mitokondri, ATP ve ısı üretimi için makineler içeren iki zara [OMM (mor) ve IMM (turuncu)] sahiptir. TTM, ATP sentaz (AS) tarafından ATP üretmek için kullanılan ve UCP'ler tarafından ısı üretmek için kullanılan IMM'de bir elektrokimyasal H + gradyanı üretir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mitokondriyal yama-kelepçe tekniği (Bertholet ve ark. 2020'den modifiye edilmiştir)15. (A) Mitokondri, santrifüjleme yoluyla doku lizatından izole edilir (morda OMM ve turuncuda IMM). (B) Düşük basınçlı Fransız basını, bir mitoplast veren İBB'yi serbest bırakmak için OMM'yi yırtar. Sol panel, İBB'ye bağlı OMM kalıntıları ile 8 şeklinde bir form alan bir mitoplastı temsil eder. Bir gigaohm conta (mitoplasta bağlı konfigürasyon) oluşturmak için İBB'ye bir cam pipet yaklaştırılır. Mitoplasta takılı konfigürasyonun bir fotoğrafı sağ panelde gösterilir. (C) Tüm İBB'nin konfigürasyonu (sol paneldeki diyagram), pipet altındaki membran yamasının birkaç voltaj darbesiyle (200-500 mV) kırılmasından sonra elde edilir. Tüm İBB konfigürasyonunun bir fotoğrafı sağ panelde gösterilir. İç akımlar (I, kırmızı) negatiftir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: French Press ve elektrofizyolojik kurulum. (A) İBB'yi serbest bırakmak için OMM'nin parçalanmasına yardımcı olan Fransız Basınının resmi. (B) Bir Faraday kafesi, diferansiyel girişim kontrastlı (DIC) ters çevrilmiş mikroskop, 60x suya daldırma hedefi, bir titreşim izolasyon tablosu ve bir mikromanipülatörün resmi. Standart amplifikatör, standart bir sayısallaştırıcı ve PC bilgisayarı resimde gösterilmemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kahverengi yağda UCP1 yoluyla H + akımı. (A) WT (üst panel) ve UCP1 − / - farelerden (alt panel) izole edilen kahverengi yağ mitoplastından kaydedilen temsili UCP1 bağımlı H + akımı. Siyah renkte gösterilen kontrol H+ akım izleri, İBB kırıldıktan sonra stabilize edilmiş akım genliğine karşılık gelir. 1 mM GSYİH daha sonra banyo çözeltisine (turuncu) eklenir. Voltaj rampası protokolü WT izlerinin üzerinde gösterilmiştir. Banyo ve pipet çözeltilerinin pH'ı pipet-mitoplast diyagramında gösterilmiştir. (B) UCP1'in kahverengi yağda pürin nükleotidler tarafından inhibisyonu. Temsili UCP1-bağımlı H + akımı, termonötritede farelerin kahverengi yağının İBB'sinin sitozolik yüzünde çeşitli konsantrasyonlarda ATP izleri. UCP1'e bağımlı H + akımı, 10 mM MβCD ile karıştırılmış 0.5 mM oleik asit (OA) ile aktive edildi.Voltaj protokolü üstte belirtilmiştir. Alt panelde, aynı iz temsil edilir ancak mitoplast membran kapasitansı ile normalleştirilmez. Bu şekildeki kahverengi yağ mitoplastı, 0.624 pF'lik bir membran kapasitansına sahipti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kalp mitoplastında AAC üzerinden FA'ya bağımlı H+ akımı. (A) WT kalp mitoplastlarında banyo çözeltisine (üst panel, turuncu) 2 μM AA uygulandığında ve 1 μM CATR (mor) ile inhibe edildiğinde temsili AAC'ye bağımlı H+ akımı. AAC1 −/− kalp mitoplastında kaydedilen temsili iz alt paneldedir. Kontrol akımı siyah renktedir. Voltaj rampası protokolü WT izlerinin üzerinde gösterilmiştir. Banyo ve pipet çözeltilerinin pH'ı pipet-mitoplast diyagramında gösterilmiştir. (B) Pipet çözeltisi 1 mM ADP içerirken, AAC bağımlı H+ akımı 2 μM AA (turuncu) ile indüklenir ve banyoya 1 mM ADP ilavesiyle inhibe edilir (mor). Gerilim rampası protokolü izin üzerinde gösterilir. Banyo ve pipet çözeltilerinin pH'ı pipet-mitoplast diyagramında gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Sakaroz | 250 mM |
| HEPES | 10 mM |
| cesaret | 1 mM |
| TrisBase ile pH 7,2'ye ayarlandı |
Tablo 1: Mitokondriyal izolasyon tamponu (tonisite ~ kg başına 300 mmol)
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Sakaroz | 140 mM |
| D-mannitol | 440 mM |
| HEPES | 10 mM |
| cesaret | 1 mM |
| TrisBase ile pH 7,2'ye ayarlandı |
Tablo 2: Hipertonik-mannitol tamponu
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Kartal | 750 mM |
| HEPES | 20 mM |
| cesaret | 1 mM |
| TrisBase ile pH 7,2'ye ayarlandı |
Tablo 3: Hipertonik-KCl tamponu
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Tma | 130 mM |
| HEPES | 100 mM |
| cesaret | 1 mM |
| UCP1 kayıtları için MgCl2 | 2 mM |
| veya | |
| AAC kayıtları için TrisCl | |
| D-glukonik asit ile 7.0 veya 7.5'e ayarlanmış pH |
Tablo 4: TMA bazlı pipet çözeltisi (ton değeri ~ kg başına 360 mmol)
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Kartal | 150 mM |
| HEPES | 10 mM |
| cesaret | 1 mM |
| TrisBase ile pH 7,0'a ayarlandı |
Tablo 5: KCl banyo çözeltisi (ton değeri ~ kg başına 300 mmol)
| Reaktif | Son konsantrasyon |
| Sakaroz | UCP1 kayıtları için 100 mM |
| veya | |
| AAC kayıtları için 150 mM | |
| HEPES | UCP1 kayıtları için 150 mM |
| veya | |
| AAC kayıtları için 100 mM | |
| 1 mM EGTA | |
| TrisBase ile pH 7,0'a ayarlandı |
Tablo 6: HEPES banyo çözeltisi (ton değeri ~ kg başına 300 mmol)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem makalesi, mitokondriyal termojenezden sorumlu İBB aracılığıyla H + sızıntısını doğrudan incelemek için yeni bir yaklaşım olan mitokondriye yakın zamanda uygulanan yama-kelepçe tekniğini sunmayı amaçlamaktadır 5,6,7,15. Bu teknik dokularla sınırlı değildir ve HAP1, COS7, C2C12 ve MEF hücreleri gibi farklı standart insan ve hücre modellerinde İBB'nin H + sızıntısını ve diğer iletkenliklerini analiz etmek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, her mitokondriyal izolasyon, her hücre veya doku tipine özgü bazı yeniden ayarlamalar gerektirir.
Kahverengi yağ 5,6ve kalp 5'in İBB'si aracılığıyla H + akımlarının doğrudan ölçülmesindeki ana adımlar, uzmanlaşmış termojenik ve yağ dışı dokularda mitokondriyal termojenezden sorumlu mekanizmaları göstermek için burada özetlenmiştir. Gerçekten de, bu tekniğin ilk kez geliştirilmesi, iki ana UCP'nin (UCP1 ve AAC) doğal membran ortamlarında, aşağıdakiler gibi kritik deneysel koşulların hassas kontrolü ile yüksek çözünürlüklü fonksiyonel analizine izin vermektedir: 1) pipet ve banyo çözeltilerinin pH'ı, 2) İBB genelinde membran potansiyelinin kontrolü ve 3) H + dışındaki İBB'ye geçirgen olan iyonları ve metabolitleri dışlamak için çözeltilerin hassas bileşimi. TMA bazlı pipet (Tablo 4) ve HEPES banyo çözeltileri (Tablo 6), H+ akımlarını kaydedecek şekilde formüle edilmiştir ve yalnızca normalde İBB'ye geçirimsiz olan büyük anyonlara ve katyonlara ayrışan tuzları içerir. Banyo çözeltisi, membranın sitozolik tarafına farklı tedavilerin uygulanmasına izin veren bir perfüzyon sistemi kullanılarak değiştirilebilirken, intrapipet çözeltisinin bileşimini değiştirmek mümkün değildir. Bu, matris tarafında meydana gelen düzenleyici mekanizmaların anlaşılmasını sınırlar. Gerçekten de, pipeti doldururken bileşikler intrapipet çözeltisi içinde bulunmalıdır. Bu nedenle, H + sızıntısı diğer akımların izolasyonunda incelenebilir. Farmakolojik çalışmalar ve KO farelerinin kullanımı, çeşitli dokuların İBB'si aracılığıyla H + akımından sorumlu proteinlerin karakterizasyonu ve tanımlanması için gerekliydi 5,6,7. Bu sonuçlar, UCP1'in kahverengi ve bej yağın ana UCP'si ve yağ dışı dokularda AAC olduğunu ortaya koymuştur. UCP1 ve AAC tarafından aracılık edilmeyen diğer H + akımlarının varlığı olasılığını tamamen dışlayamayız. Bununla birlikte, eğer başka H + akımları varsa, genlikleri elektrofizyolojik kurulumumuzun çözünürlüğünün ötesindeydi. Bu makalede açıklanan koşullar altında TTM'nin H+ pompalanmasını ölçmüyoruz. Tüm İBB konfigürasyonuna ulaştıktan sonra, mitokondriyal matris, pipet içi çözeltinin perfüzyonu ile yıkanır. Membranlar arası boşluk, OMM'yi Fransız basını ile kırma adımından bu yana artık mevcut değil. ETC yoluyla H + pompalama için çok önemli olan solunum komplekslerinin hiçbir substratı eklenmemiştir. Bu nedenle, burada ayrıntılı olarak açıklanan elektrofizyolojik koşullar altında aktif H + pompalamanın gelişmesi olası değildir.
Çıkarılan yamaların tek kanallı kayıtları bu makalede açıklanmaz. İBB'deki UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + akımları, yüksek protein yoğunlukları nedeniyle sağlam olmasına rağmen, UCP1 ve AAC üniter akımlarının genliği muhtemelen çok küçük olduğu için tek kanallı açıklıklar çözülemedi.
Biyokimyasal çalışmaların aksine, bu makalede açıklanan mitokondriyal izolasyonun yüksek düzeyde mitokondriyal saflık ile sonuçlanması gerekmez. Gerçekten de, çok sayıda bireyselleştirilmiş mitoplasttan ve hücre kalıntılarından oluşan mitokondriyal preparat, yama için 8 şekilli bir mitoplast bulmak için mikroskop altında taranır. Mitoplastın 8 şekilli formu, İBB'nin Fransız basın prosedürünün neden olduğu OMM'deki bir delikten serbest bırakılmasından kaynaklanmaktadır (Şekil 2). Daha az yoğun lob, İBB 15,17'ye karşılık gelir. Uygun bir preparat, hücresel döküntülerden kolayca ayırt edilebilen serbestçe hareket eden mitoplastlarla tanımlanabilir. Bununla birlikte, IMM'nin kirlenmesini önlemek için döküntü sayısını azaltmak önemlidir, bu da cam pipetin membranla sızdırmazlığının kalitesini etkileyebilir. Mikroskop altındaki bu tarama adımı, OMM tarafından sınırlandırılandan daha az yoğun bir lob tarafından tanınan yüksek IMM bütünlüğüne sahip bir mitoplastın seçilmesini mümkün kılar ve bu nedenle başarılı bir kırılma şansını arttırır.
Bu teknik ilk kez UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + akımlarının doğal membranlarında doğrudan ölçülmesini sağladı. Bununla birlikte, mitokondriyal bütünlük ve bölümleme, OMM ve muhtemelen cristae'nin yırtılması nedeniyle artık mevcut değildir. Bu nedenle, yama-kelepçe analizini, yeni karakterize edilen proteinlerin bozulmamış mitokondrideki fizyolojik rolünü doğrulamak için mitokondriyal solunum gibi diğer klasik yöntemlerle tamamlamak önemlidir.
Mitokondriye uygulanan yama-kelepçe tekniği, mitokondriyal H + sızıntısı ve termojenezden sorumlu moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için yeni olanaklar sunmaktadır. Modern hücresel ve moleküler tekniklerle birleştirildiğinde, bu yenilikçi yaklaşım, mitokondrinin termojenik kapasitesini kontrol eden mekanizmalara ve mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili hastalıklarla mücadele etmek için nasıl hedeflenebileceklerine dair yeni bilgiler sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar, birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Dr. Yuriy Kirichok'a laboratuvarında parçası olduğum büyük bilim için ve Kirichok laboratuvarının üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca AAC1 nakavt fareleri sağladığı için Dr. Douglas C. Wallace'a teşekkür ederim. Finansman: A.M.B, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 19CDA34630062 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
